CN110664876B - 一种大枣落果多酚类组分的提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明本发明涉及一种大枣落果多酚类组分的提取方法，该制备工艺包括：(1)将待处理大枣落果打成果浆，制备多酚提取液；(2)将步骤(1)获得的多酚提取液制备粗多酚溶液；(3)将步骤(2)制得的粗多酚溶液经纯化、减压浓缩、真空干燥，制得大枣落果多酚。本申请首次针对我国当前大枣种植产业中尚未开发利用的大量落果资源进行高值化加工，并根据大枣落果中多样化学成分的溶出特点和形态变化，设计了有利于提取其中多酚类成分的提取方法，不仅实现了大枣落果资源的高效利用，提高其附加值，并且操作简单方便，成本低且安全性好，具有重要经济和社会效益。
Description
技术领域
本发明涉及一种大枣落果多酚类组分的提取方法，属于功能食品加工技术领域。
背景技术
大枣与桃、李、栗、杏并称为我国古代五果，其具有补血、健脑、抗癌及健脾强身等功效，被《神农本草经》中列为上品，历代本草中均有收载，在我国已有4000多年食用历史。由于枣果生长过程中树体营养消耗大，枣树在幼果期就开始落果，落果量多时可占总量的80％以上，严重地影响了枣树生产的经济效益。目前我国尚未对大枣落果资源实施有效的开发利用，相关高值化加工技术也比较滞后，大量落果资源被当做饲料或农业垃圾处理，造成了极大的资源浪费。因此，如何利用落果资源生产高附加值产品，进一步提升果农的收益、解除果农的后顾之忧，是大枣产业中亟须解决的问题。
果蔬是天然的植物源食品，富含多种生物活性成分。随着现代科学技术的发展，人们对其中功能成分的研究也愈加深入。多酚是植物次生代谢产物，不但是果蔬营养品质的主要决定因素，也对植物的生长发育、基因表达、信号传导过程具有重要的影响。植物多酚已被证实具有较强的抗氧化作用，能有效预防高血糖、高血脂、心脑血管等慢性疾病，还具有提高免疫力以及抵抗神经性疾病的功效。
现有的植物多酚类产品深受广大消费者欢迎，市场需求也呈不断上升趋势。欧美发达国家对植物多酚加工技术的研究处于领先行列，不仅研究时间长、而且专业化程度高，也开发出许多终端产品，涉及保健品、食品甚至药品多个领域。国际绝大多数植物药厂、保健品和健康食品公司都有自己多酚类制剂的拳头产品，仅银杏黄酮全球一年的销售就在50亿美元左右。
中国专利文献CN103142662A(申请号201310070959.8)公开了一种南酸枣皮中多酚提取纯化的方法，利用乙醇回流提取南酸枣皮多酚，提取液回收乙醇后所得到的南酸枣皮多酚粗提物用正己烷萃取，除去提取液中的非极性物质，再旋转蒸发除去正己烷，离心，采用HP2MGL型大孔吸附树脂对上清液进行纯化，上样后用蒸馏水洗至流出液无浑浊，再用乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液浓缩、冻干，即得南酸枣皮多酚精制品。该方法采用常用的多酚工业制备方法，即有机溶剂提取结合大孔树脂纯化工艺，此类方法提取效果不完善，且操作过程大量使用有机溶剂成本较高、安全性差。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种大枣落果多酚类组分高效提取方法，该方法工艺安全、操作简单，提取率高达90％以上，可以最大限度的获得稳定的大枣多酚类活性组分，该组分具有激活抗氧化酶、提升机体免疫、促进及加速血管新生等功能效果。
发明概述：
本发明针对现有技术的不足，提供一种大枣落果多酚类组分的提取方法。该方法以大枣落果为原料，采用复合pH值提取技术、Ca2+沉淀及聚酰胺树脂层析工艺提取多酚类组分，不仅实现了大枣落果资源的高效回收再利用，也为开发新的植物提取物资源进一步拓宽了思路，具有深远的经济效益和社会效益。
发明详述：
本发明技术方案如下：
一种大枣落果多酚类组分提取方法，包括如下步骤：
(1)将待处理大枣落果打成果浆，用不同pH值的水溶液，依次分别在60～80℃提取30～120min，合并提取液并加入乙醇静置沉淀，收集上清液、调节pH值至中性，过滤，制得多酚提取液；
