CN110669147A - 一种用于Saureus菌检测的含明胶酶酶切序列的抗菌剂FAM-AMP - Google Patents
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Abstract
本发明属于抗菌剂技术领域,具体公开了一种用于S.aureus菌检测的含明胶酶酶切序列的抗菌剂FAM‑AMP。AMP抗菌剂中的GKRWWKWWRR为抗菌肽,PLGVRG为明胶酶酶切序列,可被S.aureus菌分泌的明胶酶识别并切断,通过多肽固相合成法将二者偶联,形成具有明胶酶酶切位点的新型抗菌剂。再通过偶联剂将荧光素FAM标记到抗菌剂AMP上,标记后的FAM‑AMP可进一步通过毛细管电泳检测S.aureus菌的浓度。本发明制备的抗菌剂FAM‑AMP既可以检测S.aureus菌浓度又能有效灭菌,并且生物相容性好,对机体细胞的正常生理活动干扰小,毒性低,安全性高。
Description
技术领域
本发明属于抗菌剂技术领域,具体公开了一种用于S.aureus菌检测的含明胶酶酶切序列的抗菌剂FAM-AMP。
背景技术
抗生素类药物在抗感染方面有着卓越的贡献,然而,抗生素类药物的广泛使用乃至滥用,导致了许多重要的人类病原菌已经表现出越来越强的耐药性,迫切需要找到不易产生耐药性的新型抗生素。抗菌肽(AMPs)有着传统抗生素无可比拟的优势,其抗菌机制独特,杀菌作用迅速且不易引发细菌的耐药性,是一类极具潜力的抗菌药物。抗菌肽因为抗菌活性高,抗菌谱广,种类多,可供选择的范围广,靶菌株不易产生抗性突变等原因,而被认为将会在医药工业上有着广阔的应用前景。但还存在毒性高、稳定性低和生产成本高等限制其开发成药物的问题需要解决。
最近,已经开发了几种用于细菌检测的技术,例如荧光成像,表面增强拉曼光谱,免疫学和比色测定。然而例如比色测定,通常易受环境条件(即pH值,离子浓度和溶剂)的干扰,因此损害了细菌检测的特异性和准确性。
发明内容
为了解决现有技术中的不足,本发明将荧光素FAM与含有明胶酶酶切位点的AMP结合,提供了一种新型的抗菌剂FAM-AMP,本发明制备的抗菌剂不仅具有优异的抑菌性能,并且能够被S.aureus菌(金色葡萄球菌)分泌的明胶酶识别并切断,从而提出一种S.aureus菌检测新方法。通过荧光检测的毛细管电泳,将样品各组分根据其淌度和分配系数的差异进行高效快速分离,从而实现S.aureus菌的有效检测。与传统方法相比,本发明采用CE(毛细管电泳检测)具有分离效率高、灵敏度高、速度快、样品消耗低、成本廉价等优点。该抗菌肽自身并没有明显抗菌效果,但是在菌液中会被明胶酶切断,释放出抗菌肽序列,从而达到抗菌目的。可用于S.aureus菌检测,具有广泛的应用前景。
本发明的具体技术方案如下所述:
本发明制备的抗菌剂FAM-AMP由荧光剂以及含明胶酶酶切位点的抗菌肽组成。
制备的抗菌剂FAM-AMP中荧光剂为5-FAM,其最大吸收波长为492nm,荧光发射波长为518nm。
含明胶酶酶切位点的抗菌肽AMP的氨基酸序列为GKRWWKWWRRPLGVRGC,其中,GKRWWKWWRR为抗菌肽,PLGVRG为明胶酶酶切序列。
AMP采用常规的Fmoc固相法合成,即固相树脂上被Fmoc保护的单体氨基酸去保护后露出氨基,通过缩合反应与溶液中氨基酸的羧基形成肽键,从而将氨基酸连接到树脂上,使肽链从C端向N端延伸,直至合成所需肽链。
荧光剂5-FAM标记AMP的方法为:称取相当于带有多肽的树脂3倍摩尔量的5-FAM、HOBT、EDC溶解于DMF中,加入DIEA避光过夜反应,最后用切割液将标记的多肽从树脂上裂解下来,经过HPLC进行纯化,并通过质谱进行分析。
