CN110669147A - 一种用于Saureus菌检测的含明胶酶酶切序列的抗菌剂FAM-AMP - Google Patents
一种用于Saureus菌检测的含明胶酶酶切序列的抗菌剂FAM-AMP Download PDFInfo
- Publication number
- CN110669147A CN110669147A CN201911017237.XA CN201911017237A CN110669147A CN 110669147 A CN110669147 A CN 110669147A CN 201911017237 A CN201911017237 A CN 201911017237A CN 110669147 A CN110669147 A CN 110669147A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- fam
- antibacterial agent
- antibacterial
- gelatinase
- agent
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 title claims abstract description 38
- 102000013382 Gelatinases Human genes 0.000 title claims abstract description 19
- 108010026132 Gelatinases Proteins 0.000 title claims abstract description 19
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 title claims abstract description 9
- 239000003910 polypeptide antibiotic agent Substances 0.000 claims abstract description 11
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 18
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 18
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 17
- NJYVEMPWNAYQQN-UHFFFAOYSA-N 5-carboxyfluorescein Chemical group C12=CC=C(O)C=C2OC2=CC(O)=CC=C2C21OC(=O)C1=CC(C(=O)O)=CC=C21 NJYVEMPWNAYQQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 9
- YEDUAINPPJYDJZ-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxybenzothiazole Chemical compound C1=CC=C2SC(O)=NC2=C1 YEDUAINPPJYDJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 8
- NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N hydroxybenzotriazole Substances O=C1C=CC=C2NNN=C12 NPZTUJOABDZTLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 8
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 8
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 claims description 7
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 claims description 7
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 7
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 claims description 7
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 7
- WSLDOOZREJYCGB-UHFFFAOYSA-N 1,2-Dichloroethane Chemical compound ClCCCl WSLDOOZREJYCGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 5
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 4
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 claims description 4
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims description 4
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 2
- 238000006482 condensation reaction Methods 0.000 claims description 2
- 238000005336 cracking Methods 0.000 claims description 2
- 239000002173 cutting fluid Substances 0.000 claims description 2
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 claims description 2
- 238000005303 weighing Methods 0.000 claims description 2
