CN110623977A - 靶向bcma的嵌合抗原受体t细胞在自身免疫性疾病中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种靶向BCMA的嵌合抗原受体T细胞在制备预防和/或治疗自身免疫性疾病的药物中的应用，还提供了一种用于预防和/或治疗自身免疫性疾病的试剂盒、方法。

Description

靶向BCMA的嵌合抗原受体T细胞在自身免疫性疾病中的应用
技术领域
本发明涉及医学生物领域，特别涉及一种靶向BCMA的嵌合抗原受体T细胞在制备预防和/或治疗自身免疫性疾病的药物中的应用、用于预防和/或治疗自身免疫性疾病的试剂盒及方法。
背景技术
自身免疫性疾病是指机体对自身抗原发生免疫反应而导致自身组织损害所引起的疾病，一般是由多种遗传和环境因素等共同造成。举例来说，***性红斑狼疮(SLE)是一种多发于青年女性的累及多脏器的自身免疫性炎症性***病，其病因至今尚未肯定，会导致T淋巴细胞减少、T抑制细胞功能降低、B细胞过度增生，产生大量的自身抗体，并与体内相应的自身抗原结合形成相应的免疫复合物，沉积在皮肤、关节、小血管、肾小球等部位，这些复合物触发炎症、组织破坏或过早死亡。
自身免疫性疾病的治疗方法的疗效相当有限。传统治疗方法依赖于类固醇和各种细胞毒性和细胞抑制性免疫抑制剂的作用，它们应迅速清除扩增性自身反应性免疫细胞从而延缓自身免疫进程的发展。最常用的自身免疫疾病治疗药物(如可的松、氨甲喋呤、霉酚酸酯等)疗效有限，并伴有多种副作用。因此，有必要提供一种副作用小的、可有效治疗自身免疫性疾病的药物及方法。
免疫细胞治疗法已经成为继手术、放疗、化疗之后在肿瘤治疗中具有巨大前景的一种治疗方法，它具有特异性强、几乎无毒副作用的巨大优势弥补了传统疗法的弊端，常见的有嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)技术和T细胞受体(T cell receptor，TCR)基因修饰T细胞(TCR-T)技术。但目前还未见有免疫细胞治疗术在自身免疫性疾病中的应用。
发明内容
鉴于此，本发明提供了一种靶向BCMA的嵌合抗原受体T细胞在自身免疫性疾病中的应用，以提供关于自身免疫性疾病的一种新的预防、治疗手段，且其毒副作用小。
本发明提供了一种靶向BCMA的嵌合抗原受体T细胞在制备预防和/或治疗自身免疫性疾病的药物中的应用。
其中，所述自身免疫疾病包括***性红斑狼疮、类风湿性关节炎、慢性活动性肝炎、硬皮病、天疱疮、皮肌炎、溃疡性结肠炎和桥本甲状腺炎。
可选地，所述自身免疫疾病为***性红斑狼疮。
上述靶向BCMA的嵌合抗原受体T细胞包括：靶向BCMA的嵌合抗原受体CAR-BCMA，所述CAR-BCMA包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向BCMA的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列，其中，所述靶向BCMA的单链抗体包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，所述靶向BCMA的单链抗体为人源化单链抗体。
所述靶向BCMA的单链抗体与有风险发生或已患有自身免疫性疾病的受试者中的B细胞上的BCMA蛋白发生特异性结合。此外，所述靶向BCMA的单链抗体为人源化单链抗体，可以避免引起人机体的免疫反应。
可选地，所述靶向BCMA的单链抗体的编码基因包括如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
可选地，所述CAR-BCMA的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。
可选地，所述CAR-BCMA的编码基因包括如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。
进一步地，所述CAR-BCMA的编码基因包括从5’端到3’端顺次连接的信号肽的编码基因、靶向BCMA的单链抗体的编码基因、胞外铰链区的编码基因、跨膜区的编码基因、胞内信号区的编码基因；所述靶向BCMA的单链抗体为人源化单链抗体，所述靶向BCMA的单链抗体的编码基因包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列所对应的核苷酸序列。
优选地，所述CAR-BCMA的编码基因包括如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。
BCMA是肿瘤坏死因子受体TNF超家族的成员，可结合B细胞激活因子(BAFF)和增殖诱导配体(APRIL)，表达在骨髓瘤细胞、正常浆细胞和部分成熟B细胞中，是一种极为重要的B细胞生物标志物。所述靶向BCMA的嵌合抗原受体T细胞在回输至受试者时，与有风险发生或已患有自身免疫性疾病的受试者中表达BCMA的B细胞发生特异性结合，并在受试者体内有效扩增，高效且特异性地杀伤B细胞，达到预防和/或治疗自身免疫性疾病的目的。
本发明还提供了一种用于预防和/或治疗自身免疫性疾病的试剂盒，所述试剂盒包括靶向BCMA的嵌合抗原受体T细胞。
其中，所述试剂盒还包括药学可接受载体。进一步地，所述药学可接受载体包括水或生理盐水，但不限于此。
其中，所述试剂盒还包括说明书，所述说明书记载有关于对受试者施用所述靶向BCMA的嵌合抗原受体T细胞和所述药学可接受载体的组合物，以预防和/或治疗受试者发生自身免疫性疾病的一种或多种症状的说明。
本发明还提供了一种预防和/或治疗自身免疫性疾病的方法，包括：向受试者施用靶向BCMA的嵌合抗原受体T细胞。这样可预防受试者发生自身免疫病的一种或多种症状，或者使已发生的病症得到改善。
可选地，所述受试者为尚无症状但有风险发生自身免疫性疾病的一种或多种症状的受试者。
进一步地，所述受试者有风险发生***性红斑狼疮(SLE)的一种或多种症状。
