CN110687243B - 一种快速鉴别金银花和山银花的薄层检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种快速鉴别金银花和山银花的薄层检测方法，解决了现有四种鉴别金银花和山银花方法中所存在的可靠性低、成本高、时间长的问题。该方法选用金银花和山银花特有的代表成分对来两者进行鉴别，包括以下步骤：1)制备对照品溶液和样品溶液；2)薄层点样；3)制备展开剂；4)展开；5)显色与检视。采用此种薄层检测方法简单、快速、灵敏度高、专属性强，对金银花和山银花的对比明显，结果直观，易于辨认和区分，为确保区分金银花和山银花提供了可靠的鉴别方法。

Description

一种快速鉴别金银花和山银花的薄层检测方法

技术领域

本发明属于植物鉴别领域，具体涉及一种快速鉴别金银花和山银花的薄层检测方法。

背景技术

《中国药典》2015版规定：金银花为忍冬科植物忍冬(Lonicera japonica Thunb.)的干燥花蕾或带初开的花；夏初花开放前进行采收，干燥；主要产于河南、山东、广西、湖南、广东等地。它是临床上常用的一味中药，素有“中药中的青霉素”之称。山银花为忍冬科植物灰毡毛忍冬(Lonicera macranthoides Hand.-Mazz.)、红腺忍冬(Lonicera hypoglaucaMiq.)、华南忍冬(0Lonicera confusa D C.)或黄褐毛忍冬(Lonicera fulvotomentosaHsu et S.C.Cheng)的干燥花蕾或带初开的花；夏初花开放前进行采收，干燥。

由此可见，山银花与金银花虽然同为忍冬属植物，但实为两类明显不同的物种，其中，山银花是上述四种忍冬的笼统叫法。

自2005版起，《中国药典》就将金银花与山银花分列为两项，但功用表述却完全相同。药典委员会也回应，尽管金银花和山银花二者在一些功效方面存在着相同性，但更应关注其内在化学成分的差异。

山银花中含有大量皂苷类成分，如果用于生产中药注射剂，则可能存在溶血等风险。市场上，山银花在销售价格上明显更低，因此，制备含金银花的药剂时，在利益驱使下不良商家会使用山银花替代金银花。同时，也由于金银花和山银花之争，引发了两者在质量评定、市场流通、临床应用等方面的一系列问题。因此，两者的鉴别工作尤为重要。

目前，鉴别金银花和山银花的方法有性状鉴别，显微鉴别、薄层鉴别和液相含量的鉴别。

1.性状鉴别：

《中国药典》2015版中，金银花的性状鉴别为：本品呈棒状，上粗下细，略弯曲，长2～3cm，上部直径约3mm，下部直径约1.5mm；表面黄白色或绿白色(贮久色渐深)，密被短柔毛，偶见叶状苞片，花萼绿色，先端5裂，裂片有毛，长约2mm；开放者花冠筒状，先端二唇形；雄蕊5，附于筒壁，黄色；雌蕊1，子房无毛；气清香，味淡、微苦。

山银花的性状鉴别为：(1)灰毡毛忍冬呈棒状而稍弯曲，长3～4.5cm，上部直径约2mm，下部直径约1mm；表面黄色或黄绿色；总花梗集结成簇，开放者花冠裂片不及全长之半；质稍硬，手捏之稍有弹性；气清香，味微苦甘。(2)红腺忍冬长2.5～4.5cm，直径0.8～2mm；表面黄白至黄棕色，无毛或疏被毛，萼筒无毛，先端5裂，裂片长三角形，被毛，开放者花冠下唇反转，花柱无毛。(3)华南忍冬长1.6～3.5cm，直径0.5～2mm；萼筒和花冠密被灰白色毛。(4)黄褐毛忍冬长1～3.4cm，直径1.5～2mm；花冠表面淡黄棕色或黄棕色，密被黄色茸毛。

2.显微鉴别

《中国药典》2015版中，金银花的显微鉴别为：本品粉末浅黄棕色或黄绿色；腺毛较多，头部倒圆锥形、类圆形或略扁圆形，4～33细胞，成2～4层，直径30～64～108pm，柄部1～5细胞，长可达70pm。非腺毛有两种：一种为厚壁非腺毛，单细胞，长可达90pm，表面有微细疣状或泡状突起，有的具螺纹；另一种为薄壁非腺毛，单细胞，甚长，弯曲或皱缩，表面有微细疣状突起。草酸钙簇晶直径6～45pm。花粉粒类圆形或三角形，表面具细密短剌及细颗粒状雕纹，具3孔沟。

