CN110639063A - 一种透明质酸寡糖修饰的矿化胶原仿生骨修复材料 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种透明质酸寡糖修饰的矿化胶原仿生骨修复材料及其制备方法。透明质酸寡糖修饰的矿化胶原仿生骨修复材料,结构如下:胶原‑羟基磷灰石复合材料中的胶原通过C‑N键连接透明质酸寡糖,获得糖基化修饰的矿化胶原复合材料,透明质酸寡糖的分子量为776~5000Da。本发明首次利用希夫碱反应对胶原进行透明质酸寡糖修饰,可获得共价结合的糖基化胶原,并首次提出将糖基化胶原作为矿化模板用于骨支架设计中,除了发挥低分子量HA利于细胞迁移、增殖、分化及促创伤愈合的功能外,为体外构建血管化支架提供了新的材料基础及研究策略。
Description
本申请是以下申请的分案申请:申请日2017年3月28日,申请号2017101926909,发明创造名称:一种透明质酸寡糖修饰的矿化胶原仿生骨修复材料及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种透明质酸寡糖修饰的矿化胶原仿生骨修复材料及其制备方法,属于生物医用材料技术领域。
背景技术
由创伤、肿瘤、感染及病理因素等造成的骨缺损在临床中十分常见,成为困扰人类健康生活的难题之一。骨移植已成为仅次于输血的需求量最大的移植物,而且有逐年增加的趋势。目前,临床应用的骨修复材料包括自体骨、异体骨、异种骨、人工骨等,但都存在一定的问题,不能完全解决临床对骨材料的巨大需求。尽管存在来源有限和二次创伤问题,但自体骨仍是目前临床效果最好的骨植入材料,一直以来作为骨缺损治疗的“金标准”。因此,模仿天然骨的成分和结构,国内外科学家通过体外人工合成的方法,仿生制备了胶原-羟基磷灰石不同形式的复合骨材料,并应用于临床。但随着研究的深入和临床应用跟踪,发现这些材料与自体骨相比存在生物活性不足或骨修复效果不足等缺点,难以取得理想的修复效果。另外,骨是一个高度血管化的组织,而现行组织工程骨的研究多忽略移植物的再血管化,对于大的骨缺损来说,周围组织渗透营养、氧气的范围有限,而植入骨材料的内生血管形成较慢或难以血管化,最终导致移植骨的成骨活性显著降低,甚至出现组织中央细胞坏死的情况。因此,传统骨支架材料存在的生物活性不足及血管化问题等仍是组织工程骨研究的重点。
透明质酸(HA)是天然的细胞外基质,具有良好的生物相容性及理化性能,可影响细胞的增殖、迁移及分化,尤其是其寡糖oHA具有促血管化和创伤修复及免疫调节的生物活性。目前,透明质酸与胶原等蛋白结合用于组织材料构建的研究较多,但多集中于大分子量透明质酸的使用,至少也是5kD以上的寡聚糖。这主要是因为5kD以下的oHA制备困难且价格昂贵,且分子量越低其在材料设计中的难度也会相应加大。
中国专利文献CN105903081A(申请号201510926063.4)公开了一种新型双层蛋白多糖基修复材料的制备方法,其中透明质酸与I型胶原(Col I)主要通过电荷及氢键作用进行结合,后续经冷冻干燥及热交联处理得到三维网状复合材料,该多糖与胶原的复合材料主要应用于软组织的修复。