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 claims 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 abstract description 18
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 11
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 abstract description 6
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 4
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 abstract description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 abstract description 2
- 239000007822 coupling agent Substances 0.000 abstract 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 abstract 1
- 230000001766 physiological effect Effects 0.000 abstract 1
- 229920006227 ethylene-grafted-maleic anhydride Polymers 0.000 description 78
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 17
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 description 9
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 8
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 7
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 5
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 5
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 125000003345 AMP group Chemical group 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- JFLSOKIMYBSASW-UHFFFAOYSA-N 1-chloro-2-[chloro(diphenyl)methyl]benzene Chemical compound ClC1=CC=CC=C1C(Cl)(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 JFLSOKIMYBSASW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 150000001371 alpha-amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 235000008206 alpha-amino acids Nutrition 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000007398 colorimetric assay Methods 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 2
- 229910004835 Na2B4O7 Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004952 Polyamide Substances 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000002924 anti-infective effect Effects 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 229940124350 antibacterial drug Drugs 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- UQGFMSUEHSUPRD-UHFFFAOYSA-N disodium;3,7-dioxido-2,4,6,8,9-pentaoxa-1,3,5,7-tetraborabicyclo[3.3.1]nonane Chemical compound [Na+].[Na+].O1B([O-])OB2OB([O-])OB1O2 UQGFMSUEHSUPRD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 238000000799 fluorescence microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000002866 fluorescence resonance energy transfer Methods 0.000 description 1
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 231100000086 high toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 244000052637 human pathogen Species 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000011056 performance test Methods 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 229920002647 polyamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 239000012146 running buffer Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000004416 surface enhanced Raman spectroscopy Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