所述不同pH值的水溶液分别为pH 1.5～3的水溶液、pH 5～7.5的水溶液、pH 8.5～10的水溶液；
(2)将步骤(1)获得的多酚提取液浓缩至乙醇全部去除，加入多酚提取液重量10～15倍的水稀释后，加入CaCl2进行络合反应，过滤收集沉淀物，沉淀物以酸溶液再次溶解，离心收集上清液，制得粗多酚溶液；
(3)将步骤(2)制得的粗多酚溶液上样至聚酰胺树脂柱进行纯化，先用体积百分比5～15％乙醇溶液洗去杂质，然后用体积百分比40％～80％乙醇溶液洗脱，收集合并在紫外波长下有吸收的部分，经减压浓缩、真空干燥，制得大枣落果多酚。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中待处理落果大枣为清洗后的大枣落果。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中待处理大枣质量与每次提取时加入的水溶液的体积比为1：(5～15)。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中不同pH值的水溶液的酸度调节剂为硫酸、盐酸或柠檬酸，碱度调节剂为NaOH或KOH；进一步优选的，所述步骤(1)中不同pH值的水溶液的酸度调节剂为硫酸，碱度调节剂为NaOH。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中不同pH值的水溶液分别为pH 2.0的水溶液、pH6.5的水溶液、pH 9的水溶液。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中提取温度为70℃。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中加入乙醇的量为合并后提取液总质量的50％～90％，静置时间为6～24h；进一步优选的，所述步骤(1)中加入乙醇的量为合并后提取液总质量的65％～80％，静置时间为8～16h；更优选的，所述步骤(1)中加入乙醇的量为合并后提取液总质量的75％，静置时间为12h。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中CaCl2加入至浓度为10～40mg/mL，络合反应温度15～50℃，络合反应时间1～8h；进一步优选的，所述步骤(2)中CaCl2加入至浓度为20～35mg/mL，络合反应温度20～40℃，络合反应时间3～6h；更优选的，所述步骤(2)中CaCl2加入至浓度为25mg/mL，络合反应温度25℃，络合反应时间4h。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中酸溶液为硫酸溶液；进一步优选的，所述硫酸溶液浓度为1～3mol/L，料酸质量比为1：(2～6)；更优选的，所述硫酸溶液浓度为2mol/L，料酸质量比为1：3。
根据本发明优选的，所述步骤(2)离心为在4000～8000rpm/min条件下离心5～15min；进一步优选的，所述步骤(2)离心为在6000rpm/min条件下离心10min。
根据本发明优选的，所述步骤(3)聚酰胺柱洗脱流速为1～4倍柱体积/h，洗脱液收集部分为在紫外波长200～400nm的吸收部分；进一步优选的，聚酰胺柱洗脱流速为1～2.5倍柱体积/h，洗脱液收集部分为在紫外波长254～365nm的吸收部分；最为优选的，聚酰胺柱洗脱流速为1.5倍柱体积/h，洗脱液收集部分为在紫外波长280nm的吸收部分。
由上述提取方法制备获得的多酚类组分。
上述多酚类组分在制备抗氧化食品或药物中的应用。
上述多酚类组分在制备增强免疫力的食品或药物中的应用。
提取原理：
发明人通过研究发现大枣落果中多样化学成分的溶出特点和形态变化，并依据上述发现采用复合pH值提取技术依次在酸性、中性及碱性环境下对落枣中各组分进行全面提取；利用金属离子可与多酚类成分聚合的特性，进一步采用CaCl2对落枣多酚提取物实施络合反应，回收沉淀并以酸溶液进行转溶，使多酚再次变为游离状态；最后以聚酰胺树脂层析技术对大枣落果中多酚类化学组分进行富集精制。本发明对落枣中多酚类成分进行了有效的富集，该活性组分在功能食品领域中应用验证显示，其可明显改善小鼠的体内抗氧化指标、提升小鼠脾淋巴细胞的增殖率，由此判定其具有抗氧化、免疫促进的功效。此外，斑马鱼体内模型试验证明落枣多酚可修复PTK787诱导的节间血管损伤，具有促血管新生的活性，该功效可用于心脑血管疾病的康复保健。
本发明的优点如下：
1、本申请首次针对我国当前大枣种植产业中尚未开发利用的大量落果资源进行高值化加工，并根据大枣落果中多样化学成分的溶出特点和形态变化，设计了有利于提取其中多酚类成分的提取方法，不仅实现了大枣落果资源的高效利用，提高其附加值，并且操作简单方便，成本低且安全性好，具有重要经济和社会效益；
2.本发明所述的提取方法获得的多酚类组分目标成分富集率高，终产品总多酚含量可达到90％以上，可进行规模化放大生产；所得的多酚类组分结构性质多样，生物活性良好，具有抗自由基氧化、提升免疫、促进血管生成等保健功效；即可作为单方又可与其他药物组分复配使用，适用于各种常规剂型，易于广大消费者所接受。
附图说明
图1和图2为大枣落果多酚类成分高效液相色谱图；
图3为大枣落果多酚类成分促血管生成试验结果照片；
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但本发明所保护范围不限于此。
实施例1
一种大枣落果多酚类组分高效提取方法，具体步骤如下：
(1)取待处理落果大枣10kg打成果浆，按1：10比例依次加入不同pH值的水溶液，不同pH值的水溶液分别为pH 2的水溶液、pH 6.5的水溶液、pH 9的水溶液；上述不同pH值的水溶液采用硫酸为酸度调节剂、NaOH为碱度调节剂，每次提取温度为70℃，提取时间为60min；合并提取液并加入乙醇至质量浓度为75％、静置沉淀12h，收集上清液、调节pH值至中性，过滤，制得多酚提取液；
(2)将步骤(1)获得的多酚提取液浓缩至乙醇全部去除，加入多酚提取液重量10倍的水稀释后，加入CaCl2至浓度25mg/mL，在温度25℃条件下，络合反应4h，过滤收集沉淀物，沉淀物以2mol/L硫酸水溶液、料酸质量比1:3进行转溶，6000rpm/min离心10min，收集上清液，制得粗多酚溶液；
(3)将步骤(2)制得的粗多酚溶液上样至聚酰胺树脂柱进行纯化，先用体积百分比10％乙醇溶液洗去杂质，然后用体积百分比60％乙醇溶液洗脱，洗脱流速为2倍柱体积/h，洗脱液收集部分为在紫外波长280nm的吸收部分，减压浓缩、真空干燥，制得粉末形式保存的制得大枣落果多酚类组分327g，经检测，产物中多酚类成分含量为94.6％。
实施例2
一种大枣落果多酚类组分高效提取方法，具体步骤如下：
(1)取待处理落果大枣10kg打成果浆，按1：5比例依次加入不同pH值的水溶液，不同pH值的水溶液分别为pH 1.5的水溶液、pH 5.5的水溶液、pH 10的水溶液；上述不同pH值的水溶液采用盐酸为酸度调节剂、KOH为碱度调节剂，每次提取温度为60℃，提取时间为90min；合并提取液并加入乙醇至质量浓度为50％、静置沉淀8h，收集上清液、调节pH值至中性，过滤，制得多酚提取液；
(2)将步骤(1)获得的多酚提取液浓缩至乙醇全部去除，加入多酚提取液重量15倍的水稀释后，加入CaCl2至浓度35mg/mL，在温度40℃条件下，络合反应8h，过滤收集沉淀物，沉淀物以3mol/L硫酸水溶液、料酸质量比1:2进行转溶，8000rpm/min离心5min，收集上清液，制得粗多酚溶液；
(3)将步骤(2)制得的粗多酚溶液上样至聚酰胺树脂柱进行纯化，先用体积百分比5％乙醇溶液洗去杂质，然后用体积百分比80％乙醇溶液洗脱，洗脱流速为1倍柱体积/h，洗脱液收集部分为在紫外波长254nm的吸收部分，减压浓缩、真空干燥，制得粉末形式保存的制得大枣落果多酚类组分263g，经检测，产物中多酚类成分含量为90.6％。
实施例3
一种大枣落果多酚类组分高效提取方法，具体步骤如下：
(1)取待处理落果大枣8kg打成果浆，按1：15比例依次加入不同pH值的水溶液，不同pH值的水溶液分别为pH 3的水溶液、pH 7.5的水溶液、pH 10的水溶液；上述不同pH值的水溶液采用柠檬酸为酸度调节剂、NaOH为碱度调节剂，每次提取温度为80℃，提取时间为120min；合并提取液并加入乙醇至质量浓度为85％、静置沉淀24h，收集上清液、调节pH值至中性，过滤，制得多酚提取液；
(2)将步骤(1)获得的多酚提取液浓缩至乙醇全部去除，加入多酚提取液重量10倍的水稀释后，加入CaCl2至浓度20mg/mL，在温度20℃条件下，络合反应2h，过滤收集沉淀物，沉淀物以1mol/L硫酸水溶液、料酸质量比1:6进行转溶，4000rpm/min离心15min，收集上清液，制得粗多酚溶液；
(3)将步骤(2)制得的粗多酚溶液上样至聚酰胺树脂柱进行纯化，先用体积百分比15％乙醇溶液洗去杂质，然后用体积百分比40％乙醇溶液洗脱，洗脱流速为4倍柱体积/h，洗脱液收集部分为在紫外波长365nm的吸收部分，减压浓缩、真空干燥，制得粉末形式保存的制得大枣落果多酚类组291g，经检测，产物中多酚类成分含量为91.5％。
对比例1
一种大枣落果多酚类组分高效提取方法，采用传统的有机溶剂提取-大孔树脂纯化工艺：
1)取大枣落果10Kg打成匀浆，加入15倍量70％乙醇，60℃提取3次，每次2小时，合并浓缩至无醇味，10倍量乙酸乙酯萃取3次，收集萃取浓缩液。
2)AB-8树脂工艺对大枣落果多酚类组分进行纯化，树脂洗脱条件为：上样流速为2倍柱体积/h，吸附8h；6倍柱体积纯水、6倍柱体积60％乙醇依次洗脱，洗脱流速为2倍柱体积/h，收集60％乙醇洗脱液，减压浓缩、真空干燥，得到粉末形式保存的提取物271g，经检测，产物中多酚类成分含量为69.5％。
对比例2
一种大枣落果多酚类组分高效提取方法，采用复合pH值提取-聚酰胺树脂纯化工艺：
根据实施例1中步骤1)的方法制得提取液，浓缩至无醇味上样聚酰胺树脂，依照步骤3)的洗脱条件制备得到粉末形式保存的提取物311g，经检测，产物中多酚类成分含量为72.3％。
对比例3
一种大枣落果多酚类组分高效提取方法，同实施例1，不同之处在于：
步骤2)采用ZnSO4为沉淀剂，浓度及其他制备步骤同实施例1，得到粉末形式保存的提取物306g，其中多酚含量为86.1％
对比例4
一种大枣落果多酚类组分高效提取方法，同实施例1，不同之处在于：
不同pH值的水溶液分别为pH 9的水溶液、pH 6.5的水溶液、pH 2的水溶液；
得到粉末形式保存的提取物302g，经检测产物中多酚类成分含量为80.2％，结果与实施例1～3相比存在差距，说明溶液特定的pH变化次序对多酚提取效果具有一定影响。
应用试验例1
实施例1和对比例1中的多酚类成分组分分析
1)色谱条件
色谱柱：安捷伦C18反相色谱柱(5μm，4.6mm×250mm)；流动相：A泵为0.5％醋酸水溶液，B泵为0.5％的醋酸乙腈溶液；流速1mL/min；检测波长280nm。洗脱梯度为：0～15min，5％～40％B；15～35min，40％～55％B；35～50min，55％B；50～60min，55％～80％B。
2)对照品标准曲线绘制
精确称取儿茶素和表儿茶素标准品各3mg，置于5mL棕色容量瓶中，用甲醇定容，摇匀，稀释成不同浓度标准品溶液。以峰面积y与样品的质量浓度(x，mg/mL)进行线性回归，儿茶素的回归方程为：y＝15617x+2760，R＝0.9957，表儿茶素的回归方程为：y＝19843x+4732，R＝0.9964
3)多酚类组成分析
称取多酚提取物100mg，50％乙醇定容至25mL棕色容量瓶中。供试溶液按1)色谱条件进样，色谱分析结果如图1和图2所示。
外标法求得实施例1中儿茶素和表儿茶素的含量分别为11.4％和28.6％，对比例1中儿茶素和表儿茶素的含量分别为11.9％和30.1％，结果见表1。可以看出这两组多酚样品中的儿茶素与表儿茶素的含量并无显著差别。
表1儿茶素和表儿茶素样品含量测定结果
实施例1和对比例1的化学成分全谱分析结果显示，在洗脱保留时间22～30min和32～36min的范围内，实施例1样品的出峰数要比对比例1样品的出峰数多，证明更为多样的大枣落果多酚类组分在制备过程中得以保存。因此，采用本专利工艺制得的样品具有显著地化学多样性特征，有待进一步的深入研究开发。
应用试验例2
落枣多酚类组分体内抗氧化活性研究
1)实验方法
雄性昆明种小鼠(6-8周龄，体重20±2g)，购自山东省实验动物中心。小鼠随机分为6组，每组10只，自由采食饮水，适应性饲养7d。正常对照组灌胃生理盐水，持续18d。从第1d第3d，其余5组小鼠通过腹腔注射80mg·kg-1·d-1环磷酰胺(CY)。从第4d到第18d，模型对照组小鼠灌胃生理盐水；给药组分别灌胃50、100、250mg·kg-1体重的实施例1制得的大枣落果多酚类组分和250mg·kg-1体重的对比例1制得的大枣落果多酚类组分。
2)标本处理
在预冷的等渗生理盐水中制备小鼠心脏、肝脏和肾脏组织匀浆液样品，将其制成0.1g/mL湿重的溶液，4℃ 2000rpm/min离心10min，上清液备用。
3)抗氧化指标的测定
参照超氧化物歧化酶(SOD)，谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)，丙二醛(MDA)试剂盒说明书进行检测。
4)实验结果
表2.多酚组分对小鼠心脏、肝脏和肾脏中SOD活性的影响
与正常对照组相比，CY处理显著降低小鼠心脏、肝脏和肾脏的SOD水平。实施例1组多酚浓度100、250mg·kg-1时可升高心脏和肝脏SOD活性，与模型对照组相比分别呈现显著(p<0.05)和极显著(p<0.01)差异；在250mg·kg-1时可显著升高肾脏中SOD活性(p<0.05)。对比例1组多酚250mg·kg-1给药对造模小鼠的心脏、肝脏和肾脏SOD水平略有升高，但并未展现出显著差异。
表3.多酚组分对小鼠心脏、肝脏和肾脏中GSH-Px活性的影响
与正常对照组相比，CY处理可显著降低小鼠心脏、肝脏和肾脏的GSH-Px水平。与模型对照组相比，实施例1组多酚浓度100mg·kg-1时肝脏GSH-Px活性即呈现显著增加趋势(p<0.05)，浓度250mg·kg-1时肝脏GSH-Px活性增加极显著(p<0.01)；而在心脏和肾脏组织中，给药浓度250mg·kg-1时显著增加GSH-Px活性(p<0.05)。对比例1组多酚在250mg·kg-1时仅对小鼠肝脏的GSH-Px水平具有较好的提升效果(p<0.05)，总体活性效果要弱于实施例1组多酚样品。
表4.多酚组分对小鼠心脏、肝脏和肾脏中MDA的影响
与正常对照组相比，CY处理显著增加小鼠心脏、肝脏和肾脏的MDA水平。实施例1组多酚给药后，各处理组的MDA含量均呈现降低趋势；与模型对照组相比，浓度250mg·kg-1给药时心脏MDA水平下降趋势显著(p<0.05)，浓度100、250mg·kg-1给药时，肝脏MDA水平下降分别呈显著(p<0.05)、极显著趋势(p<0.01)。同表2和表3试验结果相似，对比例1组多酚250mg·kg-1给药后，造模小鼠心脏、肝脏和肾脏中MDA水平并未表现出显著变化趋势。
SOD和GSH-Px可将有害的自由基转变为无毒化合物，是机体内清除活性氧和自由基的第一道防线。在临床研究上，SOD主要应用于抗炎、自身免疫性疾病、抗癌等方面。GSH-Px广泛存在于细胞质和线粒体内，可催化过氧化物反应、减少二硫化谷胱甘肽的形成和过氧化氢的产物。而MDA是机体脂质过氧化作用所产生的代谢产物，它可引起细胞代谢异常进而造成损伤，机体内发生脂质过氧化作用时MDA含量显著升高。本实验提示实施例1制得的大枣落果多酚类组分可通过调节抗氧化酶类的活性来达到抗氧化的作用。通过进一步试验，对比例1组大枣落果多酚类组分(经传统制备工艺制得)对环磷酰胺造模小鼠体内抗氧化酶的调节作用要弱于实施例1组。结合多酚类成分的HPLC分析，实施例1样品优良的体内抗氧化活性与其中多样化学成分组成有关，并不单单受儿茶素与表儿茶素含量的影响，且各多酚组分之间可能存在协同作用。
应用试验例3
落枣多酚类组分对小鼠淋巴细胞增殖的影响
1)实验方法
昆明小鼠(雌雄各半)体重18～22g，购自山东省实验动物中心；将小鼠脱颈椎处死，无菌分离脾脏并切成小块，加入适量全血及组织稀释液研磨收集细胞悬液，过滤后移至离心管中。另取离心管加入细胞分离液，吸取单细胞悬液加于分离液液面上，2500r/min离心25min；用吸管将第2层环状乳白色淋巴细胞移至灭菌15mL离心管中，加入细胞洗涤液洗涤白膜层细胞，1000r/min离心10min弃掉上清液，再加入5mL PBS溶液重悬细胞，1000r/min离心10min，此步骤重复3次；离心后弃上清液，向离心管加入5mL PRMI-1640完全培养基重悬细胞，转移到培养瓶置恒温细胞培养箱中备用。
2)淋巴细胞增殖检测
小鼠脾淋巴细胞悬液按2×106个/mL、100μL/孔加入96孔板，空白对照组每孔加100μL RPMI-1640培养基，阳性对照组每孔加100μL香菇多糖(终浓度100μg/mL)，多酚给药组每孔分别加不同浓度实施例1制得的大枣落果多酚类组分100μL(终浓度分别为100、200、400μg/mL)，联合给药组每孔加50μL香菇多糖(终浓度100μg/mL)和50μL多酚类组分(终浓度200μg/mL)。每组6个复孔，同时设置3组平行实验，培养箱内继续培养24、48、72h，每孔加入20μL的cck-8试剂孵育2h，450nm波长测定吸光度值计算增殖率。
3)实验结果
表5小鼠脾淋巴细胞增殖效果
阳性对照组和给药组的小鼠脾淋巴细胞增殖较空白对照组有升高趋势，多酚浓度400μg/mL 48h给药后，淋巴细胞的增殖效果与空白对照组相比呈现显著性(p<0.05)。联合给药组淋巴细胞在24、48、72h培养后，其增殖率与空白对照组相比均有显著性差异(p<0.05)且高于阳性对照药物，说明该多酚类组分联合用药要比单独使用有更好的效果，存在协同增效作用。
淋巴细胞增殖率是反映机体细胞免疫能力最直接的指标。本实验研究结果表明，多酚类组分可以促进淋巴细胞的增殖，对增强机体免疫功能具有重要的意义，可以用于抗衰老及某些免疫缺陷病的辅助治疗。
应用试验例4
基于斑马鱼模型的促血管生成实验
1)实验方法
FLK系血管荧光转基因斑马鱼，由山东省科学院生物研究所孵育。取24hpf(hourpost fertilization)斑马鱼受精卵，加入适量1mg/mL链霉蛋白酶E溶液，脱膜后置于24孔板中(10个/孔)，设空白对照组、模型组(PTK787，0.3μg/mL)、给药组A(PTK787+实施例1制得的大枣落果多酚类组分400μg/mL)及给药组B(PTK787+对比例1制得的大枣落果多酚类组分400μg/mL)，每组均设置2个复孔，置28℃光控培养箱培养48h，采用体视荧光显微镜观察斑马鱼节间血管(Intersegmental Vessel,ISV)生长情况。
2)实验结果
实验结果如图3所示，空白对照组中ISV从腹侧背主动脉发出，向背侧延伸到达背侧纵向血管，相邻ISV间均匀而有序的并排分布。模型组中加入PTK787后使得部分ISV仅仅长出血管芽或者ISV长度偏短，且呈现出血管排列不规律特点。400μg/mL多酚给药后，PTK787对ISV荧光信号的抑制作用得到很好的缓解，说明该多酚组分对斑马鱼胚胎ISV的生长显现促进作用。此外，实施例1多酚给药组的血管生成效果略好于对比例1多酚给药组，进一步阐明了本制备工艺对优良活性的重要影响。大枣落果多酚加速血管新生功效的阐述拓展了其广阔的临床应用前景。
Claims (21)
1.一种大枣落果多酚类组分提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将待处理大枣落果打成果浆，用不同pH值的水溶液，依次分别在60～80℃提取30～120min，合并提取液并加入乙醇静置沉淀，收集上清液、调节pH值至中性，过滤，制得多酚提取液；
所述不同pH值的水溶液分别为pH 1.5～3的水溶液、pH 5～7.5的水溶液、pH 8.5～10的水溶液；
所述加入乙醇的量为合并后提取液总质量的50％～90％，静置时间为6～24h；
(2)将步骤(1)获得的多酚提取液浓缩至乙醇全部去除，加入多酚提取液重量10～15倍的水稀释后，加入CaCl2进行络合反应，过滤收集沉淀物，沉淀物以酸溶液再次溶解，离心收集上清液，制得粗多酚溶液；
所述CaCl2加入至浓度为10～40mg/mL，络合反应温度15～50℃，络合反应时间1～8h；
(3)将步骤(2)制得的粗多酚溶液上样至聚酰胺树脂柱进行纯化，先用体积百分比5～15％乙醇溶液洗去杂质，然后用体积百分比40％～80％乙醇溶液洗脱，收集合并在紫外波长下有吸收的部分，经减压浓缩、真空干燥，制得大枣落果多酚。
2.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤(1)中待处理落果大枣为清洗后的大枣落果。
3.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤(1)中不同pH值的水溶液的酸度调节剂为硫酸、盐酸或柠檬酸，碱度调节剂为NaOH或KOH。
4.如权利要求3所述的提取方法，其特征在于，所述步骤(1)中不同pH值的水溶液的酸度调节剂为硫酸，碱度调节剂为NaOH。
5.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤(1)中不同pH值的水溶液分别为pH 2.0的水溶液、pH 6.5的水溶液、pH 9的水溶液。
6.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤(1)中提取温度为70℃。
7.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤(1)中加入乙醇的量为合并后提取液总质量的65％～80％，静置时间为8～16h。
8.如权利要求7所述的提取方法，其特征在于，所述步骤(1)中加入乙醇的量为合并后提取液总质量的75％，静置时间为12h。
9.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤(2)中CaCl2加入至浓度为20～35mg/mL，络合反应温度20～40℃，络合反应时间3～6h。
10.如权利要求9所述的提取方法，其特征在于，所述步骤(2)中CaCl2加入至浓度为25mg/mL，络合反应温度25℃，络合反应时间4h。
11.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤(2)中酸溶液为硫酸溶液。
12.如权利要求11所述的提取方法，其特征在于，所述硫酸溶液浓度为1～3mol/L，料酸质量比为1：(2～6)。
13.如权利要求12所述的提取方法，其特征在于，所述硫酸溶液浓度为2mol/L，料酸质量比为1：3。
14.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤(2)离心为在4000～8000rpm/min条件下离心5～15min。
15.如权利要求14所述的提取方法，其特征在于，所述步骤(2)离心为在6000rpm/min条件下离心10min。
16.如权利要求1所述的提取方法，其特征在于，所述步骤(3)聚酰胺柱洗脱流速为1～4倍柱体积/h，洗脱液收集部分为在紫外波长200～400nm的吸收部分。
17.如权利要求16所述的提取方法，其特征在于，聚酰胺柱洗脱流速为1～2.5倍柱体积/h，洗脱液收集部分为在紫外波长254～365nm的吸收部分。
18.如权利要求17所述的提取方法，其特征在于，聚酰胺柱洗脱流速为1.5倍柱体积/h，洗脱液收集部分为在紫外波长280nm的吸收部分。
19.由权利要求1所述提取方法制备获得的多酚类组分。
20.权利要求19所述多酚类组分在制备抗氧化食品或药物中的应用。
21.权利要求19所述多酚类组分在制备增强免疫力的食品或药物中的应用。
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