CN110632295A - 一种Fe3O4-Au抗体纳米磁珠及其制备方法与应用 - Google Patents

一种Fe3O4-Au抗体纳米磁珠及其制备方法与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110632295A
CN110632295A CN201910916384.4A CN201910916384A CN110632295A CN 110632295 A CN110632295 A CN 110632295A CN 201910916384 A CN201910916384 A CN 201910916384A CN 110632295 A CN110632295 A CN 110632295A
Authority
CN
China
Prior art keywords
solution
antibody
preparation
precipitate
nano magnetic
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201910916384.4A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110632295B (zh
Inventor
王立新
沈艳飞
张越
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Southeast University
Original Assignee
Southeast University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Southeast University filed Critical Southeast University
Priority to CN201910916384.4A priority Critical patent/CN110632295B/zh
Publication of CN110632295A publication Critical patent/CN110632295A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110632295B publication Critical patent/CN110632295B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54346—Nanoparticles

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明公开了一种Fe3O4‑Au抗体纳米磁珠及其制备方法与应用。其中所述的Fe3O4抗体纳米磁珠的制备方法为Fe3O4溶液由聚二烯丙基二甲基氯化铵修饰，AuNPs静电吸附到聚二烯丙基二甲基氯化铵修饰后的Fe3O4上，得到Fe3O4‑Au，微管相关蛋白轻链3B抗体共价结合到修饰后的Fe3O4‑Au上，即得。本发明所提供的Fe3O4‑Au抗体纳米磁珠填补了目前富集纯化分泌型自噬小体的空缺，其不需要对样品进行的复杂处理，有优异的抗干扰性能，对分泌型自噬小体具有很高的选择性；另外，Fe3O4‑Au抗体纳米磁珠在富集纯化分泌型自噬小体的应用，具有富集效率高、产物纯度高，操作简便的优势。