山银花的显微鉴别为：(1)灰毡毛忍冬腺毛较少，头部大多圆盘形，顶端平坦或微凹，侧面观5～16细胞，直径37～228pm；柄部2～5细胞，与头部相接处常为2(～3)细胞并列，长32～240pm，直径15～51pm。厚壁非腺毛较多，单细胞，似角状，多数甚短，长21～240(～315)pm，表面微具疣状突起，有的可见螺纹，呈短角状者体部胞腔不明显；基部稍扩大，似三角状。草酸钙簇晶，偶见。花粉粒，直径54～82pm。(2)红腺忍冬腺毛极多，头部盾形而大，顶面观8～40细胞，侧面观7～10细胞；柄部1～4细胞，极短，长5～56pm。厚壁非腺毛长短悬殊，长38～1408μm,表面具细密疣状突起，有的胞腔内含草酸钙结晶。(3)华南忍冬腺毛较多，头部倒圆锥形或盘形，侧面观20～60～100细胞；柄部2～4细胞，长50～176(～248)μm。厚壁非腺毛，单细胞，长32～623(～848)μm，表面有微细疣状突起，有的具螺纹，边缘有波状角质***。(4)黄褐毛忍冬腺毛有两种类型：一种较长大，头部倒圆锥形或倒卵形，侧面观12～25细胞，柄部微弯曲，3～5(～6)细胞，长88～470μm；另一种较短小，头部顶面观4～10细胞，柄部2～5细胞，长24～130(～190)μm。厚壁非腺毛平直或稍弯曲，长33～200μm，表面疣状突起较稀，有的具菲薄横隔。

3.薄层鉴别

《中国药典》2015版中，金银花的薄层鉴别为：取本品粉末0.2g，加甲醇5ml，放置12小时，过滤，取滤液作为供试品溶液；另取绿原酸对照品，加甲醇制成每lml含lmg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取供试品溶液10～20μl、对照品溶液10μl，分别点于同一硅胶H薄层板上，以乙酸丁酯-甲酸-水(体积比7∶2.5∶2.5)的上层溶液为展开剂，展开、取出、晾干，置于紫外光灯(365nm光照)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

山银花的薄层鉴别为：取本品粉末0.2g，加甲醇5ml，放置12小时，过滤，取滤液作为供试品溶液；另取绿原酸对照品，加甲醇制成每lml含1mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取供试品溶液10～20μl、对照品溶液10μl，分别点于同一硅胶H薄层板上，以乙酸丁酯-甲酸-水(体积比7∶2.5∶2.5)的上层溶液为展开剂，展开、取出、晾干，置于紫外光灯(365nm光照)下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。

4.液相鉴别

《中国药典》2015版中，金银花中含绿原酸不得少于1.5％，含木犀草苷不得少于0.05％；山银花中含绿原酸不得少于2.0％，含灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙的总量不得少于5.0％。其他研究学者也用液相法对金银花和山银花中的化学成分有建立指纹图谱的比较，如路俊仙等的《金银花和灰毡毛忍冬多成分定性的指纹图谱比较》。

因山银花与金银花同属忍冬科植物，两者在性状及显微特征等方面存在许多相似之处，因此，从性状和显微上很难对其进行区分。而药典中金银花和山银花的薄层鉴别方法是一样的，经过实验对比发现，通过药典中记载的薄层鉴别方法并不能很好的对金银花和山银花做出区分。同时，液相鉴别的成本高，时间长，不利于快速鉴别，并非最佳鉴别方法。