在组织工程骨中比较重要的一类基础材料是胶原/羟基磷灰石复合材料,其制备工艺和成分也在不断改善,由以往的钙磷盐与胶原的机械混合逐渐发展为无机颗粒在胶原等聚合物基体上的定向排列而实现无机成分与有机成分的有效复合,另外也通过引入其他成分来改善胶原力学性能差的缺陷。中国专利文献CN101590293A(申请号200910149959.0)公开了一种HA(此指羟基磷灰石)/胶原/壳聚糖互穿聚合物网络支架的制备方法,该法将PVP为模板制得的羟基磷灰石溶胶分散在胶原和壳聚糖共混液中,经两步交联后通过减压、除气等后处理得到复合支架,虽然该支架中无机颗粒在胶原/壳聚糖基体中分散良好,但整体来看操作过程较多,而且天然骨是以胶原为模板通过非胶原蛋白的调控或胶原与矿物相的相互作用实现钙磷盐的成核矿化,并以胶原的自组装过程为基础形成的分级结构,骨的这种由微观到宏观逐级形成的多级有序结构对骨的性能及功能十分重要,而该文献中只是将单独制备的羟基磷灰石交联结合在聚合物基体上,并未实现骨的微结构仿生。
发明内容
针对当前临床骨移植的巨大需求及现有骨修复材料仍存在的缺陷,本发明克服现有技术的不足,提供一种透明质酸寡糖修饰的矿化胶原仿生骨修复材料及其制备方法。
本发明的技术方案如下:
一种透明质酸寡糖修饰的矿化胶原仿生骨修复材料,结构如下:
胶原-羟基磷灰石复合材料中的胶原通过C-N键连接透明质酸寡糖,获得糖基化修饰的矿化胶原复合材料,透明质酸寡糖的分子量为776~5000Da。
根据本发明优选的,所述透明质酸寡糖修饰胶原的载糖质量百分比为0.909%~5.266%。
根据本发明优选的,所述胶原为I型胶原,胶原分子量为8~12KD。
上述透明质酸寡糖修饰的矿化胶原仿生骨修复材料的结构组装过程如下:
透明质酸寡糖修饰的胶原分子自组装形成胶原微纤维;糖基化胶原分子调控钙磷盐沿微纤维轴向取向排列,进一步组装形成矿化胶原纤维;矿化胶原纤维进一步组装形成取向排列的糖基化矿化胶原纤维束(如图2所示);通过静电纺丝,将上述矿化材料组装成纳米纤维仿生骨修复材料(如图1所示)。
一种透明质酸寡糖修饰的矿化胶原仿生骨修复材料的制备方法,包括如下步骤:
(1)将胶原、透明质酸和NaBH3CN加入反应体系中,36~38℃避光条件下搅拌反应1~3天,然后加入醋酸溶液稀释,超滤离心,沉淀干燥后,制得糖基化胶原蛋白;
所述反应体系为六氟异丙醇(HFP)或二甲基酰胺(DMF)溶剂之一与碳酸氢钠的混合溶液,碳酸氢钠的摩尔浓度为0.05~0.15M,六氟异丙醇或二甲基酰胺与碳酸氢钠的体积比为3:(1~3);
所述胶原加入反应体系后的质量浓度为18~22g/L,透明质酸加入反应体系后的质量浓度为4~6g/L,NaBH3CN加入反应体系后的质量浓度为6g/L~18g/L;
(2)将步骤(1)制得的糖基化胶原蛋白加入盐酸中,搅拌溶解,制得浓度为0.5~0.7mg/ml的糖基化胶原蛋白溶液,然后加入CaCl2溶液,混合均匀,静置8~15min,然后搅拌加入NaH2PO4溶液,调节pH至7,25~38℃静置2~24h,固液分离,沉淀经洗涤后,干燥,制得糖基化胶原矿化复合材料;
所述CaCl2溶液的添加量为步骤(1)中每克胶原添加0.023~0.0913mol的CaCl2;CaCl2与NaH2PO4的摩尔比为(1.5~1.8):1;
(3)将成型剂溶解于六氟异丙醇中,制得质量浓度为2~4%的溶液,然后加入步骤(2)制得的糖基化胶原矿化复合材料,糖基化胶原矿化复合材料剂与成型的质量比为(1~3):1,混合均匀,静电纺丝成多孔纳米纤维形态,制得透明质酸寡糖修饰的矿化胶原仿生骨修复材料;
所述成型剂为胶原、聚乳酸或步骤(1)制得的糖基化胶原蛋白;
根据本发明优选的,所述步骤(1)中,碳酸氢钠的摩尔浓度为0.1M,六氟异丙醇或二甲基酰胺溶剂与碳酸氢钠的体积比为3:2;所述胶原为I型胶原,加入反应体系后的质量浓度为20g/L,透明质酸加入反应体系后的质量浓度为5g/L,NaBH3CN加入反应体系后的质量浓度为6g/L。
根据本发明优选的,所述步骤(1)中,37℃避光条件下搅拌反应1天。
根据本发明优选的,所述步骤(1)中,醋酸溶液的质量浓度为5%,稀释体积倍数为8倍。
根据本发明优选的,所述步骤(1)中,超滤离心的超滤管为30k,离心条件为:4000g/min,25min/次,超滤次数为3~8次。
根据本发明优选的,所述步骤(1)中,干燥为真空冷冻干燥。
根据本发明优选的,所述步骤(2)中,盐酸的浓度为0.01M。
根据本发明优选的,所述步骤(2)中,糖基化胶原蛋白溶液的浓度为0.6mg/ml。
根据本发明优选的,所述步骤(2)中,pH调节剂为浓度为0.1~0.5M NaOH溶液。pH调节过程中,当pH接近或达到6时溶液开始出现浑浊,pH 6.2左右时变化波动较大,此时反应仍在进行,继续搅拌并滴加NaOH溶液至体系pH为7,之后继续搅拌2h。
根据本发明优选的,所述步骤(2)中,37℃静置22~24h;优选的,所述清洗过程为去离子水反复离心清洗3次,8000~10000r/min,离心8min。
根据本发明优选的,所述步骤(2)中,干燥为真空冷冻干燥。
根据本发明优选的,所述步骤(3)中,最终电纺液的质量浓度为8%;优选的,所述成型剂为糖基化胶原蛋白。
根据本发明优选的,所述步骤(3)中,混合均匀为采用磁力搅拌混合5~10min后,400~500W超声处理20min,继续搅拌24h~48h;优选的,所述纺丝电压为15~20kv,速率为0.6~1.0mL/h,接收距离为8~15cm,接受装置为铝箔或置于铝箔上的直径为14mm的盖玻片;
一种透明质酸寡糖修饰的矿化胶原仿生骨修复材料的生物相容性检测方法,包括如下步骤:
a、将待检测的透明质酸寡糖修饰的矿化胶原仿生骨修复材料经固定交联处理、干燥,制得预处理材料;
b、将预处理材料杀菌后,用质量浓度为70%的乙醇溶液浸泡2.5~3.5h,然后转入灭菌的PBS缓冲浸泡2h,取出重复浸泡3~4次,然后用1640培养基或α-MEM培养基浸泡0.5h,制得预处理后样品;
c、将内皮细胞PIEC或前体成骨细胞MC3T3-E1与步骤c制得的预处理后样品共培养,细胞密度103~104个/cm2,37℃、5%CO2条件下培养,分别于培养后的1d、3d、5d和7d检测细胞的增殖情况,用扫描电子显微镜(SEM)观察细胞培养3d、5d后在支架的黏附及生长形态,并对MC3T3-E1在培养过程中检测其碱性磷酸酶ALP的表达情况,根据结果进行生物相容性评价。
上述生物相容性评价评价可采用本领域常规评价方法。如内皮细胞PIEC可参考《静电纺丝制备胶原蛋白-壳聚糖纳米纤维仿生细胞外基质》(陈宗刚;东华大学,2007.)中的相关方法;MC3T3-E1细胞可参考《改性聚(D,L-乳酸)与MC3T3-E1细胞的生物相容性》(郑丹芳;重庆大学,2008.)中的相关方法。
根据本发明优选的,所述步骤a中,固定交联处理为采用25%戊二醛蒸汽处理24~36h或者采用含有EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)的95%乙醇体系浸泡20~24h;优选的,所述干燥为在真空干燥箱中静置3~5天。
根据本发明优选的,所述步骤c中,培养过程中每隔2~3天换培养基一次。
上述1640培养基和α-MEM培养基均为本领域常规市售培养基。内皮细胞PIEC和前体成骨细胞MC3T3-E1为本领域常规市售细胞。
有益效果
1、本发明首次利用希夫碱反应对胶原进行透明质酸寡糖修饰,可获得共价结合的糖基化胶原,除了发挥低分子量HA利于细胞迁移、增殖和分化的功能外,在胶原空间构型及活性,分子识别、细胞通信、信号转导等方面也具有潜在影响;本发明制得的糖基化胶原较现有利用物理方式实现小分子寡聚糖与胶原的交联具有显著的优势;此外,本发明用低分子量HA修饰胶原,方法简单,成本低廉,且可用于后续矿化反应中钙磷盐沉积的模板,使其在硬组织的修复与再生研究中也有潜在应用;
2、本发明利用能促血管化的透明质酸寡糖片段修饰胶原仿生胞外基质,制得的材料在改善材料生物相容性的同时可赋予材料抗凝和促血管化功能,使支架移植体内后能长期存活,这为构建血管化组织工程骨及其他组织的促血管化支架提供了新的材料基础和研究模式;
3、本发明设计的支架是基于仿生学原理和自组装技术,首次提出利用糖基化胶原为模板实现钙磷盐的成核矿化,其成分与微结构更接近于天然骨组织,且有望在新生骨内促进血管生成,提高成骨效果,较现有单独制备的羟基磷灰石溶胶分散在胶原/壳聚糖共混溶液中获得无机颗粒在聚合物基体中定向排列的复合支架具有生物学活性特点;
4、本发明利用静电纺丝技术对支架材料进行成型,不同于现有技术的无机粉末与高分子材料的简单机械混合,该电纺体系的制备是先通过生物矿化实现钙磷盐在胶原上的成核矿化以获得矿化复合材料,使无机/有机两相间能形成紧密键和并具有一定取向关系,之后通过引入一定量胶原或聚乳酸等聚合物与冻干的矿化复合粉末形成均一混合体系进行电纺,从而获得矿化材料的纳米多孔纤维,更接近天然细胞外基质的形态,利于细胞的黏附及生长,且良好的孔连通性更易于细胞的内向迁移及营养物质的扩散;这种将聚合物先预沉淀化获得复合材料再优化条件进行电纺的方法可有效改善无机颗粒分散性差或机械混合体系中的相分离问题。
附图说明
图1为胶原Col、胶原/羟基磷灰石Col/HAP、糖基化胶原/羟基磷灰石Col/oHAs/HAP的红外光谱;
图2为反应静置24h合成的胶原/oHAs/羟基磷灰石材料的TEM形貌;
图3为Col/HAP-Col-3-1混纺纤维支架的SEM形貌;
图4A为内皮细胞在Col/HAP-Col-3-1培养3天时的SEM形貌;
图4B为内皮细胞在Col/HAP-PLA-3-1培养3天时的SEM形貌;
图5为内皮细胞在各矿化胶原纤维支架上的增殖趋势结果;
图6A为内皮细胞在Col/HAP-Col-3-2上培养5天时的SEM形貌;
图6B为内皮细胞在Col/oHAs/HAP-Col-3-2上培养5天时的SEM形貌;
图6C为内皮细胞在Col/HA/HAP-Col-3-2上培养5天时的SEM形貌;
图7为MC3T3-E1在Col/HAP-Col-3-2、Col/oHAs/HAP-3-2、Col/HA/HAP-Col-3-2支架上ALP检测结果柱状图;
图8为MC3T3-E1在Col/HAP-Col-3-2、Col/oHAs/HAP-Col/oHAs-3-2、Col/HA/HAP-Col/HA-3-2纤维支架上的增殖趋势结果柱状图;
图9为MC3T3-E1在Col/oHAs/HAP-Col/oHAs-3-2纤维支架上的SEM形貌。
具体实施方式
下面结合实施例及说明书附图对本发明的技术方案做进一步阐述,但本发明的保护范围并不仅限于这些实施例。
原料来源
透明质酸钠原材料HA购自华熙福瑞达生物医药有限公司,分子量5kD;
胶原为购自成都市科乐生物技术有限公司的I型胶原,分子量10kD;
实施例1
糖基化胶原蛋白(Col/HA,HA为酶解前的透明质酸原材料)的制备:
反应体系的配制:称取胶原80mg,HA(5K)20mg,重结晶处理的NaBH3CN 30mg于25mL规格玻璃瓶中,加入配置好的反应体系(即HFP与0.1M NaHCO3混合介质,体积比3:2)5mL,黑暗条件下,37℃,磁力搅拌24h;
反应样品的清洗:反应结束后将反应液转移至小烧杯中,加入5%醋酸进行8倍稀释,分装入6个30K的超滤管中,4000g/min,25min/次,超滤离心置换6次,之后收集样品真空冷冻干燥;
反应样品载糖量测定:利用咔唑-乙醇法对干燥后的Col/HA进行糖含量测定,测定载糖量为5.266%。