Description

一种Fe3O4-Au抗体纳米磁珠及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物医学检测技术领域，具体涉及一种基于Fe3O4-Au特异性富集纯化分泌型自噬小体的纳米磁珠的制备方法与应用。
背景技术
肿瘤是严重威胁人类健康的高发病率和高死亡率疾病，大量研究和临床资料证实，早期诊断和早期治疗是防治肿瘤与降低肿瘤患者死亡率的最有效办法。因此，寻找有助于早期诊断的肿瘤标志物是人们一直关注的焦点。新型的肿瘤标志物可以为癌症的早期诊断提供更多可能，因此，新型肿瘤标志物的检测及应用具有良好的前景。
自噬是指吞噬自身细胞质蛋白或细胞器并使其包被进入囊泡，并与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物的过程。酵母细胞和哺乳动物细胞内形成的自噬小体能够释放至胞外，称之为分泌型自噬小体，自噬小体的特征性标记是LC3B(微管相关蛋白轻链3B)。
研究证实，肿瘤细胞释放自噬小体(TRAP)携带损伤相关分子模式(DAMP)分子，通过TLR2-MyD88-NF-κB信号通路诱导B细胞分化为IL-10+B细胞；通过大胞饮方式吞噬TRAP的中性粒细胞可产生活性氧(ROS)从而诱导中性粒细胞凋亡；TRAP影响巨噬细胞极化。多种证据证实，分泌型自噬小体TRAP与肿瘤的发生发展密切相关。
分泌型自噬小体在肿瘤患者胸腹水及外周血中均有，但含量少，不易捕获和检测，目前常用提取分泌型自噬小体的方法为差速离心法，但操作繁琐，产物纯度低。免疫磁珠常用于纯化，操作简便，产物纯度较高，在不同领域已有应用，具有广阔应用前景。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是针对现有技术的不足，提供了一种Fe3O4-Au抗体纳米磁珠。
进一步的，本发明还提供了Fe3O4-Au抗体纳米磁珠的制备方法。
最后，本发明还提供了Fe3O4-Au抗体纳米磁珠在富集纯化分泌型自噬小体中的应用。
为了解决上述技术问题，本发明公开了一种Fe3O4-Au抗体纳米磁珠的制备方法，其中，Fe3O4溶液由聚二烯丙基二甲基氯化铵(PDDA)修饰，AuNPs静电吸附到PDDA修饰后的Fe3O4上，得到Fe3O4-Au，微管相关蛋白轻链3B(LC3B)抗体共价结合到修饰后的Fe3O4-Au上，即得。
上述Fe3O4-Au抗体纳米磁珠的制备方法，具体包括如下步骤：
1)Fe3O4-Au的制备：将Fe3O4溶液与聚二烯丙基二甲基氯化铵混合震荡10～40min，优选30min，离心得到沉淀物，将沉淀物水洗，按每克湿沉淀物重悬于0.8～1.5mL水中，优选1mL，加入AuNPs室温混合震荡5～10h，优选7h；离心得到沉淀物，将沉淀物水洗，按每克湿沉淀物重悬于0.8～1.5mL水中重悬于水，优选1mL，得到Fe3O4-Au溶液；
2)Fe3O4-Au抗体纳米磁珠的制备：将步骤1)所制备的Fe3O4-Au溶液加入到4-巯基丁酸中，室温震荡10～24h，优选震荡过夜；磁性分离，水洗，优选水洗3次，按每克湿沉淀物重悬于0.8～1.5mL水中，优选1mL；加入1-丁硫醇，室温振荡40～80min，优选1h；磁性分离，水洗，优选水洗3次，按每克湿沉淀物重悬于0.8～1.5mL PBS中，优选1mL；加入EDC/NHS溶液室温振荡100～160min，优选2h，磁性分离，PBS洗，按每克湿沉淀物重悬于0.8～1.5mL PBS中，优选1mL；加入LC3B抗体，2～10℃振荡10～24h，优选4℃震荡过夜；加入BSA，2～10℃搅拌40～80min，优选4℃搅拌1h，磁性分离，PBS洗，优选洗三遍，按每克湿沉淀物重悬于0.8～1.5mL PBS中，优选1mL，获得Fe3O4-Au抗体纳米磁珠溶液。
其中，所述Fe3O4溶液的制备方法如下：将FeCl3与柠檬酸钠溶于乙二醇，随后加入乙酸钠，搅拌10～40min，倒入反应釜中，反应制备Fe3O4溶液。
其中，所述FeCl3与柠檬酸钠的质量比为2:1～4:1，优选3.25:1，控制乙二醇的用量使得FeCl3浓度为0.01～0.05g/mL，优选0.0325g/mL，FeCl3与乙酸钠的质量比为1:1～1:4，优选6.5:12；搅拌速率为400-1000r/min，优选800r/min，反应温度为180～220℃，反应时间为6～12h，优选200℃反应10h；所述的反应釜为水热反应釜；反应结束后物料经离心后得到第一沉淀物，第一沉淀物水洗后离心得到第二沉淀物，第二沉淀物乙醇洗后得到溶于乙醇的液体，即为Fe3O4溶液；所述Fe3O4溶液的浓度为0.5～2mg/mL，pH值为8.0～10；其中，Fe3O4溶液的浓度优选为1mg/mL，pH值优选为9.5。