- C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
- C12Q1/14—Streptococcus; Staphylococcus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/60—Fusion polypeptide containing spectroscopic/fluorescent detection, e.g. green fluorescent protein [GFP]
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/195—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria
- G01N2333/305—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Micrococcaceae (F)
- G01N2333/31—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from bacteria from Micrococcaceae (F) from Staphylococcus (G)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明属于抗菌剂技术领域，具体公开了一种用于S.aureus菌检测的含明胶酶酶切序列的抗菌剂FAM‑AMP。AMP抗菌剂中的GKRWWKWWRR为抗菌肽，PLGVRG为明胶酶酶切序列，可被S.aureus菌分泌的明胶酶识别并切断，通过多肽固相合成法将二者偶联，形成具有明胶酶酶切位点的新型抗菌剂。再通过偶联剂将荧光素FAM标记到抗菌剂AMP上，标记后的FAM‑AMP可进一步通过毛细管电泳检测S.aureus菌的浓度。本发明制备的抗菌剂FAM‑AMP既可以检测S.aureus菌浓度又能有效灭菌，并且生物相容性好，对机体细胞的正常生理活动干扰小，毒性低，安全性高。
Description
技术领域
本发明属于抗菌剂技术领域，具体公开了一种用于S.aureus菌检测的含明胶酶酶切序列的抗菌剂FAM-AMP。
背景技术
抗生素类药物在抗感染方面有着卓越的贡献，然而，抗生素类药物的广泛使用乃至滥用，导致了许多重要的人类病原菌已经表现出越来越强的耐药性，迫切需要找到不易产生耐药性的新型抗生素。抗菌肽(AMPs)有着传统抗生素无可比拟的优势，其抗菌机制独特，杀菌作用迅速且不易引发细菌的耐药性，是一类极具潜力的抗菌药物。抗菌肽因为抗菌活性高，抗菌谱广，种类多，可供选择的范围广，靶菌株不易产生抗性突变等原因，而被认为将会在医药工业上有着广阔的应用前景。但还存在毒性高、稳定性低和生产成本高等限制其开发成药物的问题需要解决。
最近，已经开发了几种用于细菌检测的技术，例如荧光成像，表面增强拉曼光谱，免疫学和比色测定。然而例如比色测定，通常易受环境条件(即pH值，离子浓度和溶剂)的干扰，因此损害了细菌检测的特异性和准确性。
发明内容
为了解决现有技术中的不足，本发明将荧光素FAM与含有明胶酶酶切位点的AMP结合，提供了一种新型的抗菌剂FAM-AMP，本发明制备的抗菌剂不仅具有优异的抑菌性能，并且能够被S.aureus菌(金色葡萄球菌)分泌的明胶酶识别并切断，从而提出一种S.aureus菌检测新方法。通过荧光检测的毛细管电泳，将样品各组分根据其淌度和分配系数的差异进行高效快速分离，从而实现S.aureus菌的有效检测。与传统方法相比，本发明采用CE(毛细管电泳检测)具有分离效率高、灵敏度高、速度快、样品消耗低、成本廉价等优点。该抗菌肽自身并没有明显抗菌效果，但是在菌液中会被明胶酶切断，释放出抗菌肽序列，从而达到抗菌目的。可用于S.aureus菌检测，具有广泛的应用前景。
本发明的具体技术方案如下所述：
本发明制备的抗菌剂FAM-AMP由荧光剂以及含明胶酶酶切位点的抗菌肽组成。
制备的抗菌剂FAM-AMP中荧光剂为5-FAM，其最大吸收波长为492nm，荧光发射波长为518nm。
含明胶酶酶切位点的抗菌肽AMP的氨基酸序列为GKRWWKWWRRPLGVRGC，其中，GKRWWKWWRR为抗菌肽，PLGVRG为明胶酶酶切序列。
AMP采用常规的Fmoc固相法合成，即固相树脂上被Fmoc保护的单体氨基酸去保护后露出氨基，通过缩合反应与溶液中氨基酸的羧基形成肽键，从而将氨基酸连接到树脂上，使肽链从C端向N端延伸，直至合成所需肽链。
荧光剂5-FAM标记AMP的方法为：称取相当于带有多肽的树脂3倍摩尔量的5-FAM、HOBT、EDC溶解于DMF中，加入DIEA避光过夜反应，最后用切割液将标记的多肽从树脂上裂解下来，经过HPLC进行纯化，并通过质谱进行分析。
本发明制备的抗菌剂FAM-AMP可进一步通过荧光检测毛细管电泳(CE-FL)检测S.aureus菌浓度。
荧光毛细管电泳检测S.aureus菌浓度的具体方法如下：
CE-FL采用实验室自行搭建的检测***。由高压电源(20kV)提供电场，内径75μm，有效长度50cm(外径365μm，总长75cm)的聚酰胺胶涂层毛细管连接正负极电泳槽，并固定在倒置荧光显微镜检测窗口，100W汞灯提供光源，并经过激发过滤器(BP 420±20nm)和双色镜(DM 455)处理，最终光纤光谱仪Maya-2000pro在检测窗口将光信号转为电信号在电脑终端形成电泳谱图。毛细管在使用前依次用1M HCl，1M NaOH和电泳缓冲液(25mM Na2B4O7，pH9.3)冲洗30min。电泳采用正极端手动进样。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明制备得到的FAM-AMP抗菌剂，自身并没有明显的抗菌效果，但是在S.aureus菌(金色葡萄球菌)菌液中会被明胶酶切断，释放出抗菌肽序列，从而达到抗菌目的。
