CN110669869A - 一种磁珠法核酸提取结合荧光pcr检测血浆eb病毒dna的方法 - Google Patents

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林莺莺
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Abstract

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种磁珠法核酸提取结合荧光PCR检测血浆EB病毒DNA的方法。包括如下步骤：步骤1、核酸提取：对血浆样本利进行磁珠法病毒核酸提取，利用异硫氰酸胍盐将病毒蛋白外壳裂解，释放出病毒核酸，通过对核酸具有吸附功能的磁珠将释放出的病毒核酸及血浆中游离状态的病毒核酸吸附到磁珠表面，通过清洗液洗去未吸附上的杂质进行核酸的纯化，最后用洗脱液将病毒核酸从磁珠上洗脱下来，作为后续PCR模板；步骤2、核酸扩增：利用商业化的病毒核酸定量检测试剂盒，在样本核酸提取纯化后通过PCR体外扩增对病毒DNA进行快速定量检测。本发明通过核酸提取的优化建立起一套具有较高分析灵敏度、可定量溯源，室间可比的血浆样本病毒DNA检测方法。

Description

一种磁珠法核酸提取结合荧光PCR检测血浆EB病毒DNA的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种磁珠法核酸提取结合荧光PCR检测血浆EB病毒DNA的方法。
背景技术
PCR(Polymerase Chain Reaction)即聚合酶链式反应是1986年由Kallis Mullis发现。这项技术已广泛地应用于分子生物学各个领域，它不仅可用于基因分离克隆和核酸序列分析，还可用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病诊断，肿瘤机制探查，法医鉴定等方面。PCR技术已成为方法学上的一次革命，它必将大大推动分子生物学各学科的研究发展。
影响PCR检测结果的因素是多方面的，其中核酸提取纯化步骤是改善优化PCR结果的关键，核酸制备所得的模板质量和纯度的优劣将直接影响后续PCR实验的结果，特别是最低检测下限(LoD)等技术性能。
发明内容
本发明要解决的技术问题，在于提供一种磁珠法核酸提取结合荧光PCR检测血浆EB病毒DNA的方法，具有良好的可靠性，使得检测灵敏度较高、检出限低。
本发明是这样实现的：
本发明提供的一种磁珠法核酸提取结合荧光PCR检测血浆EB病毒DNA的方法，包括如下步骤：
步骤1、核酸提取：对血浆样本利进行磁珠法病毒核酸提取，利用异硫氰酸胍盐将病毒蛋白外壳裂解，释放出病毒核酸，通过对核酸具有吸附功能的磁珠将释放出的病毒核酸及血浆中游离状态的病毒核酸吸附到磁珠表面，通过清洗液洗去未吸附上的杂质进行核酸的纯化，最后用洗脱液将病毒核酸从磁珠上洗脱下来，作为后续PCR模板；
步骤2、核酸扩增：利用商业化的病毒核酸定量检测试剂盒，在样本核酸提取纯化后通过PCR体外扩增对病毒DNA进行快速定量检测；PCR条件：93℃2分钟，93℃45秒→55℃60秒10循环→93℃30秒→55℃45秒30循环；报告基团：FAM，淬灭基团：TAMRA。
优选地，所述步骤1中，核酸提取提取在全自动核酸检测反应体系构建***中进行。
本发明具有如下优点：通过核酸提取的优化建立起一套具有较高分析灵敏度、可定量溯源，室间可比的血浆样本病毒DNA检测方法。
具体实施方式
实施例1以检测EB病毒DNA为例
一种检测血浆EB病毒DNA的方法，包括如下步骤：
1.核酸提取。磁珠法EB病毒核酸提取，原理如下：利用离散剂高浓度异硫氰酸胍盐将EB病毒蛋白外壳裂解，释放出病毒核酸。通过对核酸具有吸附功能的磁珠将释放出的EB病毒核酸及血浆中游离状态的EB病毒核酸吸附到磁珠表面。磁力拌的搅拌保证这一过程充分进行。通过通电与否调节磁力拌磁性，实现磁珠在不同反应孔间的转移，进而带动核酸在不同反应孔的转移。通过清洗液洗去未吸附上的杂质进行核酸的纯化，最后用洗脱液将病毒核酸从磁珠上洗脱下来，作为后续PCR模板。核酸提取使用珀金埃尔默上海浩源生物科技有限公司核酸提取试剂，由PerkinElmer公司Pre-NAT全自动核酸检测反应体系构建***完成试剂、耗材、样本的自动分配、核酸抽提、清洗、洗脱及PCR上样，满盘96份样本全程约2.5小时。参数如下：800微升抽提液+15微升磁珠悬液+400微升血浆进行核酸抽提，800微升清洗液A+800微升清洗液B顺序清洗，60微升洗脱液将得到的核酸洗脱重悬，10微升洗脱液进行后续PCR上样分析。