实施例2
糖基化胶原蛋白(Col/oHAs,oHAs为酶解后的寡糖)的制备:
如实施例1所述的制备方法,不同之处在于,胶原80mg,oHAs(776.5-2293.4)20mg,重结晶处理的NaBH3CN 30mg,超滤离心置换4次。
利用咔唑-乙醇法对干燥后的Col/HA进行糖含量测定,测定载糖量为2.101%。
oHAs为采用透明质酸寡糖对胶原进行糖基化修饰,透明质酸寡糖为5k的玻尿酸钠经酶解、分离纯化后得到的四糖、六糖、八糖、十糖、十二糖及其混合物,分子量范围在776-2293Da。
透明质酸寡糖的制备步骤参见《透明质酸酶催化透明质酸水解反应的最适条件》(崔向珍,倪运杰,王凤山等,中国生化药物杂志[J].2007,25(3):62-64)。
实施例3
糖基化胶原矿化复合材料(Col/oHAs/HAP)的制备:
称取实施例2制得的干燥的糖基化胶原蛋白(Col/oHAs)60mg于100mL HCl(浓度0.01M)溶液中,磁力搅拌溶解获得Col/HA溶液,搅拌同时缓慢滴加CaCl2(0.1M)溶液14mL,混匀后静置10min,继续搅拌缓慢滴加NaH2PO4(0.1M)溶液8.4mL(Ca:P=1.66),之后搅拌中缓慢滴加0.1M NaOH对该体系进行pH调节,当pH接近6时溶液开始出现浑浊,pH 6.2左右时波动较大,此时反应仍在进行,继续滴加NaOH至体系pH为7,之后继续搅拌2h并维持矿化体系pH不变;搅拌结束后37℃静置24h,倒去上清,沉淀用去离子水洗涤,8000r/min离心3次(8min/次),最后对样品冷冻干燥,研磨获得透明质酸修饰的矿化胶原复合材料粉末,用Col/oHAs/HAP表示,其中HAP为矿化形成的羟基磷灰石,对该粉末进行红外分析,SEM、TEM观察形貌。
由SEM图观察到糖基化胶原纤维表面有大量不规则无机颗粒覆盖;FTIR结果如图1所示,胶原发生矿化后代表蛋白质酰胺键的三个特征峰发生变化,特别是酰胺Ⅲ带吸收峰明显降低且接近消失,表明矿化过程中胶原上的羧基或羰基通过与Ca2+作用提供成核位点,使得反应形成的羟基磷灰石与模板结合形成矿化复合材料,另外磷酸根的引入也使得胶原经矿化反应后在1024cm-1、870cm-1、603cm-1和564cm-1处有吸收峰的变化;图2的Col/oHAs/HAP的低倍TEM照片显示矿化后的糖基化胶原基本呈束状结构。
实施例4
糖基化胶原矿化复合材料(Col/HA/HAP)的制备:
本实施例中利用分子量为5K的透明质酸对胶原进行修饰,参考实施例1制备糖基化胶原Col/HA,将干燥得到的Col/HA样品溶解于HCl(0.01M)中,参考实施例3的具体矿化条件制备糖基化胶原矿化复合材料Col/HA/HAP。
实施例5
矿化胶原复合材料(Col/HAP-Col-3-1)纳米纤维多孔支架的制备:
本实施例中所用的矿化胶原制备方法参考实施例3,不同处是将未经任何处理的胶原直接溶解于HCl(0.01M)中,与糖基化胶原相比,未处理胶原更易溶解;经矿化处理冷冻干燥后获得胶原/纳米羟基磷灰石复合材料,用Col/HAP表示:
①称取胶原45mg,加入2mL HFP磁力搅拌10min溶解胶原,待胶原充分溶解后,加入研磨的Col/HAP粉末135mg,为了使该矿化胶原粉末更好地分散在电纺体系中,在加入该粉末后进行450W功率超声处理20min,之后继续磁力搅拌32h使电纺溶液达到良好的粘稠状态;
②将电纺溶液转移至1mL注射器中,调节纺丝参数,给液速率:0.9mL/h,纺丝电压:20kv,接收距离:10cm,利用置于铝箔上的直径14mm的盖玻片接收电纺纤维;制得透明质酸寡糖修饰的矿化胶原仿生骨修复材料;
③将收集的电纺纤维样品置于真空干燥箱中2d以除去残余的有机试剂,之后样品表面喷金进行电镜观察,由图3知,在矿化胶原与胶原按照3:1混纺的条件下仍能获得多孔的纳米纤维结构,但由于无机成分的存在,纤维上出现较多的bead结构和块状物质;
④电纺纤维的固定:将纤维样品置于底部具有质量百分比浓度25%戊二醛水溶液的干燥器中,封闭条件下利用戊二醛蒸汽对其处理30h,之后取出样品将其置于真空干燥箱中静置几天以除去有毒试剂;固定之后的纤维膜置于O.O1M PBS(pH 7.4)缓冲液浸泡2d,移去液体置于真空干燥箱中干燥,根据扫描电镜观察发现胶原混纺组材料发生一定溶胀,纤维直径***,而聚乳酸组变化不大,材料的纤维形貌仍基本存在,并仍有较高孔隙率及良好的孔连通性。
实施例6
透明质酸寡糖修饰矿化胶原(Col/oHAs/HAP-Col-3-2)纳米纤维支架的制备:
称取胶原64mg,加入2mL HFP磁力搅拌溶解胶原,待胶原充分溶解后,加入研磨的实施例4制得的Col/oHAs/HAP粉末96mg,为了使该矿化胶原粉末更好地分散在电纺体系中,在加入该粉末后进行超声处理20min,之后继续磁力搅拌24h,在该电纺溶液达到良好的粘稠状态后开始纺丝,后续具体操作参考实施例5中的步骤。
实施例7
PIEC在Col/HAP与胶原或聚乳酸按3:1混纺的支架上生长形态:
材料的预处理:Col/HAP-Col-3-1,Col/HAP-PLA-3-1,其中Col/HAP-PLA-3-1制备参考
实施例5,不同之处是将聚乳酸代替胶原与制备的Col/HAP粉末混纺,得到的电纺纤维膜在使用前均要进行固定交联。将上述材料每组3片放入24孔板中,紫外杀菌,另体积浓度70%乙醇浸泡3h,吸出乙醇,无菌PBS缓冲液浸泡4次,时间6h,后用未含血清的1640培养基(购自Hyclone)浸泡0.5h,具体操作在生物安全柜内完成;
细胞种植:将备好的PIEC细胞悬液于每孔中接种200uL,种植密度为1.9×104个/cm2,培养箱中培养4h后每孔补加400μL培养基,每隔2-3天给细胞换液;
形貌观察:于培养后的3d取出各组材料-细胞样品,无菌PBS清洗3次,后续经质量浓度2.5%戊二醛常温固定3h,梯度乙醇脱水,最后样品真空冷冻干燥,喷金后观察形貌。内皮细胞在材料上培养3天的SEM照片表明,细胞可在材料上充分伸展,能维持细胞正常的生长状态,呈多角或菱形,细胞间能形成突起,部分区域还可观察到细胞立体生长并向材料内部迁移的现象,说明该方法制备的材料具有较好的生物相容性,如图4所示。
实施例8
PIEC与糖基化矿化胶原的生物相容性:
方法参考实施例7,不同之处在于,细胞初始种植密度为1.03×104个/cm2,实验组材料为Col/HAP-Col-3-2,Col/oHAs/HAP-Col-3-2,Col/HA/HAP-Col-3-2,关于细胞的增殖利用MTT法测定,形貌利用SEM观察;
由细胞的增殖结果(见图5)知,内皮细胞在培养3天之后的增殖速度开始加快,与未连糖组材料比,内皮细胞在糖基化材料组上的增殖幅度相对大些,尤其是寡糖修饰的矿化胶原材料组。而由细胞培养5天的SEM图(见图6)发现细胞在糖基化材料组部分区域有聚集成片生长的迹象,而在未连糖组未观察到此类现象。
由此推测,在材料中引入低分子量透明质酸影响细胞的黏附、增殖等生长行为。
实施例9
MC3T3-E1在各材料上表达碱性磷酸酶ALP的情况:
方法参考实施例7,不同之处在于,培养细胞为MC3T3-E1,培养基为α-MEM,实验组材料为Col/HAP-Col-3-2,Col/oHAs/HAP-Col-3-2,Col/HA/HAP-Col-3-2,检测指标为细胞培养21,28,35天后在各材料上表达碱性磷酸酶活性的情况。
由图7可以看出,与未连糖材料比,细胞在糖基化矿化材料上表达ALP活性相对较高。
实施例10
MC3T3-E1在各材料上的增殖及表达ALP情况:
方法参考实施例7,不同在于培养细胞为MC3T3-E1,实验组材料为Col/HAP-Col-3-2,Col/oHAs/HAP-Col/oHAs-3-2,Col/HA/HAP-Col/HA-3-2。MC3T3-E1细胞种植密度为2.15×104个/cm2,培养基为含10%胎牛血清的α-MEM液体培养基。
由图8可以看出,与未连糖矿化材料比,细胞在糖基化矿化材料上的增殖相对较高,另外由ALP检测结果知,MC3T3-E1在材料上培养7天时并未检测到碱性磷酸酶活性,之后在培养的14、21、28d均检测到其活性,且在各时间点中透明质酸寡糖修饰的材料组活性相对较高,说明上述材料特别是糖基化修饰的材料能促进MC3T3-E1逐渐分化为成熟的成骨细胞。
实施例11
MC3T3-E1在Col/oHAs/HAP-Col/oHAs混纺纤维支架上的生长形态:
方法参考实施例7,不同之处在于,MC3T3-E1细胞初始种植密度为1.6×104个/cm2,于培养后的4d取出该材料-细胞样品,无菌PBS清洗3次,后续固定及脱水后真空冷冻干燥,喷金后观察形貌。由MC3T3-E1在材料上培养4天的SEM形貌可知,见图9,该细胞可在材料上充分伸展、黏附,维持细胞正常的生长状态,呈多角或梭形,细胞间形成突起使得细胞间及细胞与材料之间均能较好接触,这为细胞的增殖、分化、信号间传递等生理行为提供了有力的条件。相比未糖基化材料组,在糖基化修饰材料组多观察到MC3T3-E1细胞向材料内部迁移或长入材料内部的现象(如图9中箭头所指),说明胶原经糖基化修饰后能够促进MC3T3-E1细胞的立体迁移,对细胞的生长行为有一定影响。
Claims (10)
1.一种透明质酸寡糖修饰的矿化胶原仿生骨修复材料,结构如下:
胶原-羟基磷灰石复合材料中的胶原通过C-N键连接透明质酸寡糖,获得糖基化修饰的矿化胶原复合材料,透明质酸寡糖的分子量为776~5000Da。
2.如权利要求1所述的矿化胶原仿生骨修复材料,其特征在于,所述透明质酸寡糖修饰胶原的载糖质量百分比为0.909%~5.266%;
优选的,所述胶原为I型胶原,胶原分子量为8~12KD。
3.如权利要求1所述的矿化胶原仿生骨修复材料,其特征在于,按照如下步骤制备得到:
(1)将胶原、透明质酸和NaBH3CN加入反应体系中,36~38℃避光条件下搅拌反应1~3天,然后加入醋酸溶液稀释,超滤离心,沉淀干燥后,制得糖基化胶原蛋白;
所述反应体系为六氟异丙醇(HFP)或二甲基酰胺(DMF)溶剂之一与碳酸氢钠的混合溶液,碳酸氢钠的摩尔浓度为0.05~0.15M,六氟异丙醇或二甲基酰胺与碳酸氢钠的体积比为3:(1~3);
所述胶原加入反应体系后的质量浓度为18~22g/L,透明质酸加入反应体系后的质量浓度为4~6g/L,NaBH3CN加入反应体系后的质量浓度为6g/L~18g/L;
(2)将步骤(1)制得的糖基化胶原蛋白加入盐酸中,搅拌溶解,制得浓度为0.5~0.7mg/ml的糖基化胶原蛋白溶液,然后加入CaCl2溶液,混合均匀,静置8~15min,然后搅拌加入NaH2PO4溶液,调节pH至7,25~38℃静置2~24h,固液分离,沉淀经洗涤后,干燥,制得糖基化胶原矿化复合材料;
所述CaCl2溶液的添加量为步骤(1)中每克胶原添加0.023~0.0913mol的CaCl2;CaCl2与NaH2PO4的摩尔比为(1.5~1.8):1;
(3)将成型剂溶解于六氟异丙醇中,制得质量浓度为2~4%的溶液,然后加入步骤(2)制得的糖基化胶原矿化复合材料,糖基化胶原矿化复合材料剂与成型的质量比为(1~3):1,混合均匀,静电纺丝,制得透明质酸寡糖修饰的矿化胶原仿生骨修复材料;
所述成型剂为胶原、聚乳酸或步骤(1)制得的糖基化胶原蛋白。
4.如权利要求3所述的矿化胶原仿生骨修复材料,其特征在于,所述步骤(1)中,碳酸氢钠的摩尔浓度为0.1M,六氟异丙醇或二甲基酰胺溶剂与碳酸氢钠的体积比为3:2;所述胶原为I型胶原,加入反应体系后的质量浓度为20g/L,透明质酸加入反应体系后的质量浓度为5g/L,NaBH3CN加入反应体系后的质量浓度为6g/L;
优选的,所述步骤(1)中,37℃避光条件下搅拌反应1天;
优选的,所述步骤(1)中,醋酸溶液的质量浓度为5%,稀释体积倍数为8倍;
优选的,所述步骤(1)中,超滤离心的超滤管为30k,离心条件为:4000g/min,25min/次,超滤次数为3~8次;
优选的,所述步骤(1)中,干燥为真空冷冻干燥。
5.如权利要求3所述的矿化胶原仿生骨修复材料,其特征在于,所述步骤(2)中,盐酸的浓度为0.01M;
优选的,所述步骤(2)中,糖基化胶原蛋白溶液的浓度为0.6mg/ml。
6.如权利要求3所述的矿化胶原仿生骨修复材料,其特征在于,所述步骤(2)中,pH调节剂为浓度为0.1~0.5M NaOH溶液;
优选的,所述步骤(2)中,37℃静置22~24h;优选的,所述清洗过程为去离子水反复离心清洗3次,8000~10000r/min,离心8min;
优选的,所述步骤(2)中,干燥为真空冷冻干燥。
7.如权利要求3所述的矿化胶原仿生骨修复材料,其特征在于,所述步骤(3)中,最终电纺液的质量浓度为8%;
优选的,所述成型剂为糖基化胶原蛋白;
优选的,所述步骤(3)中,混合均匀为采用磁力搅拌混合5~10min后,400~500W超声处理20min,继续搅拌24h~48h;优选的,所述纺丝电压为15~20kv,速率为0.6~1.0mL/h,接收距离为8~15cm,接受装置为铝箔或置于铝箔上的直径为14mm的盖玻片。
8.一种透明质酸寡糖修饰的矿化胶原仿生骨修复材料的生物相容性检测方法,其特征在于,包括如下步骤:
a、将待检测的透明质酸寡糖修饰的矿化胶原仿生骨修复材料经固定交联处理、干燥,制得预处理材料;
b、将预处理材料杀菌后,用质量浓度为70%的乙醇溶液浸泡2.5~3.5h,然后转入灭菌的PBS缓冲浸泡2h,取出重复浸泡3~4次,然后用1640培养基或α-MEM培养基浸泡0.5h,制得预处理后样品;
c、将内皮细胞PIEC或前体成骨细胞MC3T3-E1与步骤c制得的预处理后样品共培养,细胞密度103~104个/cm2,37℃、5%CO2条件下培养,分别于培养后的1d、3d、5d和7d检测细胞的增殖情况,用扫描电子显微镜(SEM)观察细胞培养3d、5d后在支架的黏附及生长形态,并对MC3T3-E1在培养过程中检测其碱性磷酸酶ALP的表达情况,根据结果进行生物相容性评价。
9.如权利要求8所述的生物相容性检测方法,其特征在于,所述步骤a中,固定交联处理为采用25%戊二醛蒸汽处理24~36h或者采用含有EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)的95%乙醇体系浸泡20~24h;优选的,所述干燥为在真空干燥箱中静置3~5天。
10.如权利要求8所述的生物相容性检测方法,其特征在于,所述步骤b中,培养过程中每隔2~3天换培养基一次。
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