本发明制备的抗菌剂FAM-AMP可进一步通过荧光检测毛细管电泳(CE-FL)检测S.aureus菌浓度。
荧光毛细管电泳检测S.aureus菌浓度的具体方法如下:
CE-FL采用实验室自行搭建的检测***。由高压电源(20kV)提供电场,内径75μm,有效长度50cm(外径365μm,总长75cm)的聚酰胺胶涂层毛细管连接正负极电泳槽,并固定在倒置荧光显微镜检测窗口,100W汞灯提供光源,并经过激发过滤器(BP 420±20nm)和双色镜(DM 455)处理,最终光纤光谱仪Maya-2000pro在检测窗口将光信号转为电信号在电脑终端形成电泳谱图。毛细管在使用前依次用1M HCl,1M NaOH和电泳缓冲液(25mM Na2B4O7,pH9.3)冲洗30min。电泳采用正极端手动进样。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
本发明制备得到的FAM-AMP抗菌剂,自身并没有明显的抗菌效果,但是在S.aureus菌(金色葡萄球菌)菌液中会被明胶酶切断,释放出抗菌肽序列,从而达到抗菌目的。
本发明制备得到的FAM-AMP抗菌剂能够被S.aureus菌分泌的明胶酶识别并切断,从而提出一种S.aureus菌检测新方法。通过荧光检测的毛细管电泳,将样品各组分根据其淌度和分配系数的差异进行高效快速分离,从而实现S.aureus菌的有效检测。
本发明公开的制备工艺简单,原料来源广泛,反应条件温和,易于合成,适于推广使用。
附图说明
图1为AMP的HPLC图。
图2为FAM-AMP的HPLC图。
图3为FAM-AMP的质谱图。
图4为AMP、FAM-AMP的紫外吸收图。
图5为FAM-AMP的荧光发射图。
图6(A、B)为S.aureus菌浓度对FAM-AMP酶切效果的影响图。
图7为S.aureus菌浓度对FAM-AMP酶切效果的拟合曲线图。
图8为FAM-AMP抗菌剂对S.aureus菌生长曲线的影响图。
图9为不同浓度的FAM-AMP溶液中S.aureus菌的存活率。
图10为E.coli菌浓度对FAM-AMP酶切效果的影响图。
图11为FAM-AMP抗菌剂对E.coli菌生长曲线的影响图。
图12为不同浓度的AMP溶液中S.aureus菌的存活率。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明进行详细阐述,但本发明不局限于这些实施例。
实施例1
1、FAM-AMP的合成
1)AMP的合成
AMP是基于带有Fmoc保护基团的2-Chlorotrityl Chloride树脂,通过固相多肽合成法得到。具体为:分别称取相当于树脂5倍摩尔量的氨基酸(经化学修饰的α-氨基酸)、HBTU、HOBT,溶于DMF中,加入DIEA偶联30min。然后加入20%哌啶反应30min脱去Fmoc保护基,重复此步骤直达合成所需的肽链,合成后的肽链经HPLC纯化,纯化效果如附图1所示。
2)5-FAM荧光素标记AMP
称取30mg树脂(上述合成的有肽链的树脂),和相当于树脂3倍摩尔量的5-FAM、HOBT、EDC溶解于1mL DMF中,加入10μL DIEA避光过夜反应,最后用切割液将标记的多肽从树脂上裂解下来,经HPLC纯化,分子量通过LC-MS确定,纯化图和质谱图如附图2和附图3所示。
2、FAM-AMP抗菌剂的表征
1)AMP、FAM-AMP抗菌剂紫外吸收的测定实验
将合成的AMP、FAM-AMP经水系(0.22μm)滤膜过滤之后,稀释一倍,每个样平行测定三次,取平均值,用紫外分光光度计扫描AMP、FAM-AMP的紫外吸收,扫描的范围为300nm~800nm,紫外吸收图谱如附图4所示。由图可知,单独的AMP在300-800nm没有明显的吸收,而FAM-AMP在492nm有明显的吸收峰,说明了5-FAM成功标记上了AMP。
