CN110680919A - Cdk4/6抑制剂联合免疫治疗在制备***的药物的用途 - Google Patents

Abstract

本披露中涉及CDK4/6抑制剂联合免疫治疗在制备***的药物的用途。具体而言，提供了式I所示化合物或其可药用盐联合抗PD‑1抗体或其抗原结合片段在制备***如肺癌、黑素瘤、乳腺癌、肝癌、胃癌、肠癌、肾癌的药物中的用途，该方案展现联合用药的协同效应。

Description

CDK4/6抑制剂联合免疫治疗在制备***的药物的用途

技术领域

本披露中涉及一种CDK4/6抑制剂联合免疫治疗在制备***的药物的用途。

背景技术

大量研究发现肿瘤与细胞周期反常相关，大部分肿瘤都存在有丝***信号蛋白的大量突变/抗有丝***信号蛋白缺陷，基因组不稳定性(GIN)和染色体组不稳定性(CIN)，这三种基本的细胞周期缺陷都直接或间接由细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)的失控引起。细胞周期蛋白Cyclin B/CDK1、Cyclin A/CDK2、Cyclin E/CDK2、Cyclin D/CDK4、Cyclin D/CDK6和其它杂二聚物(包括CDK3和CDK7)是细胞周期进展的重要调节剂。目前已公开了一些CDK抑制剂，其中CDK4/6抑制剂有abemaciclib、ribociclib、palbociclib等。W02014183520提供了一种有效的CDK4/6抑制剂，结构如式I所示，WO2016124067公开了前述新的CDK4/6抑制剂的羟乙基磺酸盐，

肿瘤免疫治疗集中在通过激活的效应细胞的过继转移，针对相关抗原的免疫或提供非特异性免疫刺激剂如细胞因子来增强抗肿瘤免疫反应的方法上。开发特异性免疫检查点途径抑制剂已经开始成为一种新的治疗癌症的免疫治疗方法，例如用于治疗晚期黑色素瘤的CTLA抗体Ipilimumab

(Hodi等人，2010)，特异性结合程序性死亡受体(PD-1)nivolumab或pembrolizumab。WO2015085847A也公开了一种新的抗PD-1抗体，正处于临床试验阶段，已经显示出一定的抗肿瘤作用。

近年来，肿瘤免疫治疗取得了突破性进展。多项临床研究表明抗PD-1/PD-L1抗体在黑色素瘤、肾癌、非小细胞肺癌、三阴乳腺癌等多种晚期实体瘤中显示了不俗的疗效，其客观有效率(ORR)在不同实体瘤中约10％-40％，其中在恶性黑色素瘤中最高(约36％-53％)。但是，许多晚期结直肠癌患者单用抗PD-1/PD-L1抗体并未获得良好的疗效，因此找到能与抗PD-1/PD-L1抗体联用并增强其疗效的靶向药物迫在眉睫。

张等人(Nature vol 553,pages 91–95)研究发现，PD-L1蛋白丰度受到细胞周期蛋白D-CDK4激酶以及Cullin 3-SPOP E3连接酶的调节，调节过程属于经典的蛋白酶体介导降解途径。体内研究发现，CDK4/6抑制剂通过阻碍细胞周期蛋白D-CDK4介导speckle型POZ(SPOP)蛋白磷酸化，促进FZR1降解SPOP，增加PD-L1的表达。这篇文章奠定了PD-L1抗体联合CDK4/6抑制剂增强抗肿瘤的免疫治疗的理论基础。

近期，礼来和默沙东公司合作开展了CDK4/6抑制剂玻玛西尼(Abemaciclib)联合特异性结合程序性死亡受体(PD-1)Pembrolizumab治疗乳腺癌和非小细胞肺癌的临床试验(NCT02779751)。