因此，寻求一种可靠、低成本、简便且高效鉴别金银花和山银花的方法迫在眉睫。

发明内容

本发明的目的在于解决背景技术中四种鉴别金银花和山银花方法中所存在的可靠性低、成本高、时间长的不足之处，而提供了一种新的鉴别金银花和山银花的方法。

为实现上述目的，本发明的构思是：

在上述四种鉴别方法中，性状鉴别以及显微镜鉴别均属于物理鉴别，对于经验丰富的人来说操作性较强，而对于经验尚浅的人来说适用性并不强，只能慢慢积累经验；液相鉴别却因成本高、时间长一般不会作为鉴别两者的首选方法；反而薄层鉴别方法具有成本低、操作简单、快速、图谱信息丰富等优点，更受鉴别操作人员青睐。因此，本发明考虑从薄层鉴别方法作为突破口，建立一种快速鉴别金银花和山银花的检测方法。本发明结合金银花和山银花的异和同，分析两者在薄层上各自特有的薄层斑点，发现金银花和山银花在皂苷类成分上有区别的特点，其中，金银花具有木樨草苷特有的斑点，而山银花具有灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙特有的斑点，通过各自特有的斑点便可将两者很好的区分开来。

本发明所提供的技术解决方案是：

一种快速鉴别金银花和山银花的薄层检测方法，其特殊之处在于，包括以下步骤：

1)制备对照品溶液和样品溶液

1.1)分别取适量的绿原酸、木樨草苷、灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙，并分别加甲醇溶解制成0.8～2mg/ml的对照品溶液；

1.2)分别取适量的金银花和山银花原料样品，粉碎后过筛，置于可密封的试验容器中；

1.3)向所述试验容器中加入所述原料样品质量5～10倍量、质量浓度为70％～95％的乙醇，并进行超声处理30～60分钟，取出试验容器后放至室温；

1.4)对步骤1.3)经超声处理后的样品进行微孔滤膜过滤，收集滤液作为样品溶液；

2)薄层点样

将步骤1)中制备好的样品溶液和对照品溶液依次分别点于同一硅胶G薄层板上同一高度的不同位置上形成点样原点；

3)制备展开剂

3.1)取乙酸乙酯、甲醇、水和甲酸，以10∶3∶1∶0.5的体积比混合，得到展开剂，此处乙酸乙酯、甲醇和甲酸均为纯品；

3.2)将展开剂置于展开缸中，密封展开缸，预饱和15～20分钟；

4)展开

将步骤3)预饱和后的展开缸打开，迅速将步骤2)点样后的硅胶G薄层板放入展开缸中，放入的硅胶G薄层板应斜靠在展开缸中，且展开缸中的展开剂不能没过点样原点；当展开剂的前沿上行至硅胶G薄层板上边缘，距离点样原点6cm～15cm时，将硅胶G薄层板取出；

5)显色与检视

5.1)吹干步骤4)展开好的硅胶G薄层板上的试剂后，喷以天然显色剂，在105℃下加热2～4分钟，放至室温后在白光下检视，金银花有明显的木樨草苷的斑点，而山银花木樨草苷的斑点颜色很浅；

5.2)再向硅胶G薄层板喷以质量浓度为5％～10％的硫酸乙醇溶液，并在105℃下加热3～5分钟，放至室温后分别在紫外365nm光照下和白光下检视，山银花有明显的灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙的斑点，而金银花没有这两个斑点。

进一步地，为了得到较好的展开图，所述对照品溶液的浓度为1mg/ml，若浓度太低则颜色不清晰，若浓度太高则无法得到较好的分离效果。

进一步地，步骤1.2)中，将金银花和山银花原料样品，粉碎后过80目筛，置于带塞的三角瓶中。

进一步地，步骤1.3)中，向所述试验容器中加入所述原料样品质量6～8倍量、质量浓度为80％的乙醇，并进行超声处理60分钟，取出试验容器后放至室温，采用此条件处理的原料样品，在后续展开中能够形成特征分明的展开图。

进一步地，步骤2)中，所述样品溶液和对照品溶液的点样位置距离硅胶G薄层板下边缘的距离为1.0～1.5cm，能够在完成展开步骤时，有效地利用薄层板。

进一步地，步骤3.2)中，为了使展开剂在展开缸中更好的达到平衡，从而减少硅胶G薄层板的边缘效应，所述展开缸采用双槽展开缸，双槽展开缸的大小可以为10×10cm、20×10cm或10×20cm，且双槽中的展开剂剂量保持一致，并预饱和15分钟。