本发明制备得到的FAM-AMP抗菌剂能够被S.aureus菌分泌的明胶酶识别并切断，从而提出一种S.aureus菌检测新方法。通过荧光检测的毛细管电泳，将样品各组分根据其淌度和分配系数的差异进行高效快速分离，从而实现S.aureus菌的有效检测。
本发明公开的制备工艺简单，原料来源广泛，反应条件温和，易于合成，适于推广使用。
附图说明
图1为AMP的HPLC图。
图2为FAM-AMP的HPLC图。
图3为FAM-AMP的质谱图。
图4为AMP、FAM-AMP的紫外吸收图。
图5为FAM-AMP的荧光发射图。
图6(A、B)为S.aureus菌浓度对FAM-AMP酶切效果的影响图。
图7为S.aureus菌浓度对FAM-AMP酶切效果的拟合曲线图。
图8为FAM-AMP抗菌剂对S.aureus菌生长曲线的影响图。
图9为不同浓度的FAM-AMP溶液中S.aureus菌的存活率。
图10为E.coli菌浓度对FAM-AMP酶切效果的影响图。
图11为FAM-AMP抗菌剂对E.coli菌生长曲线的影响图。
图12为不同浓度的AMP溶液中S.aureus菌的存活率。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明进行详细阐述，但本发明不局限于这些实施例。
实施例1
1、FAM-AMP的合成
1)AMP的合成
AMP是基于带有Fmoc保护基团的2-Chlorotrityl Chloride树脂，通过固相多肽合成法得到。具体为：分别称取相当于树脂5倍摩尔量的氨基酸(经化学修饰的α-氨基酸)、HBTU、HOBT，溶于DMF中，加入DIEA偶联30min。然后加入20％哌啶反应30min脱去Fmoc保护基，重复此步骤直达合成所需的肽链，合成后的肽链经HPLC纯化，纯化效果如附图1所示。
2)5-FAM荧光素标记AMP
称取30mg树脂(上述合成的有肽链的树脂)，和相当于树脂3倍摩尔量的5-FAM、HOBT、EDC溶解于1mL DMF中，加入10μL DIEA避光过夜反应，最后用切割液将标记的多肽从树脂上裂解下来，经HPLC纯化，分子量通过LC-MS确定，纯化图和质谱图如附图2和附图3所示。
2、FAM-AMP抗菌剂的表征
1)AMP、FAM-AMP抗菌剂紫外吸收的测定实验
将合成的AMP、FAM-AMP经水系(0.22μm)滤膜过滤之后，稀释一倍，每个样平行测定三次，取平均值，用紫外分光光度计扫描AMP、FAM-AMP的紫外吸收，扫描的范围为300nm～800nm，紫外吸收图谱如附图4所示。由图可知，单独的AMP在300-800nm没有明显的吸收，而FAM-AMP在492nm有明显的吸收峰，说明了5-FAM成功标记上了AMP。
2)FAM-AMP抗菌剂荧光发射的测定实验
将合成的FAM-AMP抗菌剂经水系(0.22μm)滤膜过滤之后，稀释一倍，每个样品平行测定三次，取平均值，用荧光光谱仪测试FAM-AMP抗菌剂的荧光，荧光发射光谱如附图5所示，由图可知FAM-AMP的最大发射波长为518nm。
3、CE-FL检测S.aureus菌浓度对FAM-AMP酶切效果的影响
为了探究不同S.aureus菌浓度对FAM-AMP酶切效果的影响，分别将不同浓度的S.aureus菌与FAM-AMP共同孵育3h，将样品使用CE-FL进行分析，观察荧光信号的变化。样品选用480nm的波长激发，进样时间为20s，观察518nm通道(对应FAM的发射波长)的电泳谱图。
将106CFU/mL～108CFU/mL的S.aureus菌与FAM-AMP混合，共孵育3小时，使用CE-FL进行分析。
如附图6(A、B)所示，FAM-AMP的电泳峰(P1)出现在240s处，随着S.aureus菌浓度的增加，在295s处出现一个新的电泳峰(P2)，并且P2的荧光强度逐渐增加，而P1的荧光强度逐渐减小。由此我们可以推断，P2处的峰为FAM-AMP酶解产物的电泳峰，随着S.aureus菌浓度的增加，S.aureus菌对FAM-AMP酶切效果越好，当浓度为108CFU/mL时，P1峰几乎消失，此时FAM-AMP已被完全酶解。
根据附图6(A、B)中P1与P2的面积与S.aureus菌的浓度的关系作图，线性拟合曲线如附图7所示，S.aureus菌的浓度越高，ln(SP1/SP2)的值越小。此曲线可以用于S.aureus菌浓度的检测。
3、FAM-AMP抗菌性能测试
1)FAM-AMP抗菌剂对S.aureus菌生长曲线的影响
为了探究FAM-AMP抗菌剂对S.aureus菌生长的影响，将过夜培养的S.aureus菌稀释至105CFU/mL，于96孔板中加入200μL的菌液，并加入10μL 100μM的FAM-AMP抗菌剂，每组做三个平行样。通过酶标仪检测600nm处的吸光度，连续检测10小时，然后根据检测出的数据作图观察实验组和对照组细菌的生长情况(图8)。
由图可知，共同孵育4小时后，S.aureus菌对照组的OD600值已经达到1，而加FAM-AMP抗菌剂组的OD600值仅为对照组的1/3，为0.3左右(附图9)，表现出明显抑制作用，这可能是由于AMP的作用引起的。
2)FAM-AMP抗菌剂MIC90值测定
用无菌水配制15μM、30μM、45μM、60μM、75μM、90μM、105μM的FAM-AMP，取108CFU/mL的S.aureus菌液1mL与250μL的样品共同孵育1小时，稀释103，取100μL涂板，放入生化培养箱15小时后，对琼脂平板上长出的菌落数进行计数，每个样平行测定三次(图9)。
如附图9的涂板结果所示，FAM-AMP抗菌剂的浓度对S.aureus的存活率有明显的抑制作用，且浓度越大抑制效果越好。当FAM-AMP抗菌剂的浓度为18μM时，S.aureus的存活率仅为3％，即MIC90为18μM。
对比实施例1
(1)CE-FL检测E.coli菌浓度对FAM-AMP酶切效果的影响
为了探究E.coli对FAM-AMP酶切效果的影响，将108CFU/mL E.coli菌与FAM-AMP共同孵育3h，将样品使用CE-FL进行分析，观察FRET的变化。样品选用480nm的波长激发，进样时间为20s，观察518nm通道(对应FAM的发射波长)的电泳谱图。
如附图10所示，FAM-AMP的电泳峰(P1)出现在240s处。108CFU/mL E.coli菌与FAM-AMP共孵育3小时，295s处没有出现新的峰，说明E.coli菌不能分泌明胶酶，不能识别切断AMP多肽序列。
(2)FAM-AMP抗菌剂对E.coli菌生长曲线的影响
为了探究FAM-AMP抗菌剂对E.coli菌生长的影响，将过夜培养的E.coli菌稀释至105CFU/mL，于96孔板中加入200μL的菌液，并加入10μL 100μM的FAM-AMP抗菌剂，每组做三个平行样。通过酶标仪检测600nm处的吸光度，连续检测10小时，然后根据测出的数据作图观察实验组和对照组细菌的生长情况(图11)。
由图可知，共同孵育5小时后，E.coli对照组的OD600值已经达到1，而加FAM-AMP抗菌剂组也表现出抑制作用(附图11)，但是不如S.aureus菌的效果明显(附图9)。
(3)GKRWWKWWRR的MIC90值测定
用无菌水配制10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、70μM、80μM的GKRWWKWWRR，取108CFU/mL的S.aureus菌液1mL与250μL的样品共同孵育1小时，稀释103，取100μL涂板，放入生化培养箱15小时后，对琼脂平板上长出的菌落数进行计数，每个样平行测定三次(图12)。
如附图12的结果所示，GKRWWKWWRR的浓度对S.aureus的存活率有明显的抑制作用，且浓度越大抑制效果越好。当浓度为10μM时，S.aureus的存活率仅为9％，即MIC90为10μM。
对比实施例2
1、FAM-AMP的合成
1)AMP的合成
AMP是基于带有Fmoc保护基团的2-Chlorotrityl Chloride树脂，通过固相多肽合成法得到。具体为：分别称取相当于树脂5倍摩尔量的氨基酸(经化学修饰的α-氨基酸)、HBTU、HOBT，溶于DMF中，加入DIEA偶联30min。然后加入20％哌啶反应30min脱去Fmoc保护基，重复此步骤直达合成所需的肽链(GKRWWKWWRR)。
2)5-FAM荧光素标记AMP
称取30mg树脂(上述合成的有肽链的树脂)，和相当于树脂3倍摩尔量的5-FAM、HOBT、EDC溶解于1mL DMF中，加入10μL DIEA避光过夜反应，最后用切割液将标记的多肽从树脂上裂解下来，经HPLC纯化，分子量通过LC-MS确定。
这条序列仅是抗菌序列，没有酶切序列，所以不能特异识别S.aureus菌分泌的明胶酶。
Claims (6)
1.一种含明胶酶酶切序列的抗菌剂FAM-AMP，其特征在于，所述的抗菌剂为荧光剂标记的含明胶酶酶切位点的抗菌肽。
2.根据权利要求1所述的抗菌剂，其特征在于，所述荧光剂为5-FAM，其最大吸收为492nm，荧光发射为518nm。
3.根据权利要求1所述的抗菌剂，其特征在于，所述含明胶酶酶切位点的抗菌肽AMP的氨基酸序列为GKRWWKWWRRPLGVRGC，其中，GKRWWKWWRR为抗菌肽，PLGVRG为明胶酶酶切序列。
4.根据权利要求1所述的抗菌剂，其特征在于，所述AMP采用常规的Fmoc固相法合成，即固相树脂上被Fmoc保护的单体氨基酸去保护后露出氨基，通过缩合反应与溶液中氨基酸的羧基形成肽键，从而将氨基酸连接到树脂上，使肽链从C端向N端延伸，直至合成所需肽链。
5.根据权利要求1所述的抗菌剂，其特征在于，荧光剂5-FAM标记AMP的方法为：称取相当于带有多肽的树脂3倍摩尔量的5-FAM、HOBT、EDC溶解于DMF中，加入DIEA避光过夜反应，最后用切割液将标记的多肽从树脂上裂解下来，经过HPLC进行纯化，并通过质谱进行分析。
6.一种根据权利要求1所述的抗菌剂的应用，其特征在于，所述抗菌剂FAM-AMP用作抗菌剂，并用于荧光毛细管电泳检测S.aureus菌的菌浓度。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201911017237.XA CN110669147A (zh) | 2019-10-24 | 2019-10-24 | 一种用于Saureus菌检测的含明胶酶酶切序列的抗菌剂FAM-AMP |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201911017237.XA CN110669147A (zh) | 2019-10-24 | 2019-10-24 | 一种用于Saureus菌检测的含明胶酶酶切序列的抗菌剂FAM-AMP |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110669147A true CN110669147A (zh) | 2020-01-10 |
Family
ID=69084018
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201911017237.XA Pending CN110669147A (zh) | 2019-10-24 | 2019-10-24 | 一种用于Saureus菌检测的含明胶酶酶切序列的抗菌剂FAM-AMP |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN110669147A (zh) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111321205A (zh) * | 2020-03-11 | 2020-06-23 | 昆明理工大学 | 一种miRNA的检测方法 |
| CN112321680A (zh) * | 2020-09-24 | 2021-02-05 | 南京斯泰尔医药科技有限公司 | 一种能够特异性识别并靶向S.aureus菌的抗菌肽 |
| CN112868668A (zh) * | 2021-03-19 | 2021-06-01 | 常州英诺升康生物医药科技有限公司 | 一种Fe3O4-DA-AMP纳米复合抗菌材料及其制备方法和应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110028553A (zh) * | 2019-04-26 | 2019-07-19 | 常州大学 | 一种抗菌纳米探针Au-PEG-AMP-Ce6的制备方法和应用 |
| CN110066321A (zh) * | 2019-04-26 | 2019-07-30 | 常州大学 | 一种抗菌水凝胶及其制备方法和应用 |
-
2019
