CN104672307B - 一种提高阳离子短肽抗菌性和稳定性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种提高阳离子短肽抗菌性和稳定性的方法，属于抗菌药物技术领域。该方法主要包括利用具有负电性的多阴离子诱导阳离子短肽组装形成水溶性阳离子多聚体进而增强阳离子短肽与细菌细胞膜间的键合能力，同时有效避免传统阳离子短肽在细菌细胞膜表面的缓慢迁移、聚集等不足，最终极大提高了阳离子短肽的抗菌性及稳定性。这种方法的优势在于通过简单、方便的步骤提高了阳离子短肽抗菌性和稳定性的目的。此外，这种方法突破了传统抗菌肽序列过长、合成复杂、价格昂贵、难以批量合成、稳定性差等限制，极大扩展了抗菌肽的种类范围，有望在多肽抗菌药物的开发、筛选及应用方面发挥重要作用。
Description
技术领域
本发明属于抗菌药物技术领域，具体涉及一种提高阳离子短肽抗菌性和稳定性的有效方法。
背景技术
细菌感染所引起的疾病危害严重威胁着人类健康和生命安全。虽然人们合成了众多抗菌药物(又称抗生素)来抑制细菌的活性，但抗生素在临床上的大量应用使细菌的抗药性明显增加(Stark,M.；Liu,L.-P.andDeber,C.M.Antimicrob.AgentsChemother.,2002,46,3585-3590.)，有的甚至产生了多重抗药性，引发重大公共安全事故。如上世纪50年代欧美地区发生的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistantStphylococcusaureus，简称MRSA)感染很快蔓延至全球，导致约5000万人被感染，50多万人死亡。随后，探索、开发具有持久功效的新型抗菌药物成为全球科研工作者的重要任务。人们经过大量研究发现天然阳离子肽可通过静电作用吸附到细菌细胞膜表面，进而在细胞膜表面迁移、组装、聚集，最终导致细菌细胞的瓦解、凋亡(Herzog,I.M.andFridman,M.,Med.Chem.Commun.,2014,5,1014-1026)。这种通过破坏细胞膜而引起细菌死亡的方式不易使细菌对其产生抗药性，因此，阳离子肽有望作为广谱抗菌剂用以解决人类社会共同面临的细菌抗药性问题。迄今为止，通过人工合成或天然提取的抗菌阳离子肽已经超过2500种(参见抗菌肽数据库http://aps.unmc.edu/AP/main.php)，其中有99％以上的抗菌肽是包含多个氨基酸残基(氨基酸数12-50)的两亲性长链肽，而两亲性短链抗菌肽(氨基酸数小于10)的数量只占不到0.5％。尽管长链抗菌肽具有高效的抗菌生物活性，但其作为临床药物使用还存在产率低、成本高、价格昂贵、难以大批量生产、稳定性差及体内循环寿命短等缺点。
与长链肽相比，阳离子短肽的制备简单，产率较高，成本低，有利于批量合成，是理想的临床药物(Won,A.；Pripotnev,S.；Ruscito,A.andIanoul,A.J.Phys.Chem.B,2011,115,2371-2379)。然而，大多数合成的阳离子短肽其抗菌性严重不足，难以满足实际要求。
发明内容
本发明的目的是提供一种简单、有效的方法用以提高阳离子短肽的生物抗菌性和稳定性，为抗菌肽的低成本开发，筛选及应用提供重要参考。
提高阳离子短肽的抗菌性及稳定性将是开发低成本抗菌药物的有效途径。本发明通过引入客体分子来调控阳离子短肽的构象及聚集状态，利用两者的协同组装解决阳离子短肽抗菌性低和稳定性差等问题。考虑到阳离子短肽的正电性特征及自排斥效应，选用具有负电性的多阴离子客体来屏蔽自排斥作用，同时利用具有负电性的多阴离子客体的尺寸效应及特定的刚性结构诱导阳离子短肽的二级结构发生变化。具有负电性的多阴离子客体可与阳离子短肽通过多重离子键合作用相连接，相邻肽链之间进一步通过氢键、疏水及π-π作用形成有序的组装体。得到的有序组装体有效增加了阳离子短肽与细菌细胞膜的键合强度从而表现出很好的抗菌性。同时，协同组装过程也将阳离子短肽极易降解的活性位点包埋在组装体中降低了阳离子短肽与混合人血清中酶的接触，提高了稳定性。
具有负电性的多阴离子客体与阳离子短肽通过离子自组装形成宽为10～16纳米，长为0.3～3微米的纤维状阳离子多聚体。阳离子多聚体对革兰阴性菌和革兰阳性菌具有很好的抑制效果。此外，与单独的阳离子短肽相比，多聚体在混合人血清中的降解速率大大降低，稳定性明显提高。
本发明包括以下步骤：
(1)阳离子短肽的制备：
本发明涉及的阳离子短肽(氨基酸残基数低于8)其基本结构由亲水的碱性L-氨基酸(如赖氨酸)和含疏水基团(如甲基，苯环，吲哚环，偶氮苯等)的L-氨基酸构成。阳离子短肽的合成可通过标准的微波辅助固相法实现：以酰胺树脂为基材，以9-芴甲氧羰基保护的L-氨基酸为原料，干燥后的N,N-二甲基甲酰胺(纯度大于99.5％)为反应溶剂，苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐为偶联试剂，N,N-二异丙基乙胺为活化剂进行氨基酸缩合偶联反应，哌啶为去保护试剂除去9-芴甲氧羰基基团。通过反复的9-芴甲氧羰基保护的L-氨基酸缩合偶联以及去除9-芴甲氧羰基保护基等步骤在酰胺树脂表面依次偶联相应的9-芴甲氧羰基保护的L-氨基酸。本发明中选用的9-芴甲氧羰基-L-氨基酸包括：9-芴甲氧羰基-叔丁基氧羰基-L-赖氨酸，9-芴甲氧羰基-叔丁基氧羰基-L-色氨酸，9-芴甲氧羰基-L-苯丙氨酸，9-芴甲氧羰基-L-丙氨酸等商品化的氨基酸，以及化学合成的9-芴甲氧羰基-4’-偶氮苯基-L-苯丙氨酸(合成详见文献Chem.Commun.,2012,48,8796-8798)。待偶联反应完成后，利用三氟乙酸将酰胺树脂与阳离子肽链剥离，获得设定的阳离子短肽，其结构式如下所示：