进一步地，步骤4)中，当展开剂的前沿上行至硅胶G薄层板上边缘，距离点样原点8cm～10cm时，将硅胶G薄层板取出。

进一步地，步骤5.1)中，所述天然显色剂为10g/L的二苯硼酸-2-氨基乙酯甲醇溶液或者50g/L的聚乙二醇4000甲醇溶液。

进一步地，步骤5.2)中，为了使显色效果更好，所述硫酸乙醇溶液的质量浓度为10％。

进一步地，所述步骤5)中，采用吹风机将硅胶G薄层板上的试剂吹干；采用电加热板对硅胶G薄层板进行加热；且喷天然显色剂时的加热时间较喷硫酸乙醇溶液时的加热时间短1分钟。

本发明中样品溶液、对照品溶液、展开剂的配制顺序可根据实际检测情况进行调整。

本发明的优点是：

1.采用此种薄层检测方法简单、快速、灵敏度高、专属性强，对金银花和山银花的对比明显，结果直观，易于辨认和区分，为确保区分金银花和山银花提供了可靠的鉴别方法。

2.本发明选用金银花和山银花特有的代表成分对来两者进行鉴别，斑点清晰，结果判断直观准确。

3.本发明选用适量的乙醇直接对原料样品进行超声处理，过滤，滤液作为检测溶液，样品前处理非常简单。

4.本发明采用乙酸乙酯、甲醇、水和甲酸以10∶3∶1∶0.5的体积比进行混合，得到展开剂，斑点分离效果好，各样品特征斑点突出，且没有斑点拖尾和斑点扩散现象，结果对比明显，容易判断。

5.本发明选择在薄层板展开距离为8～10cm时取出薄层板，此时斑点分离度效果好，斑点没有重合现象。

6.本发明先采用天然显色剂显色，在天然显色剂的基础上再用质量浓度为5％～10％的硫酸乙醇进行显色，叠加使用显色剂，多方面多角度对比，使各样品特征斑点突出，信息全面，使金银花和山银花更易于识别和辨认。

附图说明

图1为实施例一中仅使用天然显色剂显色，并在白光下进行检视的视图；

图2为实施例一中使用天然显色剂和硫酸乙醇显色，并在紫外365nm光照下进行检视的视图；

图3为实施例一中使用天然显色剂和硫酸乙醇显色，并在白光下进行检视的视图；

图4为采用2015版《中国药典》中记载的薄层鉴别方法进行检视的视图。

图5为实施例二中仅使用天然显色剂显色，并在白光下进行检视的视图；

图6为实施例二中使用天然显色剂和硫酸乙醇显色，并在紫外365nm光照下进行检视的视图；

图7为实施例二中使用天然显色剂和硫酸乙醇显色，并在白光下进行检视的视图；

图8为实施例三中仅使用天然显色剂显色，并在白光下进行检视的视图；

图9为实施例三中使用天然显色剂和硫酸乙醇显色，并在紫外365nm光照下进行检视的视图；

图10为实施例三中使用天然显色剂和硫酸乙醇显色，并在白光下进行检视的视图；

图11为实施例四中仅使用天然显色剂显色，并在白光下进行检视的视图；

图12为实施例四中使用天然显色剂和硫酸乙醇显色，并在紫外365nm光照下进行检视的视图；

图13为实施例四中使用天然显色剂硫酸乙醇显色，并在白光下进行检视的视图；

图14为实施例五中仅使用天然显色剂显色，并在白光下进行检视的视图；

图15为实施例五中使用天然显色剂和硫酸乙醇显色，并在紫外365nm光照下进行检视的视图；

图16为实施例五中使用天然显色剂硫酸乙醇显色，并在白光下进行检视的视图。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明的内容作进一步的详细描述：

实施例一

一种快速鉴别金银花和山银花的薄层检测方法，包括以下步骤：

1)制备对照品溶液和样品溶液

1.1)取适量绿原酸、木樨草苷、灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙适量，加甲醇溶解制成浓度为1mg/ml的对照品溶液，依次编号为1号、2号、3号、4号。

1.2)分别取适量的金银花(包括金银花对照药材和金银花检测样品)和山银花(包括山银花对照药材和山银花检测样品)，粉碎后过80目筛，置于戴塞的三角瓶中，共四组，并进行编号：5号为金银花对照药材、6号为山银花对照药材、7号为山银花检测样品、8号为金银花检测样品；其中，金银花对照药材编号#2747(来源：AHP；拉丁名：Lonicera japonica)；山银花对照药材编号121595-201202(来源：中国食品药品检定研究院)；