其中，所述AuNPs的制备方法如下：将HAuCl4溶液加热至沸腾，搅拌下加入柠檬酸钠溶液，继续加热煮沸10～30min，优选15min，冷却，制备AuNPs溶液；
其中，所述HAuCl4溶液的溶剂为水，质量百分比为0.005％～0.02％，优选0.01％；所述柠檬酸钠溶液的溶剂为水，质量百分比为0.05％～2％，优选1％；HAuCl4溶液与柠檬酸钠溶液的体积比为55:1～40:1，优选50:1。
步骤1)中，所述PDDA的质量百分比为2％～5％，优选4％；Fe3O4溶液与PDDA的体积比为1:0.6～1:0.2，优选1:0.4；所述AuNPs的pH值为6.5～7.8，优选7.0；Fe3O4溶液与AuNPs的体积比为1:6～1:15，优选1:10；所述Fe3O4-Au溶液的浓度为0.5～2mg/mL，优选1mg/mL；所述水洗为水洗2～5次，优选3次；所述离心，其转速为8000～12000rpm，优选10000rpm。
步骤2)中，所述4-巯基丁酸的浓度为0.8～1.2mM，优选1mM，Fe3O4-Au溶液与4-巯基丁酸的体积比为6000:1～4000:1，优选5000:1；所述1-丁硫醇的浓度为0.8～1.2mM，优选1mM，Fe3O4-Au溶液与1-丁硫醇的体积比为6000:1～4000:1，优选5000:1；所述EDC/NHS溶液中EDC的浓度为15～30mg/mL，优选20mg/mL，NHS的浓度为5～15mg/mL，优选10mg/mL，溶剂为PBS(pH＝6.0)，Fe3O4-Au溶液与EDC/NHS溶液的体积比为1:0.8～1:1.5，优选1:1；所述LC3B抗体的浓度为0.8～1.2mg/mL，优选1mg/mL，Fe3O4-Au溶液与LC3B抗体的体积比为50:1～200:1，优选100:1；所述BSA的质量百分比为0.2％～2％，优选1％；所述的磁性分离为用磁铁吸引磁性纳米颗粒Fe3O4-Au-LC3B抗体复合物。
上述的制备方法制备得到的Fe3O4-Au抗体纳米磁珠也在本发明保护范围之内。
上述Fe3O4-Au抗体纳米磁珠在富集纯化分泌型自噬小体中的应用也在本发明保护范围之内。
其中，所述的应用为Fe3O4-Au抗体纳米磁珠在细胞培养上清、小鼠外周血和人外周血中富集纯化分泌型自噬小体的应用，包括如下步骤：
①磁性富集纯化自噬小体：将Fe3O4-Au抗体纳米磁珠溶液滴加于自噬小体溶液，20～50℃反应10～120min，优选37℃反应100min，然后用PBS溶液清洗并重悬于PBS，捕获自噬小体；
②将步骤①所捕获的自噬小体用于Western blot、流式细胞术、ELISA检测等。
步骤①中，所述Fe3O4-Au抗体纳米磁珠溶液的的浓度为10～30μg/mL，优选10μg/mL；滴加量为80～150μL，优选100μL；自噬小体溶液量为500～1000μL，优选500μL；重悬于50～100μL PBS，优选50μL。
本发明中技术术语的缩写如下：
肿瘤细胞分泌的自噬小体：TRAP；四氧化三铁：Fe3O4；金纳米粒子：AuNPs；聚二烯丙基二甲基氯化铵：PDDA；1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐：EDC；氮羟基琥珀酰亚胺：NHS；微管相关蛋白轻链3B：LC3B；牛血清白蛋白：BSA。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优势：
(1)本发明的特异性富集纯化分泌型自噬小体的纳米磁珠，填补了目前富集纯化分泌型自噬小体的空缺，不需要对样品进行的复杂处理。
(2)本发明的纳米磁珠具有优异的抗干扰性能，对分泌型自噬小体具有很高的选择性。
(3)本发明的纳米磁珠选择Fe3O4作为原料，价格低廉。
(4)本发明的纳米磁珠富集纯化所得自噬小体可以继续用于后续实验。
(5)本发明所提供的Fe3O4-Au抗体纳米磁珠在富集纯化分泌型自噬小体的应用，其富集效率高、产物纯度高，操作简便。
附图说明
图1本发明中Fe3O4的扫描电镜图。
图2本发明中Fe3O4-Au的扫描电镜图。
图3本发明中Fe3O4-Au抗体纳米磁珠的激光共聚焦图。
图4本发明中Fe3O4-Au抗体纳米磁珠捕获TRAP的激光共聚焦图。
图5本发明中Fe3O4-Au抗体纳米磁珠的特异性验证激光共聚焦图。
图6本发明中Fe3O4-Au抗体纳米磁珠的特异性验证ELISA结果。
图7本发明中Fe3O4-Au抗体纳米磁珠的富集效率Western blot验证。
图8本发明中Fe3O4-Au抗体纳米磁珠的产物纯度流式细胞术验证。
图9本发明中Fe3O4-Au抗体纳米磁珠的富集效率ELISA验证。
图10本发明中Fe3O4-Au抗体纳米磁珠富集肿瘤患者外周血中TRAP的电镜图。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