- 2019-10-24 CN CN201911017237.XA patent/CN110669147A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110028553A (zh) * | 2019-04-26 | 2019-07-19 | 常州大学 | 一种抗菌纳米探针Au-PEG-AMP-Ce6的制备方法和应用 |
| CN110066321A (zh) * | 2019-04-26 | 2019-07-30 | 常州大学 | 一种抗菌水凝胶及其制备方法和应用 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| LI-LI LI ET AL: "Pathological-Condition-Driven Construction of Supramolecular Nanoassemblies for Bacterial Infection Detection", 《ADVANCED MATERIALS》 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN111321205A (zh) * | 2020-03-11 | 2020-06-23 | 昆明理工大学 | 一种miRNA的检测方法 |
| CN112321680A (zh) * | 2020-09-24 | 2021-02-05 | 南京斯泰尔医药科技有限公司 | 一种能够特异性识别并靶向S.aureus菌的抗菌肽 |
| CN112868668A (zh) * | 2021-03-19 | 2021-06-01 | 常州英诺升康生物医药科技有限公司 | 一种Fe3O4-DA-AMP纳米复合抗菌材料及其制备方法和应用 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110669147A (zh) | 一种用于Saureus菌检测的含明胶酶酶切序列的抗菌剂FAM-AMP | |
| US11548912B2 (en) | Antimicrobial compounds | |
| CA2589833A1 (en) | Antimicrobial peptides with reduced hemolysis and methods of their use | |
| EP1502949A1 (en) | Antimicrobial polypeptide and utizliation thereof | |
| CN115947788B (zh) | 色氨酸和亮氨酸跨链交互作用β-发卡抗菌肽WLF及制备方法和应用 | |
| CN110692651A (zh) | 一种抗菌纳米探针BSA@AuNc-AMP-Ce6及其制备方法和应用 | |
| Sato et al. | Novel des-fatty acyl-polymyxin B derivatives with Pseudomonas aeruginosa-specific antimicrobial activity | |
| AU2002257498B2 (en) | A frog skin antibacterial peptide derivative | |
| CN110938112A (zh) | 脂肪酸修饰的超短序列抗菌肽类似物及其应用 | |
| CN107344958B (zh) | 抗菌五肽衍生物及其应用 | |
| CN106916205B (zh) | 抗菌六肽及其衍生物和应用 | |
| CN113045628B (zh) | 一种抗菌肽或其变体在制备抗菌产品中的应用 | |
| Kim et al. | A “light-up” 1D supramolecular nanoprobe for silver ions based on assembly of pyrene-labeled peptide amphiphiles: cell-imaging and antimicrobial activity | |
| CN117024552A (zh) | 小分子抗菌多肽、制备方法及其用途 | |
| CN113150077A (zh) | 一种环六肽化合物desotamide A4及其在制备抗菌药物中的应用 | |
| CN116804046B (zh) | 一种环状阳离子抗菌肽及其应用 | |
| CN104672307B (zh) | 一种提高阳离子短肽抗菌性和稳定性的方法 | |
| Egawa et al. | Antibiotic YC 73 of Pseudomonas origin. II Structure and synthesis of thioformin and its cupric complex (YC 73) | |
| Dahiya | Total synthesis and biological potential of psammosilenin A | |
| Abou-Zied et al. | Elucidating the mechanism of peptide interaction with membranes using the intrinsic fluorescence of tryptophan: perpendicular penetration of cecropin B-like peptides into Pseudomonas aeruginosa | |
| CA2450540A1 (en) | Antimicrobial peptides with reduced hemolysis and methods of their use | |
| JP2005247721A (ja) | 低下された溶血反応を有する抗菌性ペプチド及びその使用方法 | |
| CN108659102A (zh) | 具有抗菌及抗炎活性的多肽化合物 | |
| JP2545750B2 (ja) | 直鎖状サーファクチン | |
| Glossop et al. | Linear analogues of the lipopeptide battacin with potent in vitro activity against S. aureus |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20200110 |