1.3)向步骤1.2)的四组三角瓶中分别加入瓶中样品质量6倍量、质量浓度为80％的乙醇，并进行超声处理60分钟，取出三角瓶后放至室温；

1.4)对步骤1.3)经超声处理后的样品进行微孔滤膜过滤，收集滤液作为样品溶液；

2)薄层点样

将步骤1)中制备好的样品溶液和对照品溶液按编号依次点于同一硅胶G薄层板上同一高度的不同位置上形成8个点样原点，且点样原点距离硅胶G薄层板下边缘的距离为1cm；

3)制备展开剂

3.1)取乙酸乙酯、甲醇、水和甲酸，以10∶3∶1∶0.5的体积比混合，制备20ml的展开剂；

3.2)将展开剂置于10×10cm规格的双槽展开缸中，并使双槽中的展开剂剂量保持一致；然后密封展开缸，预饱和15分钟；

4)展开

将步骤3)预饱和后的展开缸打开，迅速将步骤2)中的硅胶G薄层板放入展开缸中，放入的硅胶G薄层板应斜靠在展开缸中，且展开缸中的展开剂不能没过点样原点；当展开剂的前沿上行至硅胶G薄层板上边缘，距离点样原点8cm时，将硅胶G薄层板取出；

5)显色与检视

5.1)用吹风机吹干步骤4)展开好的硅胶G薄层板上的试剂后，喷以天然显色剂，置于电加热板上，在105℃下加热3分钟，放至室温后在白光下检视，得到图1中的视图；该天然显色剂可选用10g/L的二苯硼酸-2-氨基乙酯甲醇溶液或者50g/L的聚乙二醇4000甲醇溶液。

5.2)再向薄层板喷以质量浓度为10％的硫酸乙醇溶液，同样，置于电加热板上，并在105℃下加热4分钟，放至室温后分别在紫外365nm光照下和白光下检视，得到图2和图3中的视图。

6)对比鉴别

a)在硅胶G薄层板上，绿原酸是金银花和山银花都有的共同斑点，比如图4，我司为验证《中国药典》2015版中记载的金银花和山银花的薄层鉴定方法所进行实验验证，证明依照《中国药典》2015版中记载的方法是不能区分山银花和金银花。木樨草苷是金银花特有的斑点，灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙是山银花的特征斑点。有明显木樨草苷斑点的我们就可以判定其为金银花。有明显灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙斑点的我们就可以判定其为山银花。

b)在硅胶G薄层板上，喷以天然显色剂后，在白光下，Rf＝0.8附近，金银花有明显的橘红色的木樨草苷的斑点，而山银花木樨草苷的斑点几乎没有(因为山银花中也含有木樨草苷，但含量较金银花中木樨草苷的含量少很多，所以颜色很浅，与金银花很容易区分辨别)，如图1所示，因此，5号样品和8样品为金银花，6号和7号样品为山银花，与实际点样结果相符。

c)在硅胶G薄层板上，再喷以质量浓度为10％的硫酸乙醇后，在紫外365nm光照下，在Rf＝0.8附近，金银花有明显的嫩绿色的木樨草苷的斑点，而山银花木樨草苷的斑点几乎没有。与此同时，在Rf＝0.25和0.1附近，山银花有明显的绿色灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙的斑点，而金银花没有这两个斑点(因金银花中不含灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙)，如图2所示，因此，5号样品和8样品为金银花，6号和7号样品为山银花，与实际点样结果相符。

d)在硅胶G薄层板上，再喷以质量浓度为10％的硫酸乙醇后，在日光下，在Rf＝0.25和0.1附近，山银花有明显的棕色灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙的斑点，而金银花没有这两个斑点。如图3所示，因此，5号样品和8样品为金银花，6号和7号样品为山银花，与实际点样结果相符。

通过b)、c)、d)进一步地验证了本发明鉴别方法的可靠性。

实施例二

与实施例一的区别在于：

1.1)分别取适量的绿原酸、木樨草苷、灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙，并分别加甲醇溶解制成0.8mg/ml的对照品溶液；