LC3B抗体购买自NOVUS生物技术有限公司，编号1251A。
实施例1：Fe3O4-Au抗体纳米磁珠的制备
(1)Fe3O4的制备
0.65g FeCl3与0.2g柠檬酸钠溶于20mL乙二醇，随后加入1.2g乙酸钠，剧烈搅拌30min，倒入水热反应釜，200℃反应10h，应结束后物料经离心后得到第一沉淀物，第一沉淀物水洗后离心得到第二沉淀物，第二沉淀物乙醇洗后得到溶于乙醇的液体，得Fe3O4(浓度为1mg/mL，pH值为9.5)，其扫描电镜图如图1所示。
(2)AuNPs的制备
100mL质量分数0.01％HAuCl4水溶液加热至沸腾，搅拌下加入2mL质量分数1％柠檬酸钠水溶液，继续加热煮沸15min，得AuNPs，冷却待用。
(3)Fe3O4-Au的制备
将1mL步骤(1)所制备Fe3O4与400μL 4％PDDA混合振荡30min，离心得到沉淀物，将沉淀物水洗3次，按每克湿沉淀物重悬于1mL水，加入10mL AuNPs(pH＝7.0)，室温振荡7h，10000rpm离心取沉淀，水洗3次，每克湿沉淀物重悬于1mL水中，得Fe3O4-Au溶液(浓度为1mg/mL)，其扫描电镜图如图2所示。
(4)Fe3O4-Au抗体纳米磁珠的制备
向500uL步骤(3)制备的Fe3O4-Au溶液中加入0.1uL 4-巯基丁酸(溶于Fe3O4-Au溶液的终浓度为1mM)，室温振荡过夜；磁性分离，水洗3次，按每克湿沉淀物1mL水重悬，加入0.1uL 1-丁硫醇(终浓度为1mM)，室温振荡1h；磁性分离，水洗3次，按每克湿沉淀物500uLPBS重悬；加入500uL EDC/NHS(20mg/mL，10mg/mL)，室温振荡2h；加入5uL 1mg/mL LC3B抗体，4℃振荡过夜；加入质量百分比为1％BSA，4℃搅拌1h，磁性分离，PBS洗三遍，按每克湿沉淀物重悬于1mL PBS，得Fe3O4-Au抗体纳米磁珠溶液。所述的磁性分离为用磁铁吸引磁性纳米颗粒Fe3O4，其激光共聚焦图像如图3所示。
实施例2：Fe3O4-Au抗体纳米磁珠捕获TRAP验证
Fe3O4-Au抗体纳米磁珠与TRAP室温共孵育2h，磁性分离，PBS洗3遍，重悬于PBS，发现纳米磁珠可以捕获TRAP。激光共聚焦图像如图4所示。
实施例3：Fe3O4-Au抗体纳米磁珠的特异性验证
一组将Fe3O4-Au抗体纳米磁珠与干扰红色荧光蛋白室温共孵育2h，另一组将Fe3O4-Au抗体纳米磁珠与干扰红色荧光蛋白以及染了绿色荧光的TRAP室温共孵育2h，磁性分离，PBS洗3遍，重悬于PBS，发现纳米磁珠可以特异性捕获TRAP，而不会非特异性吸附干扰蛋白。激光共聚焦图像如图5所示。
实施例4：Fe3O4-Au抗体纳米磁珠的特异性验证
将人乙肝核心抗原HBcAg作为干扰蛋白，将纳米磁珠与HBcAg室温共孵育2h，磁性分离，PBS洗3遍，重悬于PBS，使用人乙肝核心抗原ELISA试剂盒检测，发现纳米磁珠不会与干扰蛋白HBcAg结合。结果如图6所示。
实施例5：Fe3O4-Au抗体纳米磁珠的富集效率Western blot验证
将纳米磁珠与自噬小体溶液室温共孵育2h，磁性分离，分别取上清和沉淀，沉淀用PBS洗3遍，重悬于PBS，将上清和沉淀全部进行Western blot检测，比较发现沉淀LC3B量多，上清基本无LC3B，说明纳米磁珠基本将TRAP完全富集，富集效率高。结果如图7所示。
实施例6：Fe3O4-Au抗体纳米磁珠的产物纯度验证
用差速离心法和制备的纳米磁珠分别富集肿瘤病人腹水中的TRAP，富集所得产物用流式细胞术进行纯度验证，观察LC3B+囊泡的比例，发现差速离心法富集的囊泡中72％为LC3B+囊泡，纳米磁珠富集的囊泡中97％为LC3B+囊泡，提示纳米磁珠富集所得的TRAP纯度高，结果如图8所示。
实施例7：Fe3O4-Au抗体纳米磁珠的富集效率ELISA验证
将纳米磁珠与自噬小体溶液室温共孵育2h，磁性分离，分别取上清和沉淀，沉淀用PBS洗3遍，重悬于PBS，将上清和沉淀富集所得TRAP以及等量原液的TRAP裂解后，全部用ELISA方法检测LC3B浓度，比较发现沉淀组的吸光度最高与原液基本相同，上清组吸光度很低，即沉淀LC3B量多，上清基本无LC3B，说明纳米磁珠基本将TRAP完全富集，富集效率高。结果如图9所示。
实施例8：Fe3O4-Au抗体纳米磁珠富集肿瘤患者外周血中TRAP的电镜图
取肿瘤病人EDTA抗凝外周全血，离心后取上清，用纳米磁珠富集后，用透射电镜拍摄所捕获的TRAP，发现其具有自噬小体典型的双层膜结构，确认为TRAP，透射电镜图像如图10所示。
本发明提供了一种Fe3O4-Au抗体纳米磁珠及其制备方法与应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。