这些研究让科学家们对包括与CDK4/6抑制剂联合施用的免疫治疗领域产生了重大兴趣。

发明内容

本披露中提供一种式I所示化合物或其可药用盐联合抗PD-1抗体或其抗原结合片段在制备***的药物中的用途，

在可选实施方案中，本披露中所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段选自AMP-224、GLS-010、IBI-308、REGN-2810、PDR-001、BGB-A317、Pidilizumab、PF-06801591、Genolimzumab、CA-170、MEDI-0680、JS-001、TSR-042、Camrelizumab、Pembrolizumab、LZM-009、AK-103和Nivolumab。

在一些实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的轻链可变区包含分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；重链可变区包含分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。

其中，前面所述的各CDR序列如下表所示：

优选地，所述PD-1抗体为人源化抗体。

进一步地，优选人源化抗体轻链可变区序列为如SEQ ID NO:10所示的序列或其变体，所述变体优选在轻链可变区有0-10的氨基酸变化，更优选为A43S的氨基酸变化；所述人源化抗体重链可变区序列为如SEQ ID NO:9所示的序列或其变体，所述变体优选在重链可变区有0-10的氨基酸变化，更优选为G44R的氨基酸变化。

前述的人源化抗体重、轻链的可变区序列如下所示：

重链可变区

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYMMSWVRQAPGKGLEWVATISGGGANTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQLYYFDYWGQGTTVTVSS

SEQID NO：9

轻链可变区

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCLASQTIGTWLTWYQQKPGKAPKLLIYTATSLADGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVYSIPWTFGGGTKVEIK

SEQID NO：10在可选实施方案中，所述人源化抗体轻链序列为如SEQ ID NO:8所示的序列或其变体；所述变体优选在轻链可变区有0-10的氨基酸变化，更优选为A43S的氨基酸变化；所述人源化抗体重链序列为如SEQ ID NO:7所示的序列或其变体，所述变体优选在重链可变区有0-10的氨基酸变化，更优选为G44R的氨基酸变化。

在优选实施方案中，所述人源化抗体的轻链序列为如SEQ ID NO:8所示的序列，重链序列为如SEQ ID NO:7所示的序列。

所述人源化抗体重、轻链的序列如下所示：

重链

EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYMMSWVRQAPGKGLEWVATISGGGANTYYPDSVKGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCARQLYYFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

SEQID NO：7

轻链

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCLASQTIGTWLTWYQQKPGKAPKLLIYTATSLADGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQVYSIPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQID NO：8

进一步地，在可选实施方案中，本披露中所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段剂量为0.1～10.0mg/kg，可以为0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、0.6mg/kg、0.7mg/kg、0.8mg/kg、0.9mg/kg、1.0mg/kg、1.2mg/kg、1.4mg/kg、1.6mg/kg、1.8mg/kg、2.0mg/kg、2.2mg/kg、2.4mg/kg、2.6mg/kg、2.8mg/kg、3.0mg/kg、3.2mg/kg、3.4mg/kg、3.6mg/kg、3.8mg/kg、4.0mg/kg、4.2mg/kg、4.4mg/kg、4.6mg/kg、4.8mg/kg、5.0mg/kg、5.2mg/kg、5.4mg/kg、5.6mg/kg、5.8mg/kg、6.0mg/kg、6.2mg/kg、6.4mg/kg、6.6mg/kg、6.8mg/kg、7.0mg/kg、7.2mg/kg、7.4mg/kg、7.6mg/kg、7.8mg/kg、8.0mg/kg、8.2mg/kg、8.4mg/kg、8.6mg/kg、8.8mg/kg、9.0mg/kg、9.2mg/kg、9.4mg/kg、9.6mg/kg、9.8mg/kg、10.0mg/kg。

在另一可选实施方案中，其中所述PD-1抗体或其抗原结合片段剂量为1～600mg，可以为1.0mg、1.2mg、1.4mg、1.6mg、1.8mg、2.0mg、2.2mg、2.4mg、2.6mg、2.8mg、3.0mg、3.2mg、3.4mg、3.6mg、3.8mg、4.0mg、4.2mg、4.4mg、4.6mg、4.8mg、5.0mg、5.2mg、5.4mg、5.6mg、5.8mg、6.0mg、6.2mg、6.4mg、6.6mg、6.8mg、7.0mg、7.2mg、7.4mg、7.6mg、7.8mg、8.0mg、8.2mg、8.4mg、8.6mg、8.8mg、9.0mg、9.2mg、9.4mg、9.6mg、9.8mg、10.0mg、15mg、20mg、25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg、55mg、60mg、65mg、70mg、75mg、80mg、85mg、90mg、95mg、100mg、105mg、110mg、115mg、120mg、125mg、130mg、135mg、140mg、145mg、150mg、155mg、160mg、165mg、170mg、175mg、180mg、185mg、190mg、195mg、200mg、205mg、210mg、215mg、220mg、225mg、230mg、235mg、240mg、245mg、250mg、255mg、260mg、265mg、270mg、275mg、280mg、285mg、290mg、295mg、300mg、305mg、310mg、315mg、320mg、325mg、330mg、335mg、340mg、345mg、350mg、355mg、360mg、365mg、370mg、375mg、380mg、385mg、390mg、395mg、400mg、405mg、410mg、415mg、420mg、425mg、430mg、435mg、440mg、445mg、450mg、455mg、460mg、465mg、470mg、475mg、480mg、485mg、490mg、495mg、500mg、505mg、510mg、515mg、520mg、525mg、530mg、535mg、540mg、545mg、550mg、555mg、560mg、565mg、570mg、575mg、580mg、585mg、590mg、595mg、600mg。

本披露中所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的给药频次为一周一次、二周一次、三周一次、四周一次或一月一次；所述式I所示化合物或其可药用盐给药频次为一日一次、一日二次、一日三次、一周一次、二周一次、三周一次、四周一次或一月一次。

本披露中所述联合式I所示化合物或其可药用盐与抗PD-1抗体或其抗原结合片段具有协同药效作用。

在可选实施方案中，本披露中所述式I所示化合物或其可药用盐剂量选自5mg、10mg、15mg、20mg、25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg、55mg、60mg、65mg、70mg、75mg、80mg、85mg、90mg、95mg、100mg、125mg、150mg、175mg、200mg、250mg、300mg、350mg、400mg、450mg、500mg、550mg、600mg、650mg、700mg、750mg、800mg、850mg、900mg、950mg、1000mg。

进一步地，在可选实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段剂量1～600mg，所述所述式I所示化合物或其可药用盐剂量为20～500mg。

在可选实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段剂量1～600mg，每1～4周一次；所述所述式I所示化合物或其可药用盐剂量为20～500mg，一日一次。

在可选实施方案中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段剂量200mg；所述式I所示化合物或其可药用盐为20～500mg。

本披露中所述给药途径可以为经口给药、胃肠外给药、经皮给药，所述胃肠外给药包括但不限于静脉注射、皮下注射、肌肉注射。

在可选实施方案中，所述PD-1抗体或其抗原结合片段以注射的方式给药，例如皮下或静脉注射，注射前需将PD-1抗体或其抗原结合片段配制成可注射的形式。特别优选的PD-1抗体或其抗原结合片段的可注射形式是注射液或冻干粉针，例如PD-1抗体的可注射形式，其包含PD-1抗体、缓冲剂、稳定剂，任选地还含有表面活性剂。缓冲剂可选自醋酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、以及磷酸盐中的一种或几种。稳定剂可选自糖或氨基酸，优选二糖，例如蔗糖、乳糖、海藻糖、麦芽糖。表面活性剂选自聚氧乙烯氢化蓖麻油、甘油脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯，优选所述聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯为聚山梨酯20、40、60或80，最优选聚山梨酯20。

本披露中所述药物的可药用盐可以是盐酸盐、磷酸盐、磷酸氢盐、硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸盐、乙酸盐、草酸盐、丙二酸盐、戊酸盐、谷氨酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、月桂酸盐、硼酸盐、对甲苯磺酸盐、甲磺酸盐、羟乙基磺酸盐、马来酸盐。苹果酸盐、酒石酸盐、苯甲酸盐、双羟萘酸盐、水杨酸盐、香草酸盐、扁桃酸盐、琥珀酸盐、葡萄糖酸盐、乳糖酸盐或月桂基磺酸盐等。

在一些实施方案中，所述式I所示化合物的可药用盐选自羟乙基磺酸盐。

在一些实施方案中，所述式I所示化合物的羟乙基磺酸盐与所述PD-1抗体或其抗原结合片段联合给药，从而增强了抗肿瘤活性，以及改善了肿瘤疾病的治疗效果。

进一步地，在可选实施方案中，本披露中所述肿瘤患者曾接受过肿瘤治疗，所述肿瘤治疗选自化疗、免疫治疗、外科手术、放射治疗或疫苗中的一种或多种，优选自化疗。

在一些实施方案中，所述肿瘤患者的靶病灶直径相对减少了至少30％。

在一些实施方案中，所述肿瘤患者的靶病灶直径相对增加了至少20％或出现一个或多个新病灶。

在一些实施方案中，所述肿瘤患者的靶病灶直径相对增加了至多20％或靶向病灶直径相对减少了至多30％。

进一步地，所述肿瘤患者为治疗失败。

本披露中所述化疗是指施用用于***的化合物治疗，所述***的化合物选自但不限于烷化剂，如噻替派、环磷酰胺、异环磷酰胺；烷基磺酸盐类，如白消安、英丙舒凡及哌泊舒凡；氮丙啶类，如苯唑多巴、卡巴醌、meturedopa及uredopa；甲基密胺类，包括altretamine、triethylenemelamine、trietylenephosphoramide、三伸乙基硫代磷酰胺(triethiylenethiophosphoramide)及三甲密胺(trimethylolomelamine)；β-拉帕酮(beta-lapachone)；喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物拓朴替康(topotecan)、CPT-11(伊诺替康(irinotecan)、乙酰基喜树碱(acetylcamptothecin)、斯考普莱叮(scopolectin)及9-胺基喜树碱)；苔藓虫素(bryostatin)；卡利斯塔叮(callystatin)；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)；氮芥类，如苯丁酸氮芥、萘氮芥(chlomaphazine)、雌氮芥(estramustine)；抗癌代谢物，诸如甲胺蝶呤及5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)(5-FU)；叶酸类似物，诸如傣诺特呤(denopterin)、甲胺蝶呤、蝶罗呤(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；雄性激素，诸如二***(calusterone)、环硫雄醇(epitiostanol)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺剂，诸如胺基苯乙哌啶酮(aminoglutethimide)；二氟甲基鸟胺酸(difluoromethylornithine)(DMFO)；类视色素类，诸如视黄酸(retinoic acid)；卡培他滨(capecitabine)；PARP抑制剂，例如奥拉帕尼、氟唑帕利；VEGFR-2抑制剂，如Foretinib、他菲替尼(Tafetinib)中的至少一种或其可药用盐、酸或衍生物。

本披露中所述的方案，所述的联合任选的还包含其他组分，所述其他组分包括但不限于其他抗肿瘤药等。

本披露中还提供了一种***的方法，包括：向肿瘤患者施用有效剂量的抗PD-1抗体或其抗原结合片段和式I所示化合物或其可药用盐。

进一步地，所述肿患者还曾接受过肿瘤治疗，优选自化疗。

在可选实施方案中，所述肿瘤患者的靶病灶直径相对增加了至少20％或出现一个或多个新病灶。

在可选实施方案中，所述肿瘤患者的靶病灶直径相对减少了至少30％。

在可选实施方案中，所述肿瘤患者的靶病灶直径相对增加了至多20％或靶向病灶直径相对减少了至多30％。

优选地，所述肿瘤患者为治疗失败。

本披露中所述肿瘤选自肺癌(如，非小细胞肺癌(NSCLC)，NSCLC包括鳞癌，腺癌(如大细胞癌)和支气管肺泡癌)、黑素瘤(如晚期黑素瘤)、乳腺癌、肝癌(如肝细胞癌)、胃癌、肠癌(如晚期结直肠癌)、肾癌(如，肾细胞癌)，优选自非小细胞肺癌、晚期结直肠癌、肝细胞癌、晚期黑素瘤、转移性肾细胞癌。

本披露还提供了一种降低抗PD-1抗体或其抗原结合片段、式I所示化合物或其可药用盐所导致的不良反应的方法，包括同步向肿瘤患者施用有效剂量的抗PD-1抗体或其抗原结合片段和式I所示化合物或其可药用盐。

本披露中还提供了一种减少PD-1抗体或其抗原结合片段、式I所示化合物或其可药用盐单独施用剂量的方法，包括同步向肿瘤患者施用有效剂量的抗PD-1抗体或其抗原结合片段和式I所示化合物或其可药用盐。

如无相反解释，本披露中中术语具有如下含义：

本披露中所述“人源化抗体(humanized antibody)”，也称为CDR移植抗体(CDR-grafted antibody)，是指将小鼠的CDR序列移植到人的抗体可变区框架，即不同类型的人种系抗体构架序列中产生的抗体。可以克服嵌合抗体由于携带大量小鼠蛋白成分，从而诱导的强烈的抗体可变抗体反应。此类构架序列可以从包括种系抗体基因序列的公共DNA数据库或公开的参考文献获得。如人重链和轻链可变区基因的种系DNA序列可以在“VBase”人种系序列数据库(在因特网www.mrccpe.com.ac.uk/vbase可获得)，以及在Kabat，E.A.等人，1991Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版中找到。在本披露中一个优选的实施方案中，所述的PD-1人源化抗体的CDR序列选自SEQ ID NO:1，2，3，4，5，6。

本披露中所述“抗原结合片段”，指具有抗原结合活性的Fab片段，Fab‘片段，F(ab’)2片段，以及与人PD-1结合的Fv片段sFv片段；包含本披露中所述抗体的选自SEQ IDNO:1至SEQ ID NO:6中的一个或多个CDR区。Fv片段含有抗体重链可变区和轻链可变区，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般地，Fv抗体还包含在VH和VL结构域之间的多肽接头，且能够形成抗原结合所需的结构。也可以用不同的连接物将两个抗体可变区连接成一条多肽链，称为单链抗体(single chain antibody)或单链Fv(sFv)。本披露中的术语“与PD-1结合”，指能与人PD-1相互作用。本披露中的术语“抗原结合位点”指抗原上不连续的，由本披露中抗体或抗原结合片段识别的三维空间位点。

本披露中所述“免疫疗法”指免疫疗法是利用免疫***来治疗疾病，在本披露中中主要指通过提高肿瘤细胞的免疫原性和对效应细胞杀伤的敏感性，激发和增强机体抗肿瘤免疫应答，并应用免疫细胞和效应分子输注宿主体内，协同机体免疫***杀伤肿瘤、抑制肿瘤生长。

本披露关于“联合”是一种给药方式，是指在一定时间期限内给予至少一种剂量的CDK4/6抑制剂式I化合物或其可药用盐和至少一种剂量的PD-1抗体或其抗原结合片段，其中两种物质都显示药理学作用。所述的时间期限可以是一个给药周期内，优选4周内，3周内，2周内，1周内，或24小时以内，更优选12小时以内。可以同时或依次给予CDK4/6抑制剂式I化合物或其可药用盐和PD-1抗体或其抗原结合片段。这种期限包括这样的治疗，其中通过相同给药途径或不同给药途径给予CDK4/6抑制剂式I化合物或其可药用盐和PD-1抗体或其抗原结合片段。本披露中所述联合的给药方式选自同时给药、独立地配制并共给药或独立地配制并相继给药。

本披露中所述“有效量”包含足以改善或预防医学病症的症状或病症的量。有效量还意指足以允许或促进诊断的量。用于特定患者或兽医学受试者的有效量可依据以下因素而变化：如待治疗的病症、患者的总体健康情况、给药的方法途径和剂量以及副作用严重性。有效量可以是避免显著副作用或毒性作用的最大剂量或给药方案。

本披露中所述“治疗失败”是指受试者在基线时伴有可测量的肿瘤病灶，根据RECIST 1.1疗效评定标准为疾病进展(PD)或不能耐受的。

本披露中所述“不能耐受的”是指因药物引起的不良反应不能继续接受治疗。

总生存期(OS)指从随机期至任何原因导致死亡的期。末次随访时仍存活的受试者，其OS以末次随访时间计为数据删失。失访的受试者，其OS以失访前末次证实存活时间计为数据删失。数据删失的OS定义为从随机分组到删失的时间。

客观缓解率(Objective response rate，ORR)指肿瘤缩小达到一定并且保持一定时间的病人的比例，包含了CR和PR的病例。采用肿瘤缓解评估标准(RECIST1.1标准)来评定肿瘤客观缓解。受试者在基线时必须伴有可测量的肿瘤病灶，疗效评定标准根据RECIST1.1标准分为完全缓解(CR)、部分缓解(PR)、稳定(SD)、进展(PD)。

疾病控制率(Disease Control Rate，DCR)指经确认的完全缓解、部分缓解和疾病稳定(≥8周)病例数在可评价疗效患者中的百分比。

完全缓解(CR)：所有靶病灶消失，全部病理***(包括靶结节和非靶结节)短直径必须减少至＜10mm。

部分缓解(PR)：靶病灶直径之和比基线水平减少至少30％。

疾病进展(PD)：以整个实验研究过程中所有测量的靶病灶直径之和的最小值为参照，直径和相对增加至少20％(如果基线测量值最小就以基线值为参照)；除此之外，必须满足直径和的绝对值增加至少5mm(出现一个或多个新病灶也视为疾病进展)。

疾病稳定(SD)：靶病灶减小的程度没达到PR，增加的程度也没达到PD水平，介于两者之间，研究时可以直径之和的最小值作为参考。

本披露中式I所示化合物的羟乙基磺酸盐可按照WO2016124067所述方法制备，其他所用到设备或试剂均可通过商业途径获得。

附图说明

图1：给药后四组小鼠肿瘤体积变化趋势；

图2：给药后四组小鼠体重变化趋势。

具体实施方式

以下结合实施例用于进一步描述本披露，但这些实施例并非限制本披露的范围。

实施例1：PD-1抗体、CDK抑制剂单用或二者联用对小鼠结肠癌细胞MC-38移植瘤C57人PD-1转基因小鼠的疗效

1、受试抗体和化合物

化合物A(PD-1抗体，重、轻链的序列如本披露中SEQID NO：7和SEQID NO：8，200mg/瓶，配成20mg/mL备用)：用PBS配成0.03mg/mL浓度，腹腔注射体积10mL/kg；

化合物B(式I所示化合物的羟乙基磺酸盐，按照CN201780000891.2公开的方法制备，分子量：572.67，纯度：99.22％)：采用0.05mol/L柠檬酸+0.5％CMC-Na+0.5％Tween 80配制成浓度为3mg/mL的混悬液，灌胃体积为10mL/kg；

对照组给药hIgG4(0.3mg/kg)：13.0mg/mL原液采用PBS稀释至0.03mg/mL后给药，腹腔注射体积为10mL/kg。

2、实验动物

人PD-1转基因C57小鼠，SPF，体重23g～30g，雄性。从南京银河生物医药有限公司购买。

3、试验方法

3.1 C57人PD-1转基因小鼠在实验室环境适应性饲养至少5天。

3.2细胞培养

将鼠结肠癌细胞MC38培养于含10％胎牛血清的RPMI1640培养基中，细胞按照常规使用含有EDTA的胰蛋白酶消化传代，每周传代两次，放置于37℃、5％CO₂培养箱中继续培养。对数生长期的肿瘤细胞将用于进行体内移植瘤模型的建立。3.3肿瘤细胞移植

将PBS重悬的MC38细胞以5×10⁵个/0.1mL浓度，0.1mL/只体积接种于C57BL/6小鼠的右侧胁肋部皮下，当平均肿瘤体积达到100-150mm³时，挑选个体肿瘤体积适中的小鼠，分为4组，每组7只，分组当天开始给药。

3.4给药剂量及方法

化合物A，腹腔注射，BIW×6(每周2次，共给药6次)；

化合物B，口服灌胃，QD×19(每天一次，共给药19次)。具体药物给药方案见表1。

3.5移植瘤体积及小鼠体重测定

每周测量2次瘤体积和体重，记录数据。

3.6数据统计

使用Excel 2010统计软件：平均值以Ave计算；SD值以STDEV计算；SEM值以STDEV/SQRT计算；组间差异P值以TTEST计算。

肿瘤体积(V)计算公式为：V＝1/2×L_长×L_短 ²

相对体积(RTV)＝V_T/V₀

抑瘤率(％)＝(C_RTV-T_RTV)/C_RTV(％)

其中V₀、V_T分别为实验开始时及实验结束时的肿瘤体积。C_RTV、T_RTV分别为实验结束时的空白对照组及实验组的相对肿瘤体积。

4、试验结果

本次实验结果显示，化合物A腹腔注射0.3mg/kg(BIW×6)，第19天时抑瘤率达到37.25％，与对照组相比无统计学差异；化合物B口服灌胃30mg/kg(QD×19)，观察至19天时单用抑瘤率可达到42.16％，与对照组相比有显著性差异(P<0.05)；化合物A(0.3mg/kg)与化合物B(30mg/kg)联用组抑瘤率可达75.68％，与对照组以及化合物B单用组均表现出统计学差异(P<0.05)。综上结果，化合物A(0.3mg/kg)+化合物B(30mg/kg)联用有协同抗肿瘤作用，药效明显优于化合物A、化合物B单用的药效。给药各组小鼠体重正常，显示药物无明显毒副作用。具体数据见表1及图1～2。

表1

实施例2：

入组标准：

入组的受试者为具有经组织学或细胞学确认的晚期和/或转移性结直肠癌患者、晚期(ⅢB/Ⅳ期)非小细胞肺癌；或具有经组织学或细胞学确认的或临床确认的晚期肝癌患者；

或者

入组的受试者为晚期结直肠癌和非小细胞肺癌二线及二线以上治疗失败患者，肝癌一线及一线以上治疗失败患者，既往未经过PD-1抗体或CDK4/6抑制剂治疗。

给药方案：

药物A(PD-1，按照专利申请WO2017054646A中的方法制备)：剂量200mg，静脉注射，2周给药1次，每4周为1个周期；

药物B(式I所示化合物的羟乙基磺酸盐片剂，按照CN107405350A公开的方法制备)：125mg/片，口服，每日1次，每次1次，连续服药，服药3周停药1周，4周为1个周期。

结论：6例有疗效评价受试者中，4例结直肠癌患者表现为疾病稳定(SD)，1例结直肠癌患者表现为疾病进展(PD)，1例肝癌患者表现为疾病进展(PD)，疾病控制率(DiseaseControl Rate，DCR)为66.7％。

序列表

<110> 江苏恒瑞医药股份有限公司

苏州盛迪亚生物医药有限公司

<120> CDK4/6抑制剂联合免疫治疗在制备***的药物的用途

<160> 10

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 5

<212> PRT

<213> 鼠源(Mus musculus)

<400> 1

Ser Tyr Met Met Ser

1 5

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 鼠源(Mus musculus)

<400> 2

Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ala Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 3

<211> 7

<212> PRT

<213> 鼠源(Mus musculus)

<400> 3

Gln Leu Tyr Tyr Phe Asp Tyr

1 5

<210> 4

<211> 11

<212> PRT

<213> 鼠源(Mus musculus)