步骤1.3)中，向步骤1.2)的四组三角瓶中分别加入瓶中样品质量8倍量、质量浓度为70％的乙醇，并进行超声处理45分钟，取出三角瓶后放至室温；

步骤2)中，点样原点距离硅胶G薄层板下边缘的距离为1.5cm；

步骤3)中，双槽展开钢的规格为10×20cm；并将展开剂在展开缸中预饱和20分钟；

步骤4)中，当展开剂的前沿上行至硅胶G薄层板上边缘，距离点样原点6cm时，将硅胶G薄层板取出；

步骤5.1)中，喷以天然显色剂后，置于电加热板上，在105℃下加热2分钟，放至室温后在白光下检视；

步骤5.2)中，再向薄层板喷以质量浓度为6％的硫酸乙醇溶液，同样，置于电加热板上，并在105℃下加热3分钟，放至室温后分别在紫外365nm光照下和白光下检视。

实施例三

与实施例一的区别在于：

1.1)分别取适量的绿原酸、木樨草苷、灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙，并分别加甲醇溶解制成2mg/ml的对照品溶液；

步骤1.3)中，向步骤1.2)的四组三角瓶中分别加入瓶中样品质量10倍量、质量浓度为95％的乙醇，并进行超声处理30分钟，取出三角瓶后放至室温；

步骤2)中，点样原点距离硅胶G薄层板下边缘的距离为1.2cm；

步骤4)中，当展开剂的前沿上行至硅胶G薄层板上边缘，距离点样原点15cm时，将硅胶G薄层板取出；

步骤5.1)中，喷以天然显色剂后，置于电加热板上，在105℃下加热4分钟，放至室温后在白光下检视；

步骤5.2)中，再向薄层板喷以质量浓度为5％的硫酸乙醇溶液，同样，置于电加热板上，并在105℃下加热5分钟，放至室温后分别在紫外365nm光照下和白光下检视。

实施例四

与实施例一的区别在于：

1.1)分别取适量的绿原酸、木樨草苷、灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙，并分别加甲醇溶解制成1.5mg/ml的对照品溶液；

步骤1.3)中，向步骤1.2)的四组三角瓶中分别加入瓶中样品质量5倍量、质量浓度为90％的乙醇，并进行超声处理55分钟，取出三角瓶后放至室温；

步骤2)中，点样原点距离硅胶G薄层板下边缘的距离为1.3cm；

步骤3)中，双槽展开缸的规格为20×10cm；并将展开剂在展开缸中预饱和18分钟；

步骤4)中，当展开剂的前沿上行至硅胶G薄层板上边缘，距离点样原点10cm时，将硅胶G薄层板取出。

实施例五

与实施例一的区别在于：

1.1)分别取适量的绿原酸、木樨草苷、灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙，并分别加甲醇溶解制成1.3mg/ml的对照品溶液；

步骤1.3)中，向步骤1.2)的四组三角瓶中分别加入瓶中样品质量7倍量、质量浓度为75％的乙醇，并进行超声处理40分钟，取出三角瓶后放至室温；

步骤2)中，点样原点距离硅胶G薄层板下边缘的距离为1.1cm；

步骤3)中，双槽展开缸的规格为20×10cm；并将展开剂在展开缸中预饱和17分钟；

步骤4)中，当展开剂的前沿上行至硅胶G薄层板上边缘，距离点样原点9cm时，将硅胶G薄层板取出；

步骤5.1)中，喷以天然显色剂后，置于电加热板上，在105℃下加热2分钟，放至室温后在白光下检视；

步骤5.2)中，再向薄层板喷以质量浓度为8％的硫酸乙醇溶液，同样，置于电加热板上，并在105℃下加热3分钟，放至室温后分别在紫外365nm光照下和白光下检视。

同样，采用实施例二-实施例五的检测条件并进行检视，可得到与实施例一相类似的检测视图，具体参见图5～图16，均能显示出金银花和山银花特有的特征斑点，协助人员鉴别金银花和山银花，对比明显，结果直观，在此不再赘述。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明公开的技术范围内，可轻易想到各种等效的修改或替换，这些修改或替换都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种快速鉴别金银花和山银花的薄层检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)制备对照品溶液和样品溶液