Claims (10)

1.一种Fe3O4-Au抗体纳米磁珠的制备方法，其特征在于，Fe3O4溶液由聚二烯丙基二甲基氯化铵修饰，AuNPs静电吸附到聚二烯丙基二甲基氯化铵修饰后的Fe3O4上，得到Fe3O4-Au，微管相关蛋白轻链3B抗体共价结合到修饰后的Fe3O4-Au上，即得。
2.根据权利要求1所述Fe3O4-Au抗体纳米磁珠的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)Fe3O4-Au的制备：将Fe3O4溶液与聚二烯丙基二甲基氯化铵混合震荡10～40min，离心得到沉淀物，将沉淀物水洗，按每克湿沉淀物重悬于0.8～1.5mL水中，加入AuNPs室温混合震荡5～10h，离心得到沉淀物，将沉淀物水洗，重悬于水，得到Fe3O4-Au溶液；
2)Fe3O4-Au抗体纳米磁珠的制备：将步骤1)制备得到的Fe3O4-Au溶液加入到4-巯基丁酸中，室温震荡10～24h；磁性分离，水洗，重悬于水，加入1-丁硫醇，室温振荡40～80min；磁性分离，水洗，重悬于PBS；加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐/氮羟基琥珀酰亚胺溶液室温振荡100～160min，磁性分离，PBS洗，按每克湿沉淀物重悬于0.8～1.5mLPBS中；加入LC3B抗体，2～10℃振荡10～24h；加入BSA，2～10℃搅拌40～80min，磁性分离，PBS洗，重悬于PBS，获得Fe3O4-Au抗体纳米磁珠溶液。
3.根据权利要求1或2所述Fe3O4-Au抗体纳米磁珠的制备方法，其特征在于，所述Fe3O4溶液的制备方法如下：将FeCl3与柠檬酸钠溶于乙二醇，随后加入乙酸钠，搅拌10～40min，倒入反应釜中，反应制备Fe3O4溶液。
4.根据权利要求3所述Fe3O4-Au抗体纳米磁珠的制备方法，其特征在于，所述FeCl3与柠檬酸钠的质量比为2:1～4:1，控制乙二醇的用量使得FeCl3浓度为0.01～0.05g/mL，FeCl3与乙酸钠的质量比为1:1～1:4，搅拌速率为400～1000r/min，反应温度为180～220℃，反应时间为6～12h；反应结束后物料经离心后得到第一沉淀物，第一沉淀物水洗后离心得到第二沉淀物，第二沉淀物乙醇洗后得到溶于乙醇的液体，即为Fe3O4溶液；所述Fe3O4溶液的浓度为0.5～2mg/mL，pH值为8.0～10.0。
5.根据权利要求1或2所述Fe3O4-Au抗体纳米磁珠的制备方法，其特征在于，所述AuNPs的制备方法如下：将HAuCl4溶液加热至沸腾，搅拌下加入柠檬酸钠溶液，继续加热煮沸10～30min，冷却，制备AuNPs溶液；
其中，所述HAuCl4溶液的溶剂为水，质量百分比为0.005％～0.02％；所述柠檬酸钠溶液的溶剂为水，质量百分比为0.05％～2％；HAuCl4溶液与柠檬酸钠溶液的体积比为55:1～40:1。
6.根据权利要求2所述Fe3O4-Au抗体纳米磁珠的制备方法，其特征在于，步骤1)中，所述聚二烯丙基二甲基氯化铵的质量百分比为2％～5％；Fe3O4溶液与聚二烯丙基二甲基氯化铵的体积比为1:0.6～1:0.2；所述AuNPs的pH值为6.5～7.8；Fe3O4溶液与AuNPs的体积比为1:6～1:15；所述Fe3O4-Au溶液的浓度为0.5～2mg/mL。
7.根据权利要求2所述Fe3O4-Au抗体纳米磁珠的制备方法，其特征在于，步骤2)中，所述4-巯基丁酸的浓度为0.8～1.2mM，Fe3O4-Au溶液与4-巯基丁酸的体积比为6000:1～4000:1；所述1-丁硫醇的浓度为0.8～1.2mM，Fe3O4-Au溶液与1-丁硫醇的体积比为6000:1～4000:1；所述1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐/氮羟基琥珀酰亚胺溶液中1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐的浓度为15～30mg/mL，氮羟基琥珀酰亚胺的浓度为5～15mg/mL，溶剂为pH＝6.0的PBS，Fe3O4-Au溶液与1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐/氮羟基琥珀酰亚胺溶液的体积比为1:0.8～1:1.5；所述LC3B抗体的浓度为0.8～1.2mg/mL，Fe3O4-Au溶液与LC3B抗体的体积比为50:1～200:1；所述BSA的质量百分比为0.2％～2％；所述的磁性分离为用磁铁吸引磁性纳米颗粒Fe3O4-Au-LC3B抗体复合物。
8.权利要求1或2所述的制备方法制备得到的Fe3O4-Au抗体纳米磁珠。
9.权利要求8所述Fe3O4-Au抗体纳米磁珠在富集纯化分泌型自噬小体中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：将Fe3O4-Au抗体纳米磁珠溶液滴加于自噬小体溶液，20～50℃反应10～120min，然后用PBS溶液清洗并重悬于PBS，磁性富集捕获自噬小体。
CN201910916384.4A 2019-09-26 2019-09-26 一种Fe3O4-Au抗体纳米磁珠及其制备方法与应用 Active CN110632295B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910916384.4A CN110632295B (zh) 2019-09-26 2019-09-26 一种Fe3O4-Au抗体纳米磁珠及其制备方法与应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910916384.4A CN110632295B (zh) 2019-09-26 2019-09-26 一种Fe3O4-Au抗体纳米磁珠及其制备方法与应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110632295A true CN110632295A (zh) 2019-12-31
CN110632295B CN110632295B (zh) 2022-10-14