<400> 4

Leu Ala Ser Gln Thr Ile Gly Thr Trp Leu Thr

1 5 10

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> 鼠源(Mus musculus)

<400> 5

Thr Ala Thr Ser Leu Ala Asp

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> 鼠源(Mus musculus)

<400> 6

Gln Gln Val Tyr Ser Ile Pro Trp Thr

1 5

<210> 7

<211> 443

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(443)

<223> 重链序列

<400> 7

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Met Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ala Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gln Leu Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

115 120 125

Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

130 135 140

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

180 185 190

Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr

195 200 205

Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro

210 215 220

Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro

225 230 235 240

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

245 250 255

Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn

260 265 270

Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg

275 280 285

Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val

290 295 300

Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser

305 310 315 320

Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

325 330 335

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu

340 345 350

Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

355 360 365

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

370 375 380

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

385 390 395 400

Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly

405 410 415

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

420 425 430

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

435 440

<210> 8

<211> 214

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(214)

<223> 轻链序列

<400> 8

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Gln Thr Ile Gly Thr Trp

20 25 30

Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Thr Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Tyr Ser Ile Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 9

<211> 116

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(116)

<223> 重链可变区

<400> 9

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Met Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Thr Ile Ser Gly Gly Gly Ala Asn Thr Tyr Tyr Pro Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gln Leu Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 10

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<221> PEPTIDE

<222> (1)..(10)

<223> 轻链可变区

<400> 10

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Leu Ala Ser Gln Thr Ile Gly Thr Trp

20 25 30

Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Thr Ala Thr Ser Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Tyr Ser Ile Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

Claims (12)

1.式I所示化合物或其可药用盐联合抗PD-1抗体或其抗原结合片段在制备***的药物中的用途，

2.权利要求1所述的用途，其中所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段选自：AMP-224、GLS-010、IBI-308、REGN-2810、PDR-001、BGB-A317、Pidilizumab、PF-06801591、Genolimzumab、CA-170、MEDI-0680、JS-001、TSR-042、Camrelizumab、Pembrolizumab、LZM-009、AK-103和Nivolumab。

3.权利要求1所述的用途，其中所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的轻链可变区包含分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3所述的PD-1抗体的重链可变区包含分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。

4.权利要求3所述的用途，其中所述抗PD-1抗体为人源化抗体。

5.权利要求4所述的用途，其中所述人源化抗体的轻链可变区序列为如SEQ ID NO:10所示的序列或其变体，所述变体优选在轻链可变区有0-10的氨基酸变化，更优选为A43S的氨基酸变化；所述人源化抗体的重链可变区序列为如SEQ ID NO:9所示的序列或其变体，所述变体优选在重链可变区有0-10的氨基酸变化，更优选为G44R的氨基酸变化。

6.权利要求4所述的用途，其中所述人源化抗体的轻链序列为如SEQ ID NO:8所示的序列或其变体，所述变体优选在轻链可变区有0-10的氨基酸变化，更优选为A43S的氨基酸变化；所述人源化抗体的重链序列为如SEQ ID NO:7所示的序列或其变体，所述变体优选在重链可变区有0-10的氨基酸变化，更优选为G44R的氨基酸变化。

7.权利要求6所述的用途，其中所述人源化抗体的轻链序列为如SEQ ID NO:8所示的序列，重链序列为如SEQ ID NO:7所示的序列。

8.权利要求1-7任一项所述的用途，其中所述肿瘤选自肺癌、黑素瘤、乳腺癌、肝癌、胃癌、肠癌、肾癌，优选自非小细胞肺癌、晚期结直肠癌、肝细胞癌、晚期黑素瘤、转移性肾细胞癌。

9.权利要求1-8任一项所述的用途，其中所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段剂量选自0.1～10.0mg/kg。

10.根据权利要求1-9任一项所述的用途，其中所述式I所示化合物或其可药用盐的剂量选自1～1000mg

11.权利要求1-10任一项所述的用途，其中所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段剂量为1～600mg。

12.权利要求1-11任一项所述的用途，其中所述式I所示化合物的可药用盐为羟乙基磺酸盐。

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