其中，阳离子短肽序列按照从N端到C端的顺序分别描述如下：KazoKazoKazoK；KazoKWKazoK；KazoKFKazoK；KazoKAKazoK；KWKazoKWK；KazoKazoK(K代表赖氨酸，W代表色氨酸，F代表苯丙氨酸，A代表丙氨酸，azo代表4’-偶氮苯基-L-苯丙氨酸)。
(2)阳离子多聚体的制备：
本发明中选用的具有负电性的多阴离子客体为Na3AlMo6O18(OH)6、H4SiW12O40、K6P2W18O62、1,3,6,8-芘四磺酸钠盐或四苯基卟啉四磺酸。具体步骤如下：
①阳离子短肽和具有负电性的多阴离子客体分别溶于二次蒸馏水中得澄清、透明溶液，控制阳离子短肽的赖氨酸数与具有负电性的多阴离子客体的电荷数之间的比例为4:1～2:1，在室温搅拌的条件下将具有负电性的多阴离子客体水溶液逐滴加入到阳离子短肽水溶液中，最终得到阳离子短肽浓度为0.05～0.5mg/mL的水溶液；
②将上述溶液继续搅拌1h～3h，并在4～40℃温度范围内静置12～48h，在这一过程中具有负电性的多阴离子客体通过静电相互作用诱导阳离子短肽从无规构象转变为β折叠构象，随后组装成表面为赖氨酸基团的阳离子多聚体；从而实现阳离子短肽的抗菌性和稳定性的提高。所得到的阳离子多聚体是由具有负电性的多阴离子客体与阳离子短肽交替排列形成的宽为10～16纳米、长为0.3～3微米的纤维状结构。
(3)阳离子多聚体的抗菌性和稳定性：
将细菌细胞培养液(革兰阴性菌如大肠杆菌、酵母菌，革兰阳性菌如黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌)加入无菌的试管中，向试管中加入阳离子多聚体溶液，最终阳离子短肽的浓度为0.05～0.077mg/mL；将上述配好的样品置于转数为80～240转/分且温度为37℃的恒温摇床中培养。取不同培养时间(0～525分钟)的上述溶液，用核酸蛋白测定仪测定相应的光密度值(OD600)，以评价阳离子多聚体的抗菌性。
商品化的混合人血清稀释10倍，将稀释后的混合人血清水溶液与阳离子多聚体混合，使得最终阳离子短肽的浓度为0.05～0.1mg/mL，混合人血清体积分数为0.08～0.16％。所得溶液置于转数为80～240转/分且温度为37℃的恒温摇床中培养。取不同培养时间(0～24小时)的上述溶液，分别用高效液相色谱仪及质谱分析仪研究阳离子多聚体在混合人血清水溶液中的稳定性。
本发明利用具有负电性的多阴离子客体诱导阳离子短肽在水溶液中组装形成稳定的阳离子多聚体，这种协同组装所形成的阳离子多聚体有效增加了阳离子短肽与细菌细胞膜的作用强度，表现出很好的抗菌性。同时，协同组装过程也将阳离子短肽极易降解的活性位点包埋在组装体中降低了阳离子短肽与混合人血清中酶的接触，提高了稳定性。
本发明采用的方法操作简便，条件温和，尤其适用于成本低廉、抗菌性不足的阳离子短肽。此外，这种方法突破了传统抗菌肽序列过长、合成复杂、价格昂贵、难以批量合成、稳定性差等限制，极大扩展了抗菌肽的种类范围。
附图说明
图1：实施例1中KazoKazoKazoK的基质辅助激光解析飞行时间质谱；
图2：实施例1中KazoKazoK的基质辅助激光解析飞行时间质谱；
图3：实施例1中KazoKazoKazoK和Na3AlMo6O18(OH)6形成的阳离子多聚体的透射电镜照片；
图4：实施例1中KazoKazoKazoK和Na3AlMo6O18(OH)6形成的阳离子多聚体在水溶液中的表面电势图；
图5：实施例1中大肠杆菌分别在空白水溶液，KazoKazoKazoK浓度为0.05mg/mL的水溶液，Na3AlMo6O18(OH)6浓度为0.02mg/mL的水溶液，以及KazoKazoKazoK和Na3AlMo6O18(OH)6形成的阳离子多聚体水溶液(其中KazoKazoKazoK浓度为0.05mg/mL，Na3AlMo6O18(OH)6浓度为0.02mg/mL)中的生长曲线；
图6：实施例1中KazoKazoKazoK以及KazoKazoKazoK和Na3AlMo6O18(OH)6形成的阳离子多聚体在混合人血清水溶液中随培养时间变化的降解曲线。
具体实施方式
以下实施实例对本发明做更详细的描述，但所述实例不构成对本发明的限制。
实施例1
1、阳离子短肽的制备：
阳离子短肽的合成可通过标准的微波辅助固相法实现：以酰胺树脂为基材，以9-芴甲氧羰基保护的L-氨基酸为原料，干燥后的N,N-二甲基甲酰胺(纯度大于99.5％)为反应溶剂，苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐为偶联试剂，N,N-二异丙基乙胺为活化剂进行氨基酸缩合偶联反应，哌啶为去保护试剂除去9-芴甲氧羰基基团。通过反复的L-氨基酸缩合偶联以及去除9-芴甲氧羰基保护基等步骤在酰胺树脂表面依次偶联相应的9-芴甲氧羰基保护的L-氨基酸。
实施例1－1：
叔丁基氧羰基-4-偶氮苯基-L-苯丙氨酸的合成：将2g叔丁基氧羰基-4-氨基-L-苯丙氨酸溶于200mL冰醋酸中，然后向其中快速加入1.156g亚硝基苯，室温搅拌8h。反应完成后向反应液中加入300mL饱和的碳酸氢钠水溶液，以上溶液用乙酸乙酯萃取3次，收集乙酸乙酯相用无水硫酸镁干燥、，过滤所得滤液浓缩后用硅胶柱对粗产物进行纯化。展开剂二氯：甲醇＝1：1(体积比)，得到1.64g黄色固体产物，产率为65％。