可选地，所述受试者为表现出自身免疫性疾病的一种或多种症状的受试者。
本发明的优点将会在下面的说明书中部分阐明，一部分根据说明书是显而易见的，或者可以通过本发明实施例的实施而获知。
附图说明
图1为本发明实施例提供的pWPXLd-CAR-BCMA重组质粒的质粒图谱。
图2为本发明提供的靶向BCMA的嵌合抗原受体T细胞在体外杀伤表达BCMA的细胞的效果。
具体实施方式
以下所述是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
本发明实施例提供了一种靶向BCMA的嵌合抗原受体T细胞在制备预防和/或治疗自身免疫性疾病的药物中的应用。
其中，所述自身免疫疾病包括***性红斑狼疮、类风湿性关节炎、慢性活动性肝炎、硬皮病、天疱疮、皮肌炎、溃疡性结肠炎和桥本甲状腺炎，但不限于这些与B细胞过度增生等相关的自身免疫性疾病。
可选地，所述自身免疫疾病为***性红斑狼疮。
所述自身免疫性疾病与B细胞过度增生、异常分泌抗体等有一定关系，可通过清除B细胞或抑制B细胞功能来预防和/或治疗自身免疫性疾病。而BCMA是肿瘤坏死因子受体TNF超家族的成员，可结合B细胞激活因子(BAFF)和增殖诱导配体(APRIL)，表达在骨髓瘤细胞、正常浆细胞和部分成熟B细胞中，是一种极为重要的B细胞生物标志物。所述靶向BCMA的嵌合抗原受体T细胞在回输至受试者时，可与有风险发生或已患有自身免疫性疾病的受试者中表达BCMA的B细胞发生特异性结合，并在受试者体内有效扩增，其免疫细胞治疗高效且特异性地杀伤B细胞，达到预防和/或治疗自身免疫性疾病的目的。
本发明实施例还提供了一种用于预防和/或治疗自身免疫性疾病的试剂盒，所述试剂盒包括靶向BCMA的嵌合抗原受体T细胞。
其中，所述试剂盒还包括药学可接受载体。进一步地，所述药学可接受载体包括水或生理盐水，但不限于此。
其中，所述试剂盒还包括说明书，所述说明书记载有关于对受试者施用所述靶向BCMA的嵌合抗原受体T细胞和所述药学可接受载体的组合物，以预防和/或治疗受试者发生自身免疫性疾病的一种或多种症状的说明。
本发明实施例还提供了一种预防和/或治疗自身免疫性疾病的方法，包括：向受试者施用靶向BCMA的嵌合抗原受体T细胞。这样可预防受试者发生自身免疫病的一种或多种症状，或者使已发生的病症得到改善。
可选地，所述受试者为尚无症状但有风险发生自身免疫性疾病的一种或多种症状的受试者。
进一步地，所述受试者有风险发生***性红斑狼疮(SLE)的一种或多种症状。
可选地，所述受试者为表现出自身免疫性疾病的一种或多种症状的受试者。
其中，所述靶向BCMA的嵌合抗原受体T细胞的施用量可根据其具体目的来施用。
上述靶向BCMA的嵌合抗原受体T细胞包括：靶向BCMA的嵌合抗原受体CAR-BCMA，所述CAR-BCMA包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向BCMA的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列，其中，所述靶向BCMA的单链抗体包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，所述靶向BCMA的单链抗体为人源化单链抗体。
所述靶向BCMA的嵌合抗原受体T细胞能通过其上的CAR-BCMA中的所述靶向BCMA的单链抗体可与有风险发生或已患有自身免疫性疾病的受试者中表达BCMA的B细胞发生特异性结合，所述T细胞的胞内信号区被激活，可在受试者体内有效扩增，高效且特异性地杀伤B细胞，达到预防和/或治疗自身免疫性疾病的目的。此外，所述靶向BCMA的单链抗体为人源化单链抗体，可以避免引起人机体的免疫反应。
可选地，所述靶向BCMA的单链抗体的编码基因包括如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
可选地，所述靶向BCMA的单链抗体编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQ ID NO:2具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO:1。
所述“从氨基端到羧基端顺次连接”具体为：所述靶向BCMA的单链抗体或所述靶向BCMA的单链抗体的氨基酸序列的羧基端与所述胞外铰链区的氨基酸序列的氨基端相连，所述胞外铰链区的氨基酸序列的羧基端与所述跨膜区的氨基酸序列的氨基端相连，所述跨膜区的氨基酸序列的羧基端与所述胞内信号区的氨基酸序列的氨基端相连。
本发明中，所述CAR-BCMA中的胞外铰链区用于促进所述靶向BCMA的单链抗体与表达BCMA的B淋巴细胞上的BCMA结合。
可选地，所述胞外铰链区包括CD8α铰链区、CD28铰链区、CD4铰链区、CD5铰链区、CD134铰链区、CD137铰链区、ICOS铰链区中的一种或多种的组合。
进一步可选地，所述胞外铰链区为CD8α铰链区。
可选地，所述CD8α铰链区的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。
可选地，所述CD8α铰链区的编码基因包括如SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列。所述CD8α铰链区的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQ ID NO:7具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO:6。
本发明中，所述跨膜区用于固定所述靶向BCMA的嵌合抗原受体CAR-BCMA。
可选地，所述跨膜区包括CD3跨膜区、CD4跨膜区、CD8跨膜区、CD28跨膜区中的一种或多种的组合。
进一步可选地，所述跨膜区为CD8跨膜区。