2)FAM-AMP抗菌剂荧光发射的测定实验
将合成的FAM-AMP抗菌剂经水系(0.22μm)滤膜过滤之后,稀释一倍,每个样品平行测定三次,取平均值,用荧光光谱仪测试FAM-AMP抗菌剂的荧光,荧光发射光谱如附图5所示,由图可知FAM-AMP的最大发射波长为518nm。
3、CE-FL检测S.aureus菌浓度对FAM-AMP酶切效果的影响
为了探究不同S.aureus菌浓度对FAM-AMP酶切效果的影响,分别将不同浓度的S.aureus菌与FAM-AMP共同孵育3h,将样品使用CE-FL进行分析,观察荧光信号的变化。样品选用480nm的波长激发,进样时间为20s,观察518nm通道(对应FAM的发射波长)的电泳谱图。
将106CFU/mL~108CFU/mL的S.aureus菌与FAM-AMP混合,共孵育3小时,使用CE-FL进行分析。
如附图6(A、B)所示,FAM-AMP的电泳峰(P1)出现在240s处,随着S.aureus菌浓度的增加,在295s处出现一个新的电泳峰(P2),并且P2的荧光强度逐渐增加,而P1的荧光强度逐渐减小。由此我们可以推断,P2处的峰为FAM-AMP酶解产物的电泳峰,随着S.aureus菌浓度的增加,S.aureus菌对FAM-AMP酶切效果越好,当浓度为108CFU/mL时,P1峰几乎消失,此时FAM-AMP已被完全酶解。
根据附图6(A、B)中P1与P2的面积与S.aureus菌的浓度的关系作图,线性拟合曲线如附图7所示,S.aureus菌的浓度越高,ln(SP1/SP2)的值越小。此曲线可以用于S.aureus菌浓度的检测。
3、FAM-AMP抗菌性能测试
1)FAM-AMP抗菌剂对S.aureus菌生长曲线的影响
为了探究FAM-AMP抗菌剂对S.aureus菌生长的影响,将过夜培养的S.aureus菌稀释至105CFU/mL,于96孔板中加入200μL的菌液,并加入10μL 100μM的FAM-AMP抗菌剂,每组做三个平行样。通过酶标仪检测600nm处的吸光度,连续检测10小时,然后根据检测出的数据作图观察实验组和对照组细菌的生长情况(图8)。
由图可知,共同孵育4小时后,S.aureus菌对照组的OD600值已经达到1,而加FAM-AMP抗菌剂组的OD600值仅为对照组的1/3,为0.3左右(附图9),表现出明显抑制作用,这可能是由于AMP的作用引起的。
2)FAM-AMP抗菌剂MIC90值测定
用无菌水配制15μM、30μM、45μM、60μM、75μM、90μM、105μM的FAM-AMP,取108CFU/mL的S.aureus菌液1mL与250μL的样品共同孵育1小时,稀释103,取100μL涂板,放入生化培养箱15小时后,对琼脂平板上长出的菌落数进行计数,每个样平行测定三次(图9)。
如附图9的涂板结果所示,FAM-AMP抗菌剂的浓度对S.aureus的存活率有明显的抑制作用,且浓度越大抑制效果越好。当FAM-AMP抗菌剂的浓度为18μM时,S.aureus的存活率仅为3%,即MIC90为18μM。
对比实施例1
(1)CE-FL检测E.coli菌浓度对FAM-AMP酶切效果的影响
为了探究E.coli对FAM-AMP酶切效果的影响,将108CFU/mL E.coli菌与FAM-AMP共同孵育3h,将样品使用CE-FL进行分析,观察FRET的变化。样品选用480nm的波长激发,进样时间为20s,观察518nm通道(对应FAM的发射波长)的电泳谱图。
如附图10所示,FAM-AMP的电泳峰(P1)出现在240s处。108CFU/mL E.coli菌与FAM-AMP共孵育3小时,295s处没有出现新的峰,说明E.coli菌不能分泌明胶酶,不能识别切断AMP多肽序列。