2.核酸扩增与产物分析。本程序使用中山大学达安基因股份有限公司EB病毒核酸定量检测试剂盒，利用荧光PCR技术，以EBV基因组中相对保守区BamH1W为靶区域，设计特异性引物及荧光探针，配以PCR反应液，耐热DNA聚合酶(Taq酶)、核苷酸单体(dNTPS)等成分，在样本核酸提取纯化后通过PCR体外扩增对EBV DNA进行快速定量检测。通过检测PCR反应过程的荧光信号，利用ABI7500仪器软件***自动绘制出实时扩增曲线，调节阈值线得到样本CT值。同步扩增浓度已知的系列标准品，建立浓度与CT值的函数回归方程(定标曲线)，通过CT值在定标曲线推导得到未知样本的EBV DNA定量值。检测参数如下：40微升反应液(含引物及dNTPS)、3微升Taq酶，10微升上述洗脱液(模板)。PCR条件：93℃2分钟，93℃45秒→55℃60秒(10循环)→93℃30秒→55℃45秒(30循环)；Reporter Dye：FAM，Quencher Dye：TAMRA Data Collection：55℃45秒。
3.核酸提取及扩增综合检测***分析性能评估及初步临床应用评价：
3.1精密度
参照CLSI EP15-A2方案采用血浆样本，每天分析1批，每批3各浓度水平，每一水平重复测定4次，计算变异系数。经评估，低、中、高浓度样本日渐精密度分别为3.1％、2.3％和2.1％。
3.2正确度
通过EBV有证参考物质(GBW(E)090679/090680/069681)检测评估正确度(偏倚在靶值±0.4lg的可接受范围内)。
3.3线性范围
参照CLSI EP6-A方案，取临床高浓度样本用阴性血浆进行系列稀释(1∶101∶1001∶10001∶10000等)，每个浓度样本测定4次，计算线性相关系数和线性范围。经评估，EBV DNA在5.6E+02Copies/mL-2.0E+08Copies/mL程线性。
3.4检测下限
采用EBV中低水平血浆样本进行梯度稀释，每个稀释度样本重复测定10次，计算实测均值，变异系数。以全部检出且CV在20％允许范围内为可接受标准，该稀释度下的浓度水平为检测下限。经评估，检测下限为5.0E+02Copies/mL，较以煮沸裂解核酸提取法的检测下限5.0E+03Copies/mL明显改善。
3.5抗干扰能力
配制不同浓度血红蛋白(Hb)溶液，按1∶10与高、中、低不同浓度EBV DNA定值参考物混合，配制不同分析物浓度不同干扰物浓度的待测样本，每份样本重复测定3次取均值，计算偏倚，可接受标准参照CNAS-CL36附录A.6。经评估，在Hb浓度8.7g/L以下时对本法检测EBV DNA无明显影响。
3.6量值溯源
通过EBV有证参考物质(GBW(E)090679/090680/069681)标定厂家系列标准品(1.0E+04/1.0E+05/1.0E+06/1.0E+07Copies/mL)，将本法检测结果溯源至1st WHOInternational Standard for Epstein-Barr Virus for Nucleic Acid AmplificationTechnlques，NIBSC code：09/260。标定后约10copies＝1IU。
从实施例1可以看出，本发明的磁珠法核酸提取结合荧光PCR检测血浆EB病毒DNA的方法，具有良好的可靠性，且检测灵敏度较高、检出限低。
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是熟悉本技术领域的技术人员应当理解，我们所描述的具体的实施例只是说明性的，而不是用于对本发明的范围的限定，熟悉本领域的技术人员在依照本发明的精神所作的等效的修饰以及变化，都应当涵盖在本发明的权利要求所保护的范围内。

Claims (2)

1.一种磁珠法核酸提取结合荧光PCR检测血浆EB病毒DNA的方法，其特征在于：包括如下步骤：
步骤1、核酸提取：对血浆样本利进行磁珠法病毒核酸提取，利用异硫氰酸胍盐将病毒蛋白外壳裂解，释放出病毒核酸，通过对核酸具有吸附功能的磁珠将释放出的病毒核酸及血浆中游离状态的病毒核酸吸附到磁珠表面，通过清洗液洗去未吸附上的杂质进行核酸的纯化，最后用洗脱液将病毒核酸从磁珠上洗脱下来，作为后续PCR模板；
步骤2、核酸扩增：利用商业化的病毒核酸定量检测试剂盒，在样本核酸提取纯化后通过PCR体外扩增对病毒DNA进行快速定量检测；PCR条件：93℃2分钟，93℃45秒→55℃60秒10循环→93℃30秒→55℃45秒30循环；报告基团：FAM，淬灭基团：TAMRA。
2.根据权利要求1所述的磁珠法核酸提取结合荧光PCR检测血浆EB病毒DNA的方法，其特征在于：所述步骤1中，核酸提取提取在全自动核酸检测反应体系构建***中进行。
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