可选地，所述CD8跨膜区的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列。
可选地，所述CD8跨膜区的编码基因包括如SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列。所述CD8跨膜区的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:9所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQ ID NO:9具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO:8。
本发明中，所述胞内信号区用于提供T细胞活化的信号，维持T细胞的生存时间和激活T细胞增殖信号通路。
可选地，所述胞内信号区包括4-1BB信号区、CD3ζ信号区、ICOS信号区、CD27信号区、OX40信号区、CD28信号区、IL1R1信号区、CD70信号区、TNFRSF19L信号区中的一种或多种的组合。
在本发明一实施方式中，所述胞内信号区为从氨基端到羧基端顺次连接的4-1BB信号区和CD3ζ信号区。
在本发明另一实施方式中，所述胞内信号区还可以为从氨基端到羧基端顺次连接的CD27信号区和CD3ζ信号区。
可选地，所述4-1BB信号区的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：10所示的氨基酸序列。
可选地，所述4-1BB信号区的编码基因包括如SEQ ID NO：11所示的核苷酸序列。所述4-1BB信号区的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQ ID NO:11具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO:10。
可选地，所述CD3ζ信号区的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：12所示的氨基酸序列。
可选地，所述CD3ζ信号区的编码基因包括如SEQ ID NO：13所示的核苷酸序列。所述CD3ζ信号区的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQ ID NO:13具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO:12。
可选地，所述CAR-BCMA的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。
可选地，所述CAR-BCMA的编码基因包括如SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。所述CAR-BCMA的编码基因应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:4所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQ ID NO:4具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO:3。
进一步地，所述CAR-BCMA的编码基因包括从5’端到3’端顺次连接的信号肽的编码基因、靶向BCMA的单链抗体的编码基因、胞外铰链区的编码基因、跨膜区的编码基因、胞内信号区的编码基因；所述靶向BCMA的单链抗体为人源化单链抗体，所述靶向BCMA的单链抗体的编码基因包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列所对应的核苷酸序列。
其中，所述信号肽的编码基因可用于较好地指导所述CAR-BCMA达到细胞表面，但在嵌合抗原受体CAR-BCMA表达到T细胞表面时，信号肽在蛋白翻译成熟过程中被信号肽酶切割。因此，在翻译成的CAR-BCMA的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)中并未带有信号肽的氨基酸序列。
可选地，所述信号肽的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：14所示的氨基酸序列。
可选地，所述信号肽的编码基因包括如SEQ ID NO：15所示的核苷酸序列。所述信号肽的编码基因序列应该考虑简并碱基，即如SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列的编码基因包括如SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列，保护范围还应该保护与SEQ ID NO:15具有碱基简并性质的核苷酸序列，这些核苷酸序列对应的氨基酸序列仍然为SEQ ID NO:14。
优选地，所述CAR-BCMA的编码基因包括如SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。与SEQID NO：4所示的核苷酸序列相比，SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列中多了信号肽的编码基因。
本发明一实施方式中，所述靶向BCMA的嵌合抗原受体T细胞可通过以下方法制得：
(1)提供靶向BCMA的嵌合抗原受体CAR-BCMA的编码基因，所述CAR-BCMA的编码基因包括从5’端到3’端顺次连接的信号肽的编码基因、靶向BCMA的单链抗体的编码基因、胞外铰链区的编码基因、跨膜区的编码基因和胞内信号区的编码基因；所述靶向BCMA的单链抗体为人源化单链抗体，所述靶向BCMA的单链抗体的编码基因包括如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；
(2)将所述CAR-BCMA的编码基因***到pWPXLD载体中，得到pWPXLD-CAR-BCMA重组质粒；
(3)将所述pWPXLD-CAR-BCMA重组质粒与包膜质粒、包装质粒共转染宿主细胞，包装得到重组慢病毒；
(4)将所述重组慢病毒转染CD3阳性T淋巴细胞，获得靶向BCMA的嵌合抗原受体T细胞。
所述重组慢病毒的包装可采用三质粒***或四质粒***，包膜质粒、包装质粒为本领域常用的物质。
下面通过一个具体的实施例来介绍靶向BCMA的嵌合抗原受体T细胞的制备，具体包括以下步骤：
(1)制备靶向BCMA的嵌合抗原受体CAR-BCMA的基因序列
分别制备信号肽、靶向BCMA的单链抗体、CD8α铰链区、CD8跨膜区、4-1BB信号区和CD3ζ信号区的编码基因，所述信号肽的编码基因序列如SEQ ID NO：15所示，所述靶向BCMA的单链抗体的编码基因序列如SEQ ID NO：2所示，所述CD8α铰链区的编码基因序列如SEQID NO：7所示，所述CD8跨膜区的编码基因序列如SEQ ID NO：9所示，所述4-1BB信号区的编码基因序列如SEQ ID NO：11所示，所述CD3ζ信号区的编码基因序列如SEQ ID NO：13所示。
通过PCR的方法将上述信号肽、靶向BCMA的单链抗体、CD8α铰链区、CD8跨膜区、4-1BB信号区和CD3ζ信号区的编码基因依次从5’端到3’端连接到一起，得到CAR-BCMA的编码基因，该CAR-BCMA的编码基因如SEQ ID NO：5所示，靶向BCMA的单链抗体为人源化单链抗体。
(2)构建pWPXLd-CAR-BCMA重组质粒
将CAR-BCMA的编码基因***到pWPXLD载体的BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点之间，且位于pWPXLD载体的延伸因子1α(EF1α)之后，以EF1α为启动子。所述CAR-BCMA的编码基因***到pWPXLD载体时，所述CAR-BCMA的编码基因的5’端可加入起始密码子(如ATG)与pWPXLD载体中BamHⅠ酶切位点相连，3’端可加入终止密码子(如TAA)与pWPXLD载体中EcoRⅠ酶切位点相连。然后转入大肠杆菌感受态细胞DH5α，进行阳性克隆PCR鉴定和测序鉴定。经过PCR产物凝胶电泳检测和测序鉴定符合目的片段大小和序列，成功构建如图1所示的pWPXLd-CAR-BCMA重组质粒。
(3)重组慢病毒构建
将pWPXLd-CAR-BCMA重组质粒、包装质粒psPAX2、包膜质粒pMD2G三者共转染入培养好的HEK293T细胞。第48h收获含病毒的上清，经0.45μm滤膜过滤，-80℃超低温冰箱中保存；第72h二次收获含病毒的上清，0.45μm滤膜过滤，与第48h收获的病毒上清合并后一起加入超速离心管中，逐一放入至Beckman超速离心机内，设置离心参数为25000rpm，离心时间为2h，离心温度控制在4℃；离心结束后，弃去上清，尽量去除残留在管壁上的液体，加入病毒保存液，轻轻反复吹打重悬；经充分溶解后，高速离心10000rpm，离心5min后，取上清荧光法测定滴度，病毒按照100μl，2×108个/mL分装，保存于-80℃超低温冰箱，得到带CAR-BCMA编码基因的重组慢病毒。
(5)靶向性T淋巴细胞的制备
a)PBMC(外周血单个核细胞)的分离
PBMC来源于自体静脉血、自体骨髓、脐带血和胎盘血等。最好是来源于癌症患者手术一个月后、放化疗一个月后采集的新鲜外周血或骨髓。
抽取病人血液，送样至血液分离室；采集外周血单个核细胞，Ficoll离心分离后取中间层细胞；经PBS洗涤后，得到PBMC。
b)免疫磁珠法分离抗原特异性T淋巴细胞
取上述PBMC，加入不含血清的基础培养基，配成细胞悬液；按磁珠与细胞的比例为3:1，加入CD3/CD28免疫磁珠，室温孵1-2h；采用磁铁对孵育好磁珠的细胞进行筛选；PBS洗涤，去除免疫磁珠后，得到CD3阳性T淋巴细胞。
c)病毒转染法制备抗原特异性T淋巴细胞
取上述经免疫磁珠分离法得到的CD3阳性T淋巴细胞，加入与CD3阳性细胞数相应的病毒滴度的所述重组慢病毒进行培养。
培养的第3天，进行细胞计数和换液，调整细胞浓度为1×106个/mL，接种，培养；培养的第5天，观察细胞状态，如果细胞密度增大，则稀释细胞浓度为1×106个/mL，检测细胞活性，继续培养。扩增培养到第9-11天，收集细胞，得到靶向BCMA的嵌合抗原受体T细胞，并保存在回输专用的细胞冻存液中，以供患者回输用。
效果实施例
为了评估本发明所描述的上述方法制备的靶向BCMA的嵌合抗原受体T细胞在自身免疫性疾病方面的效果，进行如下效果实施例。
评估靶向BCMA的嵌合抗原受体T细胞的体外杀伤表达BCMA的细胞的能力
采取人的外周血，将本发明实施例制得的靶向BCMA的嵌合抗原受体T细胞(简写为实验组)与未经制备的T淋巴细胞(阴性对照组)进行体外杀伤表达BCMA的细胞的效果比较，具体地：在体外将上述两组效应细胞(即靶向BCMA的嵌合抗原受体T细胞、未经制备的T淋巴细胞)与靶细胞(H929细胞)按数量比为20:1、10:1、5:1、2.5:1、1.2:1、0.6:1和0.3:1的比例，在37℃、5％CO2下进行共培养，在培养后的第3.5小时，在靶细胞最大释放组的孔中分别加入细胞裂解液，之后继续在37℃下培养。将培养4h后的96孔板在300g下离心2min，每孔吸取上清50μL，转入一个新的透明平底96孔板，每孔加入50μL的LDH工作液(注意操作过程尽量不要产生气泡，逐个检查每孔是否有气泡，气泡一定要用移液枪尖吸出，否则对OD值读数影响很大)。室温反应30min，共反应4小时，于全波长读数仪上读取OD490和OD600，检测H929细胞的杀伤情况，结果如图2所示。
从图2中可看出，实验组的所述靶向BCMA的嵌合抗原受体T细胞具有十分强的杀伤表达BCMA的细胞(即H929细胞)的能力，这说明其有望杀伤患自身免疫性疾病的患者中过度表达的带BCMA靶点的B细胞，达到治疗自身免疫性疾病的效果。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 深圳宾德生物技术有限公司
<120> 靶向BCMA的嵌合抗原受体T细胞在自身免疫性疾病中的应用
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 248
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Pro Ser Leu Ala Met Ser Leu Gly
1 5 10 15
Lys Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Thr Ile Leu
20 25 30
Gly Ser His Leu Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Thr Leu Leu Ile Gln Leu Ala Ser Asn Val Gln Thr Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Asp Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Arg
85 90 95
Thr Ile Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys
130 135 140
Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
145 150 155 160
Thr Asp Tyr Ser Ile Asn Trp Val Lys Arg Ala Pro Gly Lys Gly Leu
165 170 175
Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Arg Glu Pro Ala Tyr Ala
180 185 190
Tyr Asp Phe Arg Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser
195 200 205
Thr Ala Thr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Tyr Glu Asp Thr Ala Thr
210 215 220
Tyr Phe Cys Ala Leu Ala Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
225 230 235 240
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 2
<211> 744
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gacatcgtgc tgacccagag ccctcctagc ctggccatga gcctgggcaa gagggccacc 60
atcagctgca gggccagcga aagcgtgacc atcctgggca gccacctgat ccactggtac 120
cagcagaagc ctggccagcc ccctaccctg ctgatccagc tggccagcaa cgtgcagaca 180
ggcgtgcctg ccaggtttag cggcagcggc agcaggaccg acttcaccct gaccatcgac 240
cctgtggagg aggacgacgt ggccgtgtac tactgcctgc agagcaggac catccctagg 300
accttcggcg gcggcaccaa gctggagatt aagggaggcg gaggatctgg cggcggagga 360
agtggcggag ggggatctgg gggaggcgga agccagatcc agctggtgca gagcggccct 420
gagctgaaga agcccggcga gaccgtgaag atcagctgca aggccagcgg ctacaccttc 480
accgactaca gcatcaactg ggtgaagagg gcccctggca agggcctgaa gtggatgggc 540
tggatcaaca ccgagaccag ggagcccgcc tacgcctacg acttcagggg caggttcgcc 600
ttcagcctgg agacaagcgc cagcaccgcc accctgcaga tcaacaacct gaagtacgag 660
gacaccgcca catacttctg cgccctggcc tacagctacg ccatggacta ctggggccag 720
ggcacatccg tgaccgtgag cagc 744
<210> 3
<211> 471
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Pro Ser Leu Ala Met Ser Leu Gly
1 5 10 15
Lys Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Thr Ile Leu
20 25 30
Gly Ser His Leu Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Thr Leu Leu Ile Gln Leu Ala Ser Asn Val Gln Thr Gly Val Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Asp Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser Arg
85 90 95
Thr Ile Pro Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly
100 105 110
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
115 120 125
Gly Gly Ser Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys
130 135 140
Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe
145 150 155 160
Thr Asp Tyr Ser Ile Asn Trp Val Lys Arg Ala Pro Gly Lys Gly Leu
165 170 175
Lys Trp Met Gly Trp Ile Asn Thr Glu Thr Arg Glu Pro Ala Tyr Ala
180 185 190
Tyr Asp Phe Arg Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser
195 200 205
Thr Ala Thr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Tyr Glu Asp Thr Ala Thr
210 215 220
Tyr Phe Cys Ala Leu Ala Tyr Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
225 230 235 240
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro
245 250 255
Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro
260 265 270
Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu
275 280 285
Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys
290 295 300
Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly
305 310 315 320
Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val
325 330 335
Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu
340 345 350
Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp
355 360 365
Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn
370 375 380
Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg
385 390 395 400
Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly
405 410 415
Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu
420 425 430
Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu
435 440 445
Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His
450 455 460
Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
465 470
<210> 4
<211> 1413
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gacatcgtgc tgacccagag ccctcctagc ctggccatga gcctgggcaa gagggccacc 60
atcagctgca gggccagcga aagcgtgacc atcctgggca gccacctgat ccactggtac 120
cagcagaagc ctggccagcc ccctaccctg ctgatccagc tggccagcaa cgtgcagaca 180
ggcgtgcctg ccaggtttag cggcagcggc agcaggaccg acttcaccct gaccatcgac 240
cctgtggagg aggacgacgt ggccgtgtac tactgcctgc agagcaggac catccctagg 300
accttcggcg gcggcaccaa gctggagatt aagggaggcg gaggatctgg cggcggagga 360
agtggcggag ggggatctgg gggaggcgga agccagatcc agctggtgca gagcggccct 420
gagctgaaga agcccggcga gaccgtgaag atcagctgca aggccagcgg ctacaccttc 480
accgactaca gcatcaactg ggtgaagagg gcccctggca agggcctgaa gtggatgggc 540
tggatcaaca ccgagaccag ggagcccgcc tacgcctacg acttcagggg caggttcgcc 600
ttcagcctgg agacaagcgc cagcaccgcc accctgcaga tcaacaacct gaagtacgag 660
gacaccgcca catacttctg cgccctggcc tacagctacg ccatggacta ctggggccag 720
ggcacatccg tgaccgtgag cagcaccacg acgccagcgc cgcgaccacc aacaccggcg 780
cccaccatcg cgtcgcagcc cctgtccctg cgcccagagg cgtgccggcc agcggcgggg 840
ggcgcagtgc acacgagggg gctggacttc gcctgtgata tctacatctg ggcgcccttg 900
gccgggactt gtggggtcct tctcctgtca ctggttatca ccctttactg caaacggggc 960
agaaagaaac tcctgtatat attcaaacaa ccatttatga gaccagtaca aactactcaa 1020
gaggaagatg gctgtagctg ccgatttcca gaagaagaag aaggaggatg tgaactgaga 1080
gtgaagttca gcaggagcgc agacgccccc gcgtacaagc agggccagaa ccagctctat 1140
aacgagctca atctaggacg aagagaggag tacgatgttt tggacaagag acgtggccgg 1200
gaccctgaga tggggggaaa gccgagaagg aagaaccctc aggaaggcct gtacaatgaa 1260
ctgcagaaag ataagatggc ggaggcctac agtgagattg ggatgaaagg cgagcgccgg 1320
aggggcaagg ggcacgatgg cctttaccag ggtctcagta cagccaccaa ggacacctac 1380
gacgcccttc acatgcaggc cctgccccct cgc 1413
<210> 5
<211> 1473
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gccctgcctg tgacagccct gctgctgcct ctggctctgc tgctgcatgc cgctagaccc 60
gacatcgtgc tgacccagag ccctcctagc ctggccatga gcctgggcaa gagggccacc 120
atcagctgca gggccagcga aagcgtgacc atcctgggca gccacctgat ccactggtac 180
cagcagaagc ctggccagcc ccctaccctg ctgatccagc tggccagcaa cgtgcagaca 240
ggcgtgcctg ccaggtttag cggcagcggc agcaggaccg acttcaccct gaccatcgac 300
cctgtggagg aggacgacgt ggccgtgtac tactgcctgc agagcaggac catccctagg 360
accttcggcg gcggcaccaa gctggagatt aagggaggcg gaggatctgg cggcggagga 420
agtggcggag ggggatctgg gggaggcgga agccagatcc agctggtgca gagcggccct 480
gagctgaaga agcccggcga gaccgtgaag atcagctgca aggccagcgg ctacaccttc 540
accgactaca gcatcaactg ggtgaagagg gcccctggca agggcctgaa gtggatgggc 600
tggatcaaca ccgagaccag ggagcccgcc tacgcctacg acttcagggg caggttcgcc 660
ttcagcctgg agacaagcgc cagcaccgcc accctgcaga tcaacaacct gaagtacgag 720
gacaccgcca catacttctg cgccctggcc tacagctacg ccatggacta ctggggccag 780
ggcacatccg tgaccgtgag cagcaccacg acgccagcgc cgcgaccacc aacaccggcg 840
cccaccatcg cgtcgcagcc cctgtccctg cgcccagagg cgtgccggcc agcggcgggg 900
ggcgcagtgc acacgagggg gctggacttc gcctgtgata tctacatctg ggcgcccttg 960
gccgggactt gtggggtcct tctcctgtca ctggttatca ccctttactg caaacggggc 1020
agaaagaaac tcctgtatat attcaaacaa ccatttatga gaccagtaca aactactcaa 1080
gaggaagatg gctgtagctg ccgatttcca gaagaagaag aaggaggatg tgaactgaga 1140
gtgaagttca gcaggagcgc agacgccccc gcgtacaagc agggccagaa ccagctctat 1200
aacgagctca atctaggacg aagagaggag tacgatgttt tggacaagag acgtggccgg 1260
gaccctgaga tggggggaaa gccgagaagg aagaaccctc aggaaggcct gtacaatgaa 1320
ctgcagaaag ataagatggc ggaggcctac agtgagattg ggatgaaagg cgagcgccgg 1380
aggggcaagg ggcacgatgg cctttaccag ggtctcagta cagccaccaa ggacacctac 1440
gacgcccttc acatgcaggc cctgccccct cgc 1473
<210> 6
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 7
<211> 135
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60
tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120
gacttcgcct gtgat 135
<210> 8
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
20
<210> 9
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60
accctttact gc 72
<210> 10
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 11
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60
actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120
gaactg 126
<210> 12
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Lys Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 13
<211> 336
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc 60
tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120
cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180
gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240
cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300
tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336
<210> 14
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu His
1 5 10 15
Ala Ala Arg Pro
20
<210> 15
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gccctgcctg tgacagccct gctgctgcct ctggctctgc tgctgcatgc cgctagaccc 60

Claims (10)

1.一种靶向BCMA的嵌合抗原受体T细胞在制备预防和/或治疗自身免疫性疾病的药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述自身免疫疾病包括***性红斑狼疮、类风湿性关节炎、慢性活动性肝炎、硬皮病、天疱疮、皮肌炎、溃疡性结肠炎和桥本甲状腺炎。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述靶向BCMA的嵌合抗原受体T细胞包括靶向BCMA的嵌合抗原受体CAR-BCMA，其中，所述CAR-BCMA包括从氨基端到羧基端顺次连接的靶向BCMA的单链抗体、胞外铰链区、跨膜区和胞内信号区的氨基酸序列；所述靶向BCMA的单链抗体的氨基酸序列包括如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，所述靶向BCMA的单链抗体为人源化单链抗体。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述靶向BCMA的单链抗体的编码基因包括如SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述CAR-BCMA的氨基酸序列包括如SEQ IDNO：3所示的氨基酸序列。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述CAR-BCMA的编码基因序列包括如SEQ IDNO：4所示的核苷酸序列。
7.一种用于预防和/或治疗自身免疫性疾病的试剂盒，所述试剂盒包括靶向BCMA的嵌合抗原受体T细胞。
8.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括药学可接受载体。
9.如权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括说明书，所述说明书记载有关于对受试者施用所述靶向BCMA的嵌合抗原受体T细胞和所述药学可接受载体的组合物，以预防和/或治疗受试者发生自身免疫性疾病的一种或多种症状的说明。
10.一种预防和/或治疗自身免疫性疾病的方法，包括：向受试者施用靶向BCMA的嵌合抗原受体T细胞。
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