(2)FAM-AMP抗菌剂对E.coli菌生长曲线的影响
为了探究FAM-AMP抗菌剂对E.coli菌生长的影响,将过夜培养的E.coli菌稀释至105CFU/mL,于96孔板中加入200μL的菌液,并加入10μL 100μM的FAM-AMP抗菌剂,每组做三个平行样。通过酶标仪检测600nm处的吸光度,连续检测10小时,然后根据测出的数据作图观察实验组和对照组细菌的生长情况(图11)。
由图可知,共同孵育5小时后,E.coli对照组的OD600值已经达到1,而加FAM-AMP抗菌剂组也表现出抑制作用(附图11),但是不如S.aureus菌的效果明显(附图9)。
(3)GKRWWKWWRR的MIC90值测定
用无菌水配制10μM、20μM、30μM、40μM、50μM、60μM、70μM、80μM的GKRWWKWWRR,取108CFU/mL的S.aureus菌液1mL与250μL的样品共同孵育1小时,稀释103,取100μL涂板,放入生化培养箱15小时后,对琼脂平板上长出的菌落数进行计数,每个样平行测定三次(图12)。
如附图12的结果所示,GKRWWKWWRR的浓度对S.aureus的存活率有明显的抑制作用,且浓度越大抑制效果越好。当浓度为10μM时,S.aureus的存活率仅为9%,即MIC90为10μM。
对比实施例2
1、FAM-AMP的合成
1)AMP的合成
AMP是基于带有Fmoc保护基团的2-Chlorotrityl Chloride树脂,通过固相多肽合成法得到。具体为:分别称取相当于树脂5倍摩尔量的氨基酸(经化学修饰的α-氨基酸)、HBTU、HOBT,溶于DMF中,加入DIEA偶联30min。然后加入20%哌啶反应30min脱去Fmoc保护基,重复此步骤直达合成所需的肽链(GKRWWKWWRR)。
2)5-FAM荧光素标记AMP
称取30mg树脂(上述合成的有肽链的树脂),和相当于树脂3倍摩尔量的5-FAM、HOBT、EDC溶解于1mL DMF中,加入10μL DIEA避光过夜反应,最后用切割液将标记的多肽从树脂上裂解下来,经HPLC纯化,分子量通过LC-MS确定。
这条序列仅是抗菌序列,没有酶切序列,所以不能特异识别S.aureus菌分泌的明胶酶。
Claims (6)
1.一种含明胶酶酶切序列的抗菌剂FAM-AMP,其特征在于,所述的抗菌剂为荧光剂标记的含明胶酶酶切位点的抗菌肽。
2.根据权利要求1所述的抗菌剂,其特征在于,所述荧光剂为5-FAM,其最大吸收为492nm,荧光发射为518nm。
3.根据权利要求1所述的抗菌剂,其特征在于,所述含明胶酶酶切位点的抗菌肽AMP的氨基酸序列为GKRWWKWWRRPLGVRGC,其中,GKRWWKWWRR为抗菌肽,PLGVRG为明胶酶酶切序列。
4.根据权利要求1所述的抗菌剂,其特征在于,所述AMP采用常规的Fmoc固相法合成,即固相树脂上被Fmoc保护的单体氨基酸去保护后露出氨基,通过缩合反应与溶液中氨基酸的羧基形成肽键,从而将氨基酸连接到树脂上,使肽链从C端向N端延伸,直至合成所需肽链。
5.根据权利要求1所述的抗菌剂,其特征在于,荧光剂5-FAM标记AMP的方法为:称取相当于带有多肽的树脂3倍摩尔量的5-FAM、HOBT、EDC溶解于DMF中,加入DIEA避光过夜反应,最后用切割液将标记的多肽从树脂上裂解下来,经过HPLC进行纯化,并通过质谱进行分析。
6.一种根据权利要求1所述的抗菌剂的应用,其特征在于,所述抗菌剂FAM-AMP用作抗菌剂,并用于荧光毛细管电泳检测S.aureus菌的菌浓度。
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