Family

ID=68974439

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910916384.4A Active CN110632295B (zh) 2019-09-26 2019-09-26 一种Fe3O4-Au抗体纳米磁珠及其制备方法与应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110632295B (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113804633A (zh) * 2021-09-15 2021-12-17 中国石油大学(华东) 基于Au-Fe3O4纳米材料的沙门氏菌识别免疫探针的制备方法及其应用
CN114602439A (zh) * 2021-07-01 2022-06-10 中国科学院上海硅酸盐研究所 一种ACE2修饰的磁珠及制备方法和在SARS-CoV-2病毒检测中的应用

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101776691A (zh) * 2010-02-09 2010-07-14 北京大学 一种基于金包裹四氧化三铁纳米颗粒的免疫亲和固相萃取方法
CN102507714A (zh) * 2011-11-07 2012-06-20 华中师范大学 有机磷农药生物标志物的检测方法
CN102520164A (zh) * 2011-12-21 2012-06-27 深圳市老年医学研究所 一种提高免疫层析检测灵敏性及特异性的方法
CN103439495A (zh) * 2013-08-13 2013-12-11 南昌大学 单核增生李斯特氏菌富集和快速检测方法
CN105738341A (zh) * 2016-02-22 2016-07-06 中国科学院生态环境研究中心 一种重金属汞离子检测方法
WO2018081684A1 (en) * 2016-10-31 2018-05-03 Musc Foundation For Research Development Polypeptides for improved response to anti-cancer therapy
WO2018200829A1 (en) * 2017-04-26 2018-11-01 University Of South Florida Nanoparticle-enhanced enzymatic immune biosensor assay for antigen detection

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101776691A (zh) * 2010-02-09 2010-07-14 北京大学 一种基于金包裹四氧化三铁纳米颗粒的免疫亲和固相萃取方法
CN102507714A (zh) * 2011-11-07 2012-06-20 华中师范大学 有机磷农药生物标志物的检测方法
CN102520164A (zh) * 2011-12-21 2012-06-27 深圳市老年医学研究所 一种提高免疫层析检测灵敏性及特异性的方法
CN103439495A (zh) * 2013-08-13 2013-12-11 南昌大学 单核增生李斯特氏菌富集和快速检测方法
CN105738341A (zh) * 2016-02-22 2016-07-06 中国科学院生态环境研究中心 一种重金属汞离子检测方法
WO2018081684A1 (en) * 2016-10-31 2018-05-03 Musc Foundation For Research Development Polypeptides for improved response to anti-cancer therapy
WO2018200829A1 (en) * 2017-04-26 2018-11-01 University Of South Florida Nanoparticle-enhanced enzymatic immune biosensor assay for antigen detection