1.1)分别取适量的绿原酸、木樨草苷、灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙，并分别加入甲醇溶解制成浓度为0.8～2mg/ml的对照品溶液；

1.2)分别取适量的金银花和山银花原料样品，粉碎后过筛，置于可密封的试验容器中；

1.3)向所述试验容器中加入所述原料样品质量5～10倍量、质量浓度为70％～95％的乙醇，并进行超声处理30～60分钟，取出试验容器后放至室温；

1.4)对步骤1.3)经超声处理后的样品进行微孔滤膜过滤，收集滤液作为样品溶液；

2)薄层点样

将步骤1)中制备好的样品溶液和对照品溶液依次分别点于同一硅胶G薄层板上同一高度的不同位置上形成点样原点；

3)制备展开剂

3.1)取乙酸乙酯、甲醇、水和甲酸，以10∶3∶1∶0.5的体积比混合，得到展开剂；

3.2)将展开剂置于展开缸中，密封展开缸，预饱和15～20分钟；

4)展开

将步骤3)预饱和后的展开缸打开，迅速将步骤2)点样后的硅胶G薄层板放入展开缸中，且展开缸中的展开剂不能没过点样原点；当展开剂的前沿上行至硅胶G薄层板上边缘，距离点样原点6cm～15cm时，将硅胶G薄层板取出；

5)显色与检视

5.1)吹干步骤4)展开好的硅胶G薄层板上的试剂后，喷以天然显色剂，在105℃下加热2～4分钟，放至室温后在白光下检视，金银花有明显的木樨草苷的斑点，而山银花木樨草苷的斑点颜色很浅；

5.2)再向硅胶G薄层板喷以质量浓度为5％～10％的硫酸乙醇溶液，并在105℃下加热3～5分钟，放至室温后分别在紫外365nm光照下和白光下检视，山银花有明显的灰毡毛忍冬皂苷乙和川续断皂苷乙的斑点，而金银花没有这两个斑点。

2.根据权利要求1所述的快速鉴别金银花和山银花的薄层检测方法，其特征在于：

步骤1.1)中，所述对照品溶液的浓度为1mg/ml。

3.根据权利要求2所述的快速鉴别金银花和山银花的薄层检测方法，其特征在于：

步骤1.2)中，将金银花和山银花原料样品，粉碎后过80目筛，置于带塞的三角瓶中。

4.根据权利要求3所述的快速鉴别金银花和山银花的薄层检测方法，其特征在于：

步骤1.3)中，向所述带塞的三角瓶中加入所述原料样品质量6～8倍量、质量浓度为80％的乙醇，并进行超声处理60分钟，取出三角瓶后放至室温。

5.根据权利要求4所述的快速鉴别金银花和山银花的薄层检测方法，其特征在于：

步骤2)中，所述样品溶液和对照品溶液的点样位置距离硅胶G薄层板下边缘的距离为1.0～1.5cm。

6.根据权利要求5所述的快速鉴别金银花和山银花的薄层检测方法，其特征在于：

步骤3.2)中，所述展开缸采用双槽展开缸，双槽展开缸的大小为10×10cm、20×10cm或10×20cm，且双槽中的展开剂剂量保持一致，并预饱和15分钟。

7.根据权利要求6所述的快速鉴别金银花和山银花的薄层检测方法，其特征在于：

步骤4)中，当展开剂的前沿上行至硅胶G薄层板上边缘，距离点样原点8cm～10cm时，将硅胶G薄层板取出。

8.根据权利要求7所述的快速鉴别金银花和山银花的薄层检测方法，其特征在于：

步骤5.1)中，所述天然显色剂为10g/L的二苯硼酸-2-氨基乙酯甲醇溶液或者50g/L的聚乙二醇4000甲醇溶液。

9.根据权利要求8所述的快速鉴别金银花和山银花的薄层检测方法，其特征在于：

步骤5.2)中，所述硫酸乙醇溶液的质量浓度为10％。

10.根据权利要求9所述的快速鉴别金银花和山银花的薄层检测方法，其特征在于：

所述步骤5)中，采用吹风机将硅胶G薄层板上的试剂吹干；采用电加热板对硅胶G薄层板进行加热；且喷天然显色剂时的加热时间较喷硫酸乙醇溶液时的加热时间短1分钟。

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