9-芴甲氧羰基-4-偶氮苯基-L-苯丙氨酸的合成：取1g上述得到的叔丁基氧羰基-4-偶氮苯基-L-苯丙氨酸和50mL二氯甲烷加入到250mL圆底烧瓶中，在0℃冰浴、氮气保护的条件下，向其中缓慢加入40mL三氟乙酸，滴加完成后继续室温搅拌5～6h。反应液旋转蒸发得4-偶氮苯基-L-苯丙氨酸。将4-偶氮苯基-L-苯丙氨酸溶于40mL二氧六环中，在冰浴0℃情况下向其中加入100mL质量分数为10％的碳酸钠水溶液，然后将50mL含0.76g9-芴甲氧羰酰琥珀酰亚胺的二氧六环溶液滴加到上述混合溶液中，在0℃冰浴下搅拌1h，继续室温搅拌20h。反应完成后，向反应液中加入150mL二次蒸馏水，溶液冷却到0℃，用6mol/L的盐酸将溶液pH值调到2。最终得到的悬浮液用乙酸乙酯萃取3～4次，收集乙酸乙酯溶液，并用无水硫酸钠进行干燥，过滤所得滤液用旋转蒸发仪浓缩，用柱层层析法进行纯化。用乙酸乙酯和甲醇体积比为20：1的混合溶剂作展开剂，得0.67g9-芴甲氧羰基-4-偶氮苯基-L-苯丙氨酸，产率为50％。
KazoKazoKazoK(分子量1283.5g/mol)的合成：将150mg酰胺树脂(0.60mmol/g,AdvancedChemTech)溶于含5mL二氯甲烷的反应管中浸泡3h，抽滤，并向反应管中加入1mL含20％(20％为哌啶与N,N-二甲基甲酰胺的体积比)哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液在微波反应器中反应3min进行脱保护处理，反应完成后，抽滤，酰胺树脂依次用N,N-二甲基甲酰胺冲洗2次，二氯甲烷冲洗2次，N,N-二甲基甲酰胺冲洗1次。将85mg9-芴甲氧羰基-叔丁基氧羰基-L-赖氨酸、103.5mg苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐及60uLN,N-二异丙基乙胺溶于1mLN,N-二甲基甲酰胺中，所得混合溶液全部加入到上述含酰胺树脂的反应管中进行9-芴甲氧羰基-叔丁基氧羰基-L-赖氨酸偶联反应，在微波反应器中反应7min，抽滤，酰胺树脂依次用DMF冲洗2次，二氯甲烷冲洗2次，N,N-二甲基甲酰胺冲洗1次，按照以上相同步骤进行脱保护处理。将89mg9-芴甲氧羰基-4-偶氮苯基-L-苯丙氨酸、103.5mg苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐及60uLN,N-二异丙基乙胺溶于1mLN,N-二甲基甲酰胺中，所得混合溶液全部加入到上述含酰胺树脂的反应管中进行9-芴甲氧羰基-4-偶氮苯基-L-苯丙氨酸偶联反应，在微波反应器中反应7min，抽滤，依次用N,N-二甲基甲酰胺冲洗2次，二氯甲烷冲洗2次，N,N-二甲基甲酰胺冲洗1次。按照以上脱保护及偶联反应步骤依次偶联9-芴甲氧羰基-叔丁基氧羰基-L-赖氨酸，9-芴甲氧羰基-4-偶氮苯基-L-苯丙氨酸，9-芴甲氧羰基-叔丁基氧羰基-L-赖氨酸，9-芴甲氧羰基-4-偶氮苯基-L-苯丙氨酸，9-芴甲氧羰基-叔丁基氧羰基-L-赖氨酸。反应完成后，向反应管中加入3mL含三氟乙酸、苯甲醚、水、三异丙基硅烷(体积比为88：5：5：2)的混合溶液，并在转数为480转/分且温度为25℃的恒温摇床中持续振荡3h。反应完成后将过滤所得溶液加入到10mL冰***中，在转数为9000转/分的离心机上离心3min得KazoKazoKazoK粗产物沉淀。将沉淀溶于5mL含0.1％三氟乙酸的乙腈溶液并向其中加入5mL含0.1％三氟乙酸的水溶液，所得混合溶液用孔径为0.45um的聚四氟乙烯滤膜过滤，在配有C18反相柱的高效液相色谱仪上进行纯化，并用基质辅助激光解析飞行时间质谱仪确定KazoKazoKazoK的准确分子量(如附图1所示)。其中，质荷比(m/z)1283.76为[KazoKazoKazoK+H]+，质荷比(m/z)1305.74为[KazoKazoKazoK+Na]+，质荷比(m/z)1321.73为[KazoKazoKazoK+K]+。
实施例1－2：
KazoKazoK(分子量903.5g/mol)的合成：如实施例1－1所示，其它条件不变，按照实施例1－1所述脱保护及偶联反应步骤在酰胺树脂上依次偶联9-芴甲氧羰基-叔丁基氧羰基-L-赖氨酸，9-芴甲氧羰基-4-偶氮苯基-L-苯丙氨酸，9-芴甲氧羰基-叔丁基氧羰基-L-赖氨酸，9-芴甲氧羰基-4-偶氮苯基-L-苯丙氨酸，9-芴甲氧羰基-叔丁基氧羰基-L-赖氨酸。反应完成后，向反应管中加入3mL含三氟乙酸、苯甲醚、水、三异丙基硅烷(体积比为88：5：5：2)的混合溶液，并在转数为480转/分且温度为25℃的恒温摇床中持续振荡3h。反应完成后将过滤所得溶液加入到10mL冰***中，在转数为9000转/分的离心机上离心3min得KazoKazoK粗产物沉淀。将沉淀溶于5mL含0.1％三氟乙酸的乙腈溶液并向其中加入5mL含0.1％三氟乙酸的水溶液，所得混合溶液用孔径为0.45um的聚四氟乙烯滤膜过滤，在配有C18反相柱的高效液相色谱仪上进行纯化，并用基质辅助激光解析飞行时间质谱仪确定KazoKazoK的准确分子量(如附图2所示)。其中，质荷比(m/z)904.71为[KazoKazoK+H]+，质荷比(m/z)926.71为[KazoKazoK+Na]+，质荷比(m/z)942.68为[KazoKazoK+K]+。
2、阳离子多聚体的制备：
将0.51mgKazoKazoKazoK(分子量为1283.5g/mol)溶于1mL二次蒸馏水中，0.16mgNa3AlMo6O18(OH)6(分子量为1205.7g/mol)溶于3mL二次蒸馏水中，待二者完全溶解得澄清、透明溶液。控制KazoKazoKazoK中的赖氨酸数与Na3AlMo6O18(OH)6的电荷数之间的比例为4：1，在室温搅拌的条件下将3mL Na3AlMo6O18(OH)6的水溶液全部加入到1mLKazoKazoKazoK的水溶液中，溶液继续搅拌2h，并室温静置36h得到稳定的阳离子多聚体(其中KazoKazoKazoK的最终浓度为0.125mg/mL)。多聚体的形貌(如附图3所示)及表面电位(如附图4所示)分别用透射电子显微镜及电位分析仪进行表征。
附图3是KazoKazoKazoK和Na3AlMo6O18(OH)6形成的阳离子多聚体的透射电镜图。从图中可以看出，多聚体呈现纤维状纳米结构，其宽度为12～14纳米，长度为0.8～1.6微米。
附图4是KazoKazoKazoK和Na3AlMo6O18(OH)6形成的阳离子多聚体的在水溶液中的表面电位图。从图中可以看出，多聚体的表面电位为+43.4mV，说明多聚体表面显正电性。
3、抗菌实验测试：
1)培养基的制备：将10g蛋白胨，5g酵母提取物，溶于1L二次蒸馏水中，并在130℃条件下对其进行高温灭菌20分钟，得新鲜的培养基。将大肠杆菌(BL21-gold(DE3))挑菌到20mL上述新鲜的培养基中，并置于转数为160转/分且温度为37℃的恒温摇床中培养14h。随后用新鲜的培养基将所得大肠杆菌培养液稀释到OD600值(OD光密度，OD600是指某种溶液在600nm处的吸光值)0.02左右。
2)抗菌样品制备：分别取4份稀释好的大肠杆菌培养液(每份1.5mL)加入到4个无菌试管中，编号为1号，2号，3号，4号。向1号试管中加入1mL二次蒸馏水作为空白实验，制备得总体积为2.5mL的溶液；向2号试管中加入1mL浓度为0.13mg/mL的KazoKazoKazoK水溶液，制备得KazoKazoKazoK的浓度为0.05mg/mL且总体积为2.5mL的抗菌样品溶液；向3号试管中加入1mL浓度为0.05mg/mL的Na3AlMo6O18(OH)6水溶液，制备得Na3AlMo6O18(OH)6的浓度为0.02mg/mL且总体积为2.5mL的抗菌样品溶液；向4号试管中加入1mL KazoKazoKazoK和Na3AlMo6O18(OH)6形成的阳离子多聚体溶液(其中KazoKazoKazoK的浓度为0.13mg/mL)，制备得KazoKazoKazoK的浓度为0.05mg/mL、Na3AlMo6O18(OH)6的浓度为0.02mg/mL且总体积为2.5mL的抗菌样品溶液。分别将上述制好的样品溶液置于转数为160转/分、温度为37℃的恒温摇床中培养，以比较空白水溶液，单独KazoKazoKazoK水溶液，单独Na3AlMo6O18(OH)6水溶液，以及KazoKazoKazoK和Na3AlMo6O18(OH)6形成的阳离子多聚体水溶液的抗菌性。
3)光密度值(OD600)的检测：分别从上述4个试管中取不同培养时间(0，25min，50min，125min，150min，175min，200min，225min，275min，375min)的抗菌样品溶液，用核酸蛋白测定仪测定相应的光密度值(OD600)。OD600值检测过程中，所有的操作均在无菌环境下进行，使用灭菌的移液枪及枪头移取样品，取样时先将样品摇匀再取，每次取100uL样品溶液加入到塑料比色皿中，排除气泡，然后用核酸蛋白测定仪检测OD600值，测试过程中以培养基为背底，实验数据重复三次取平均值。所得数据按光密度值对不同培养时间作图得到大肠杆菌在不同抗菌样品溶液中的生长曲线(如附图5所示)。
附图5是大肠杆菌分别在空白水溶液，KazoKazoKazoK浓度为0.05mg/mL的水溶液，Na3AlMo6O18(OH)6浓度为0.02mg/mL的水溶液，以及KazoKazoKazoK和Na3AlMo6O18(OH)6形成的阳离子多聚体水溶液(其中KazoKazoKazoK浓度为0.05mg/mL，Na3AlMo6O18(OH)6浓度为0.02mg/mL)中的生长曲线。从图中可以看出大肠杆菌在空白水溶液中的光密度值随培养时间延长逐渐从0.046递增到1.22。大肠杆菌在KazoKazoKazoK水溶液以及Na3AlMo6O18(OH)6水溶液中的生长曲线与其在空白水溶液中的生长曲线类似，光密度值分别从0.046递增到1.38以及从0.046递增到1.15。然而，大肠杆菌在KazoKazoKazoK和Na3AlMo6O18(OH)6形成的阳离子多聚体水溶液中的生长情况受到明显抑制，光密度值从0.046缓慢增加到0.28，这说明制备所得的阳离子多聚体对大肠杆菌表现出很好的抗菌性。
4、稳定性实验测试：
将混合人血清水溶液分别加入到含KazoKazoKazoK的水溶液，以及KazoKazoKazoK和Na3AlMo6O18(OH)6形成的阳离子多聚体水溶液中用以比较研究阳离子短肽KazoKazoKazoK在组装前后的稳定性。取5mL混合人血清溶液在转数为5000转/分、温度为4℃的离心机上离心30min，离心所得上清液用孔径为0.45微米的水系膜过滤，所得澄清溶液进一步用无菌水稀释10倍待用。分别将9.6μL稀释后的混合人血清水溶液加入到1.2mL0.05mg/mL的KazoKazoKazoK水溶液以及1.2mLKazoKazoKazoK和Na3AlMo6O18(OH)6形成的阳离子多聚体水溶液中(其中KazoKazoKazoK的浓度为0.05mg/mL)，制备所得的两种溶液中KazoKazoKazoK的浓度均为0.05mg/mL，混合人血清体积分数均为0.08％。将以上两种溶液分别装入12个离心管中，每管100uL，将上述分装后的溶液置于恒温摇床中培养，温度为37℃，转数为160转/分。离心管中样品按如下培养时间(0h，1h，2h，3h，4h，5h，6h，9h，12h，24h)依次取出，并向其中加入400uL含0.1％三氟乙酸的乙腈溶液(0.1％为三氟乙酸与乙腈的体积比)，离心管随后置于转数为160转/分、温度为4℃的恒温摇床中培养1h。培养后的溶液在转数为10000转/分的离心机上离心10min，取上清液用高效液相色谱仪及质谱分析仪检测溶液中剩余KazoKazoKazoK的含量。按KazoKazoKazoK的含量随培养时间的变化曲线评价组装前后KazoKazoKazoK在混合人血清中的稳定性。
附图6是KazoKazoKazoK以及KazoKazoKazoK和Na3AlMo6O18(OH)6形成的阳离子多聚体在混合人血清水溶液中随培养时间变化的降解曲线。从图6可以发现KazoKazoKazoK在混合人血清水溶液中培养1h有50％降解，培养6h后KazoKazoKazoK完全降解。而KazoKazoKazoK和Na3AlMo6O18(OH)6形成的阳离子多聚体在混合人血清中培养6h只降解26.5％，培养16h降解50％，培养24h后才完全降解，说明KazoKazoKazoK和Na3AlMo6O18(OH)6形成的阳离子多聚体明显提高了KazoKazoKazoK在混合人血清中的稳定性。
实施例2
如实施例1所示，其他条件不变，将Na3AlMo6O18(OH)6的质量改成0.21mg，此时KazoKazoKazoK中含有的赖氨酸数与Na3AlMo6O18(OH)6之间的电荷数的比例为3：1，重复以上阳离子多聚体的制备过程，制得宽为12～14纳米，长度为1.7～2微米的纤维状结构的阳离子多聚体。然后按实施例1的步骤分别检测KazoKazoKazoK和Na3AlMo6O18(OH)6形成的阳离子多聚体的抗菌性及稳定性。核酸蛋白测定仪测得大肠杆菌在空白水溶液中的光密度值随培养时间延长逐渐从0.046递增到1.22。大肠杆菌在KazoKazoKazoK水溶液以及Na3AlMo6O18(OH)6水溶液中的生长曲线与其在空白水溶液中的生长曲线类似，光密度值分别从0.046递增到1.38以及从0.046递增到1.15。然而，大肠杆菌在KazoKazoKazoK和Na3AlMo6O18(OH)6形成的阳离子多聚体水溶液中的生长情况受到明显抑制，光密度值从0.046缓慢增加到0.19，这说明制备所得的阳离子多聚体对大肠杆菌表现出很好的抗菌性。高效液相色谱仪及质谱分析仪测得KazoKazoKazoK在混合人血清水溶液中培养1h有50％降解，培养6h后KazoKazoKazoK完全降解。而KazoKazoKazoK和Na3AlMo6O18(OH)6形成的阳离子多聚体在混合人血清中培养6h只降解20％，培养16.5h降解50％，培养24h后才完全降解，说明KazoKazoKazoK和Na3AlMo6O18(OH)6形成的阳离子多聚体明显提高了KazoKazoKazoK在混合人血清中的稳定性。
实施例3
如实施例1所示，其他条件不变，将Na3AlMo6O18(OH)6的质量改成0.32mg，此时KazoKazoKazoK中含有的赖氨酸数与Na3AlMo6O18(OH)6之间的电荷数的比例为2：1，重复以上阳离子多聚体的制备过程，制得宽度为12～14纳米，长度为2～2.5微米的纤维状结构的阳离子多聚体。然后按实施例1的步骤分别检测KazoKazoKazoK和Na3AlMo6O18(OH)6形成的阳离子多聚体的抗菌性及稳定性。核酸蛋白测定仪测得大肠杆菌在空白水溶液中的光密度值随培养时间延长逐渐从0.046递增到1.22。大肠杆菌在KazoKazoKazoK水溶液以及Na3AlMo6O18(OH)6水溶液中的生长曲线与其在空白水溶液中的生长曲线类似，光密度值分别从0.046递增到1.41以及从0.046递增到1.35。然而，大肠杆菌在KazoKazoKazoK和Na3AlMo6O18(OH)6形成的阳离子多聚体水溶液中的生长情况受到明显抑制，光密度值从0.046缓慢增加到0.25，这说明制备所得的阳离子多聚体对大肠杆菌表现出很好的抗菌性。高效液相色谱仪及质谱分析仪测得KazoKazoKazoK在混合人血清水溶液中培养1h有50％降解，培养6h后KazoKazoKazoK完全降解。而KazoKazoKazoK和Na3AlMo6O18(OH)6形成的阳离子多聚体在混合人血清中培养6h只降解19％，培养18h降解50％，培养24h后才完全降解，说明KazoKazoKazoK和Na3AlMo6O18(OH)6形成的阳离子多聚体明显提高了KazoKazoKazoK在混合人血清中的稳定性。
实施例4
如实施例1所示，其他条件不变，将0.16mgNa3AlMo6O18(OH)6改成溶于1mL二次蒸馏水中，在室温不断搅拌的条件下将1mL的Na3AlMo6O18(OH)6水溶液全部加入到1mLKazoKazoKazoK的水溶液中，最终KazoKazoKazoK的浓度为0.25mg/mL，重复以上阳离子多聚体的制备过程，制得宽为12～14纳米，长度为2.1～2.5微米的纤维状结构的阳离子多聚体。然后按实施例1的步骤分别检测KazoKazoKazoK和Na3AlMo6O18(OH)6形成的阳离子多聚体的抗菌性及稳定性。核酸蛋白测定仪测得大肠杆菌在空白水溶液中的光密度值随培养时间延长逐渐从0.046递增到1.22。大肠杆菌在KazoKazoKazoK水溶液以及Na3AlMo6O18(OH)6水溶液中的生长曲线与其在空白水溶液中的生长曲线类似，光密度值分别从0.046递增到1.28以及从0.046递增到1.27。然而，大肠杆菌在KazoKazoKazoK和Na3AlMo6O18(OH)6形成的阳离子多聚体水溶液中的生长情况受到明显抑制，光密度值从0.046缓慢增加到0.32，这说明制备所得的阳离子多聚体对大肠杆菌表现出很好的抗菌性。高效液相色谱仪及质谱分析仪测得KazoKazoKazoK在混合人血清水溶液中培养1h有50％降解，培养6h后KazoKazoKazoK完全降解。而KazoKazoKazoK和Na3AlMo6O18(OH)6形成的阳离子多聚体在混合人血清中培养6h只降解23％，培养17h降解50％，培养24h后才完全降解，说明KazoKazoKazoK和Na3AlMo6O18(OH)6形成的阳离子多聚体明显提高了KazoKazoKazoK在混合人血清中的稳定性。
实施例5
如实施例1所示，其他条件不变，将KazoKazoKazoK的质量改成1.02mg溶于1mL二次蒸馏水中,Na3AlMo6O18(OH)6的质量改成0.32mg溶于1mL二次蒸馏水中，在室温不断搅拌的条件下将1mL的Na3AlMo6O18(OH)6水溶液全部加入到1mLKazoKazoKazoK的水溶液中，最终KazoKazoKazoK的浓度为0.5mg/mL，重复以上阳离子多聚体的制备过程，制得宽为10～14纳米，长度为2.2～3微米的纤维状结构的阳离子多聚体。然后按实施例1的步骤分别检测KazoKazoKazoK和Na3AlMo6O18(OH)6形成的阳离子多聚体的抗菌性及稳定性。核酸蛋白测定仪测得大肠杆菌在空白水溶液中的光密度值随培养时间延长逐渐从0.046递增到1.22大肠杆菌在KazoKazoKazoK水溶液以及Na3AlMo6O18(OH)6水溶液中的生长曲线与其在空白水溶液中的生长曲线类似，光密度值分别从0.046递增到1.18以及从0.046递增到1.3。然而，大肠杆菌在KazoKazoKazoK和Na3AlMo6O18(OH)6形成的阳离子多聚体水溶液中的生长情况受到明显抑制，光密度值从0.046缓慢增加到0.34，这说明制备所得的阳离子多聚体对大肠杆菌表现出很好的抗菌性。高效液相色谱仪及质谱分析仪测得KazoKazoKazoK在混合人血清水溶液中培养1h有50％降解，培养6h后KazoKazoKazoK完全降解。而KazoKazoKazoK和Na3AlMo6O18(OH)6形成的阳离子多聚体在混合人血清中培养6h只降解27％，培养19h降解50％，培养24h后才完全降解，说明KazoKazoKazoK和Na3AlMo6O18(OH)6形成的阳离子多聚体明显提高了KazoKazoKazoK在混合人血清中的稳定性。
实施例6
如实施例1所示，其他条件不变，将0.51mgKazoKazoKazoK改成0.49mgKazoKWKazoK(分子量1218.5g/mol)，重复以上阳离子多聚体的制备过程，制得宽为11～15纳米，长度为2～2.4微米的纤维状结构的阳离子多聚体。然后按实施例1的步骤分别检测KazoKWKazoK和Na3AlMo6O18(OH)6形成的阳离子多聚体的抗菌性及稳定性。核酸蛋白测定仪测得大肠杆菌在空白水溶液中的光密度值随培养时间延长逐渐从0.05递增到1.22。大肠杆菌在KazoKWKazoK水溶液以及Na3AlMo6O18(OH)6水溶液中的生长曲线与其在空白水溶液中的生长曲线类似，光密度值分别从0.05递增到1.28以及从0.05递增到1.18。然而，大肠杆菌在KazoKWKazoK和Na3AlMo6O18(OH)6形成的阳离子多聚体水溶液中的生长情况受到明显抑制，光密度值从0.05缓慢增加到0.21，这说明制备所得的阳离子多聚体对大肠杆菌表现出很好的抗菌性。高效液相色谱仪及质谱分析仪测得KazoKWKazoK在混合人血清水溶液中培养1h有50％降解，培养6h后KazoKWKazoK完全降解。而KazoKWKazoK和Na3AlMo6O18(OH)6形成的阳离子多聚体在混合人血清中培养6h只降解29％，培养20h降解50％，培养24h后才完全降解，说明KazoKWKazoK和Na3AlMo6O18(OH)6形成的阳离子多聚体明显提高了KazoKWKazoK在混合人血清中的稳定性。
实施例7
如实施例1所示，其他条件不变，将0.51mgKazoKazoKazoK改成0.47mgKazoKFKazoK(分子量1179.5g/mol)，重复以上阳离子多聚体的制备过程，制得宽为12～14纳米，长度为1.8～2.6微米的纤维状结构的阳离子多聚体。然后按实施例1的步骤分别检测KazoKFKazoK和Na3AlMo6O18(OH)6形成的阳离子多聚体的抗菌性及稳定性。核酸蛋白测定仪测得大肠杆菌在空白水溶液中的光密度值随培养时间延长逐渐从0.056递增到1.22。大肠杆菌在KazoKFKazoK水溶液以及Na3AlMo6O18(OH)6水溶液中的生长曲线与其在空白水溶液中的生长曲线类似，光密度值分别从0.056递增到1.32以及从0.056递增到1.32。然而，大肠杆菌在KazoKFKazoK和Na3AlMo6O18(OH)6形成的阳离子多聚体水溶液中的生长情况受到明显抑制，光密度值从0.056缓慢增加到0.18，说明制备所得的阳离子多聚体对大肠杆菌表现出很好的抗菌性。高效液相色谱仪及质谱分析仪测得KazoKFKazoK在混合人血清水溶液中培养1h有50％降解，培养6h后KazoKFKazoK完全降解。而KazoKFKazoK和Na3AlMo6O18(OH)6形成的阳离子多聚体在混合人血清中培养6h只降解22％，培养17.5h降解50％，培养24h后才完全降解，说明KazoKFKazoK和Na3AlMo6O18(OH)6形成的阳离子多聚体明显提高了KazoKFKazoK在混合人血清中的稳定性。
实施例8
如实施例1所示，其他条件不变，将0.51mgKazoKazoKazoK改成0.44mgKazoKAKazoK(分子量1103.4g/mol)，重复以上阳离子多聚体的制备过程，制得宽为12～14纳米，长度为1.8～2.2微米的纤维状结构的阳离子多聚体。然后按实施例1的步骤分别检测KazoKAKazoK和Na3AlMo6O18(OH)6形成的阳离子多聚体的抗菌性及稳定性。核酸蛋白测定仪测得大肠杆菌在空白水溶液中的光密度值随培养时间延长逐渐从0.061递增到1.22。大肠杆菌在KazoKAKazoK水溶液以及Na3AlMo6O18(OH)6水溶液中的生长曲线与其在空白水溶液中的生长曲线类似，光密度值分别从0.061递增到1.19以及从0.064递增到1.23。然而，大肠杆菌在KazoKAKazoK和Na3AlMo6O18(OH)6形成的阳离子多聚体水溶液中的生长情况受到明显抑制，光密度值从0.064缓慢增加到0.3，这说明制备所得的阳离子多聚体对大肠杆菌表现出很好的抗菌性。高效液相色谱仪及质谱分析仪测得KazoKAKazoK在混合人血清水溶液中培养1h有50％降解，培养6h后KazoKAKazoK完全降解。而KazoKAKazoK和Na3AlMo6O18(OH)6形成的阳离子多聚体在混合人血清中培养6h只降解25％，培养17.3h降解50％，培养24h后才完全降解，说明KazoKAKazoK和Na3AlMo6O18(OH)6形成的阳离子多聚体明显提高了KazoKAKazoK在混合人血清中的稳定性。
实施例9
如实施例1所示，其他条件不变，将0.51mgKazoKazoKazoK改成0.46mgKWKazoKWK(分子量1153.4g/mol)，重复以上阳离子多聚体的制备过程，制得宽为11～15纳米，长度为1.3～2.3微米的纤维状结构的阳离子多聚体。然后按实施例1的步骤分别检测KWKazoKWK和Na3AlMo6O18(OH)6形成的阳离子多聚体的抗菌性及稳定性。核酸蛋白测定仪测得大肠杆菌在空白水溶液中的光密度值随培养时间延长逐渐从0.056递增到1.22。大肠杆菌在KWKazoKWK水溶液以及Na3AlMo6O18(OH)6水溶液中的生长曲线与其在空白水溶液中的生长曲线类似，光密度值分别从0.056递增到1.09以及从0.056递增到1.25。然而，大肠杆菌在KWKazoKWK和Na3AlMo6O18(OH)6形成的阳离子多聚体水溶液中的生长情况受到明显抑制，光密度值从0.056缓慢增加到0.33，这说明制备所得的阳离子多聚体对大肠杆菌表现出很好的抗菌性。高效液相色谱仪及质谱分析仪测得KWKazoKWK在混合人血清水溶液中培养1h有50％降解，培养6h后KWKazoKWK完全降解。而KWKazoKWK和Na3AlMo6O18(OH)6形成的阳离子多聚体在混合人血清中培养6h只降解23％，培养17.2h降解50％，培养24h后才完全降解，说明KWKazoKWK和Na3AlMo6O18(OH)6形成的阳离子多聚体明显提高了KWKazoKWK在混合人血清中的稳定性。
实施例10
如实施例1所示，其他条件不变，将0.51mgKazoKazoKazoK改成0.36mgKazoKazoK(分子量904.1g/mol)，重复以上阳离子多聚体的制备过程，制得宽为10～14纳米，长度为0.9～1.5微米的纤维状结构的阳离子多聚体。然后按实施例1的步骤分别检测KazoKazoK和Na3AlMo6O18(OH)6形成的阳离子多聚体的抗菌性及稳定性。核酸蛋白测定仪测得大肠杆菌在空白水溶液中的光密度值随培养时间延长逐渐从0.049递增到1.22。大肠杆菌在KazoKazoK水溶液以及Na3AlMo6O18(OH)6水溶液中的生长曲线与其在空白水溶液中的生长曲线类似，光密度值分别从0.049递增到1.09以及从0.049递增到1.39。然而，大肠杆菌在KazoKazoK和Na3AlMo6O18(OH)6形成的阳离子多聚体水溶液中的生长情况受到明显抑制，光密度值从0.049缓慢增加到0.4，这说明制备所得的阳离子多聚体对大肠杆菌表现出很好的抗菌性。高效液相色谱仪及质谱分析仪测得KazoKazoK在混合人血清水溶液中培养1h有50％降解，培养6h后KazoKazoK完全降解。而KazoKazoK和Na3AlMo6O18(OH)6形成的阳离子多聚体在混合人血清中培养6h只降解23％，培养17.4h降解50％，培养24h后才完全降解，说明KazoKazoK和Na3AlMo6O18(OH)6形成的阳离子多聚体明显提高了KazoKazoK在混合人血清中的稳定性。
实施例11
如实施例1所示，其他条件不变，将0.16mgNa3AlMo6O18(OH)6改成0.29mg H4SiW12O40(分子量为2878.2g/mol)，重复以上阳离子多聚体的制备过程，制得宽为12～14纳米，长度为1.9～2.9微米的纤维状结构的阳离子多聚体。然后按实施例1的步骤分别检测KazoKazoKazoK和H4SiW12O40形成的阳离子多聚体的抗菌性及稳定性。核酸蛋白测定仪测得大肠杆菌在空白水溶液中的光密度值随培养时间延长逐渐从0.046递增到1.22。大肠杆菌在KazoKazoKazoK水溶液以及H4SiW12O40水溶液中的生长曲线与其在空白水溶液中的生长曲线类似，光密度值分别从0.046递增到1.34以及从0.046递增到1.19。然而，大肠杆菌在KazoKazoKazoK和H4SiW12O40形成的阳离子多聚体水溶液中的生长情况受到明显抑制，光密度值从0.046缓慢增加到0.23，这说明制备所得的阳离子多聚体对大肠杆菌表现出很好的抗菌性。高效液相色谱仪及质谱分析仪测得KazoKazoKazoK在混合人血清水溶液中培养1h有50％降解，培养6h后KazoKazoKazoK完全降解。而KazoKazoKazoK和H4SiW12O40形成的阳离子多聚体在混合人血清中培养6h只降解24％，培养15.5h降解50％，培养24h后才完全降解，说明KazoKazoKazoK和H4SiW12O40形成的阳离子多聚体明显提高了KazoKazoKazoK在混合人血清中的稳定性。
实施例12
如实施例1所示，其他条件不变，将0.16mgNa3AlMo6O18(OH)6改成0.46mg K6P2W18O62(分子量为4597.6g/mol)，重复以上阳离子多聚体的制备过程，制得宽为13～16纳米，长度为300～500纳米的纤维状结构的阳离子多聚体。然后按实施例1的步骤分别检测KazoKazoKazoK和K6P2W18O62形成的阳离子多聚体的抗菌性及稳定性。核酸蛋白测定仪测得大肠杆菌在空白水溶液中的光密度值随培养时间延长逐渐从0.046递增到1.22。大肠杆菌在KazoKazoKazoK水溶液以及K6P2W18O62水溶液中的生长曲线与其在空白水溶液中的生长曲线类似，光密度值分别从0.046递增到1.08以及从0.046递增到1.35。然而，大肠杆菌在KazoKazoKazoK和K6P2W18O62形成的阳离子多聚体水溶液中的生长情况受到明显抑制，光密度值从0.046缓慢增加到0.39，这说明制备所得的阳离子多聚体对大肠杆菌表现出很好的抗菌性。高效液相色谱仪及质谱分析仪测得KazoKazoKazoK在混合人血清水溶液中培养1h有50％降解，培养6h后KazoKazoKazoK完全降解。而KazoKazoKazoK和K6P2W18O62形成的阳离子多聚体在混合人血清中培养6h只降解32％，培养21h降解50％，培养24h后才完全降解，说明KazoKazoKazoK和K6P2W18O62形成的阳离子多聚体明显提高了KazoKazoKazoK在混合人血清中的稳定性。
实施例13
如实施例1所示，其他条件不变，将0.16mgNa3AlMo6O18(OH)6改成0.06mg1,3,6,8-苝四磺酸钠盐(分子量为614.4g/mol)，重复以上阳离子多聚体的制备过程，制得宽为12～14纳米，长度为2.5～3微米的纤维状结构的阳离子多聚体。然后按实施例1的步骤分别检测KazoKazoKazoK和1,3,6,8-苝四磺酸钠盐形成的阳离子多聚体的抗菌性及稳定性。核酸蛋白测定仪测得大肠杆菌在空白水溶液中的光密度值随培养时间延长逐渐从0.046递增到1.22。大肠杆菌在KazoKazoKazoK水溶液以及1,3,6,8-苝四磺酸钠盐水溶液中的生长曲线与其在空白水溶液中的生长曲线类似，光密度值分别从0.046递增到1.29以及从0.046递增到1.25。然而，大肠杆菌在KazoKazoKazoK和1,3,6,8-苝四磺酸钠盐形成的阳离子多聚体水溶液中的生长情况受到明显抑制，光密度值从0.046缓慢增加到0.21，这说明制备所得的阳离子多聚体对大肠杆菌表现出很好的抗菌性。高效液相色谱仪及质谱分析仪测得KazoKazoKazoK在混合人血清水溶液中培养1h有50％降解，培养6h后KazoKazoKazoK完全降解。而KazoKazoKazoK和1,3,6,8-苝四磺酸钠盐形成的阳离子多聚体在混合人血清中培养6h只降解22％，培养15h降解50％，培养24h后才完全降解，说明KazoKazoKazoK和1,3,6,8-苝四磺酸钠盐形成的阳离子多聚体明显提高了KazoKazoKazoK在混合人血清中的稳定性。
实施例14
如实施例1所示，其他条件不变，将0.16mgNa3AlMo6O18(OH)6改成0.09mg四苯基卟啉四磺酸(分子量为935g/mol)，重复以上阳离子多聚体的制备过程，制得宽为12～14纳米，长度为2.3～3微米的纤维状结构的阳离子多聚体。然后按实施例1的步骤分别检测KazoKazoKazoK和四苯基卟啉四磺酸形成的阳离子多聚体的抗菌性及稳定性。核酸蛋白测定仪测得大肠杆菌在空白水溶液中的光密度值随培养时间延长逐渐从0.046递增到1.22。大肠杆菌在KazoKazoKazoK水溶液以及四苯基卟啉四磺酸水溶液中的生长曲线与其在空白水溶液中的生长曲线类似，光密度值分别从0.046递增到1.26以及从0.046递增到1.32。然而，大肠杆菌在KazoKazoKazoK和四苯基卟啉四磺酸形成的阳离子多聚体水溶液中的生长情况受到明显抑制，光密度值从0.046缓慢增加到0.28，这说明制备所得的阳离子多聚体对大肠杆菌表现出很好的抗菌性。高效液相色谱仪及质谱分析仪测得KazoKazoKazoK在混合人血清水溶液中培养1h有50％降解，培养6h后KazoKazoKazoK完全降解。而KazoKazoKazoK和四苯基卟啉四磺酸形成的阳离子多聚体在混合人血清中培养6h只降解21％，培养14h降解50％，培养24h后才完全降解，说明KazoKazoKazoK和四苯基卟啉四磺酸形成的阳离子多聚体明显提高了KazoKazoKazoK在混合人血清中的稳定性。
Claims (1)
1.一种提高阳离子短肽抗菌性和稳定性的方法，其步骤如下：
(1)将阳离子短肽和具有负电性的多阴离子客体分别溶于二次蒸馏水中得澄清、透明的溶液，控制阳离子短肽的赖氨酸数与具有负电性多阴离子客体的电荷数之间的比例为4：1～2：1，在室温搅拌的条件下将具有负电性的多阴离子客体水溶液逐滴加入到阳离子短肽水溶液中，最终得到阳离子短肽浓度为0.05～0.5mg/mL的水溶液；
(2)将上述溶液继续搅拌1h～3h，并在4～40℃温度范围内静置12～48h，得到表面为赖氨酸基团、由具有负电性的多阴离子客体与阳离子短肽交替排列形成的纤维状结构的阳离子多聚体，从而实现阳离子短肽的抗菌性和稳定性的提高；
其中，阳离子短肽的结构式如下之一所示，
具有负电性的多阴离子客体为Na3AlMo6O18(OH)6、H4SiW12O40、K6P2W18O62、1,3,6,8-芘四磺酸钠盐或四苯基卟啉四磺酸。
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| "Self-Assembly of Peptide-Inorganic Hybrid Spheres for Adaptive Encapsulation of Guests";Xuehai Yan et al.;《ADVANCE MATERIALS》;20101231(第22期);参见第1283页左栏第1段-右栏第2段，第1286页右栏第1段-第1287页左栏第1段，图1 * |
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