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANTHONY J. DI PASQUA,ET AL: "Preparation of antibody-conjugated gold nanoparticles", 《MATERIALS LETTERS》 *
JINGYU YAO,ET AL: "Tumor-released autophagosomes induce IL-10-producing B cells with suppressive activity on T lymphocytes via TLR2-MyD88-NF-κB signal pathway", 《ONCOIMMUNOLOGY》 *
ZHI-FA WEN，ET AL: "Tumor cell-released autophagosomes (TRAPs) promote immunosuppression through induction of M2-like macrophages with increased expression of PD-L1", 《JOURNAL FOR IMMUNOTHERAPY OF CANCER》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114602439A (zh) * 2021-07-01 2022-06-10 中国科学院上海硅酸盐研究所 一种ACE2修饰的磁珠及制备方法和在SARS-CoV-2病毒检测中的应用
CN114602439B (zh) * 2021-07-01 2023-10-13 中国科学院上海硅酸盐研究所 一种ACE2修饰的磁珠及制备方法和在SARS-CoV-2病毒检测中的应用
CN113804633A (zh) * 2021-09-15 2021-12-17 中国石油大学(华东) 基于Au-Fe3O4纳米材料的沙门氏菌识别免疫探针的制备方法及其应用
CN113804633B (zh) * 2021-09-15 2023-07-11 中国石油大学(华东) 基于Au-Fe3O4纳米材料的沙门氏菌识别免疫探针的制备方法及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN110632295B (zh) 2022-10-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN109507418B (zh) 具有仿细胞结构的磁性纳米粒子、免疫磁性纳米粒子及其制备方法与应用
Zhang et al. A silicon dioxide modified magnetic nanoparticles–labeled lateral flow strips for HBs antigen
WO2011144012A1 (zh) 一种快速检测微生物的磁性荧光试剂盒及其制备方法和使用方法
CN110632295B (zh) 一种Fe3O4-Au抗体纳米磁珠及其制备方法与应用
CN106366196B (zh) 一种EpCAM抗体免疫磁珠及其制备方法
CN111505264B (zh) 外泌体分离方法、免疫磁珠和试剂盒
CN107614458A (zh) 稳定的纳米磁性颗粒分散体
CN110632148B (zh) 一种测定分泌型自噬小体的电化学免疫传感器及其制备方法与应用
CN112011513B (zh) 基于生物正交化学法捕获高纯度循环肿瘤细胞的方法
CN106366197B (zh) 一种HER2、EGFR、EpCAM、MUC1多重抗体免疫磁珠及其制备方法
CN110501208B (zh) 叶酸功能化的链霉亲和素修饰的磁性纳米颗粒、其制备方法和应用
CN112924695B (zh) 基于dna四面体的复合磁性纳米材料、制备及应用
CN111337328A (zh) 一种全血中循环肿瘤细胞无损伤快速捕捉和释放的方法
CN106198963A (zh) 一种用于捕获白细胞的免疫磁珠及其制备方法
CN111624189A (zh) 一种检测癌细胞的表面增强拉曼散射磁性复合纳米材料
WO2017206713A1 (zh) 一种磁微粒偶联抗体分子的方法
CN106366195B (zh) 一种pd-l1抗体免疫磁珠及其制备方法
CN111100840A (zh) 特异性捕获和有效释放循环肿瘤细胞的磁性纳米复合物及其制备方法
CN107389916A (zh) 一种cd133免疫磁珠的制备方法
Zhu et al. Immuno-affinitive supramolecular magnetic nanoparticles incorporating cucurbit [8] uril-mediated ternary host-guest complexation structures for high-efficient small extracellular vesicle enrichment
CN110412262B (zh) 一种鉴定***内皮细胞的磁性探针及其制备
CN106279421B (zh) 一种cd133、cd24、cd44多重抗体免疫磁珠及其制备方法
CN106366198A (zh) 一种免疫磁珠及其制备方法
CN112394167A (zh) 用于捕获和鉴定CTCs的荧光纳米磁珠及其制法和应用
CN113311153B (zh) 一种用于阿尔茨海默病诊疗一体化的多功能的纳米粒子

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant