CN110621322A

CN110621322A - 用异双功能性化合物进行的可调节的内源性蛋白质降解

Info

Publication number: CN110621322A
Application number: CN201880024547.1A
Authority: CN
Inventors: D·巴克利; G·温特; A·J·菲利普斯; T·P·赫弗南; J·布拉德纳; J·罗伯茨; B·纳贝特
Original assignee: Dana Farber Cancer Institute Inc
Current assignee: Dana Farber Cancer Institute Inc
Priority date: 2017-02-08
Filing date: 2018-02-08
Publication date: 2019-12-27
Also published as: JP2020513789A; JP7273713B2; WO2018148443A1; US20190374657A1; EP3579847A4; AU2018219292A1; EP3579847A1; CA3053008A1

Abstract

本发明提供了一种以避免与CRISPR内源性蛋白质敲除或敲入策略和提供单核苷酸校正或改变的策略相关的问题的方式调节体内基因表达的方法。本发明包含将编码异双功能性化合物靶向蛋白(dTAG)的核苷酸与编码感兴趣的内源性表达蛋白的基因的核苷酸序列框内***基因组中，该基因在表达时产生内源性蛋白质‑dTAG杂合蛋白。这允许使用异双功能性化合物的该dTAG和该融合的内源性蛋白质的靶向蛋白降解。

Description

用异双功能性化合物进行的可调节的内源性蛋白质降解

相关申请案

本申请主张2017年2月8日提交的临时美国专利申请案第 62/456,654号和2017年2月9日提交的临时美国专利申请案第 62/457,127号的权益。这些申请案的全部内容通过引用并入本文以进行所有目的。

引用方式而并入

名称为“16010-025WO1_sequencelisting_ST25.txt”的文本文件的内容是在2018年1月26日创建，大小为287千字节，通过引用方式整体并入本文。

技术领域

本发明描述了使用靶向蛋白降解调节内源性表达蛋白质的方法、化合物和组合物。

背景技术

已经开发了许多工具来操纵基因表达以询问感兴趣的基因或蛋白质的功能。例如，诸如RNA干扰和反义脱氧寡核苷酸的技术通常用于破坏RNA和DNA水平的蛋白质表达。同源重组或功能丧失突变可以使用锌指核酸酶、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)或聚集调节间隙短回文重复(CRISPR)-Cas9进行位点特异性双股断裂 (Cheng,J.K.andAlper,H.S.,“The genome editing toolbox:a spectrum of approaches for targetedmodification”Curr.Opin. Biotechnol.,30C，(2014):87-94；和Graham et al.,GenBiol， (2015):16:260)。CRISPR-Cas9***已用于通过将特定突变并入感兴趣的基因来调节内源性基因表达(参见，例如，Lo et al.,Genetics, 2013；195(2):331-348；Yu et al.,Biology Open,2014；3:271-280； Park et al.,PLOS One,2013；9(4):e95101；Lackner etal.,Nature Communications,2015；17(6):1-7；美国专利第8,771,945和 9,228,208号；WO2014/204729；以及美国专利申请案 2014/0273235)。

例如，CRISPR-Cas9***用于在携带人肝细胞的嵌合肝脏-人源化小鼠中突变人类PCSK9基因(Wang,X.,et al."CRISPR-Cas9 Targeting of PCSK9 in HumanHepatocytes In Vivo." Arteriosclerosis,Thrombosis,and Vascular Biology,(2016))。 PCSK9成功突变，并且已提出CRISPR-Cas9***可用作体内治疗人类疾病的方法。然而，永久性基因组修饰的长期影响尚不清楚，并且存在关于基因组编辑的不完全精确性，及病毒传递的CRISPR-Cas9 的连续活性以及成人可能存在的生物补偿机制对直接校正的影响 (Kormann et al.,“Expression of therapeutic proteins after deliveryof chemically modified mRNA in mice”Nat.Biotechnol.,29, (2011):154-157；Cho etal.,“Analysis of off-target effects of CRISPR/Cas-derived RNA-guidedendonucleases and nickases.” Genome Res.,24,(2014):132-141)。此外，在表达的蛋白质(即使不完美)对细胞功能必不可少的情况下，CRISPR敲除策略可能是不合需要的。

已经努力使用诱导型降解***在体外调节基因表达。例如，植物中的植物生长素诱导降解(AID)***已经能够控制酵母和培养的脊椎动物细胞中的蛋白质消耗。该***依赖于植物特异性F盒蛋白TIR1 的表达，其调节响应于植物激素生长素的植物生长和形态发生的多个方面。TIR1是Skp1-Cullin-F-box E3泛素连接酶复合物的底物识别组分，其仅在生长素存在下识别底物，并靶向它们以被蛋白酶体降解。该***已经***作并显示出能够在秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)以及人HCT116细胞中产生条件性生长素依赖性蛋白质消耗 (参见，例如，Zhang et al.,Development,2015；142:4374-4384 andNatsume et al.,Cell Reports,2016；15:210-218)。然而，由于生长素的毒性，这种方法作为体内调节***是不切实际的。

可逆控制基因表达的另一种方法是使用配体依赖性去稳定结构域和Shield-1配体，其允许以剂量依赖性方式对标记的感兴趣的蛋白质进行可逆的稳定化和去稳定化(参见，例如，Rakhit et al., Chemistry&Biology,2014；21:1238-1252)。将去稳定结构域与感兴趣的基因融合导致表达融合蛋白，其被蛋白酶体降解。Shield-1特异性结合去稳定化结构域并使蛋白质降解失活。然而，由于需要在细胞质中存在Sield-1以避免降解，该***作为体内调节策略也不可行。这种方法需要持续给药Shield-1以维持蛋白质稳定性。

因此，仍然存在对改进的***的未满足的需求，该改进的***允许在体内可逆地控制内源性基因表达，同时在患有诸如蛋白病的病症的受试者中提供改善的治疗方式。

因此，本发明的一个目的是提供方法、化合物和组合物，以避免与CRISPR内源性蛋白质敲除或敲入策略相关的问题的方式调节体内基因表达。

发明内容

本发明提供了一种以避免与CRISPR内源性蛋白质敲除或敲入策略和提供单一核苷酸校正或改变的策略相关的问题的方式调节体内基因表达的方法。本发明包括将编码异双功能性化合物靶向蛋白(dTAG) 的核苷酸与编码感兴趣的内源性表达蛋白的基因的核苷酸序列同框插入基因组中，该基因在表达时产生内源性蛋白质-dTAG杂合蛋白。这允许以受控的可调节方式使用异双功能性化合物来靶向蛋白降解 dTAG和融合的内源性蛋白质。

如本文所考虑的异双功能性化合物是在体内通过泛素连接酶结合部分与泛素连接酶结合并且还通过其dTAG靶向配体与dTAG结合的化合物，如下文更详细地定义。异双功能性化合物能够经由募集 E3泛素连接酶和随后的泛素化来诱导蛋白酶体介导的融合内源性蛋白质的降解。这些类似药物的分子提供了对蛋白质水平的可逆、剂量反应、可调节、暂时控制的可能性。

与将不可逆变化并入感兴趣的基因中的CRISPR-Cas9基因组编辑相比，使用异双功能性化合物以dTAG靶向内源性表达的蛋白质允许可逆地控制感兴趣的内源性表达的蛋白质。因此，异双功能性化合物可用作蛋白质表达的变阻器(rheostat)，提供在滴定异双功能性化合物时开启和关闭内源性蛋白质表达的能力。此外，通过基因组和稳定地将编码dTAG的核酸序列整合到内源性蛋白质的基因的5'或 3'中，可以避免与CRISPR-Cas9相关的副作用，例如与永久编辑基因相关的负面下游后果。

本发明提供了通过将基因组工程与小分子活化/降解调节相结合来控制介导疾病的内源性蛋白质降解的机制。本文所述的方法和组合物特别适用于靶向与疾病相关的内源性蛋白质，这是由于蛋白质可能参与的获得功能，毒性积累，过表达或下游酶促过程。该技术的应用包括但不限于1)蛋白质的靶向降解，其中病理学是获得功能的突变的结果，2)蛋白质的靶向降解，其中病理学是扩增或增加的表达的功能，3)作为单基因疾病表现的蛋白质的靶向降解，4)蛋白质的靶向降解，其中遗传易感性表现出较长时间并且通常在替代的生物学补偿机制不再足够之后，例如但不限于高胆固醇血症和蛋白质病。

因此，在一个具体例中，提供了一种方法，其至少包括以下步骤：

(i)用编码dTAG的核酸序列转化受试者(通常是人类)的相关细胞，其中该核酸序列与内源性蛋白质的核酸序列在框架内基因组整合，该内源性蛋白质充当疾病介质，其中编码dTAG 的核酸***基因组序列中，在表达时产生内源性蛋白质- dTAG杂合体或融合蛋白；和

(ii)根据需要向受试者给药异双功能性化合物，该异双功能性化合物以使dTAG(和因此内源性蛋白质-dTAG杂合蛋白)接近泛素连接酶的方式结合a)***的dTAG和b)泛素连接酶，使内源性蛋白质-dTAG杂合蛋白泛素化，然后被蛋白酶体降解。

在一个具体例中，受试者的细胞在体内转化。在一个具体例中，将受试者的细胞离体转化并给药回受试者。在一个具体例中，受试者的细胞是肝细胞。

在一个具体例中，提供了一种方法，包括以下步骤：

根据需要向受试者给药异双功能性化合物，其中该受试者具有一个或多个已用编码dTAG的核酸序列转化的细胞，其中该核酸序列用作为疾病介质的内源性蛋白质的核酸序列定向，在基因组中以5'或 3'内框内整合，其中编码dTAG的核酸***基因组序列，在蛋白质表达时产生内源性蛋白质-dTAG杂合体或融合蛋白质；并且其中异双功能性化合物以使dTAG(和因此内源性蛋白质-dTAG杂合蛋白)接近泛素连接酶的方式结合a)***的dTAG和b)泛素连接酶，使得内源性蛋白质-dTAG杂合蛋白被泛素化，然后被蛋白酶体降解。

如本文所考虑的，编码感兴趣的内源性蛋白质-dTAG杂合体的合成基因通过将编码dTAG的核酸以5'或3'靶向框内***编码感兴趣的蛋白质的核酸而在体内衍生。这导致框内基因融合，其在用能够结合dTAG的异双功能性化合物处理时对蛋白酶体介导的降解敏感。在一个主要具体例中，dTAG基本上不干扰内源性表达的蛋白质的功能。在一个具体例中，dTAG是非内源肽，其允许异双功能性化合物的选择性并且在给药异双功能性化合物时使靶外效应最小化。在一个具体例中，dTAG是衍生自内源性蛋白质的氨基酸序列，其已例如通过“凸块(bump)”策略修饰(参见，例如，参见Clackson et al., “Redesigning anFKBP–ligand interface to generate chemical dimerizers with novelspecificity”,PNAS 95(1998):10437–10442，其通过引用方式并入本文)，以使异双功能性化合物仅与dTAG的经修饰氨基酸序列结合或优先结合，而不与相应的内源性表达蛋白结合。

本文还考虑了通过将编码dTAG的核酸序列以5'或3'靶向框内插入编码感兴趣的蛋白质的基因组序列来体外等位基因特异性调节内源性蛋白质的方法，其中，编码dTAG的核酸***基因组序列中，在表达时产生内源性蛋白质-dTAG杂合体或融合蛋白，其中内源性蛋白质-dTAG能够被异双功能性化合物降解，该异双功能性化合物以使dTAG(和因此内源性蛋白质-dTAG杂合蛋白)接近泛素连接酶的方式结合a)***的dTAG和b)泛素连接酶，使得内源性蛋白质-dTAG 杂合蛋白泛素化，然后被蛋白酶体降解。通过使用本文所述的方法将编码dTAG的核酸框内***编码感兴趣的内源性蛋白质的基因，所得蛋白质的表达可以通过引入能够结合dTAG的异双功能性化合物来严格控制，从而得到内源性蛋白质的降解。重要的是，通过使用异双功能性化合物，可以可逆地控制内源性蛋白质的表达，从而允许检查蛋白质表达对细胞的影响。

因此，通过以这种方式调节内源性蛋白质的表达，可以在多种蛋白质和细胞类型以及各种生理条件下检测调节蛋白质表达的下游效应。因为可以滴定细胞内的异双功能性化合物浓度，可以精细调节细胞内的蛋白质-dTAG杂合蛋白浓度，允许细胞内蛋白质丰度的条件改变和根据需要改变细胞内表型的能力。在一个具体例中，本文提供评估细胞中蛋白质表达衰减的方法，包括将编码dTAG的核酸序列*** 到编码感兴趣的蛋白质的基因组序列的5'或3'框架中，其中将编码 dTAG的核酸***到基因组序列中造成在表达时产生内源性蛋白质- dTAG杂合体或融合蛋白，其中内源性蛋白质-dTAG能够被异双功能性化合物降解，该异双功能性化合物以使dTAG(和因此内源性蛋白质-dTAG杂合蛋白)接近泛素连接酶的方式结合a)***的dTAG和 b)泛素连接酶，使得内源性蛋白质-dTAG杂合蛋白泛素化，然后被蛋白酶体降解。在一个具体例中，向细胞给药异双功能性化合物，使得细胞中蛋白质-dTAG杂合蛋白的浓度部分地降解。在一个具体例中，向细胞给药异双功能性化合物，使得细胞中内源性蛋白质-dTAG 杂合蛋白的浓度完全地降解。

在一个具体例中，本文提供了鉴定与疾病或病症相关的蛋白质靶标的方法，包括将编码dTAG的核酸序列***编码感兴趣的蛋白质的基因组序列的5'或3'框架中，其中将编码dTAG的核酸***基因组序列中，在表达时产生内源性蛋白质-dTAG杂合体或融合蛋白，其中内源性蛋白质-dTAG能够被异双功能性化合物降解，该异双功能性化合物以使dTAG(以及因此内源性蛋白质-dTAG杂合蛋白)接近泛素连接酶的方式结合a)***的dTAG和b)泛素连接酶，使得内源性蛋白质-dTAG杂合蛋白被泛素化，然后被蛋白酶体降解，接着测量蛋白质降解对细胞病症或疾病状态的影响。通过使用本文所述的方法将编码dTAG的核酸框内***编码感兴趣的内源性蛋白质的基因，可以检查各种蛋白质的下调，并且可以鉴定用于治疗与特定疾病状态相关的病症的潜在靶标。此外，目前的方法可用于验证与疾病状态相关的潜在蛋白质。

在一个特别具体例中，用于本发明的dTAG包括衍生自内源性蛋白质激酶的氨基酸序列。在一个具体例中，内源性蛋白质激酶氨基酸序列包括使激酶失活的突变。在一个具体例中，蛋白激酶中的突变发生在保守的激酶催化性三联体氨基酸序列内。在一个具体例中，保守的激酶催化性三联体氨基酸序列是TVS。在一个具体例中，保守的激酶催化性三联体氨基酸序列是HRD。在一个具体例中，保守的激酶催化性三联体氨基酸序列是DFG。在一个具体例中，保守的激酶催化性三联体氨基酸序列是TRD。参见Kornev et al.,“Surface comparison of active and inactive protein kinases identifies aconserved activation mechanism,”PNAS 2006；103(47):17783–17788，其通过引用方式并入本文。在一个具体例中，至少一种催化性三联体氨基酸取代丙氨酸。在一个具体例中，至少一种催化性三联体氨基酸取代甘氨酸。在一个具体例中，异双功能性化合物含有能够选择性结合突变蛋白激酶序列的等位基因特异性配体。在一个具体例中，突变激酶是如Roskoski et al.,“Classification of small molecule protein kinase inhibitorsbased upon the structures of their drug-enzyme complexes,”PharmacologicalResearch http://dx.doi.org/10.1016/j.phrs.2015.10.021所述，其通过引用方式并入本文和/或Roskoski et al.,“A historical overview of protein kinases and theirtargeted small molecule inhibitors,”Pharmaceutical Research(2015),http://dx.doi.org/10.1016/j.phrs.2015.07.10，其通过引用方式并入本文。在一个具体例中，dTAG衍生自作为类似物敏感性激酶的激酶。在一个具体例中，突变激酶是如Zhang etal., “Structure-guided inhibitor design expands the scope of analog-sensitive kinase technology,”ACS Chem Biol.2013:8(9)；1931-1938 所述，其通过引用方式并入本文。在替代具体例中，用于本发明的 dTAG包括但不限于衍生自选自EGFR、BCR-ABL、ALK、JAK2、 BRAF、LRRK2、PDGFRα和RET的蛋白质的氨基酸序列。在一个具体例中，蛋白质含有一个或多个突变。在一个具体例中，一种或多种突变使蛋白质失活。

在替代的具体例中，用于本发明的dTAG包括但不限于衍生自选自Src、Src、Pkd1、Kit、Jak2、Abl、Mek1、HIV整合酶和HIV 逆转录酶的蛋白质的氨基酸序列。

在特别的具体例中，用于本发明的dTAG包括但不限于衍生自内源性表达的蛋白质的氨基酸序列，该自内源性表达的蛋白质是例如 FK506结合蛋白-12(FKBP12)、含溴结构域的蛋白质4(BRD4)、 CREB结合蛋白质(CREBBP)、或转录激活因子BRG1(SMARCA4)。在其他具体例中，用于本发明的dTAG可包括，例如，激素受体，例如***受体蛋白、雄激素受体蛋白、类视黄醇x受体(RXR)蛋白或二氢叶酸还原酶(DHFR)，包括细菌DHFR。在其他具体例中， dTAG可包括，例如，衍生自细菌脱卤素酶的氨基酸序列。在其他具体例中，dTAG可包括衍生自7,8-二氢-8-氧鸟嘌呤三磷酸酶、AFAD、花生四烯酸5-脂氧合酶活化蛋白、载脂蛋白、ASH1L、ATAD2、含杆状病毒IAP重复序列的蛋白2、BAZ1A、BAZ1B、BAZ2A、 BAZ2B、Bcl-2、Bcl-xL、BRD1、BRD2、BRD3、BRD4、BRD5、 BRD6、BRD7、BRD8、BRD9、BRD10、BRDT、BRPF1、BRPF3、BRWD3、CD209、CECR2、CREBBP、E3连接酶XIAP、EP300、 FALZ、来自脂肪细胞的脂肪酸结合蛋白4(FABP4)、GCN5L2、GTP 酶k-RAS、HDAC6、造血***素D合成酶、KIAA1240、乳谷胱甘肽裂解酶、LOC93349、Mcl-1、MLL、PA2GA、PB1、PCAF、肽基-脯氨酰顺反异构酶NIMA相互作用1、PHIP、聚ADP-核糖聚合酶14、聚ADP-核糖聚合酶15、PRKCBP1、***素、***素 E合酶、视网膜视杆细胞敏感cGMP 3','5-环磷酸二酯酶亚基δ、 S100-A7、SMARCA2、SMARCA4、SP100、SP110、SP140、Src、 Sumo-结合酶UBC9、超氧化物歧化酶、TAF1、TAF1 L、端锚聚合酶1、端锚聚合酶2、TIF1a、TRIM28、TRIM33、TRIM66、WDR9、 ZMYND11或MLL4的氨基酸序列。在更进一步的具体例中，dTAG 可包括，例如，衍生自MDM2的氨基酸序列。

在一个特别具体例中，dTAG衍生自BRD2、BRD3、BRD4或 BRDT。在某些具体例中，dTAG是修饰的或突变的BRD2、BRD3、 BRD4或BRDT蛋白。在某些具体例中，BRD2的一个或多个突变包括氨基酸位置97处的色氨酸(W)的突变，氨基酸位置103处的缬氨酸(V)的突变，氨基酸位置110处的亮氨酸(L)的突变，氨基酸位置 370处的W的突变，氨基酸位置376处的V的突变，或氨基酸位置 381处的L的突变。

在某些具体例中，BRD3的一个或多个突变包括在氨基酸位置 57处的W的突变，在氨基酸位置63处的V的突变，在氨基酸位置 70处的L的突变，在氨基酸位置332处的W的突变，氨基酸位置 338处的V的突变，或氨基酸位置345处的L的突变。在某些具体例中，BRD4的一个或多个突变包括氨基酸位置81处的W的突变，氨基酸位置87处的V的突变，氨基酸位置94处的L的突变，氨基酸位置374处的W的突变，氨基酸位置380处的V的突变或氨基酸位置387处的L的突变。在某些具体例中，BRDT的一个或多个突变包括在氨基酸位置50处的W的突变，在氨基酸位置56处的V的突变，在氨基酸位置63处的L的突变，氨基酸位置293处W的突变，氨基酸位置299处V的突变，或氨基酸位置306处的L突变。

在特别的具体例中，dTAG衍生自胞质信号传导蛋白FKBP12。在某些具体例中，dTAG是修饰的或突变的胞质信号传导蛋白 FKBP12。在某些具体例中，修饰的或突变的胞质信号传导蛋白 FKBP12含有一个或多个突变，其产生FKBP12配体的扩增的结合口袋(pocket)。在某些具体例中，该一个或多个突变包括在氨基酸位置 36处的苯丙氨酸(F)突变为缬氨酸(V)(F36V)(在本文中可互换地称为 FKBP*或FKBP12*)。

在一个具体例中，dTAG衍生自SEQ.ID.NO.1至44的任一个的氨基酸序列或其片段。在特别具体例中，dTAG衍生自SEQ.ID.NO.: 1的氨基酸序列或其片段。在特别具体例中，dTAG衍生自SEQ.ID. NO.:2的氨基酸序列或其片段。在特别具体例中，dTAG衍生自SEQ.ID.NO.:3的氨基酸序列或其片段。在特别具体例中，dTAG衍生自SEQ.ID.NO.:4的氨基酸序列或其片段。在特别具体例中，dTAG衍生自SEQ.ID.NO.:5的氨基酸序列或其片段。在特别具体例中，dTAG衍生自SEQ.ID.NO.:6的氨基酸序列或其片段。在特别具体例中，dTAG衍生自SEQ.ID.NO.:7的氨基酸序列或其片段。在特别具体例中，dTAG衍生自SEQ.ID.NO.:8的氨基酸序列或其片段。在特别具体例中，dTAG衍生自SEQ.ID.NO.:9的氨基酸序列或其片段。在一个特别具体例中，其片段是指异双功能性化合物需要结合的最小氨基酸序列。在特别具体例中，dTAG衍生自SEQ. ID.NO.:10的氨基酸序列或其片段。在特别具体例中，dTAG衍生自 SEQ.ID.NO.:11的氨基酸序列或其片段。在特别具体例中，dTAG 衍生自SEQ.ID.NO.:12的氨基酸序列或其片段。在特别具体例中， dTAG衍生自SEQ.ID.NO.:13的氨基酸序列或其片段。在特别具体例中，dTAG衍生自SEQ.ID.NO.:14的氨基酸序列或其片段。在特别具体例中，dTAG衍生自SEQ.ID.NO.:15的氨基酸序列或其片段。在特别具体例中，dTAG衍生自SEQ.ID.NO.:16的氨基酸序列或其片段。在特别具体例中，dTAG衍生自SEQ.ID.NO.:17的氨基酸序列或其片段。在特别具体例中，dTAG衍生自SEQ.ID.NO.:18的氨基酸序列或其片段。在特别具体例中，dTAG衍生自SEQ.ID. NO.:19的氨基酸序列或其片段。在特别具体例中，dTAG衍生自 SEQ.ID.NO.:20的氨基酸序列或其片段。在特别具体例中，dTAG 衍生自SEQ.ID.NO.:21的氨基酸序列或其片段。在特别具体例中， dTAG衍生自SEQ.ID.NO.:22的氨基酸序列或其片段。在特别具体例中，dTAG衍生自SEQ.ID.NO.:23的氨基酸序列或其片段。在特别具体例中，dTAG衍生自SEQ.ID.NO.:24的氨基酸序列或其片段。在特别具体例中，dTAG衍生自SEQ.ID.NO.:25的氨基酸序列或其片段。在特别具体例中，dTAG衍生自SEQ.ID.NO.:26的氨基酸序列或其片段。在特别具体例中，dTAG衍生自SEQ.ID.NO.27的氨基酸序列或其片段。在特别具体例中，dTAG衍生自SEQ.ID.NO.28的氨基酸序列或其片段。在特别具体例中，dTAG衍生自SEQ.ID. NO.:29的氨基酸序列或其片段。在特别具体例中，dTAG衍生自 SEQ.ID.NO.:30的氨基酸序列或其片段。在特别具体例中，dTAG 衍生自SEQ.ID.NO.:31的氨基酸序列或其片段。在特别具体例中，dTAG衍生自SEQ.ID.NO.:32的氨基酸序列或其片段。在特别具体例中，dTAG衍生自SEQ.ID.NO.:33的氨基酸序列或其片段。在特别具体例中，dTAG衍生自SEQ.ID.NO.:34的氨基酸序列或其片段。在特别具体例中，dTAG衍生自SEQ.ID.NO.:35的氨基酸序列或其片段。在特别具体例中，dTAG衍生自SEQ.ID.NO.:36的氨基酸序列或其片段。在特别具体例中，dTAG衍生自SEQ.ID.NO.:37的氨基酸序列或其片段。在特别具体例中，dTAG衍生自SEQ.ID. NO.:38的氨基酸序列或其片段。在特别具体例中，dTAG衍生自 SEQ.ID.NO.:39的氨基酸序列或其片段。在特别具体例中，dTAG 衍生自SEQ.ID.NO.:40的氨基酸序列或其片段。在特别具体例中， dTAG衍生自SEQ.ID.NO.:41的氨基酸序列或其片段。在特别具体例中，dTAG衍生自SEQ.ID.NO.:42的氨基酸序列或其片段。在特别具体例中，dTAG衍生自SEQ.ID.NO.:43的氨基酸序列或其片段。在特别具体例中，dTAG衍生自SEQ.ID.NO.:44的氨基酸序列或其片段。在特别具体例中，其片段是指需要结合异双功能性化合物的最小胺基酸序列。在特别具体例中，dTAG衍生自SEQ.ID.NO.:62的氨基酸序列或其片段。在特别具体例中，dTAG衍生自SEQ.ID. NO.:63的氨基酸序列或其片段。在特别具体例中，其片段是指需要结合异双功能性化合物的最小胺基酸序列。

在一个特定具体例中，dTAG衍生自SEQ.ID.NO.:1的氨基酸序列或其片段，和dTAG能够被选自dFKBP-1至dFKBP-5中任一种的异双功能性化合物结合。dTAG衍生自SEQ.ID.NO.:2的氨基酸序列或其片段，和dTAG能够被选自dFKBP-6至dFKBP-10中任一种的异双功能性化合物结合。dTAG衍生自SEQ.ID.NO.:3的氨基酸序列或其片段，和dTAG能够被选自dBET-1至dBET-18中任一种的异双功能性化合物结合。dTAG衍生自SEQ.ID.NO.:3的氨基酸序列或其片段，和dTAG能够被选自dBromo-1至dBromo-34中任一种的异双功能性化合物结合。dTAG衍生自SEQ.ID.NO.:9的氨基酸序列或其片段，和dTAG能够被选自dHalo-1至dHalo-2中任一种的异双功能性化合物结合。

在一个具体例中，dTAG衍生自本文所述的任何氨基酸序列或其片段，并且dTAG能够被包含能够结合本文所述dTAG的dTAG靶向配体的相应异双功能性化合物结合。在一个具体例中，dTAG是能够被图29，图30，图31，图32和图33中描述的异双功能性化合物结合的氨基酸序列，或本文所述的任何其他异双功能性化合物。在一个具体例中，dTAG是能够被包含表T中描述的dTAG靶向配体的异双功能性化合物结合的氨基酸序列。在一个特别具体例中，dTAG衍生自SEQ.ID.NO.:1的氨基酸序列或其片段，和dTAG能够被选自 dFKBP-1至dFKBP-5中的任一种的异双功能性化合物结合。在一个特别具体例中，dTAG衍生自SEQ.ID.NO.:1的氨基酸序列或其片段，和dTAG能够被选自dFKBP-6至dFKBP-13中的任一种的异双功能性化合物结合。在一个特别具体例中，dTAG衍生自SEQ.ID.NO.:3 的氨基酸序列或其片段，和dTAG能够被选自任何dBET1至 dBET18的异双功能性化合物结合。在一个特别具体例中，dTAG衍生自SEQ.ID.NO.:3的氨基酸序列或其片段，和dTAG能够被选自dBromo1至dBromo34中的任何一种的异双功能性化合物结合。在一个特别具体例中，dTAG衍生自SEQ.ID.NO.:9的氨基酸序列或其片段，和dTAG能够被选自dHalo1至dHalo2中的任何一种的异双功能性化合物结合。在一个特别具体例中，dTAG衍生自 CREBBP，和异双功能性化合物含有选自表T的CREBBP dTAG靶向配体。在一个特别具体例中，dTAG衍生自SMARCA4、PB1或 SMARCA2，和异双功能性化合物含有选自表T的 SMARCA4/PB1/SMARCA2dTAG靶向配体。在特别具体例中， dTAG衍生自TRIM24或BRPF1，和异双功能性化合物含有选自表 T的TRIM24/BRPF1 dTAG靶向配体。在一个特别具体例中，dTAG 衍生自糖皮质激素受体，和异双功能性化合物含有选自表T的糖皮质激素dTAG靶向配体。在特别具体例中，dTAG来自***或雄激素受体，和异双功能性化合物含有***/雄激素受体dTAG靶向配体选自表T。在一个特别具体例中，dTAG衍生自DOT1L，和异双功能性化合物含有选自表T的DOT1L dTAG靶向配体。在一个特定具体例中，dTAG衍生自Ras，和异双功能性化合物含有选自表T的Ras dTAG靶向配体。在一个特别具体例中，dTAG衍生自RasG12C，和异双功能性化合物含有选自表T的RasG12C dTAG靶向配体。在特别具体例中，dTAG衍生自HER3，和异双功能性化合物含有选自表T的HER3 dTAG靶向配体。在一个特别具体例中，dTAG衍生自 Bcl-2或Bcl-XL，和异双功能性化合物含有选自表T的Bcl-2/Bcl- XL dTAG靶向配体。在一个特别具体例中，dTAG衍生自HDAC，和异双功能性化合物含有选自表T的HDAC dTAG靶向配体。在特别具体例中，dTAG衍生自PPAR，和异双功能性化合物含有选自表 T的PPAR dTAG靶向配体。在一个特别具体例中，dTAG衍生自 DHFR，和异双功能性化合物含有选自表T的DHFRdTAG靶向配体。

在一个方面，本发明的合成基因包括与遗传疾病有关的感兴趣的基因。作为非限制性实例，突变基因(例如，编码α-1抗胰蛋白酶 (A1AT))可以在细胞中为dTAG靶向而框内***以产生合成基因，其编码能够由靶向内源性A1AT-dTAG杂合蛋白的dTAG的异双功能性化合物降解的杂合蛋白。通过产生A1AT-dTAG杂合体，突变的 A1AT的功能可以通过给药异双功能性化合物来调节或调整，允许细胞维持A1AT内源性蛋白质的一些功能，同时减少A1AT过表达的影响。可靶向的蛋白质的其他非限制性实例包括β-连环蛋白 (CTNNB1)，载脂蛋白B(APOB)，血管生成素样蛋白3(ANGPTL3)，前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型(PCSK9)，载脂蛋白 C3(APOC3)，低密度脂蛋白受体(LDLR)，C-反应蛋白(CRP)，载脂蛋白a(Apo(a))，因子VII，因子XI，抗凝血酶III(SERPINC1)，磷脂酰肌醇聚糖A类(PIG-A)，C5，α-1抗胰蛋白酶(SERPINA1)，铁调素调节(TMPRSS6)，(δ-氨基乙酰丙酸合成酶1(ALAS-1)，酰基 CaA：二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)，miR-122，miR-21，miR- 155，miR-34a，前激肽释放酶(KLKB1)，***生长因子(CCN2)，细胞间粘附分子1(ICAM-1)，胰高血糖素受体(GCGR)，糖皮质激素受体(GCCR)，蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP-1B)，c-Raf激酶(RAF1)，成纤维细胞生长因子受体4(FGFR4)，血管粘附分子-1(VCAM-1)，极晚期抗原-4(VLA-4)，运甲状腺素蛋白(TTR)，存活运动神经元2 (SMN2)，生长激素受体(GHR)，肌张力障碍肌强直蛋白激酶(DMPK)，细胞核酸结合蛋白(CNBP或ZNF9)，凝聚素(CLU)，真核转译起始因子4E(eIF-4e)，MDM2，MDM4，热休克蛋白27(HSP 27)，信号转导和转录激活因子3蛋白(STAT3)，血管内皮生长因子 (VEGF)，驱动蛋白纺锤体蛋白(KIF11)，乙型肝炎基因组，雄激素受体(AR)，Atonal同源物1(ATOH1)，血管内皮生长因子受体1(FLT1)，视网膜中毒1(RS1)，视网膜色素上皮特异性65kDa蛋白(RPE65)， Rab护送蛋白1(CHM)和钠通道，电压门控，类型X，α亚基(PN3或SCN10A)。遗传性疾病包括但不限于纯合子家族性高胆固醇血症， AGS1至AGS7，PRAAS/CANDLE，SAVI，ISG15 def，SPENCDI，噬血细胞性淋巴组织细胞增生症，NLRC4-MAS，CAMPS，DADA2， PLAID，I型酪氨酸血症，BSEP缺乏症，MRD3基因缺陷，糖原贮积病IV，I，Crigler-Najjar综合征，鸟氨酸转氨甲酰酶缺乏症，原发性高草酸尿症，Wilson病，囊性纤维化，FIC1缺乏症，瓜氨酸血症，胱氨酸病，丙酸学术，ADA-SCID，X性联SCID，脂蛋白脂酶缺乏，Leber的先天性黑朦和肾上腺脑白质营养不良。

本文还考虑使用能够结合本发明的内源性蛋白质-dTAG杂合体的dTAG，并通过泛素化诱导降解的异双功能性化合物。通过向受试者给药针对dTAG的异双功能性化合物，可以在患有靶蛋白表达的疾病或病症的受试者中调节内源性蛋白质-dTAG杂合体。用于本发明的异双功能性化合物是小分子拮抗剂，其能够通过内源性蛋白质- dTAG杂合体的降解来抑制内源性蛋白质的生物学功能。它们经由化学缀合提供迅速的配体依赖性靶蛋白降解，例如，衍生化的邻苯二甲酰亚胺，其劫持小脑蛋白E3泛素连接酶复合物的功能。使用该方法，本发明的内源性蛋白质-dTAG杂合体可以以高特异性和高效率快速降解。

可用于本发明的异双功能性化合物包括那些包含小分子E3连接酶配体的化合物，其通过不同长度和/或功能的连接子与dTAG靶向配体共价连接，如下文更详细描述的。异双功能性化合物能够结合 dTAG并募集E3连接酶，例如，通过与含有连接酶或VonHippel- Lindau肿瘤抑制因子(VHL)的小脑蛋白(CRBN)结合至内源dTAG杂合体以进行泛素化和随后的蛋白酶体降解。

此外，通过经由本申请的双功能性分子的蛋白质降解的化学策略与基因治疗的有效性相结合，可以通过打开和关闭泛素化，以及内源性蛋白质-dTAG杂交体的蛋白酶体降解而快速、精确、时间的方式调节内源性表达的蛋白质的活性，从而调节副作用。

可用于本发明的异双功能性化合物的实例在下面进一步举例说明。

在一个方面，基因组核酸序列编码合成基因，其包含，具有编码 dTAG的核酸的5'或3'框内***的感兴趣的内源性基因，当表达时，其产生内源性蛋白质-dTAG杂合蛋白，其中dTAG能够被异双功能性化合物结合。携带这种遗传修饰的细胞和动物，尤其是非人动物，是本发明的一部分。

在一个特别具体例中，基因组核酸序列编码合成基因，其包含具有编码dTAG的核酸的5'-或3'-框内***的感兴趣的内源性基因，其中dTAG衍生自SEQ.ID.NO.:1的氨基酸序列或其片段，和dTAG 能够被选自dFKBP-1至dFKBP-5中的任一种的异双功能性化合物结合。在一个特别具体例中，基因组核酸序列编码合成基因，其包含具有编码dTAG的核酸的5'-或3'-框内***的感兴趣的内源性基因，其中dTAG衍生自SEQ.ID.NO.:2的氨基酸序列或其片段，和dTAG 能够被选自dFKBP-6至dFKBP-13中的任一种的异双功能性化合物结合。在一个特别具体例中，基因组核酸序列编码合成基因，其包含具有编码dTAG的核酸的5'-或3'-框内***的感兴趣的内源性基因，其中dTAG衍生自SEQ.ID.NO.:3的氨基酸序列或其片段，和 dTAG能够被选自任何dBET1至dBET18的异双功能性化合物结合。在一个特别具体例中，基因组核酸序列编码合成基因，其包含具有编码dTAG的核酸的5'-或3'-框内***内源性目的基因，其中dTAG衍生自SEQ.ID.NO.:3的氨基酸序列或其片段，和dTAG能够被选自dBromo1至dBromo34中的任何一种的异双功能性化合物结合。在一个特别具体例中，基因组核酸序列编码合成基因，其包含具有编码 dTAG的核酸的5'-或3'-框内***的感兴趣的内源性基因，其中 dTAG衍生自SEQ ID NO.:9的氨基酸序列或其片段，和dTAG能够被选自dHalo1和dHalo2的异双功能性化合物结合。

在一个方面，提供了由合成基因编码的氨基酸，该合成基因包含具有编码dTAG的核酸的5'-或3'-框内***的感兴趣的内源性基因，其中该氨基酸是内源性蛋白-dTAG杂合蛋白，其中dTAG能够被异双功能性化合物结合。

在一个方面，本文提供了转化细胞，其包含编码合成基因的基因组核酸序列，该合成基因包含具有编码dTAG的核酸的5'或3'框内 ***的感兴趣的内源性基因，当表达时，其产生内源性蛋白质-dTAG 杂合蛋白，其中dTAG能够被异双功能性化合物结合。

在一个方面，本文提供了表达合成基因的细胞，该合成基因包含具有编码dTAG的核酸的5'-或3'-框内***的感兴趣的内源性基因，当表达时，其产生内源性蛋白质-dTAG杂合蛋白，其中dTAG能够被异双功能性化合物结合。

在一个具体方面，提供了通过基因组***编码dTAG的核酸序列来调节内源性蛋白质活性的方法，该核酸序列在表达时产生内源性蛋白质-dTAG杂合蛋白质，其中dTAG能够是通过异双功能性化合物结合，并向受试者给药能够结合dTAG并降解内源性蛋白质-dTAG杂合体的异双功能性化合物。

在一个特定方面，提供了鉴定与疾病状态相关的内源性蛋白质的方法，其中通过基因组***编码dTAG的核酸序列来调节内源性蛋白质的活性，该核酸序列在表达时产生内源性蛋白质-dTAG杂合蛋白，其中dTAG能够被异双功能性化合物结合，并给药能够结合dTAG并降解内源性蛋白质-dTAG杂合体的异双功能性化合物，其中蛋白质的降解导致疾病状态的改变。

在一个具体例中，本文提供了包含编码SEQ.ID.NO.:52的核酸和编码dTAG的核酸的转化细胞。在一个具体例中，本文提供了包含编码SEQ.ID.NO.:52的核酸和编码衍生自选自SEQ.ID.NO.:1 至44的氨基酸序列或其片段的dTAG的核酸的转化细胞。

在一个具体例中，本文提供了编码SEQ.ID.NO.:52的第一核酸ID和编码dTAG的第二核酸。在一个具体例中，本文提供了编码 SEQ.ID.NO.:52的第一核酸和编码衍生自选自SEQ.ID.NO.:1至 44的氨基酸序列或其片段的dTAG的第二核酸。

本发明的其他方面包括编码本发明的合成基因的多核苷酸序列、质粒和载体，以及表达本发明的合成基因的宿主细胞。

在另一个具体例中，用于本发明的dTAG是衍生自EGFR的氨基酸序列。在某些具体例中，dTAG是修饰的或突变的EGFR蛋白或其片段。在某些具体例中，EGFR的一个或多个突变包括在氨基酸位置858处用亮氨酸(L)取代亮氨酸(L)，在外显子19中删除氨基酸序列LREA，在外显子19中***氨基酸VAIKEL，在氨基酸位置719 处用丙氨酸(A)，半胱氨酸(C)或丝氨酸(S)取代甘氨酸(G)，在氨基酸位置861处用丙氨酸(A)，半胱氨酸(C)、丝氨酸(S)取代亮氨酸(L)，在氨基酸位置765处用丙氨酸(A)取代缬氨酸(V)，在氨基酸位置783 处用丙氨酸(A)取代苏氨酸(T)，在氨基酸位置784处用脯氨酸(P)取代丝氨酸(S)，在氨基酸位置790M处用甲硫氨酸(M)取代苏氨酸(T)，在氨基酸位置854处用丙氨酸(A)取代苏氨酸(T)，在氨基酸位置761 处用酪氨酸(Y)取代天冬氨酸(D)，在氨基酸位置747处用丝氨酸(S) 取代亮氨酸(L)，在氨基酸位置797处用丝氨酸(S)或甘氨酸(G)取代半胱氨酸(C)。在一个具体例中，dTAG是衍生自SEQ.ID.NO.:53 的氨基酸序列或其片段。在一个具体例中，dTAG是衍生自SEQ.ID. NO.:54的氨基酸序列或其片段。在一个具体例中，SEQ.ID.NO.:54 在位置163处具有亮氨酸。在一个具体例中，dTAG是衍生自SEQ. ID.NO.:55的氨基酸序列或其片段。在一个具体例中，SEQ.ID. NO.:55在位置163处具有亮氨酸。在一个具体例中，SEQ ID NO.:55在位置95处具有苏氨酸。在一个具体例中，SEQ.ID. NO.:55在位置163处具有亮氨酸。在一个具体例中，SEQ.ID. NO.:55在位置95处具有苏氨酸。在一个具体例中，dTAG是衍生自SEQ.ID.NO.:56的氨基酸序列或其片段。在一个具体例中，SEQ. ID.NO.:56在位置163处具有亮氨酸。在一个具体例中，SEQ.ID. NO.:56在位置95处具有苏氨酸。在一个具体例中，SEQ.ID. NO.:56在位置163处具有亮氨酸和在位置95处具有苏氨酸。

在另一个具体例中，用于本发明的dTAG是衍生自BCR-ABL的氨基酸序列。在某些具体例中，dTAG是修饰的或突变的BCR-ABL 蛋白或其片段。在某些具体例中，BCR-ABL的一个或多个突变包括在氨基酸位置315处用异亮氨酸(I)取代酪氨酸(T)。在一个具体例中，dTAG是衍生自SEQ.ID.NO.:57的氨基酸序列或其片段。在一个具体例中，dTAG是衍生自SEQ.ID.NO.:58的氨基酸序列或其片段。

在另一个具体例中，用于本发明的dTAG是衍生自ALK的氨基酸序列。在某些具体例中，dTAG是修饰的或突变的ALK蛋白或其片段。在某些具体例中，ALK的一个或多个突变包括在氨基酸位置 1196处用甲硫氨酸取代亮氨酸(L)。在一个具体例中，dTAG是衍生自SEQ.ID.NO.:59的氨基酸序列或其片段。

在另一个具体例中，用于本发明的dTAG是衍生自JAK2的氨基酸序列。在某些具体例中，dTAG是修饰的或突变的JAK2蛋白或其片段。在某些具体例中，JAK2的一个或多个突变包括在氨基酸位置 617处用缬氨酸(F)取代缬氨酸(V)。在一个具体例中，dTAG是衍生自SEQ.ID.NO.:60的氨基酸序列或其片段。

在另一个具体例中，用于本发明的dTAG是衍生自BRAF的氨基酸序列。在某些具体例中，dTAG是修饰的或突变的BRAF蛋白或其片段。在某些具体例中，BRAF的一个或多个突变包括在氨基酸位置600处用谷氨酸(E)取代缬氨酸(V)。在一个具体例中，dTAG是衍生自SEQ.ID.NO.:61的氨基酸序列或其片段。

在替代具体例中，用于本发明的dTAG包括但不限于衍生自选自EGFR、BCR-ABL、ALK、JAK2和BRAF的蛋白质的氨基酸序列。在一个具体例中，蛋白质含有一个或多个突变。在一个具体例中，一种或多种突变使蛋白质失活。

在另一个具体例中，用于本发明的dTAG是衍生自Src的氨基酸序列。在某些具体例中，dTAG是修饰的或突变的Src蛋白或其片段。在某些具体例中，Src的一个或多个突变或修饰包括在氨基酸位置 341处用甘氨酸(G)或丙氨酸(A)取代苏氨酸(T)。在一个具体例中， dTAG是衍生自SEQ.ID.NO.:62的氨基酸序列或其片段。在一个具体例中，dTAG是衍生自SEQ.ID.NO.:63的氨基酸序列或其片段。

在另一个具体例中，用于本发明的dTAG是衍生自LKKR2的氨基酸序列。在某些具体例中，dTAG是修饰的或突变的LKKR2蛋白或其片段。在某些具体例中，LKKR2的一个或多个突变包括在氨基酸1441处用半胱氨酸(C)取代精氨酸(R)，在氨基酸2019处取代甘氨酸(G)和丝氨酸(S)，在氨基酸2020处用苏氨酸(T)取代异亮氨酸(I)。

在另一个具体例中，用于本发明的dTAG是衍生自PDGFRα的氨基酸序列。在某些具体例中，dTAG是修饰的或突变的PDGFRα 蛋白或其片段。在某些具体例中，PDGFRα的一个或多个突变包括在氨基酸674处用异亮氨酸(I)取代苏氨酸(T)。

在另一个具体例中，用于本发明的dTAG是衍生自RET的氨基酸序列。在某些具体例中，dTAG是修饰的或突变的RET蛋白或其片段。在某些具体例中，RET的一个或多个突变包括在氨基酸691 处用丝氨酸(S)取代甘氨酸(G)。在某些具体例中，RET的一个或多个突变包括在氨基酸749处用苏氨酸(T)取代精氨酸(R)。在某些具体例中，RET的一个或多个突变包括在氨基酸762处用谷氨酰胺(Q)取代谷氨酰胺(Q)。在某些具体例中，RET的一个或多个突变包括在氨基酸791处用苯丙氨酸(F)取代酪氨酸(Y)。在某些具体例中，RET的一个或多个突变包括在氨基酸804处用缬氨酸(M)取代缬氨酸(V)。在某些具体例中，RET的一个或多个突变包括在氨基酸918处用苏氨酸(T)取代甲硫氨酸(M)。

在替代具体例中，用于本发明的dTAG包括但不限于衍生自选自Kit，Jak3，Abl，Mek1，HIV逆转录酶和HIV整合酶的蛋白质的氨基酸序列。

在另一个具体例中，用于本发明的dTAG是衍生自LKKR2的氨基酸序列。在某些具体例中，dTAG是修饰的或突变的LKKR2蛋白或其片段。在某些具体例中，LKKR2的一个或多个突变包括在氨基酸1441处用半胱氨酸(C)取代精氨酸(R)，在氨基酸2019处用丝氨酸(S)取代甘氨酸(G)，和在氨基酸2020处用苏氨酸(T)取代异亮氨酸(I)。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自LRRK2蛋白(UniProtKB- Q5S007(LRKK2_HUMAN)的氨基酸序列，其通过引用方式并入本文) 或其变体。在一个具体例中，dTAG衍生自Q5S007的氨基酸1328 至1511。在一个具体例中，dTAG衍生自Q5S007的氨基酸1328至 1511，其中氨基酸1441是半胱氨酸。在一个具体例中，dTAG衍生自Q5S007的氨基酸1328至1511，和异双功能性化合物中的dTAG 靶向配体选自表T-U1中的配体。在一个具体例中，dTAG衍生自Q5S007的氨基酸1328至1511(其中氨基酸1441是半胱氨酸)，和异双功能性化合物中的dTAG靶向配体选自表T-U1中的配体。在一个具体例中，dTAG衍生自Q5S007的氨基酸1879至2138。在一个具体例中，dTAG衍生自Q5S007的氨基酸1879至2138，其中氨基酸 2019是丝氨酸。在一个具体例中，dTAG衍生自Q5S007的氨基酸 1879至2138，其中氨基酸2020是苏氨酸。在一个具体例中，dTAG 衍生自Q5S007的氨基酸1879至2138，和异双功能性化合物中的dTAG靶向配体选自表T-U2或U3中的配体。在一个具体例中， dTAG衍生自Q5S007的氨基酸1879至2138，其中氨基酸2019是丝氨酸，和异双功能性化合物中的dTAG靶向配体选自表T-U2中的配体。在一个具体例中，dTAG衍生自Q5S007的氨基酸1879至 2138，其中氨基酸2020是苏氨酸，和异双功能性化合物中的dTAG 靶向配体选自表T-U3中的配体。

在另一个具体例中，用于本发明的dTAG是衍生自PDGFRα的氨基酸序列。在某些具体例中，dTAG是修饰的或突变的PDGFRα 蛋白或其片段。在某些具体例中，PDGFRα的一个或多个突变包括在氨基酸6741处用异亮氨酸(I)取代苏氨酸(T)。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自PDGFRα蛋白(UniProtKB- P09619(PDGFR_HUMAN)的氨基酸序列，其通过引用方式并入本文) 或其变体。在一个具体例中，dTAG衍生自P09619的氨基酸600至 692。在一个具体例中，dTAG衍生自P09619的氨基酸600至692，其中氨基酸660是丙氨酸。在一个具体例中，dTAG衍生自P09619 的氨基酸600至692，和异双功能性化合物中的dTAG靶向配体选自表T-V1中的配体。在一个具体例中，dTAG衍生自P09619的氨基酸600至692，其中氨基酸660是丙氨酸，异双功能性化合物中的 dTAG靶向配体选自表T-V1中的配体。

在另一个具体例中，用于本发明的dTAG是衍生自RET的氨基酸序列。在某些具体例中，dTAG是修饰的或突变的RET蛋白或其片段。在某些具体例中，RET的一个或多个突变包括在氨基酸691 处用丝氨酸(S)取代甘氨酸(G)。在某些具体例中，RET的一个或多个突变包括在氨基酸691处用苏氨酸(T)取代精氨酸(R)。在某些具体例中，RET的一个或多个突变包括氨基酸691处用谷氨酰胺(E)取代谷氨酰胺(Q)。在某些具体例中，RET的一个或多个突变包括在氨基酸 691处用苯丙氨酸(F)取代酪氨酸(Y)。在某些具体例中，RET的一个或多个突变包括在氨基酸691处用缬氨酸(M)取代缬氨酸(M)。在某些具体例中，RET的一个或多个突变包括在氨基酸691处用苏氨酸 (T)取代甲硫氨酸(M)。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自PDGFRα蛋白(UniProtKB- P07949(RET_HUMAN)的氨基酸序列，其通过引用方式并入本文)或其变体。在一个具体例中，dTAG衍生自P07949的氨基酸724至 1016。在一个具体例中，dTAG衍生自P07949的氨基酸724至1016，其中氨基酸940是异亮氨酸。在一个具体例中，dTAG衍生自 P07949的氨基酸724至1016，和异双功能性化合物中的dTAG靶向配体选自表T-W1中的配体。在一个具体例中，dTAG衍生自 P07949的氨基酸724至1016(其中氨基酸940是异亮氨酸)，和异双功能性化合物中的dTAG靶向配体选自表T-W1中的配体。在一个具体例中，dTAG衍生自P07949的氨基酸724至1016，和异双功能性化合物中的dTAG靶向配体选自表T-W2中的配体。在一个具体例中，dTAG衍生自P07949的氨基酸724至1016，和异双功能性化合物中的dTAG靶向配体选自表T-W3中的配体。在一个具体例中， dTAG衍生自P07949的氨基酸724至1016，和异双功能性化合物中的dTAG靶向配体选自表T-W4中的配体。在一个具体例中，dTAG 衍生自P07949的氨基酸724至1016，和异双功能性化合物中的 dTAG靶向配体选自表T-W5中的配体。在一个具体例中，dTAG衍生自P07949的氨基酸724至1016，和异双功能性化合物中的dTAG 靶向配体选自表T-W6中的配体。

在一个特别具体例中，dTAG衍生自SEQ.ID.NO.:53的氨基酸序列或其片段，和dTAG能够被包含选自表T-P1的EGFR dTAG靶向配体的异双功能性化合物结合。在特别具体例中，dTAG是衍生自 SEQ ID NO.:54的氨基酸序列或其片段，和dTAG能够被包含选自表T-P2的EGFR dTAG靶向配体的异双功能性化合物结合。在特别具体例中，dTAG是衍生自SEQID NO.:55的氨基酸序列或其片段，和dTAG能够被包含选自表T-P3的EGFR dTAG靶向配体的异双功能性化合物结合。在特别具体例中，dTAG是衍生自SEQ ID NO.: 56的氨基酸序列或其片段，和dTAG能够被包含选自表T-P的 EGFR dTAG靶向配体的异双功能性化合物结合。在特别具体例中， dTAG是衍生自SEQ ID NO.:57的氨基酸序列或其片段，和dTAG 能够被包含选自表T-Q1的BCR-ABL dTAG靶向配体的异双功能性化合物结合。在特别具体例中，dTAG是衍生自SEQ ID NO.:58的氨基酸序列或其片段，和dTAG能够被包含选自表T-Q1的BCR-ABL dTAG靶向配体的异双功能性化合物结合。在特别具体例中， dTAG是衍生自SEQ IDNO.:59的氨基酸序列或其片段，和dTAG 能够被包含选自表T-R1的ALK dTAG靶向配体的异双功能性化合物结合。在特别具体例中，dTAG是衍生自SEQ ID NO.:60的氨基酸序列或其片段，dTAG能够被包含选自表T-S1的JAK2 dTAG靶向配体的异双功能性化合物结合。在特别具体例中，dTAG是衍生自 SEQ ID NO.:61的氨基酸序列或其片段，和dTAG能够被包含选自表T-T1的BRAF dTAG靶向配体的异双功能性化合物结合。

在一个具体例中，dTAG是衍生自LRRK2氨基酸1328至 1511(UnitPro-Q5S007)，和异双功能性化合物中的dTAG靶向配体是选自表T-U1中的配体。在一个具体例中，dTAG是衍生自 LRRK2氨基酸1328至1511(UniProt-Q5S007)，其中氨基酸1441是半胱氨酸，和异双功能性化合物中的dTAG靶向配体是选自表T-U1 中的配体。在一个具体例中，dTAG是衍生自LRRK2氨基酸1879 至2138(UniProt-Q5S007)。在一个具体例中，dTAG是衍生自 LRRK2氨基酸1879至2138(UniProt-Q5S007)，其中氨基酸2019是丝氨酸。在一个具体例中，dTAG是衍生自氨基酸1879至 2138(UniProt-Q5S007)，其中氨基酸2020是苏氨酸。在一个具体例中，dTAG是衍生自LRRK2氨基酸1879至2138(UniProt-Q5S007)，异双功能性化合物中的dTAG靶向配体选自表T-U2或U3中的配体。在一个具体例中，dTAG是衍生自LRRK2氨基酸1879至2138(UniProt-Q5S007)，其中氨基酸2019是丝氨酸，和异双功能性化合物中的dTAG靶向配体选自表T-U2中的配体。在一个具体例中， dTAG是衍生自LRRK2氨基酸1879至2138(UniProt-Q5S007)，其中氨基酸2020是苏氨酸，和异双功能性化合物中的dTAG靶向配体选自表T-U3中的配体。在一个具体例中，dTAG是衍生自PDGFR 氨基酸600至692(UniProt-P09619)，和异双功能性化合物中的 dTAG靶向配体选自表T-V1中的配体。在一个具体例中，dTAG是衍生自PDGFR氨基酸600至692(UniProt-P09619)，其中氨基酸 674是异亮氨酸，和异双功能性化合物中的dTAG靶向配体选自表 T-V1中的配体。在一个具体例中，dTAG是衍生自RET氨基酸724 至1016(UniProtKB-P07949)，和异双功能性化合物中的dTAG靶向配体选自表T-W1-W6中的配体。在一个具体例中，dTAG是衍生自 RET氨基酸724至1016(UniProtKB-P07949)，其中氨基酸691是丝氨酸，和异双功能性化合物中的dTAG靶向配体选自表T-W1中的配体。在一个具体例中，dTAG是衍生自RET氨基酸724至 1016(UniProtKB-P07949)，其中氨基酸749是苏氨酸，和异双功能性化合物中的dTAG靶向配体选自表T-W2中的配体。在一个具体例中，dTAG是衍生自RET氨基酸724至1016(UniProtKB-P07949)，其中氨基酸762是谷氨酰胺，和异双功能性化合物中的dTAG靶向配体选自表T-W3中的配体。在一个具体例中，dTAG是衍生自RET 氨基酸724至1016(UniProtKB-P07949)，其中氨基酸791是苯丙氨酸，和异双功能性化合物中的dTAG靶向配体选自表T-W4中的配体。在一个具体例中，dTAG衍生自RET氨基酸724至 1016(UniProtKB-P07949)，其中氨基酸804是甲硫氨酸，和异双功能性化合物中的dTAG靶向配体选自表T-W5中的配体。在一个具体例中，dTAG衍生自RET氨基酸724至1016(UniProtKB-P07949)，其中氨基酸918是苏氨酸，异双功能性化合物中的dTAG靶向配体选自表T-W6中的配体。在一个具体例中，dTAG是衍生自JAK2，和异双功能性化合物中的dTAG靶向配体选自表T-JJJ1中的配体。在一个具体例中，dTAG是衍生自Abl，和异双功能性化合物中的 dTAG靶向配体选自表T-KKK1中的配体。在一个具体例中，dTAG 衍生自MEK1，和异双功能性化合物中的dTAG靶向配体选自表T- LLL1中的配体。在一个具体例中，dTAG是衍生自KIT，和异双功能性化合物中的dTAG靶向配体选自表T-MMM1中的配体。在一个具体例中，dTAG是衍生自HIV逆转录酶，和异双功能性化合物中的dTAG靶向配体选自表T-NNN1中的配体。在一个具体例中， dTAG是衍生自HIV整合酶，和异双功能性化合物中的dTAG靶向配体选自表T-OOO1中的配体。

在特别具体例中，dTAG是衍生自选自EGFR，ErbB2，ErbB4， VEGFR1，VEGFR2，VEGFR3，Kit，BCR-Abl，Src，Lyn，Hck， RET，c-Met，TrkB，Flt3，Axl，Tie2，ALK，IGF-1R，InsR，ROS1，MST1R，B-Raf，Lck，Yes，Fyn，HER2-乳腺癌，PNET， RCC，RA ML，SEGA，BTK，FGFR1/2/3/4，DDR1，PDGFRα， PDGFRβ，CDK4，CDK6，Fms，Itk，T315I，Eph2A，JAK1， JAK2，JAK3 CDK8，CSF-1R，FKBP12/mTOR，MEK1，MEK2， Brk，EphR，A-Raf，B-Raf，C-Raf的蛋白质和异双功能性化合物含有选自表Z的dTAG靶向配体。

能够结合上述氨基酸序列或其片段的异双功能性化合物可以使用表T中描述的dTAG靶向配体产生。在一个具体例中，编码衍生自上述氨基酸序列或其片段的dTAG的核酸序列基因组***编码感兴趣的内源性蛋白质的基因中，该基因在表达时产生内源性蛋白质- dTAG杂合蛋白，并通过向受试者给药包含表T中所述dTAG靶向配体的异双功能性化合物而降解。在一个具体例中，编码衍生自上述氨基酸序列或其片段的dTAG的核酸序列基因组***编码感兴趣的内源性蛋白质的基因中，该基因在表达时产生内源性蛋白质-dTAG杂合蛋白，并通过向受试者给药其相应的异双功能性化合物而降解，该异双功能性化合物能够结合dTAG，例如图29，图30，图31，图 32和图33中描述的异双功能性化合物，或本文所述的任何其他异双功能性化合物。

附图说明

图1是表示用于选择性降解dTAG融合蛋白的“凸块孔”方法的示意图。例如，dTAG融合体可以是FK506-和雷帕霉素结合蛋白FKBP12的一种形式，其经由氨基酸突变(F36V)形成“孔”的腔。然后该突变体FKBP12(“凸起的”FKBP，又名FKBP*或FKBP12 *(SEQ.ID.NO.:2))可被具有FKBP12结合结构域中的合成“凸块”的异双功能性化合物选择性靶向，即连接子，和小脑电蛋白结合结构域。该异双功能性化合物不靶向天然FKBP12，因此提供对天然存在于人类细胞中的标签的野生型变体的选择性。

图2是表示编码dTAG的核酸序列基因组整合入编码PCSK9的内源性基因的基因组基因座的的示意图。在同源重组后，产生的*** 产生表达产物，其包含与前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型 (PCSK9)蛋白质框内的N-端dTAG，从而提供前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型(PCSK9)-dTAG杂合体。能够被靶向dTAG序列的异双功能性化合物降解。

图3是表示编码dTAG的核酸序列基因组整合入编码β-连环蛋白(CTNNB1)的内源性基因的基因组基因座的的示意图。在同源重组后，产生的***产生包含与β-连环蛋白(CTNNB1)蛋白质框架的N- 端dTAG的表达产物，从而提供能够被靶向dTAG序列的异双功能性化合物降解的β-连环蛋白(CTNNB1)-dTAG杂合体。

图4是用本发明所述异双功能性化合物处理的细胞的免疫印迹。用指定浓度的dFKBP7处理表达HA标记的FKBP12WT或FKBP* 的293FT细胞(CRBN-WT或CRBN-/-)4小时。FKBP*而非 FKBPWT的CRBN依赖性降解证实了dFKBP7对突变体FKBP*的选择性活性。

图5A和图5B是测量一组dFKBP异双功能性化合物在表达与 Nluc融合的FKBP*的细胞中的活性的图。FKBP*的降解测量为用指定浓度的dFKBP处理4小时后，野生型(图7A)或CRBN-/-(图 7B)293FT细胞中来自相同的多顺反子转录物的的NANOluc和萤火虫荧光素酶之间的信号比(Nluc/Fluc)。信号比的降低表明FKBP *(Nluc)降解。

图6是用本发明所述异双功能性化合物处理的细胞的免疫印迹。将表达FKBP12WT或FKBP*的同基因293FT细胞(CRBN-WT或 CRBN-/-)用100nM dFKBP7或dFKBP13处理4小时。FKBP*而非FKBP12WT或内源FKBP12的CRBN依赖性降解证实了dFKBP7 和dFKBP13对突变体FKBP*的选择性。

图7是用本发明所述异双功能性化合物处理的细胞的免疫印迹。用指定剂量的dFKBP13处理表达HA标记的FKBP*的同基因 293FT细胞(CRBN-WT或CRBN-/-)4小时(实施例6)。这些数据证实了dFKBP13对HA标记的FKBP*的剂量和CRBN依赖性降解。

图8是用本发明所述异双功能性化合物处理的细胞的免疫印迹。将表达HA标记的FKBP*的293FT细胞(CRBN-WT)用100nM dFKBP13处理指定的时间。收获细胞，并对蛋白质裂解物进行免疫印迹以测量由dFKBP13诱导的HA标记的FKBP*降解的动力学。

图9是用本发明所述异双功能性化合物处理的细胞的免疫印迹。表达FKBP*的293FT细胞(CRBN-WT)用1uM卡非佐米 (Carfilzomib)(蛋白酶体抑制剂)，0.5uM MLN4924(接合作用 (neddylation)抑制剂)和10uM来那度胺(Lenalidomide)(CRBN结合配体)预处理2小时，然后用dFKBP13处理4小时(实施例8)。蛋白酶体抑制剂卡非佐米挽救了dFKBP13对HA标记的FKBP*的降解，建立了蛋白酶体功能的要求。用NAE1抑制剂MLN4924的预处理挽救了HA标记的FKBP*，建立了对CRL活性的依赖性，正如所预期基于cullin的泛素连接酶需要接合作用以用于进行性E3连接酶活性。用过量的来那度胺预处理消除了dFKBP13依赖性FKBP*降解，证实了CRBN参与降解的要求。

图10A和图10B是用本发明所述异双功能性化合物处理的细胞的免疫印迹。MV4的免疫印迹；11种表达蛋白质的白血病细胞与具有HA标签的突变体FKBP*融合。用指定浓度的FKBP*选择性异双功能性化合物，dFKBP7或dFKBP13处理细胞16小时，并通过西方免疫印迹分析测量融合蛋白的丰度。

图11是表达在N末端或C末端与FKBP*融合的KRASG12V等位基因的NIH3T3细胞的免疫印迹。用500nM dFKBP7处理细胞指定的时间。收获细胞并进行免疫印迹以测量FKBP*-KRASG12V和 KRAS信号传导的下游替代物(例如pMEK和pAKT)的降解。数据暗示，在施用dFKBP7时，N-端FKBP*融合体是活性的并且降解。

图12是表达FKBP*的NIH3T3细胞的免疫印迹，该FKBP*融合至用1uM所示dFKBP异双功能性化合物处理24小时的 KRASG12V的N-末端。收获细胞并进行免疫印迹以测量FKBP*- KRASG12V和KRAS信号传导的下游替代物(例如pMEK和pAKT) 的降解。数据暗示，dFKBP9、dFKBP12和dFKBP13诱导FKBP*- KRASG12V的有效降解和下游信号传导的抑制。

图13是表达与FKBP*的NIH3T3细胞的免疫印迹，该FKBP* 融合至用指定浓度的dFKBP13处理24小时的KRASG12V的N-端。收获细胞并进行免疫印迹以测量FKBP*-KRASG12V和KRAS信号传导的下游替代物(例如pMEK和pAKT)的降解。数据暗示， dFKBP13诱导FKBP*-KRASG12V的有效降解并且有效地抑制下游信号传导，IC 50>100nM。

图14是表达FKBP*的NIH3T3细胞的免疫印迹，该FKBP*融合至用1uM dFKBP13处理指定时间的KRASG12V的N-末端。收获细胞并进行免疫印迹以测量FKBP*-KRASG12V和KRAS信号传导的下游替代物(例如pMEK和pAKT)的降解。这些数据暗示 dFKBP13早在治疗后1小时就诱导FKBP*-KRASG12V的有效降解和下游信号传导的抑制。

图15是在用dFKBP13处理4小时之前用1uM卡非佐米(蛋白酶体抑制剂)，0.5uMMLN4924(接合作用(neddylation)抑制剂)和 10μM来那度胺(CRBN结合配体)预处理表达dTAG-KRASG12V的 NIH3T3细胞2小时的免疫印迹。

图16是表达KRAS等位基因的NIH3T3细胞的免疫印迹，该 KRAS等位基因是用1uMdFKBP13处理24小时的WT或突变形式的氨基酸甘氨酸12(G12C、G12D和G12V)。

图17是用1uM dFKBP13处理24小时的表达WT或突变KRAS 等位基因(G13D、Q61L和Q61R)的NIH3T3细胞的免疫印迹。

图18A、图18B、图18C和图18D是对照NIH3T3细胞或表达 FKBP*的NIH3T3的相差图像的图，该FKBP*与用DMSO或 dFKBP13处理24小时的KRASG12V的N-末端融合。相差图像突出了在FKBP*-KRASG12V的dFKBP13依赖性降解时诱导的形态变化。

图19A、图19B、图19C和图19D是增殖图，其测量dFKBP13 对表达FKBP*-KRASG12V的NIH3T3的NIH3T3对照细胞的生长的影响。如果dFKBP持续72小时，则用指定浓度处理细胞，并使用ATPlite测定法测量细胞计数。ATPlite 1step发光测定法基于由 ATP与添加的荧光素酶和D-荧光素的反应引起的光的产生来测量细胞中的细胞增殖和细胞毒性。信号的减少表明细胞数量减少。

图20是说明用dFKBP7和dFKBP13处理48小时的表达dTAG- KRASG12V的NIH3T3细胞以诱导靶向dTAG-KRASG12V降解的柱状图。固定的细胞用碘化丙锭染色，并进行细胞周期分析。

图21A、图21B、图21C、图21D、图21E、图21F、图21G、图21H和图21I提供了用于本发明的降解决定区域部分的实例，其中R是连接子的连接点，X是如本文所定义的。

图22提供了用于本发明的降解决定区域部分的其他实例，其中 R是连接子的连接点，X如本文所定义。

图23提供了用于本发明的降解决定区域部分的其他实例，其中 R是连接子的连接点，X如本文所定义。

图24提供了用于本发明的连接子部分的实例。

图25提供了用于本发明的连接子部分的其他实例。

图26提供了用于本发明的杂脂族连接子部分的实例。

图27提供了用于本发明的芳族连接子部分的实例。

图28A、图28B、图28C、图28D、图28E、图28F和图28G 提供用于本发明的dTAG靶向配体，其中R是连接子连接的点。

图29A、图29B、图29C、图29D、图29E、图29F、图29G 和图29H提供了用于本发明的特定异双功能性化合物。

图30A，图30B、图30C、图30D、图30E、图30F、图30G、图30H、图30I、图30J、图30K、图30L、图30M、图30N、图 30O和图30P提供用于本发明的特定异双功能性化合物，其中上述结构中的X是选自F、Cl、Br和I的卤素。

图31A、图31B、图31C、图31D、图31E、图31F、图31G、图31H、图31I和图图31J提供了用于本发明的特定异双功能性化合物。

图32A、图32B、图32C、图32D、图32E、图32F、图32G、图32H、图32I、图32J、图32K、图32L、图32M、图32N、图 32O、图32P、图32Q、图32R、图32S、图32T、图32U、图32V、图32W、图32X、图32Y、图32Z、图32AA、图32BB、图32CC、图32DD和图32EE提供用于本发明的特定异双功能性化合物，其中 R^AR1和R^AR2如本文所述。

图33A、图33B、图33C、图33D、图33E、图33F、图33G、图33H、图33I、图33J、图33K、图33L、图33M、图33N、图 33O、图33P、图33Q、图33R、图33S、图33T、图33U、图33V、图33W提供用于本发明的另外的异双功能性化合物。

具体实施方式

除非另有说明，本文揭露的组合物以及制备和使用在分子生物学，生物化学，染色质结构和分析，计算化学，细胞培养，重组DNA和相关领域中的的实施落入本领域的常规技术。这些技术在文献中有充分的解释。例如，参见Sambrook et al.MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,Second edition,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989and Third edition,2001；Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULARBIOLOGY,John Wiley &Sons,New York,1987 and periodic updates；the seriesMETHODS IN ENZYMOLOGY,Academic Press,San Diego； Wolffe,CHROMATIN STRUCTUREAND FUNCTION,Third edition,Academic Press,San Diego,1998；METHODS INENZYMOLOGY,Vol.304,“Chromatin”(P.M.Wassarman and A. P.Wolffe,eds.),AcademicPress,San Diego,1999；以及 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY,Vol.119,“ChromatinProtocols”(P.B.Becker,ed.)Humana Press,Totowa,1999。

本文中，我们描述了一种利用基因和蛋白质破坏的方法，以提供促进蛋白质降解的高选择性和可逆方法。该方法对于精确的、暂时的、小分子控制的靶标验证以及对感兴趣的蛋白质降解的细胞和体内作用的探索具有价值。

在该方法中，感兴趣的靶基因的区域被引导RNA和Cas9靶向，以***(敲入)同源重组(HR)靶向载体中存在的dTAG的表达盒。HR 靶向载体在表达盒的5'和3'末端含有与感兴趣的靶向基因周围的基因组DNA同源的同源臂。通过将dTAG与感兴趣的靶基因融合在一起，表达后的所得融合蛋白在用生物惰性小分子异双功能性化合物处理后将对蛋白酶体介导的降解敏感。

哺乳动物细胞中的基因组编辑为治疗和纠正人类疾病提供了很大的潜力。通过使用短的单引导RNA(sgRNA)，可以将Cas9内切核酸酶导向目标基因组位置，从而诱导DNA双股断裂。这些断裂通过非同源末端连接修复，其可以用于产生使基因失活的***或缺失(*** 缺失)。体内基因组编辑可以通过腺病毒相关病毒(AAV)、慢病毒、颗粒、流体动力学注射-或电穿孔介导的方法或其组合用 CRISPR/Cas9递送来完成(参见，例如，Kumar etal.,Hum.Gene Ther.12,(2001):1893-1905；Wu et al.,Mol.Ther.18,(2010):80-86； Ranet al.,Nature 520,(2015):186-191；Swiech et al.,Nat. Biotechnol.33,(2015):102-105；Zuris et al.,Nat.Biotechnol.33, (2015):73-80；Kauffman et al.,Nano.Lett.15,(2015):7300-7306； Ding et al.,Circ.Res.115,(2014):488-492；Maresch et al.,Nat. Commun.7,(2016):10770；Khorsandi et al.,Cancer GeneTher.15, (2008):225-230；Yin et al.,Nat.Rev.Genet.15,(2014):541-555； Yin etal.,Nat.Biotechnol.34,(2016):328-333；以及Xue et al., Nature 514,(2014):380-384，其通过引用方式并入本文)，并且体细胞基因组编辑已应用于小鼠器官，例如肺，肝，脑和胰腺(参见，例如，Xue et al.,Nature 514,(2014):380-384；Sanchez-Rivera etal., Nature 516,(2014):428-431；Platt et al.,Cell 159,(2014):440-455； Yin etal.,Nat.Biotechnol.32,(2014):551-553；Zuckermann et al., Nat.Commun.6,(2015):7391；Chiou et al.,Genes Dev.29, (2015):1576-1585；以及Mazur et al.,Nat.Med.21,(2015):1163- 1171，其通过引用方式并入本文)。然而，永久基因组修饰的长期影响尚不清楚，并且存在关于基因组编辑的不完全精确性以及成人可能存在的生物补偿机制的对直接校正的影响的问题(参见，例如，Fu et al.,Nat.Biotechnol.31(9),(2013):822-826,and Cho et al.,Genome Res.24,(2014):132-141，通过引用并入本文)。

本文中，我们描述了广泛治疗用途的策略，其基于体内基因组工程以产生从内源性基因座产生的并且易于以配体依赖性、可逆性和剂量响应性方式降解的敲入融合蛋白。融合蛋白含有dTAG，其被双价或多价异双功能性化合物靶向。异双功能性化合物具有结合dTAG 并募集E3连接酶的能力，例如，含有小脑蛋白的CRL4A E3泛素连接酶复合物。该募集诱导融合蛋白的泛素化(在dTAG结构域或在同源蛋白上)并随后经由UPP降解。通过这种方法，可以以高特异性和高特异性的将感兴趣的蛋白质靶向快速泛素介导的降解，而不需要发现感兴趣的蛋白质的从头配体(de novo ligand)。鉴于小分子和基因组工程的组合使用，用于体内使用。

可以使用多种dTAG，包括但不限于溴结构域，例如，BRD4的第一个溴结构域；激素受体，例如，ER、AR、RXR；FKBP12； DHFR，尤其是细菌DHFR和其他常用的蛋白质融合标签，可以通过可以转化为异双功能性化合物的配体结合。在某些情况下，使用 dTAG将有一个优势，该dTAG利用概念上与开发的“凸块孔”策略相关的选择性靶向蛋白激酶的ATP结合位点的“凸块孔”策略。在这种情况下，dTAG融合物是FK506-和雷帕霉素结合蛋白FKBP12的一种形式，其经由氨基酸突变(F36V)形成“孔”的腔。然后该突变体 FKBP12(“凸起的”FKBP，又名FKBP*(SEQ.ID.NO.:2)被FKBP12 结合结构域中具有合成“凸块”、连接子和小脑蛋白靶向结构域(例如 IMID衍生物)的异双功能性化合物(或类似分子)靶向。该分子不靶向天然FKBP12，因此提供异双功能性化合物对天然存在于人类细胞中的标签的野生型变体的选择性。代表示例性“凸块孔”策略的图示是如图1所示。

本文描述的发明提供了通过将基因组工程与小分子活化/降解调节相结合来控制与疾病相关的内源性蛋白质降解的机制。该技术的应用包括但不限于1)蛋白质的靶向降解，其中病理学是功能获得突变的函数，2)蛋白质的靶向降解，其中病理学是扩增或增加的表达的函数，3)作为单基因疾病表现的蛋白质的靶向降解，4)蛋白质的靶向降解，其中遗传易感性表现出更长的时间并且通常在替代的生物补偿机制之后不再充分，例如高胆固醇血症，蛋白质病。

定义

术语“核酸”，“多核苷酸”和“寡核苷酸”可互换使用，是指线性或环状构象的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，并且是单股或双股形式。出于本揭露的目的，这些术语不应被解释为关于聚合物长度的限制。该术语可包括天然核苷酸的已知类似物，以及在碱基，糖和/ 或磷酸酯部分(例如硫代磷酸酯骨架)中被修饰的核苷酸。通常，特定核苷酸的类似物具有相同的碱基配对特异性；即，A的类似物将与T 碱基配对。

术语“多肽”，“肽”和“蛋白质”可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语也适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸是相应天然存在的氨基酸的化学类似物或修饰衍生物。

“结合”是指大分子(例如，蛋白质和核酸之间)或大分子和小分子 (例如蛋白质和药物之间)之间的序列特异性非共价相互作用。并非结合相互作用的所有组分都需要序列特异性(例如，与DNA骨架中的磷酸残基接触)，只要整个相互作用是序列特异性的。

“重组”是指在两个多核苷酸之间交换遗传信息的过程。出于本揭露的目的，“同源重组”(HR)是指这种交换的特化形式，其发生在例如经由同源定向修复机制修复细胞中的双股断裂期间。该过程需要核苷酸序列同源性，使用“供体”分子模板修复“靶”分子(即经历双股断裂的分子)，并导致遗传信息从供体转移到靶标。

如本文所述的一种或多种靶向核酸酶在预定位点处在靶序列(例如，细胞染色质)中产生双股断裂，和与断裂区域中的核苷酸序列具有同源性的编码dTAG的“供体”多核苷酸可以被引入细胞。已显示双股断裂的存在促进供体序列的整合。供体序列可以是物理整合的，导致将供体中的全部或部分核苷酸序列引入细胞染色质中。因此，可以改变细胞染色质中的第一序列并将其转化为供体多核苷酸中存在的序列。

在用于细胞染色质中感兴趣区域中的序列的靶向重组和/或置换和/或改变的某些方法中，通过与编码dTAG的外源“供体”核苷酸序列的同源重组来改变染色体序列。如果存在与断裂区域同源的序列，则通过细胞染色质中存在双股断裂来刺激这种同源重组。

在本文所述的任何方法中，外源核苷酸序列(“供体序列”或“转基因”)可含有与目标区域中的基因组序列同源但不相同的序列，从而刺激同源重组以在感兴趣的区域中***非相同序列，即编码dTAG的核酸序列。因此，供体序列中与感兴趣区域中的序列同源的部分表现出与被替换的基因组序列的约80至99％(或其间的任何整数)的序列同一性。在其他具体例中，例如，如果仅有1个核苷酸在超过100 个连续碱基对的供体和基因组序列之间不同，供体和基因组序列之间的同源性高于99％。供体序列的非同源部分含有不存在于目标区域中的核酸序列，例如编码dTAG的序列，从而将新序列引入感兴趣的区域。在这些情况下，非同源序列通常侧接其与目标区域中的序列同源或相同50至1,000个碱基对(或其间的任何整数值)或任何数目的大于1,000的碱基对的序列。在其他具体例中，供体序列与第一序列不同源，并通过非同源重组机制***基因组中。

“切割”是指DNA分子的共价骨架的断裂。切割可以通过多种方法引发，包括但不限于磷酸二酯键的酶促或化学水解。单股切割和双股切割都是可能的，并且由于两个不同的单股切割事件可以发生双股切割。DNA切割可导致钝端或交错末端的产生。在某些具体例中，融合多肽用于靶向双股DNA切割。

“染色质”是包含细胞基因组的核蛋白结构。细胞染色质包括核酸，主要是DNA和蛋白质，包括组蛋白和非组蛋白染色体蛋白。大多数真核细胞染色质以核小体的形式存在，其中核小体核心包含与包含两个组蛋白H2A，H2B，H3和H4各自的八聚体相关的约150个碱基对的DNA；和在核小体核心之间延伸的连接子DNA(可变长度取决于生物体)。组蛋白H1的分子通常与接头DNA相关。出于本公开的目的，术语“染色质”意在包括所有类型的细胞核蛋白，包括原核和真核细胞。细胞染色质包括染色体和附加型染色质。

“外源”分子是通常不存在于细胞中的分子，例如某些dTAG，但可以通过一种或多种遗传，生物化学或其他方法引入细胞中。外源分子可包含例如合成的内源性蛋白质-dTAG杂合体。

“内源”蛋白质是在特定环境条件下在特定发育阶段通常存在于特定细胞中的蛋白质。例如，内源性蛋白质，例如，可以是转录因子或酶或任何其他类型的天然表达的蛋白质。

“融合”或“杂合”蛋白质是其中两个或多个多肽优选共价连接的蛋白质。例如，融合蛋白的实例包括内源性蛋白质和dTAG之间的融合。

出于本揭露的目的，“基因”包括编码基因产物的DNA区域，以及调节基因产物产生的所有DNA区域，无论这些调节序列是否与编码相邻和/或转录序列。因此，基因包括但不必限于启动子序列，终止子，转译调控序列如核糖体结合位点和内部核糖体进入位点，增强子，沉默子，绝缘子，边界元件，复制起点，基质附着位点和基因座控制区域。

“基因表达”是指基因中包含的信息转化为基因产物。基因产物可以是基因的直接转录产物(例如，mRNA，tRNA，rRNA，反义RNA，核酶，结构RNA或任何其他类型的RNA)或通过mRNA转译产生的蛋白质。基因产物还包括通过诸如加帽，多腺苷酸化，甲基化和编辑的方法修饰的RNA，以及通过例如甲基化，乙酰化，磷酸化，泛素化，ADP-核糖基化，豆蔻酸化和糖基化修饰的蛋白质。

蛋白质表达的“调节”是指蛋白质活性的变化。表达的调节可包括但不限于降低的蛋白质活性或增加的蛋白质活性。例如，如本文所考虑的，将内源性蛋白质-dTAG杂交体暴露于异双功能性化合物，导致内源性蛋白质-dTAG杂交体的降解，可调节内源性蛋白质的活性。因此，蛋白质失活可以是部分或完全的。

“载体”能够将基因序列转移至靶细胞。通常，“载体构建体”， “表达载体”和“基因转移载体”是指能够引导感兴趣的基因表达并且可以将基因序列转移至靶细胞的任何核酸构建体。因此，该术语包括克隆和表达载体，以及整合载体。

术语“受试者”和“患者”可互换使用，并且指哺乳动物，例如人类患者和非人灵长类动物，以及实验动物，例如兔，狗，猫，大鼠，小鼠，兔和其他动物。因此，本文所用的术语“受试者”或“患者”是指患有病症的任何患者或受试者(例如哺乳动物)。

A.异双功能复合靶向蛋白(dTAG)

本发明提供了制备敲入融合蛋白的方法，该融合蛋白由内源性基因座产生并且易于以配体依赖性、可逆性和剂量响应性方式降解。具体地，将编码dTAG的核酸与感兴趣的靶基因框内***，其中在表达时，所得融合蛋白含有被双价或多价异双功能性化合物靶向的 dTAG。异双功能性化合物具有结合靶蛋白并募集E3连接酶的能力，例如，含有小脑蛋白的CRL4A E3泛素连接酶复合物。该募集诱导融合蛋白(在dTAG或同源蛋白上)的泛素化和随后经由泛素蛋白酶体途径(UPP)的降解。通过这种方法，可以以高特异性的将感兴趣的蛋白质靶向快速泛素介导的降解，而不需要发现POI的从头配体。

合成基因的异双功能性化合物靶向蛋白是异双功能性化合物可以结合的任何氨基酸序列，当与异双功能性化合物接触时，导致表达的内源性蛋白质-dTAG杂合蛋白质的泛素化和降解。优选地，dTAG 不应干扰内源性表达的蛋白质的功能。在一个具体例中，dTAG是非内源肽，导致异双功能性化合物选择性并允许在给药异双功能性化合物时避免脱靶效应。在一个具体例中，dTAG是衍生自内源性蛋白质或其片段的氨基酸序列，其已被修饰使得异双功能性化合物仅结合修饰的氨基酸序列而不结合内源性表达的蛋白质。在一个具体例中， dTAG是内源性表达的蛋白质或内源性表达的蛋白质的片段。可以通过配体结合用于异双功能性化合物的任何氨基酸序列结构域可以用作本文考虑的dTAG。在某些具体例中，优选能够被特定异双功能性化合物结合的最小氨基酸序列用作dTAG。

在特定具体例中，用于本发明的dTAG包括，但不限于，衍生自内源性表达的蛋白质的氨基酸序列，例如FK506结合蛋白- 12(FKBP12)，含溴结构域的蛋白质4(BRD4)，CREB结合蛋白(CREBBP)和转录激活因子BRG1(SMARCA4)或其变体。如本文所设想的，“变体”意指包含一个或几个至多个氨基酸的取代，删除或添加的任何变体，条件是变体实质上保留与原始序列相同的功能，在这种情况下提供异双功能性化合物的配体。在其他具体例中，用于本发明的dTAG可包括，例如，激素受体，例如，***受体蛋白，雄激素受体蛋白，类视黄醇x受体(RXR)蛋白和二氢叶酸还原酶 (DHFR)(包括细菌DHFR，细菌脱氢酶和变体)。

dTAG的一些具体例可以是，但不限于，彼等衍生自Hsp90抑制剂，激酶抑制剂，MDM2抑制剂，靶向人类含BET溴结构域蛋白的化合物，靶向胞质信号传导蛋白FKBP12的化合物，HDAC抑制剂，人类赖氨酸甲基转移酶抑制剂，血管生成抑制剂者，免疫抑制化合物和靶向芳烃受体(AHR)的化合物。

在某些具体例中，dTAG衍生自激酶，含有BET溴结构域的蛋白质，胞质信号传导蛋白质(例如，FKBP12)，核蛋白，组蛋白脱乙酰酶，赖氨酸甲基转移酶，调节血管生成的蛋白质，调节免疫应答的蛋白质，芳香烃受体(AHR)，***受体，雄激素受体，糖皮质激素受体或转录因子(例如，SMARCA4，SMARCA2，TRIM24)。

在某些具体例中，dTAG衍生自激酶，例如但不限于酪氨酸激酶 (例如，AATK，ABL，ABL2，ALK，AXL，BLK，BMX，BTK， CSF1R，CSK，DDR1，DDR2，EGFR，EPHA1，EPHA2，EPHA3， EPHA4，EPHA5，EPHA6，EPHA7，EPHA8，EPHA10，EPHB1， EPHB2，EPHB3，EPHB4，EPHB6，ERBB2，ERBB3，ERBB4， FER，FES，FGFR1，FGFR2，FGFR3，FGFR4，FGR，FLT1， FLT3，FLT4，FRK，FYN，GSG2，HCK，IGF1R，ILK，INSR， INSRR，IRAK4，ITK，JAK1，JAK2，JAK3，KDR，KIT，KSR1， LCK，LMTK2，LMTK3，LTK，LYN，MATK，MERTK，MET， MLTK，MST1R，MUSK，NPR1，NTRK1，NTRK2，NTRK3， PDGFRA，PDGFRB，PLK4，PTK2，PTK2B，PTK6，PTK7， RET，ROR1，ROR2，ROS1，RYK，SGK493，SRC，SRMS，STYK1，SYK，TEC，TEK，TEX14，TIE1，TNK1，TNK2， TNNI3K，TXK，TYK2，TYRO3，YES1或ZAP70)，丝氨酸/苏氨酸激酶(例如，酪蛋白激酶2，蛋白激酶A，蛋白激酶B，蛋白激酶C， Raf激酶，CaM激酶，AKT1，AKT2，AKT3，ALK1，ALK2， ALK3，ALK4，Aurora A，Aurora B，Aurora C，CHK1，CHK2， CLK1，CLK2，CLK3，DAPK1，DAPK2，DAPK3，DMPK， ERK1，ERK2，ERK5，GCK，GSK3，HIPK，KHS1，LKB1， LOK，MAPKAPK2，MAPKAPK，MNK1，MSSK1，MST1， MST2，MST4，NDR，NEK2，NEK3，NEK6，NEK7，NEK9， NEK11，PAK1，PAK2，PAK3，PAK4，PAK5，PAK6，PIM1， PIM2，PLK1，RIP2，RIP5，RSK1，RSK2，SGK2，SGK3，SIK1， STK33，TAO1，TAO2，TGF-β，TLK2，TSSK1，TSSK2，ULK1 或ULK2)，细胞周期蛋白依赖性激酶(例如，Cdk1-Cdk11)和富含亮氨酸的重复激酶(例如，LRRK2)。

在某些具体例中，dTAG衍生自含有BET溴结构域的蛋白质，例如但不限于ASH1L，ATAD2，BAZ1A，BAZ1B，BAZ2A， BAZ2B，BRD1，BRD2，BRD3，BRD4，BRD5，BRD6，BRD7， BRD8，BRD9，BRD10，BRDT，BRPF1，BRPF3，BRWD3， CECR2，CREBBP，EP300，FALZ，GCN5L2，KIAA1240，LOC93349，MLL，PB1，PCAF，PHIP，PRKCBP1，SMARCA2， SMARCA4，SP100，SP110，SP140，TAF1，TAF1L，TIF1a， TRIM28，TRIM33，TRIM66，WDR9，ZMYND11和MLL4。在某些具体例中，含有BET溴结构域的蛋白质是BRD4。

在某些具体例中，dTAG是衍生自，但不限于，7,8-二氢-8-氧鸟嘌呤三磷酸酶，AFAD，花生四烯酸5-脂氧合酶活化蛋白，载脂蛋白，含杆状病毒IAP重复的蛋白2，Bcl-2，Bcl-xL，E3连接酶XIAP，来自脂肪细胞的脂肪酸结合蛋白4(FABP4)，GTP酶k-RAS， HDAC6，造血***素D合成酶，乳谷胱甘肽裂解酶，Mcl-1， PA2GA，肽基-脯氨酰基顺反异构酶NIMA-相互作用1，聚-ADP-核糖聚合酶14，聚-ADP-核糖聚合酶15，鞘脂激活蛋白原，***素 E合成酶，视网膜视杆细胞视紫红质敏感性cGMP 3','5-环磷酸二酯酶亚基δ，S100-A7，Src，Sumo-共轭酶UBC9，超氧化物歧化酶，端销聚合酶(tankyrase)1或端销聚合酶2。

在某些具体例中，dTAG是衍生自核蛋白，包括但不限于BRD2， BRD3，BRD4，触角足同源域蛋白，BRCA1，BRCA2，CCAAT增强的结合蛋白，组蛋白，Polycomb-组蛋白，高迁移率组蛋白质，端粒结合蛋白，FANCA，FANCD2，FANCE，FANCF，肝细胞核因子，Mad2，NF-κB，核受体辅激活因子，CREB结合蛋白，p55， p107，p130，Rb蛋白，p53，c-fos，c-jun，c-mdm2，c-myc和c- rel。

在特别具体例中，dTAG具有衍生自BRD2的氨基酸序列 ((Universal ProteinResource Knowledge Base(UniProtKB)- P25440(BRD2_HUMAN)，其通过引用并入本文)，BRD3(UniProtKB-Q15059(BRD3_HUMAN)，其通过引用并入本文)， BRD4(UniProtKB-O60885(BRD4_HUMAN)，其通过引用方式并入本文)，或BRDT(UniProtKB-Q58F21(BRDT_HUMAN)，其通过引用方式并入本文)(参见Baud et al.,”A bump-and-hole approach to engineercontrolled selectivity of BET bromodomains chemical probesm”Science 346(6209)(2014):638-641；和Baud et al., “Triazolo-benzodiazepineAnalogues:Expanding theScope of the Bump-and-Hole Approach for Selective Bromo and Extra-Terminal(BET)Bromodomain Inhibition,JMC 59(2016):1492-1500，其均是通过引用方式并入本文)。在某些具体例中，dTAG是修饰的或突变的BRD2、BRD3、BRD4或BRDT蛋白(参见，Baud etal.,“A bump-and-hole approach to engineer controlled selectivity of BETbromodomains chemical probes”,Science 346(6209)(2014):638-641； and Baud etal.,“New Synthetic Routes to Triazolo-benzodiazepine Analogues:Expanding theScope of the Bump-and-Hole Approach for Selective Bromo and Extra-Terminal(BET)Bromodomain Inhibition”,JMC 59(2016):1492-1500，其通过引用方式并入本文)。在某些具体例中，BRD2的一个或多个突变包括氨基酸位置97处色氨酸(W)的突变。氨基酸位置103处的缬氨酸(V)的突变，氨基酸位置110处亮氨酸(L)的突变，氨基酸位置370处W的突变，氨基酸位置376处V的突变，或氨基酸位置381处L的突变。在某些具体例中，BRD3的一个或多个突变包括氨基酸位置57处W的突变，氨基酸位置63处V的突变，氨基酸位置70处的L突变，氨基酸位置 332处W的突变，氨基酸位置338处V的突变，或氨基酸位置345 处L的突变。在某些具体例中，BRD4的一个或多个突变包括氨基酸位置81处W的突变，氨基酸位置87处的V突变，氨基酸位置94 处的L突变，氨基酸位置37处W的突变，氨基酸位置380处V的突变，或在某些具体例中，BRDT的一个或多个突变包括氨基酸位置 50处W的突变，氨基酸位置56处V的突变，氨基酸位置63处L的突变，氨基酸位置293处W的突变，在氨基酸位置299处V的突变，或在氨基酸位置306处L的突变。

在某些具体例中，dTAG是衍生自激酶抑制剂，含有BET溴结构域的蛋白质抑制剂，细胞溶质信号传导蛋白FKBP12配体，HDAC 抑制剂，赖氨酸甲基转移酶抑制剂，血管生成抑制剂，免疫抑制化合物和芳烃受体(AHR)抑制剂。

在特别具体例中，dTAG是衍生自胞质信号传导蛋白FKBP12。在某些具体例中，dTAG是修饰的或突变的胞质信号传导蛋白 FKBP12。在某些具体例中，修饰的或突变的胞质信号传导蛋白 FKBP12含有一个或多个突变，其产生FKBP12配体的扩增的结合口袋。在某些具体例中，一个或多个突变包括氨基酸位置36处有苯丙氨酸(F)变为缬氨酸(V)(F36V)的突变(不包括甲硫氨酸起始密码子的计数)(称为FKBP12*或FKBP*，在本文可互换使用)(参见Clackson et al.,“Redesigning a FKBP-ligand interface to generatedchemical dimerizers with novel specificity,”PNAS 95(1998):10437-10442，其通过引用方式并入本文)。

在特别具体例中，dTAG具有衍生自FKBP12蛋白(UniProtKB- P62942(FKB1A_HUMAN)，其通过引用方式并入本文)的氨基酸序列或其变体。在一个具体例中，dTAG是衍生自氨基酸序列：(SEQ.ID. NO.:1)GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTG MLEDGKKFDSSRDRNKPFKFMLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIP PHATLVFDVELLKLE。

在一个具体例中，dTAG是衍生自FKBP12的氨基酸序列，其氨基酸位置36处有苯丙氨酸(F)变为(不包括甲硫氨酸起始密码子的计数)缬氨酸(V)(F36V)的突变(称为FKBP*)具有氨基酸序列：(SEQ. ID.NO.:2)GVQVETISPGDGRTFPKRGQTCVVHYTGMLEDGKKFDSSRDRNKPFKF MLGKQEVIRGWEEGVAQMSVGQRAKLTISPDYAYGATGHPGIIPPHATLVFDVELLKLE。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自BRD4蛋白(UniProtKB- O60885(BRD4_HUMAN)，其通过引用方式并入本文)的氨基酸序列或其变体。在一个具体例中，dTAG衍生自氨基酸序列：(SEQ.ID. NO.:3)

MSAESGPGTRLRNLPVMGDGLETSQMSTTQAQAQPQPANAAST NPPPPETSNPNKPKRQTNQLQYLLRVVLKTLWKHQFAWPFQQP VDAVKLNLPDYYKIIKTPMDMGTIKKRLENNYYWNAQECIQDF NTMFTNCYIYNKPGDDIVLMAEALEKLFLQKINELPTEETEIMIV QAKGRGRGRKETGTAKPGVSTVPNTTQASTPPQTQTPQPNPPPV QATPHPFPAVTPDLIVQTPVMTVVPPQPLQTPPPVPPQPQPPPAPA PQPVQSHPPIIAATPQPVKTKKGVKRKADTTTPTTIDPIHEPPSLPP EPKTTKLGQRRESSRPVKPPKKDVPDSQQHPAPEKSSKVSEQLK CCSGILKEMFAKKHAAYAWPFYKPVDVEALGLHDYCDIIKHPM DMSTIKSKLEAREYRDAQEFGADVRLMFSNCYKYNPPDHEVVA MARKLQDVFEMRFAKMPDEPEEPVVAVSSPAVPPPTKVVAPPSS SDSSSDSSSDSDSSTDDSEEERAQRLAELQEQLKAVHEQLAALSQ PQQNKPKKKEKDKKEKKKEKHKRKEEVEENKKSKAKEPPPKKT KKNNSSNSNVSKKEPAPMKSKPPPTYESEEEDKCKPMSYEEKRQ LSLDINKLPGEKLGRVVHIIQSREPSLKNSNPDEIEIDFETLKPSTL RELERYVTSCLRKKRKPQAEKVDVIAGSSKMKGFSSSESESSSES SSSDSEDSETEMAPKSKKKGHPGREQKKHHHHHHQQMQQAPAP VPQQPPPPPQQPPPPPPPQQQQQPPPPPPPPSMPQQAAPAMKSSPP PFIATQVPVLEPQLPGSVFDPIGHFTQPILHLPQPELPPHLPQPPEH STPPHLNQHAVVSPPALHNALPQQPSRPSNRAAALPPKPARPPAV SPALTQTPLLPQPPMAQPPQVLLEDEEPPAPPLTSMQMQLYLQQL QKVQPPTPLLPSVKVQSQPPPPLPPPPHPSVQQQLQQQPPPPPPPQ PQPPPQQQHQPPPRPVHLQPMQFSTHIQQPPPPQGQQPPHPPPGQ QPPPPQPAKPQQVIQHHHSPRHHKSDPYSTGHLREAPSPLMIHSP QMSQFQSLTHQSPPQQNVQPKKQELRAASVVQPQPLVVVKEEKI HSPIIRSEPFSPSLRPEPPKHPESIKAPVHLPQRPEMKPVDVGRPVI RPPEQNAPPPGAPDKDKQKQEPKTPVAPKKDLKIKN MGSWASLVQKHPTTPSSTAKSSSDSFEQFRRAAREKEEREKALK AQAEHAEKEKERLRQERMRSREDEDALEQARRAHEEARRRQEQ QQQQRQEQQQQQQQQAAAVAAAATPQAQSSQPQS MLDQQRELARKREQERRRREAMAATIDMNFQSDLLSIFEENLF。

在一个具体例中，dTAG是衍生自SEQ.ID.NO.:3的氨基酸75 至147。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自ASH1L蛋白(UniProtKB- Q9NR48(ASH1L_HUMAN)，其通过引用方式并入本文)的氨基酸序列或其变体。在一个具体例中，dTAG是衍生自Q9NR48的氨基酸 2463至2533。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自ATAD2蛋白(UniProtKB- Q6PL18(ATAD2_HUMAN)，其通过引用方式并入本文)的氨基酸序列或其变体。在一个具体例中，dTAG是衍生自Q6PL18的氨基酸 1001至1071。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自BAZ1A蛋白(UniProtKB- Q9NRL2(BAZ1A_HUMAN)，其通过引用并入本文)的氨基酸序列或其变体。在一个具体例中，dTAG是衍生自Q9NRL2的氨基酸1446 至1516。

在一个具体例中，dTAG是具有衍生自BAZ1B蛋白(UniProtKB- Q9UIG0(BAZ1B_HUMAN)，其通过引用方式并入本文)的氨基酸序列或其变体。在一个具体例中，dTAG是衍生自Q9UIG0的氨基酸 1356至1426。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自BAZ2A蛋白(UniProtKB- Q9UIF9(BAZ2A_HUMAN)，其通过引用方式并入本文)的氨基酸序列或其变体。在一个具体例中，dTAG是衍生自Q9UIF9的氨基酸 1810至1880。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自BAZ2B蛋白(UniProtKB- Q9UIF8(BAZ2B_HUMAN)，其通过引用方式并入本文)的氨基酸序列或其变体。在一个具体例中，dTAG是衍生自Q9UIF8的氨基酸 2077至2147。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自BRD1蛋白(UniProtKB- O95696(BRD1_HUMAN)，其通过引用方式并入本文)的氨基酸序列或其变体。在一个具体例中，dTAG是衍生自O95696的氨基酸579 至649。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自BRD2蛋白(UniProtKB- P25440(BRD2_HUMAN)，其通过引用方式并入本文)的氨基酸序列或其变体。在一个具体例中，dTAG是衍生自氨基酸序列：(SEQ. ID.NO.:13)

MLQNVTPHNKLPGEGNAGLLGLGPEAAAPGKRIRKPSLLYEGFE SPTMASVPALQLTPANPPPPEVSNPKKPGRVTNQLQYLHKVVMK ALWKHQFAWPFRQPVDAVKLGLPDYHKIIKQPMDMGTIKRRLE NNYYWAASECMQDFNTMFTNCYIYNKPTDDIVLMAQTLEKIFL QKVASMPQEEQELVVTIPKNSHKKGAKLAALQGSVTSAHQVPAVSSVSHTALYTPPPEIPTTVLNIPHPSVISSPLLKSLHSAGPPLLAV TAAPPAQPLAKKKGVKRKADTTTPTPTAILAPGSPASPPGSLEPK AARLPPMRRESGRPIKPPRKDLPDSQQQHQSSKKGKLSEQLKHC NGILKELLSKKHAAYAWPFYKPVDASALGLHDYHDIIKHPMDLS TVKRKMENRDYRDAQEFAADVRLMFSNCYKYNPPDHDVVAMA RKLQDVFEFRYAKMPDEPLEPGPLPVSTAMPPGLAKSSSESSSEE SSSESSSEEEEEEDEEDEEEEESESSDSEEERAHRLAELQEQLRAV HEQLAALSQGPISKPKRKREKKEKKKKRKAEKHRGRAGADEDD KGPRAPRPPQPKKSKKASGSGGGSAALGPSGFGPSGGSGTKLPK KATKTAPPALPTGYDSEEEEESRPMSYDEKRQLSLDINKLPGEKL GRVVHIIQAREPSLRDSNPEEIEIDFETLKPSTLRELERYVLSCLRK KPRKPYTIKKPVGKTKEELALEKKRELEKRLQDVSGQLNSTKKP PKKANEKTESSSAQQVAVSRLSASSSSSDSSSSSSSSSSSDTSDSD SG。

在一个具体例中，dTAG是衍生自SEQ.ID.NO.:13的氨基酸91 至163或364至436。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自BRD3蛋白(UniProtKB- Q15059(BRD3_HUMAN)，其通过引用方式并入本文)的氨基酸序列或其变体。在一个具体例中，dTAG是衍生自氨基酸序列：(SEQ. ID.NO.:14)

MSTATTVAPAGIPATPGPVNPPPPEVSNPSKPGRKTNQLQYMQN VVVKTLWKHQFAWPFYQPVDAIKLNLPDYHKIIKNPMDMGTIK KRLENNYYWSASECMQDFNTMFTNCYIYNKPTDDIVLMAQALE KIFLQKVAQMPQEEVELLPPAPKGKGRKPAAGAQSAGTQQVAA VSSVSPATPFQSVPPTVSQTPVIAATPVPTITANVTSVPVPPAAAP PPPATPIVPVVPPTPPVVKKKGVKRKADTTTPTTSAITASRSESPP PLSDPKQAKVVARRESGGRPIKPPKKDLEDGEVPQHAGKKGKLS EHLRYCDSILREMLSKKHAAYAWPFYKPVDAEALELHDYHDIIK HPMDLSTVKRKMDGREYPDAQGFAADVRLMFSNCYKYNPPDH EVVAMARKLQDVFEMRFAKMPDEPVEAPALPAPAAPMVSKGA ESSRSSEESSSDSGSSDSEEERATRLAELQEQLKAVHEQLAALSQ APVNKPKKKKEKKEKEKKKKDKEKEKEKHKVKAEEEKKAKVA PPAKQAQQKKAPAKKANSTTTAGRQLKKGGKQASASYDSEEEE EGLPMSYDEKRQLSLDINRLPGEKLGRVVHIIQSREPSLRDSNPD EIEIDFETLKPTTLRELERYVKSCLQKKQRKPFSASGKKQAAKSK EELAQEKKKELEKRLQDVSGQLSSSKKPARKEKPGSAPSGGPSR LSSSSSSESGSSSSSGSSSDSSDSE。

在一个具体例中，dTAG是衍生自SEQ.ID.NO.:14的氨基酸 51至123或326至398。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自BRD7蛋白(UniProtKB- Q9NPI1(BRD7_HUMAN)，其通过引用方式并入本文)的氨基酸序列或其变体。在一个具体例中，dTAG衍生自Q9NP11的氨基酸148 至218。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自BRD8蛋白(UniProtKB- Q9H0E9(BRD8_HUMAN)，其通过引用方式并入本文)的氨基酸序列或其变体。在一个具体例中，dTAG是衍生自Q9H0E9的氨基酸724 至794或1120至1190。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自BRD9蛋白(UniProtKB- Q9H8M2(BRD9_HUMAN)，其通过引用方式并入本文)的氨基酸序列或其变体。在一个具体例中，dTAG是衍生自Q9H8M2的氨基酸 153至223。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自BRDT蛋白(UniProtKB- Q58F21(BRDT_HUMAN)，其通过引用方式并入本文)的氨基酸序列或其变体。在一个具体例中，dTAG是衍生自氨基酸序列：(SEQ. ID.NO.:15)

MSLPSRQTAIIVNPPPPEYINTKKNGRLTNQLQYLQKVVLKDLW KHSFSWPFQRPVDAVKLQLPDYYTIIKNPMDLNTIKKRLENKYY AKASECIEDFNTMFSNCYLYNKPGDDIVLMAQALEKLFMQKLSQ MPQEEQVVGVKERIKKGTQQNIAVSSAKEKSSPSATEKVFKQQE IPSVFPKTSISPLNVVQGASVNSSSQTAAQVTKGVKRKADTTTPA TSAVKASSEFSPTFTEKSVALPPIKENMPKNVLPDSQQQYNVVKT VKVTEQLRHCSEILKEMLAKKHFSYAWPFYNPVDVNALGLHNY YDVVKNPMDLGTIKEKMDNQEYKDAYKFAADVRLMFMNCYK YNPPDHEVVTMARMLQDVFETHFSKIPIEPVESMPLCYIKTDITE TTGRENTNEASSEGNSSDDSEDERVKRLAKLQEQLKAVHQQLQVLSQVPFRKLNKKKEKSKKEKKKEKVNNSNENPRKMCEQMRLK EKSKRNQPKKRKQQFIGLKSEDEDNAKPMNYDEKRQLSLNINKL PGDKLGRVVHIIQSREPSLSNSNPDEIEIDFETLKASTLRELEKYVS ACLRKRPLKPPAKKIMMSKEELHSQKKQELEKRLLDVNNQLNSR KRQTKSDKTQPSKAVENVSRLSESSSSSSSSSESESSSSDLSSSDSSDSESEMFPKFTEVKPNDSPSKENVKKMKNECIPPEGRTGVTQIGY CVQDTTSANTTLVHQTTPSHVMPPNHHQLAFNYQELEHLQTVK NISPLQILPPSGDSEQLSNGITVMHPSGDSDTTMLESECQAPVQK DIKIKNADSWKSLGKPVKPSGVMKSSDELFNQFRKAAIEKEVKA RTQELIRKHLEQNTKELKASQENQRDLGNGLTVESFSNKIQNKC SGEEQKEHQQSSEAQDKSKLWLLKDRDLARQKEQERRRREAMV GTIDMTLQSDIMTMFENNFD。

在一个具体例中，dTAG衍生自SEQ.ID.NO.:15的氨基酸44 至116或287至359。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自BRPF1蛋白(UniProtKB- P55201(BRPF1_HUMAN)，其通过引用方式并入本文)的氨基酸序列或其变体。在一个具体例中，dTAG是衍生自P55201的氨基酸645 至715。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自BRPF3蛋白(UniProtKB- Q9ULD4(BRPF3_HUMAN)，其通过引用方式并入本文)的氨基酸序列或其变体。在一个具体例中，dTAG是衍生自Q9ULD4的氨基酸 606至676。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自BRWD3蛋白(UniProtKB- Q6RI45(BRWD3_HUMAN)，其通过引用方式并入本文)的氨基酸序列或其变体。在一个具体例中，dTAG是衍生自Q6RI45的氨基酸 1158至1228或1317至1412。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自CECR2蛋白(UniProtKB- Q9BXF3(CECR2_HUMAN)，其通过引用方式并入本文)的氨基酸序列或其变体。在一个具体例中，dTAG是衍生自Q9BXF3的氨基酸 451至521。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自CREBBP蛋白(UniProtKB- Q92793(CBP_HUMAN)，其通过引用方式并入本文)的氨基酸序列或其变体。在一个具体例中，dTAG是衍生自Q92793的氨基酸1103 至1175。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自EP300蛋白(UniProtKB- Q09472(EP300_HUMAN)，其通过引用方式并入本文)的氨基酸序列或其变体。在一个具体例中，dTAG是衍生自Q09472的氨基酸1067 至1139。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自FALZ蛋白(UniProtKB- Q12830(BPTF_HUMAN)，其通过引用方式并入本文)的氨基酸序列或其变体。在一个具体例中，dTAG是衍生自Q12830的氨基酸2944 至3014。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自GCN5L2蛋白(UniProtKB- Q92830(KAT2A_HUMAN)，其通过引用方式并入本文)的氨基酸序列或其变体。在一个具体例中，dTAG是衍生自Q92830的氨基酸 745至815。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自KIAA1240蛋白 (UniProtKB-Q9ULI0(ATD2B_HUMAN)，其通过引用方式并入本文) 的氨基酸序列或其变体。在一个具体例中，dTAG是衍生自Q9ULI0 的氨基酸975至1045。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自LOC93349蛋白 (UniProtKB-Q13342(SP140_HUMAN)，其通过引用方式并入本文) 的氨基酸序列或其变体。在一个具体例中，dTAG是衍生自Q13342 的氨基酸796至829。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自MLL蛋白(UniProtKB- Q03164(KMT2A_HUMAN)，其通过引用方式并入本文)的氨基酸序列或其变体。在一个具体例中，dTAG是衍生自Q03164的氨基酸 1703至1748。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自PB1蛋白(UniProtKB- Q86U86(PB1_HUMAN)，其通过引用方式并入本文)的氨基酸序列或其变体。在一个具体例中，dTAG是衍生自Q86U86的氨基酸63至 134、200至270、400至470、538至608、676至746或792至 862。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自PCAF蛋白(UniProtKB- Q92831(KAT2B_HUMAN)，其通过引用方式并入本文)的氨基酸序列或其变体。在一个具体例中，dTAG是衍生自Q92831的氨基酸 740至810。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自PHIP蛋白(UniProtKB- Q8WWQ0(PHIP_HUMAN)，其通过引用方式并入本文)的氨基酸序列或其变体。在一个具体例中，dTAG是衍生自Q8WWQ0的氨基酸 1176至1246或1333至1403。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自PRKCBP1蛋白 (UniProtKB-Q9ULU4(PKCB1_HUMAN)，其通过引用方式并入本文) 或其变体。在一个具体例中，dTAG是衍生自Q9ULU4的氨基酸165 至235的氨基酸序列。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自SMARCA2蛋白 (UniProtKB-P51531(SMCA2_HUMAN)，其通过引用方式并入本文) 的氨基酸序列或其变体。在一个具体例中，dTAG是衍生自P51531 的氨基酸1419至1489。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自SMARCA4蛋白 (UniProtKB-P51532(SMCA4_HUMAN)，其通过引用方式并入本文) 的氨基酸序列或其变体。在一个具体例中，dTAG是衍生自P51532 的氨基酸1477至1547。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自SP100蛋白(UniProtKB- P23497(SP100_HUMAN)，其通过引用方式并入本文)的氨基酸序列或其变体。在一个具体例中，dTAG是衍生自P23497的氨基酸761 至876。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自SP110蛋白(UniProtKB- Q9HB58(SP110_HUMAN)，其通过引用方式并入本文)的氨基酸序列或其变体。在一个具体例中，dTAG是衍生自Q9HB58的氨基酸581 至676。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自SP140蛋白(UniProtKB- Q13342(SP140_HUMAN)，其通过引用方式并入本文)的氨基酸序列或其变体。在一个具体例中，dTAG是衍生自Q13342的氨基酸796 至829。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自TAF1蛋白(UniProtKB- P21675(TAF1_HUMAN)，其通过引用方式并入本文)的氨基酸序列或其变体。在一个具体例中，dTAG至衍生自P21675的氨基酸1397 至1467或1520至1590。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自TAF1L蛋白(UniProtKB- Q8IZX4(TAF1L_HUMAN)，其通过引用方式并入本文)的氨基酸序列或其变体。在一个具体例中，dTAG是衍生自Q8IZX4的氨基酸 1416至1486或1539至1609。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自TIF1A蛋白(UniProtKB- O15164(TIF1A_HUMAN)，其通过引用方式并入本文)的氨基酸序列或其变体。在一个具体例中，dTAG是衍生自O15164的氨基酸932 至987。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自TRIM28蛋白(UniProtKB- Q13263(TIF1B_HUMAN)，其通过引用方式并入本文)的氨基酸序列或其变体。在一个具体例中，dTAG是衍生自Q13263的氨基酸697 至801。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自TRIM33蛋白(UniProtKB- Q9UPN9(TRI33_HUMAN)，其通过引用方式并入本文)的氨基酸序列或其变体。在一个具体例中，dTAG是衍生自Q9UPN9的氨基酸 974至1046。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自TRIM66蛋白(UniProtKB- O15016(TRI66_HUMAN)，其通过引用方式并入本文)的氨基酸序列或其变体。在一个具体例中，dTAG是衍生自O15016的氨基酸1056 至1128。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自WDR9蛋白(UniProtKB- Q9NSI6(BRWD1_HUMAN)，其通过引用方式并入本文)的氨基酸序列或其变体。在一个具体例中，dTAG衍生自Q9NSI6的氨基酸 1177至1247或1330至1400。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自ZMYND11蛋白 (UniProtKB-Q15326(ZMY11_HUMAN)，其通过引用方式并入本文) 的氨基酸序列或其变体。在一个具体例中，dTAG是衍生自Q15326 的氨基酸168至238。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自MLL4蛋白(UniProtKB- Q9UMN6(KMT2B_HUMAN)，其通过引用方式并入本文)的氨基酸序列或其变体。在一个具体例中，dTAG是衍生自Q9UMN6的氨基酸1395至1509。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自***受体的(UniProtKB- P03372-1，其通过引用方式并入本文)人类氨基酸序列或其变体。在一个具体例中，dTAG是衍生自氨基酸序列：(SEQ.ID.NO.:4)

MTMTLHTKASGMALLHQIQGNELEPLNRPQLKIPLERPLGEVYL DSSKPAVYNYPEGAAYEFNAAAAANAQVYGQTGLPYGPGSEAA AFGSNGLGGFPPLNSVSPSPLMLLHPPPQLSPFLQPHGQQVPYYL ENEPSGYTVREAGPPAFYRPNSDNRRQGGRERLASTNDKGSMA MESAKETRYCAVCNDYASGYHYGVWSCEGCKAFFKRSIQGHND YMCPATNQCTIDKNRRKSCQACRLRKCYEVGMMKGGIRKDRR GGRMLKHKRQRDDGEGRGEVGSAGDMRAANLWPSPLMIKRSK KNSLALSLTADQMVSALLDAEPPILYSEYDPTRPFSEASMMGLLT NLADRELVHMINWAKRVPGFVDLTLHDQVHLLECAWLEILMIG LVWRSMEHPGKLLFAPNLLLDRNQGKCVEGMVEIFDMLLATSS RFRMMNLQGEEFVCLKSIILLNSGVYTFLSSTLKSLEEKDHIHRV LDKITDTLIHLMAKAGLTLQQQHQRLAQLLLILSHIRHMSNKGM EHLYSMKCKNVVPLYDLLLEMLDAHRLHAPTSRGGASVEETDQSHLATAGSTSSHSLQKYYITGEAEG FPATV。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自***受体配体结合结构域的氨基酸序列或其变体。在一个具体例中，dTAG是衍生自氨基酸序列：(SEQ.ID.NO.:5)

SLALSLTADQMVSALLDAEPPILYSEYDPTRPFSEASMMGLLTNL ADRELVHMINWAKRVPGFVDLTLHDQVHLLECAWLEILMIGLV WRSMEHPGKLLFAPNLLLDRNQGKCVEGMVEIFDMLLATSSRF RMMNLQGEEFVCLKSIILLNSGVYTFLSSTLKSLEEKDHIHRVLD KITDTLIHLMAKAGLTLQQQHQRLAQLLLILSHIRHMSNKGMEH LYSMKCKNVVPLYDLLLE MLDAHRL。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自雄激素受体(UniProtKB- P10275(ANDR_HUMAN)，其通过引用方式并入本文)的氨基酸序列，或其变体。在一个具体例中，dTAG是衍生自氨基酸序列：(SEQ. ID.NO.:6)

MEVQLGLGRVYPRPPSKTYRGAFQNLFQSVREVIQNPGPRHPEA ASAAPPGASLLLLQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQQETSPRQ QQQQQGEDGSPQAHRRGPTGYLVLDEEQQPSQPQSALECHPERG CVPEPGAAVAASKGLPQQLPAPPDEDDSAAPSTLSLLGPTFPGLS SCSADLKDILSEASTMQLLQQQQQEAVSEGSSSGRAREASGAPTS SKDNYLGGTSTISDNAKELCKAVSVSMGLGVEALEHLSPGEQLR GDCMYAPLLGVPPAVRPTPCAPLAECKGSLLDDSAGKSTEDTAE YSPFKGGYTKGLEGESLGCSGSAAAGSSGTLELPSTLSLYKSGAL DEAAAYQSRDYYNFPLALAGPPPPPPPPHPHARIKLENPLDYGSA WAAAAAQCRYGDLASLHGAGAAGPGSGSPSAAASSSWHTLFTA EEGQLYGPCGGGGGGGGGGGGGGGGGGGG

GGGEAGAVAPYGYTRPPQGLAGQESDFTAPDVWYPGGMVSRVP YPSPTCVKSEMGPWMDSYSGPYGDMRLETARDHVLPIDYYFPP QKTCLICGDEASGCHYGALTCGSCKVFFKRAAEGKQKYLCASR NDCTIDKFRRKNCPSCRLRKCYEAGMTLGARKLKKLGNLKLQE EGEASSTTSPTEETTQKLTVSHIEGYECQPIFLNVLEAIEPGVVCA GHDNNQPDSFAALLSSLNELGERQLVHVVKWAKALPGFRNLHV DDQMAVIQYSWMGLMVFAMGWRSFTNVNSRMLYFAPDLVFNE YRMHKSRMYSQCVRMRHLSQEFGWLQITPQEFLCMKALLLFSII PVDGLKNQKFFDELRMNYIKELDRIIACKRKNPTSCSRRFYQLTK LLDSVQPIARELHQFTFDLLIKSHMVSVDFPEMMAEIISVQVPKILSGKVKPIYFHTQ。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自雄激素受体配体结合结构域的氨基酸序列，或其变体。在一个具体例中，dTAG是衍生自氨基酸序列：(SEQ.ID.NO.:10)

DNNQPDSFAALLSSLNELGERQLVHVVKWAKALPGFRNLHVDD QMAVIQYSWMGLMVFAMGWRSFTNVNSRMLYFAPDLVFNEYR MHKSRMYSQCVRMRHLSQEFGWLQITPQEFLCMKALLLFSIIPV DGLKNQKFFDELRMNYIKELDRIIACKRKNPTSCSRRFYQLTKLL DSVQPIARELHQFTFDLLIKSHMVSVDFPEMMAEIISVQVPKILSG KVKPIYFHT。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自视黄酸受体(UniProtKB- P19793)(RXRA_HUMAN)，其通过引用方式并入本文)的氨基酸序列或其变体。在一个具体例中，dTAG衍生自氨基酸序列：(SEQ.ID. NO.:7)

MDTKHFLPLDFSTQVNSSLTSPTGRGSMAAPSLHPSLGPGIGSPG QLHSPISTLSSPING MGPPFSVISSPMGPHSMSVPTTPTLGFSTGSPQLSSPMNPVSSSED IKPPLGLNGVLKVPAHPSGNMASFTKHICAICGDRSSGKHYGVY SCEGCKGFFKRTVRKDLTYTCRDNKDCLIDKRQRNRCQYCRYQ KCLAMGMKREAVQEERQRGKDRNENEVESTSSANEDMPVERIL EAELAVEPKTETYVEANMGLNPSSPNDPVTNICQAADKQLFTLV EWAKRIPHFSELPLDDQVILLRAGWNELLIASFSHRSIAVKDGILL ATGLHVHRNSAHSAGVGAIFDRVLTELVSKMRDMQMDKTELGC LRAIVLFNPDSKGLSNPAEVEALREKVYASLEAYCKHKYPEQPG RFAKLLLRLPALRSIGLKCLEHLFFFKLIGDTPIDTFLME MLEAPHQMT。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自视黄酸受体配体结合结构域的氨基酸序列，或其变体。在一个具体例中，dTAG是衍生自氨基酸序列：(SEQ.ID.NO.:11)

SANEDMPVERILEAELAVEPKTETYVEANMGLNPSSPNDPVTNIC QAADKQLFTLVEWAKRIPHFSELPLDDQVILLRAGWNELLIASFS HRSIAVKDGILLATGLHVHRNSAHSAGVGAIFDRVLTELVSKMR DMQMDKTELGCLRAIVLFNPDSKGLSNPAEVEALREKVYASLEA YCKHKYPEQPGRFAKLLLRLPALRSIGLKCLEHLFFFKLIGDTPID TFLME MLEAPHQM。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自DHFR，大肠杆菌， UniProtKB-Q79DQ2(Q79DQ2_ECOLX)的氨基酸序列(其通过引用并入本文)，或其变体。在一个具体例中，dTAG是衍生自氨基酸序列： (SEQ.ID.NO.:8)

MNSESVRIYLVAAMGANRVIGNGPNIPWKIPGEQKIFRRLTEGK VVVMGRKTFESIGKPLPNRHTLVISRQANYRATGCVVVSTLSHAI ALASELGNELYVAGGAEIYTLALPHAHGVFLSEVHQTFEGDAFF PMLNETEFELVSTETIQAVIPYTHSVYARRNG。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自视黄酸受体配体结合结构域的氨基酸序列或其变体。在一个具体例中，dTAG是衍生自氨基酸序列：(SEQ.ID.NO.:9)

MAEIGTGFPFDPHYVEVLGERMHYVDVGPRDGTPVLFLHGNPTS SYVWRNIIPHVAPTHRCIAPDLIGMGKSDKPDLGYFFDDHVRFM DAFIEALGLEEVVLVIHDWGSALGFHWAKRNPERVKGIAFMEFI RPIPTWDEWPEFARETFQAFRTTDVGRKLIIDQNVFIEGTLPMGV VRPLTEVEMDHYREPFLNPVDREPLWRFPNELPIAGEPANIVALV EEYMDWLHQSPVPKLLFWGTPGVLIPPAEAARLAKSLPNCKAV DIGPGLNLLQEDNPDLIGSEIARWLSTLEISG。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自MDM2的N-末端的氨基酸序列，或其变体。在一个具体例中，dTAG是衍生自氨基酸序列： (SEQ.ID.NO.:12)

MCNTNMSVPTDGAVTTSQIPASEQETLVRPKPLLLKLLKSVGAQ KDTYTMKEVLFYLGQYIMTKRLYDEKQQHIVYCSNDLLGDLFG VPSFSVKEHRKIYTMIYRNLVVV。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自凋亡调节因子Bcl-xL蛋白， UniProtKB-Q07817(B2CL1_HUMAN)(其通过引用方式并入本文)的氨基酸序列或其变体。在一个具体例中，dTAG是衍生自氨基酸序列：(SEQ.ID.NO.:16)

MSQSNRELVVDFLSYKLSQKGYSWSQFSDVEENRTEAPEGTESE METPSAINGNPSWHLADSPAVNGATGHSSSLDAREVIPMAAVKQ ALREAGDEFELRYRRAFSDLTSQLHITPGTAYQSFEQVVNELFRD GVNWGRIVAFFSFGGALCVESVDKEMQVLVSRIAAWMATYLND HLEPWIQENGGWDTFVELYGNNAAAESRKGQERFNRWFLTGMT VAGVVLLGSLFSRK。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自CD209抗原(UniProtKB- Q9NNX6(CD209_HUMAN，其通过引用并入本文)的氨基酸序列或其变体。在一个具体例中，dTAG是衍生自氨基酸序列：(SEQ.ID. NO.:17)

MSDSKEPRLQQLGLLEEEQLRGLGFRQTRGYKSLAGCLGHGPLV LQLLSFTLLAGLLVQVSKVPSSISQEQSRQDAIYQNLTQLKAAVG ELSEKSKLQEIYQELTQLKAAVGELPEKSKLQEIYQELTRLKAAV GELPEKSKLQEIYQELTWLKAAVGELPEKSKMQEIYQELTRLKA AVGELPEKSKQQEIYQELTRLKAAVGELPEKSKQQEIYQELTRLK AAVGELPEKSKQQEIYQELTQLKAAVERLCHPCPWEWTFFQGN CYFMSNSQRNWHDSITACKEVGAQLVVIKSAEEQNFLQLQSSRS NRFTWMGLSDLNQEGTWQWVDGSPLLPSFKQYWNRGEPNNVG EEDCAEFSGNGWNDDKCNLAKFWICKKSAASCSRDEEQFLSPAP ATPNPPPA。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自E3连接酶 XIAP(UniProtKB-P98170(XIAP_HUMAN)，其通过引用并入本文) 的氨基酸序列的或其变体。在一个具体例中，dTAG是衍生自氨基酸序列：(SEQ.ID.NO.:18)

MTFNSFEGSKTCVPADINKEEEFVEEFNRLKTFANFPSGSPVSAS TLARAGFLYTGEGDTVRCFSCHAAVDRWQYGDSAVGRHRKVSP NCRFINGFYLENSATQSTNSGIQNGQYKVENYLGSRDHFALDRP SETHADYLLRTGQVVDISDTIYPRNPAMYSEEARLKSFQNWPDY AHLTPRELASAGLYYTGIGDQVQCFCCGGKLKNWEPCDRAWSE HRRHFPNCFFVLGRNLNIRSESDAVSSDRNFPNSTNLPRNPSMAD YEARIFTFGTWIYSVNKEQLARAGFYALGEGDKVKCFHCGGGLT DWKPSEDPWEQHAKWYPGCKYLLEQKGQEYINNIHLTHSLEECLVRTTEKTPSLTRRIDDTIFQNPMVQEAIR

MGFSFKDIKKIMEEKIQISGSNYKSLEVLVADLVNAQKDSMQDE SSQTSLQKEISTEEQLRRLQEEKLCKICMDRNIAIVFVPCGHLVTC KQCAEAVDKCPMCYTVITFKQKIFMS。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自含杆状病毒IAP重复序列的蛋白质2(UniProtKB-Q13490(BIRC2_HUMAN)，其通过引用方式并入本文)的氨基酸序列或其变体。在一个具体例中，dTAG是衍生自氨基酸序列：(SEQ.ID.NO.:19)

MHKTASQRLFPGPSYQNIKSIMEDSTILSDWTNSNKQKMKYDFS CELYRMSTYSTFPAGVPVSERSLARAGFYYTGVNDKVKCFCCGL MLDNWKLGDSPIQKHKQLYPSCSFIQNLVSASLGSTSKNTSPMR NSFAHSLSPTLEHSSLFSGSYSSLSPNPLNSRAVEDISSSRTNPYSY AMSTEEARFLTYHMWPLTFLSPSELARAGFYYIGPGDRVACFAC GGKLSNWEPKDDAMSEHRRHFPNCPFLENSLETLRFSISNLSMQ THAARMRTFMYWPSSVPVQPEQLASAGFYYVGRNDDVKCFCC DGGLRCWESGDDPWVEHAKWFPRCEFLIRMKGQEFVDEIQGRY PHLLEQLLSTSDTTGEENADPPIIHFGPGESSSEDAVMMNTPVVK SALEMGFNRDLVKQTVQSKILTTGENYKTVNDIVSALLNAEDEK REEEKEKQAEEMASDDLSLIRKNRMALFQQLTCVLPILDNLLKA NVINKQEHDIIKQKTQIPLQARELIDTILVKGNAAANIFKNCLKEI DSTLYKNLFVDKNMKYIPTEDVSGLSLEEQLRRLQEERTCKVCM DKEVSVVFIPCGHLVVCQECAPSLRKCPICRGIIKGTVRTFLS。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自造血***素D合酶 (UniProtKB-O60760(HPGDS_HUMAN)，其通过引用方式并入本文) 的氨基酸序列或其变体。在一个具体例中，dTAG是衍生自氨基酸序列：(SEQ.ID.NO.:20)

MPNYKLTYFNMRGRAEIIRYIFAYLDIQYEDHRIEQADWPEIKST LPFGKIPILEVDGLTLHQSLAIARYLTKNTDLAGNTEMEQCHVDA IVDTLDDFMSCFPWAEKKQDVKEQMFNELLTYNAPHLMQDLDT YLGGREWLIGNSVTWADFYWEICSTTLLVFKPDLLDNHPRLVTL RKKVQAIPAVANWIKRRPQTKL。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自GTP酶k-RAS (UniProtKB-P01116(RASK_HUMAN)，其通过引用方式并入本文)的氨基酸序列或其变体。在一个具体例中，dTAG是衍生自氨基酸序列： (SEQ.ID.NO.:21)

MTEYKLVVVGAGGVGKSALTIQLIQNHFVDEYDPTIEDSYRKQV VIDGETCLLDILDTAGQEEYSAMRDQYMRTGEGFLCVFAINNTK SFEDIHHYREQIKRVKDSEDVPMVLVGNKCDLPSRTVDTKQAQD LARSYGIPFIETSAKTRQRVEDAFYTLVREIRQYRLKKISKEEKTP GCVKIKKCIIM。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自聚-ADP-核糖聚合酶 15(UniProtKB-Q460N3(PAR15_HUMAN)，其通过引用方式并入本文)的氨基酸序列或其变体。在一个具体例中，dTAG是衍生自氨基酸序列：(SEQ.ID.NO.:22)

MAAPGPLPAAALSPGAPTPRELMHGVAGVTSRAGRDREAGSVL PAGNRGARKASRRSSSRSMSRDNKFSKKDCLSIRNVVASIQTKE GLNLKLISGDVLYIWADVIVNSVPMNLQLGGGPLSRAFLQKAGP MLQKELDDRRRETEEKVGNIFMTSGCNLDCKAVLHAVAPYWN NGAETSWQIMANIIKKCLTTVEVLSFSSITFPMIGTGSLQFPKAVF AKLILSEVFEYSSSTRPITSPLQEVHFLVYTNDDEGCQAFLDEFTN WSRINPNKARIPMAGDTQGVVGTVSKPCFTAYEMKIGAITFQVA TGDIATEQVDVIVNSTARTFNRKSGVSRAILEGAGQAVESECAVL AAQPHRDFIITPGGCLKCKIIIHVPGGKDVRKTVTSVLEECEQRK YTSVSLPAIGTGNAGKNPITVADNIIDAIVDFSSQHSTPSLKTVKV VIFQPELLNIFYDSMKKRDLSASLNFQSTFSMTTCNLPEHWTDM NHQLFCMVQLEPGQSEYNTIKDKFTRTCSSYAIEKIERIQNAFLW QSYQVKKRQMDIKNDHKNNERLLFHGTDADSVPYVNQHGFNRS CAGKNAVSYGKGTYFAVDASYSAKDTYSKPDSNGRKHMYVVR VLTGVFTKGRAGLVTPPPKNPHNPTDLFDSVTNNTRSPKLFVVFF DNQAYPEYLITFTA。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自聚-ADP-核糖聚合酶 14(UniProtKB-Q460N5(PAR14_HUMAN)，其通过引用方式并入本文)的氨基酸序列或其变体。在一个具体例中，dTAG是衍生自氨基酸序列：(SEQ.ID.NO.:23)

MAVPGSFPLLVEGSWGPDPPKNLNTKLQMYFQSPKRSGGGECE VRQDPRSPSRFLVFFYPEDVRQKVLERKNHELVWQGKGTFKLTV QLPATPDEIDHVFEEELLTKESKTKEDVKEPDVSEELDTKLPLDG GLDKMEDIPEECENISSLVAFENLKANVTDIMLILLVENISGLSND DFQVEIIRDFDVAVVTFQKHIDTIRFVDDCTKHHSIKQLQLSPRLL EVTNTIRVENLPPGADDYSLKLFFENPYNGGGRVANVEYFPEESS ALIEFFDRKVLDTIMATKLDFNKMPLSVFPYYASLGTALYGKEK PLIKLPAPFEESLDLPLWKFLQKKNHLIEEINDEMRRCHCELTWS QLSGKVTIRPAATLVNEGRPRIKTWQADTSTTLSSIRSKYKVNPI KVDPTMWDTIKNDVKDDRILIEFDTLKEMVILAGKSEDVQSIEV QVRELIESTTQKIKREEQSLKEKMIISPGRYFLLCHSSLLDHLLTE CPEIEICYDRVTQHLCLKGPSADVYKAKCEIQEKVYTMAQKNIQ VSPEIFQFLQQVNWKEFSKCLFIAQKILALYELEGTTVLLTSCSSE ALLEAEKQMLSALNYKRIEVENKEVLHGKKWKGLTHNLLKKQN SSPNTVIINELTSETTAEVIITGCVKEVNETYKLLFNFVEQNMKIE RLVEVKPSLVIDYLKTEKKLFWPKIKKVNVQVSFNPENKQKGIL LTGSKTEVLKAVDIVKQVWDSVCVKSVHTDKPGAKQFFQDKAR FYQSEIKRLFGCYIELQENEVMKEGGSPAGQKCFSRTVLAPGVV LIVQQGDLARLPVDVVVNASNEDLKHYGGLAAALSKAAGPELQ ADCDQIVKREGRLLPGNATISKAGKLPYHHVIHAVGPRWSGYEA PRCVYLLRRAVQLSLCLAEKYKYRSIAIPAISSGVFGFPLGRCVET IVSAIKENFQFKKDGHCLKEIYLVDVSEKTVEAFAEAVKTVFKAT LPDTAAPPGLPPAAAGPGKTSWEKGSLVSPGGLQ

MLLVKEGVQNAKTDVVVNSVPLDLVLSRGPLSKSLLEKAGPEL QEELDTVGQGVAVS

MGTVLKTSSWNLDCRYVLHVVAPEWRNGSTSSLKIMEDIIRECM EITESLSLKSIAFPAIGTGNLGFPKNIFAELIISEVFKFSSKNQLKTL QEVHFLLHPSDHENIQAFSDEFARRANGNLVSDKIPKAKDTQGF YGTVSSPDSGVYEMKIGSIIFQVASGDITKEEADVIVNSTSNSFNL KAGVSKAILECAGQNVERECSQQAQQRKNDYIITGGGFLRCKNII HVIGGNDVKSSVSSVLQECEKKNYSSICLPAIGTGNAKQHPDKV AEAIIDAIEDFVQKGSAQSVKKVKVVIFLPQVLDVFYANMKKRE GTQLSSQQSVMSKLASFLGFSKQSPQKKNHLVLEKKTESATFRV CGENVTCVEYAISWLQDLIEKEQCPYTSEDECIKDFDEKEYQELN ELQKKLNINISLDHKRPLIKVLGISRDVMQARDEIEAMIKRVRLA KEQESRADCISEFIEWQYNDNNTSHCFNKMTNLKLEDARREKKK TVDVKINHRHYTVNLNTYTATDTKGHSLSVQRLTKSKVDIPAH WSDMKQQNFCVVELLPSDPEYNTVASKFNQTCSHFRIEKIERIQN PDLWNSYQAKKKTMDAKNGQTMNEKQLFHGTDAGSVPHVNRN GFNRSYAGKNAVAYGKGTYFAVNANYSANDTYSRPDANGRKH VYYVRVLTGIYTHGNHSLIVPPSKNPQNPTDLYDTVTDNVHHPS LFVAFYDYQAYPEYLITFRK。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自超氧化物歧化酶 (UniProtKB-P00441(SODC_HUMAN)，其通过引用方式并入本文)的氨基酸序列或其变体。在一个具体例中，dTAG是衍生自氨基酸序列： (SEQ.ID.NO.:24)

MATKAVCVLKGDGPVQGIINFEQKESNGPVKVWGSIKGLTEGLH GFHVHEFGDNTAGCTSAGPHFNPLSRKHGGPKDEERHVGDLGN VTADKDGVADVSIEDSVISLSGDHCIIGRTLVVHEKADDLGKGGNEESTKTGNAGSRLACGVIGIAQ。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自视黄醛视紫红质敏感性 cGMP 3',5'-环磷酸二酯酶亚基δ(UniProtKB- O43924(PDE6D_HUMAN)，其通过引用方式并入本文)的氨基酸序列或其变体。在一个具体例中，dTAG是衍生自氨基酸序列：(SEQ. ID.NO.:25)

MSAKDERAREILRGFKLNWMNLRDAETGKILWQGTEDLSVPGV EHEARVPKKILKCKAVSRELNFSSTEQMEKFRLEQKVYFKGQCL EEWFFEFGFVIPNSTNTWQSLIEAAPESQMMPASVLTGNVIIETKFFDDDLLVSTSRVRLFYV。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自诱导的髓样白血病细胞分化蛋白Mcl-1(UniProtKB-Q07820(MCL1_HUMAN)，其通过引用并入本文)的氨基酸序列的或其变体。在一个具体例中，dTAG是衍生自氨基酸序列：(SEQ.ID.NO.:26)

MFGLKRNAVIGLNLYCGGAGLGAGSGGATRPGGRLLATEKEAS ARREIGGGEAGAVIGGSAGASPPSTLTPDSRRVARPPPIGAEVPD VTATPARLLFFAPTRRAAPLEEMEAPAADAIMSPEEELDGYEPEP LGKRPAVLPLLELVGESGNNTSTDGSLPSTPPPAEEEEDELYRQS LEIISRYLREQATGAKDTKPMGRSGATSRKALETLRRVGDGVQR NHETAFQGMLRKLDIKNEDDVKSLSRVMIHVFSDGVTNWGRIV TLISFGAFVAKHLKTINQESCIEPLAESITDVLVRTKRDWLVKQR GWDGFVEFFHVEDLEGGIRNVLLAFAGVAGVGAGLAYLIR。

在一个实施方案中，dTAG具有衍生自凋亡调节因子Bcl- 2(UniProtKB-Q07820(BCL2_HUMAN)，其通过引用并入本文)的氨基酸序列或其变体。在一个实施方案中，dTAG衍生自氨基酸序列： (SEQ.ID.NO.:27)

MAHAGRTGYDNREIVMKYIHYKLSQRGYEWDAGDVGAAPPGA APAPGIFSSQPGHTPHPAASRDPVARTSPLQTPAAPGAAAGPALS PVPPVVHLTLRQAGDDFSRRYRRDFAEMSSQLHLTPFTARGRFA TVVEELFRDGVNWGRIVAFFEFGGVMCVESVNREMSPLVDNIAL WMTEYLNRHLHTWIQDNGGWDAFVELYGPSMRPLFDFSWLSLKTLLSLALVGACITLGAYLGHK。

在一个实施方案中，dTAG具有衍生自肽基-脯氨酰基顺反异构酶NIMA相互作用1(UniProtKB-Q13526(PIN1_HUMAN)，其通过引用并入本文)的氨基酸序列，或其变体。在一个实施方案中， dTAG是衍生自氨基酸序列：(SEQ.ID.NO.:28)

MADEEKLPPGWEKRMSRSSGRVYYFNHITNASQWERPSGNSSS GGKNGQGEPARVRCSHLLVKHSQSRRPSSWRQEKITRTKEEALE LINGYIQKIKSGEEDFESLASQFSDCSSAKARGDLGAFSRGQMQKPFEDASFALRTGEMSGPVFTDSGIHIILRTE。

在一个实施方案中，dTAG具有衍生自端锚聚合酶 1(UniProtKB-O95271(TNKS1_HUMAN)，其通过引用并入本文)的氨基酸序列或其变体。在一个实施方案中，dTAG是衍生自氨基酸序列：(SEQ.ID.NO.:29)

MAASRRSQHHHHHHQQQLQPAPGASAPPPPPPPPLSPGLAPGTTP ASPTASGLAPFASPRHGLALPEGDGSRDPPDRPRSPDPVDGTSCC STTSTICTVAAAPVVPAVSTSSAAGVAPNPAGSGSNNSPSSSSSPT SSSSSSPSSPGSSLAESPEAAGVSSTAPLGPGAAGPGTGVPAVSGA LRELLEACRNGDVSRVKRLVDAANVNAKDMAGRKSSPLHFAAG FGRKDVVEHLLQ

MGANVHARDDGGLIPLHNACSFGHAEVVSLLLCQGADPNARDN WNYTPLHEAAIKGKIDVCIVLLQHGADPNIRNTDGKSALDLADP SAKAVLTGEYKKDELLEAARSGNEEKLMALLTPLNVNCHASDG RKSTPLHLAAGYNRVRIVQLLLQHGADVHAKDKGGLVPLHNAC SYGHYEVTELLLKHGACVNAMDLWQFTPLHEAASKNRVEVCSLLLSHGADPTLVNCHGKSAVDMAPTPELRERLTYEFKGHSLLQAA READLAKVKKTLALEIINFKQPQSHETALHCAVASLHPKRKQVT ELLLRKGANVNEKNKDFMTPLHVAAERAHNDVMEVLHKHGAK MNALDTLGQTALHRAALAGHLQTCRLLLSYGSDPSIISLQGFTA AQMGNEAVQQILSESTPIRTSDVDYRLLEASKAGDLETVKQLCS SQNVNCRDLEGRHSTPLHFAAGYNRVSVVEYLLHHGADVHAKD KGGLVPLHNACSYGHYEVAELLVRHGASVNVADLWKFTPLHEA AAKGKYEICKLLLKHGADPTKKNRDGNTPLDLVKEGDTDIQDLL RGDAALLDAAKKGCLARVQKLCTPENINCRDTQGRNSTPLHLA AGYNNLEVAEYLLEHGADVNAQDKGGLIPLHNAASYGHVDIAA LLIKYNTCVNATDKWAFTPLHEAAQKGRTQLCALLLAHGADPT MKNQEGQTPLDLATADDIRALLIDAMPPEALPTCFKPQATVVSASLISPASTPSCLSAASSIDNLTGPLAELAVGGASNAGDGAAGTER KEGEVAGLDMNISQFLKSLGLEHLRDIFETEQITLDVLADMGHEE LKEIGINAYGHRHKLIKGVERLLGGQQGTNPYLTFHCVNQGTILL DLAPEDKEYQSVEEEMQSTIREHRDGGNAGGIFNRYNVIRIQKV VNKKLRERFCHRQKEVSEENHNHHNERMLFHGSPFINAIIHKGFDERHAYIGGMFGAGIYFAENSSKSNQYVYGIGGGTGCPTHKDRS CYICHRQMLFCRVTLGKSFLQFSTMKMAHAPPGHHSVIGRPSVN GLAYAEYVIYRGEQAYPEYLITYQIMKPEAPSQTATAAEQKT。

在一个实施方案中，dTAG具有衍生自端锚聚合酶 2(UniProtKB-O9H2K2(TNKS2_HUMAN)，其通过引用并入本文)的氨基酸序列或其变体。在一个实施方案中，dTAG是衍生自氨基酸序列：(SEQ.ID.NO.:30)

MSGRRCAGGGAACASAAAEAVEPAARELFEACRNGDVERVKRL VTPEKVNSRDTAGRKSTPLHFAAGFGRKDVVEYLLQNGANVQA RDDGGLIPLHNACSFGHAEVVNLLLRHGADPNARDNWNYTPLH EAAIKGKIDVCIVLLQHGAEPTIRNTDGRTALDLADPSAKAVLTG EYKKDELLESARSGNEEKMMALLTPLNVNCHASDGRKSTPLHLAAGYNRVKIVQLLLQHGADVHAKDKGDLVPLHNACSYGHYEV TELLVKHGACVNAMDLWQFTPLHEAASKNRVEVCSLLLSYGAD PTLLNCHNKSAIDLAPTPQLKERLAYEFKGHSLLQAAREADVTRI KKHLSLEMVNFKHPQTHETALHCAAASPYPKRKQICELLLRKGA NINEKTKEFLTPLHVASEKAHNDVVEVVVKHEAKVNALDNLGQ TSLHRAAYCGHLQTCRLLLSYGCDPNIISLQGFTALQMGNENVQ QLLQEGISLGNSEADRQLLEAAKAGDVETVKKLCTVQSVNCRDI EGRQSTPLHFAAGYNRVSVVEYLLQHGADVHAKDKGGLVPLHN ACSYGHYEVAELLVKHGAVVNVADLWKFTPLHEAAAKGKYEIC KLLLQHGADPTKKNRDGNTPLDLVKDGDTDIQDLLRGDAALLD AAKKGCLARVKKLSSPDNVNCRDTQGRHSTPLHLAAGYNNLEV AEYLLQHGADVNAQDKGGLIPLHNAASYGHVDVAALLIKYNACVNATDKWAFTPLHEAAQKGRTQLCALLLAHGADPTLKNQEGQT PLDLVSADDVSALLTAAMPPSALPSCYKPQVLNGVRSPGATADA LSSGPSSPSSLSAASSLDNLSGSFSELSSVVSSSGTEGASSLEKKEV PGVDFSITQFVRNLGLEHLMDIFEREQITLDVLVEMGHKELKEIGI NAYGHRHKLIKGVERLISGQQGLNPYLTLNTSGSGTILIDLSPDDKEFQSVEEEMQSTVREHRDGGHAGGIFNRYNILKIQKVCNKKLW ERYTHRRKEVSEENHNHANERMLFHGSPFVNAIIHKGFDERHAY IGGMFGAGIYFAENSSKSNQYVYGIGGGTGCPVHKDRSCYICHR QLLFCRVTLGKSFLQFSAMKMAHSPPGHHSVTGRPSVNGLALAE YVIYRGEQAYPEYLITYQIMRPEGMVDG。

在一个实施方案中，dTAG具有衍生自7,8-二氢-8-氧鸟嘌呤三磷酸酶(UniProtKB-P36639(8ODP_HUMAN)，其通过引用并入本文)的氨基酸序列的或其变体。在一个实施方案中，dTAG是衍生自氨基酸序列：(SEQ.ID.NO.:31)

MYWSNQITRRLGERVQGFMSGISPQQMGEPEGSWSGKNPGTMG ASRLYTLVLVLQPQRVLLGMKKRGFGAGRWNGFGGKVQEGETI EDGARRELQEESGLTVDALHKVGQIVFEFVGEPELMDVHVFCTD SIQGTPVESDEMRPCWFQLDQIPFKDMWPDDSYWFPLLLQKKKF HGYFKFQGQDTILDYTLREVDTV。

在一个实施方案中，dTAG具有衍生自原癌基因酪氨酸蛋白激酶 Src(UniProtKB-P12931(SRC_HUMAN)，其通过引用并入本文)的氨基酸序列的或其变体。在一个实施方案中，dTAG是衍生自氨基酸序列：(SEQ.ID.NO.:32)

MGSNKSKPKDASQRRRSLEPAENVHGAGGGAFPASQTPSKPASA DGHRGPSAAFAPAAAEPKLFGGFNSSDTVTSPQRAGPLAGGVTT FVALYDYESRTETDLSFKKGERLQIVNNTEGDWWLAHSLSTGQT GYIPSNYVAPSDSIQAEEWYFGKITRRESERLLLNAENPRGTFLV RESETTKGAYCLSVSDFDNAKGLNVKHYKIRKLDSGGFYITSRT QFNSLQQLVAYYSKHADGLCHRLTTVCPTSKPQTQGLAKDAWE IPRESLRLEVKLGQGCFGEVWMGTWNGTTRVAIKTLKPGTMSPE AFLQEAQVMKKLRHEKLVQLYAVVSEEPIYIVTEYMSKGSLLDF LKGETGKYLRLPQLVDMAAQIASGMAYVERMNYVHRDLRAAN ILVGENLVCKVADFGLARLIEDNEYTARQGAKFPIKWTAPEAALYGRFTIKSDVWSFGILLTELTTKGRVPYPGMVNREVLDQVERGY RMPCPPECPESLHDLMCQCWRKEPEERPTFEYLQAFLEDYFTSTE PQYQPGENL。

在一个具体例中，dTAG包括在氨基酸位置341处用甘氨酸(G) 或丙氨酸(A)取代苏氨酸(T)。在一个具体例中，dTAG是衍生自SEQ ID NO.:62的氨基酸序列或其片段。

LRLEVKLGQGCFGEVWMGTWNGTTRVAIKTLKPGTMSPEAFLQ EAQVMKKLRHEKLVQLYAVVSEEPIYIVTEYGSKGSLLDFLKGE TGKYLRLPQLVDMAAQIASGMAYVERMNYVHRDLRAANILVG ENLVCKVADFGLARLIEDNEYTARQGAKFPIKWTAPEAALYGRF TIKSDVWSFGILLTELTTKGRVPYPGMVNREVLDQVERGYRMPCPPECPESLHDLMCQCWRKEPEERPTFEYLQAFLEDYF。

在一个具体例中，dTAG是衍生自SEQ.ID.NO.:63的氨基酸序列或其片段。

LRLEVKLGQGCFGEVWMGTWNGTTRVAIKTLKPGTMSPEAFLQ EAQVMKKLRHEKLVQLYAVVSEEPIYIVTEYASKGSLLDFLKGE TGKYLRLPQLVDMAAQIASGMAYVERMNYVHRDLRAANILVG ENLVCKVADFGLARLIEDNEYTARQGAKFPIKWTAPEAALYGRF TIKSDVWSFGILLTELTTKGRVPYPGMVNREVLDQVERGYRMPCPPECPESLHDLMCQCWRKEPEERPTFEYLQAFLEDYF。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自***素E合酶 (UniProtKB-O14684(PTGES_HUMAN)，其通过引用并入本文)的氨基酸序列或其变体。在一个具体例中，dTAG是衍生自氨基酸序列： (SEQ.ID.NO.:33)

MPAHSLVMSSPALPAFLLCSTLLVIKMYVVAIITGQVRLRKKAFA NPEDALRHGGPQYCRSDPDVERCLRAHRNDMETIYPFLFLGFVY SFLGPNPFVAWMHFLVFLVGRVAHTVAYLGKLRAPIRSVTYTLAQLPCASMALQILWEAARHL。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自花生四烯酸5-脂氧合酶活化蛋白(UniProtKB-P20292(AL5AP_HUMAN)，其通过引用并入本文) 的氨基酸序列或其变体。在一个具体例中，dTAG是衍生自氨基酸序列：(SEQ.ID.NO.:34)

MDQETVGNVVLLAIVTLISVVQNGFFAHKVEHESRTQNGRSFQR TGTLAFERVYTANQNCVDAYPTFLAVLWSAGLLCSQVPAAFAG LMYLFVRQKYFVGYLGERTQSTPGYIFGKRIILFLFLMSVAGIFNYYLIFFFGSDFENYIKTISTTISPLLLIP。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自脂肪细胞的脂肪酸结合蛋白 (UniProtKB-P15090(FABP4_HUMAN)，其通过引用并入本文)的氨基酸序列或其变体。在一个具体例中，dTAG是衍生自氨基酸序列： (SEQ.ID.NO.:35)

MCDAFVGTWKLVSSENFDDYMKEVGVGFATRKVAGMAKPNMI ISVNGDVITIKSESTFKNTEISFILGQEFDEVTADDRKVKSTITLDG GVLVHVQKWDGKSTTIKRKREDDKLVVECVMKGVTSTRVYER A。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自PH相互作用蛋白 (UniProtKB-Q8WWQ0(PHIP_HUMAN)，其通过引用并入本文)的氨基酸序列或其变体。在一个具体例中，dTAG是衍生自氨基酸序列： (SEQ.ID.NO.:36)

MSCERKGLSELRSELYFLIARFLEDGPCQQAAQVLIREVAEKELL PRRTDWTGKEHPRTYQNLVKYYRHLAPDHLLQICHRLGPLLEQE IPQSVPGVQTLLGAGRQSLLRTNKSCKHVVWKGSALAALHCGR PPESPVNYGSPPSIADTLFSRKLNGKYRLERLVPTAVYQHMKMH KRILGHLSSVYCVTFDRTGRRIFTGSDDCLVKIWATDDGRLLATL RGHAAEISDMAVNYENTMIAAGSCDKMIRVWCLRTCAPLAVLQ GHSASITSLQFSPLCSGSKRYLSSTGADGTICFWLWDAGTLKINP RPAKFTERPRPGVQMICSSFSAGGMFLATGSTDHIIRVYFFGSGQ PEKISELEFHTDKVDSIQFSNTSNRFVSGSRDGTARIWQFKRREW KSILLDMATRPAGQNLQGIEDKITKMKVTMVAWDRHDNTVITA VNNMTLKVWNSYTGQLIHVLMGHEDEVFVLEPHPFDPRVLFSA GHDGNVIVWDLARGVKIRSYFNMIEGQGHGAVFDCKCSPDGQH FACTDSHGHLLIFGFGSSSKYDKIADQMFFHSDYRPLIRDANNFV LDEQTQQAPHLMPPPFLVDVDGNPHPSRYQRLVPGRENCREEQL IPQMGVTSSGLNQVLSQQANQEISPLDSMIQRLQQEQDLRRSGEAVISNTSRLSRGSISSTSEVHSPPNVGLRRSGQIEGVRQMHSNAPRS EIATERDLVAWSRRVVVPELSAGVASRQEEWRTAKGEEEIKTYR SEEKRKHLTVPKENKIPTVSKNHAHEHFLDLGESKKQQTNQHNY RTRSALEETPRPSEEIENGSSSSDEGEVVAVSGGTSEEEERAWHS DGSSSDYSSDYSDWTADAGINLQPPKKVPKNKTKKAESSSDEEEESEKQKQKQIKKEKKKVNEEKDGPISPKKKKPKERKQKRLAVGE LTENGLTLEEWLPSTWITDTIPRRCPFVPQMGDEVYYFRQGHEA YVEMARKNKIYSINPKKQPWHKMELREQELMKIVGIKYEVGLPT LCCLKLAFLDPDTGKLTGGSFTMKYHDMPDVIDFLVLRQQFDD AKYRRWNIGDRFRSVIDDAWWFGTIESQEPLQLEYPDSLFQCYN VCWDNGDTEKMSPWDMELIPNNAVFPEELGTSVPLTDGECRSLI YKPLDGEWGTNPRDEECERIVAGINQLMTLDIASAFVAPVDLQA YPMYCTVVAYPTDLSTIKQRLENRFYRRVSSLMWEVRYIEHNTR TFNEPGSPIVKSAKFVTDLLLHFIKDQTCYNIIPLYNSMKKKVLSD SEDEEKDADVPGTSTRKRKDHQPRRRLRNRAQSYDIQAWKKQC EELLNLIFQCEDSEPFRQPVDLLEYPDYRDIIDTPMDFATVRETLE AGNYESPMELCKDVRLIFSNSKAYTPSKRSRIYSMSLRLSAFFEE HISSVLSDYKSALRFHKRNTITKRRKKRNRSSSVSSSAASSPERK KRILKPQLKSESSTSAFSTPTRSIPPRHNAAQINGKTESSSVVRTRS NRVVVDPVVTEQPSTSSAAKTFITKANASAIPGKTILENSVKHSK ALNTLSSPGQSSFSHGTRNNSAKENMEKEKPVKRKMKSSVLPKA STLSKSSAVIEQGDCKNNALVPGTIQVNGHGGQPSKLVKRGPGR KPKVEVNTNSGEIIHKKRGRKPKKLQYAKPEDLEQNNVHPIRDE VLPSSTCNFLSETNNVKEDLLQKKNRGGRKPKRKMKTQKLDAD LLVPASVKVLRRSNRKKIDDPIDEEEEFEELKGSEPHMRTRNQGR RTAFYNEDDSEEEQRQLLFEDTSLTFGTSSRGRVRKLTEKAKAN LIGW。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自SUMO-缀合酶UBC9 (UniProtKB-P63279(UBC9_HUMAN)，其通过引用并入本文)的氨基酸序列或其变体。在一个具体例中，dTAG是衍生自氨基酸序列： (SEQ.ID.NO.:37)

MSGIALSRLAQERKAWRKDHPFGFVAVPTKNPDGTMNLMNWE CAIPGKKGTPWEGGLFKLRMLFKDDYPSSPPKCKFEPPLFHPNV YPSGTVCLSILEEDKDWRPAITIKQILLGIQELLNEPNIQDPAQAEAYTIYCQNRVEYEKRVRAQAKKFAPS。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自蛋白质S100-A7 (UniProtKB-P31151(S10A7_HUMAN)，其通过引用并入本文)的氨基酸序列或其变体。在一个具体例中，dTAG是衍生自氨基酸序列： (SEQ.ID.NO.:38)

MSNTQAERSIIGMIDMFHKYTRRDDKIEKPSLLTMMKENFPNFLS ACDKKGTNYLADVFEKKDKNEDKKIDFSEFLSLLGDIATDYHKQ SHGAAPCSGGSQ。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自磷脂酶A2(膜结合的 UniProtKB-P14555(PA2GA_HUMAN)，其通过引用并入本文)的氨基酸序列或其变体。在一个具体例中，dTAG是衍生自氨基酸序列： (SEQ.ID.NO.:39)

MKTLLLLAVIMIFGLLQAHGNLVNFHRMIKLTTGKEAALSYGFY GCHCGVGGRGSPKDATDRCCVTHDCCYKRLEKRGCGTKFLSYK FSNSGSRITCAKQDSCRSQLCECDKAAATCFARNKTTYNKKYQYYSNKHCRGSTPRC。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自组蛋白脱乙酰酶6 (UniProtKB-Q9UBN7(HDAC6_HUMAN)，其通过引用并入本文)的氨基酸序列或其变体。在一个具体例中，dTAG是衍生自氨基酸序列：(SEQ.ID.NO.:40)

MTSTGQDSTTTRQRRSRQNPQSPPQDSSVTSKRNIKKGAVPRSIP NLAEVKKKGKMKKLGQAMEEDLIVGLQGMDLNLEAEALAGTG LVLDEQLNEFHCLWDDSFPEGPERLHAIKEQLIQEGLLDRCVSFQ ARFAEKEELMLVHSLEYIDLMETTQYMNEGELRVLADTYDSVY LHPNSYSCACLASGSVLRLVDAVLGAEIRNGMAIIRPPGHHAQH SLMDGYCMFNHVAVAARYAQQKHRIRRVLIVDWDVHHGQGTQ FTFDQDPSVLYFSIHRYEQGRFWPHLKASNWSTTGFGQGQGYTI NVPWNQVGMRDADYIAAFLHVLLPVALEFQPQLVLVAAGFDALQGDPKGEMAATPAGFAQLTHLL

MGLAGGKLILSLEGGYNLRALAEGVSASLHTLLGDPCP MLESPGAPCRSAQASVSCALEALEPFWEVLVRSTETVERDNMEE DNVEESEEEGPWEPPVLPILTWPVLQSRTGLVYDQNMMNHCNL WDSHHPEVPQRILRIMCRLEELGLAGRCLTLTPRPATEAELLTCH SAEYVGHLRATEKMKTRELHRESSNFDSIYICPSTFACAQLATGAACRLVEAVLSGEVLNGAAVVRPPGHHAEQDAACGFCFFNSVAV AARHAQTISGHALRILIVDWDVHHGNGTQHMFEDDPSVLYVSL HRYDHGTFFPMGDEGASSQIGRAAGTGFTVNVAWNGPRMGDA DYLAAWHRLVLPIAYEFNPELVLVSAGFDAARGDPLGGCQVSPE GYAHLTHLLMGLASGRIILILEGGYNLTSISESMAACTRSLLGDPP PLLTLPRPPLSGALASITETIQVHRRYWRSLRVMKVEDREGPSSS KLVTKKAPQPAKPRLAERMTTREKKVLEAG

MGKVTSASFGEESTPGQTNSETAVVALTQDQPSEAATGGATLAQ TISEAAIGGAMLGQTTSEEAVGGATPDQTTSEETVGGAILDQTTS EDAVGGATLGQTTSEEAVGGATLAQTTSEAAMEGATLDQTTSE EAPGGTELIQTPLASSTDHQTPPTSPVQGTTPQISPSTLIGSLRTLE LGSESQGASESQAPGEENLLGEAAGGQDMADSMLMQGSRGLTD QAIFYAVTPLPWCPHLVAVCPIPAAGLDVTQPCGDCGTIQENWV CLSCYQVYCGRYINGHMLQHHGNSGHPLVLSYIDLSAWCYYCQ AYVHHQALLDVKNIAHQNKFGEDMPHPH。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自前蛋白原(UniProtKB- P07602(SAP_HUMAN)，其通过引用并入本文)的氨基酸序列或其变体。在一个具体例中，dTAG是衍生自氨基酸序列：(SEQ.ID.NO.: 41)

MYALFLLASLLGAALAGPVLGLKECTRGSAVWCQNVKTASDCG AVKHCLQTVWNKPTVKSLPCDICKDVVTAAGDMLKDNATEEEI LVYLEKTCDWLPKPNMSASCKEIVDSYLPVILDIIKGEMSRPGEV CSALNLCESLQKHLAELNHQKQLESNKIPELDMTEVVAPFMANI PLLLYPQDGPRSKPQPKDNGDVCQDCIQMVTDIQTAVRTNSTFV QALVEHVKEECDRLGPGMADICKNYISQYSEIAIQMMMHMQPK EICALVGFCDEVKEMPMQTLVPAKVASKNVIPALELVEPIKKHE VPAKSDVYCEVCEFLVKEVTKLIDNNKTEKEILDAFDKMCSKLP KSLSEECQEVVDTYGSSILSILLEEVSPELVCSMLHLCSGTRLPAL TVHVTQPKDGGFCEVCKKLVGYLDRNLEKNSTKQEILAALEKGCSFLPDPYQKQCDQFVAEYEPVLIEILVEVMDPSFVCLKIGACPS AHKPLLGTEKCIWGPSYWCQNTETAAQCNAVEHCKRHVWN。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自载脂蛋白a(UniProtKB- P08519(APOA_HUMAN)，其通过引用并入本文)的氨基酸序列或其变体。在一个具体例中，dTAG是衍生自氨基酸序列：(SEQ.ID. NO.:42)

MEHKEVVLLLLLFLKSAAPEQSHVVQDCYHGDGQSYRGTYSTT VTGRTCQAWSSMTPHQHNRTTENYPNAGLIMNYCRNPDAVAAP YCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQ APTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHS HSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGN GQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNY CRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVT PVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTC QAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRD PGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQR PGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPE YYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDA EGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRG TYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDA VAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLE APSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRW EYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQEC YHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAG LIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVA PPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVT GRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYC YTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAP TEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHS RTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQ CSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQ SYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCR NPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPV PSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQA WSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPG VRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPG VQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYY PNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEG TAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTY STTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAV AAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAP SEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMT PHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEY CNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECY HGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLI MNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAP PTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVT GRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYC YTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAP TEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHS RTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQ CSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQ SYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCR NPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPV PSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQA WSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPG VRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPG VQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYY PNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEG TAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTY STTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAV AAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMT PHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEY CNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECY HGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLI MNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAP PTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVT GRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYC YTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAP TEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHS RTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQ CSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQ SYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPV PSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQA WSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPG VRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPG VQECYHGNGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYY PNAGLIMNYCRNPDAVAAPYCYTRDPGVRWEYCNLTQCSDAEG TAVAPPTVTPVPSLEAPSEQAPTEQRPGVQECYHGNGQSYRGTY STTVTGRTCQAWSSMTPHSHSRTPEYYPNAGLIMNYCRNPDPVA APYCYTRDPSVRWEYCNLTQCSDAEGTAVAPPTITPIPSLEAPSE QAPTEQRPGVQECYHGNGQSYQGTYFITVTGRTCQAWSSMTPH SHSRTPAYYPNAGLIKNYCRNPDPVAAPWCYTTDPSVRWEYCN LTRCSDAEWTAFVPPNVILAPSLEAFFEQALTEETPGVQDCYYH YGQSYRGTYSTTVTGRTCQAWSSMTPHQHSRTPENYPNAGLTR NYCRNPDAEIRPWCYTMDPSVRWEYCNLTQCLVTESSVLATLT VVPDPSTEASSEEAPTEQSPGVQDCYHGDGQSYRGSFSTTVTGR TCQSWSSMTPHWHQRTTEYYPNGGLTRNYCRNPDAEISPWCYT MDPNVRWEYCNLTQCPVTESSVLATSTAVSEQAPTEQSPTVQDC YHGDGQSYRGSFSTTVTGRTCQSWSSMTPHWHQRTTEYYPNGG LTRNYCRNPDAEIRPWCYTMDPSVRWEYCNLTQCPVMESTLLT TPTVVPVPSTELPSEEAPTENSTGVQDCYRGDGQSYRGTLSTTIT GRTCQSWSSMTPHWHRRIPLYYPNAGLTRNYCRNPDAEIRPWC YTMDPSVRWEYCNLTRCPVTESSVLTTPTVAPVPSTEAPSEQAPP EKSPVVQDCYHGDGRSYRGISSTTVTGRTCQSWSSMIPHWHQRT PENYPNAGLTENYCRNPDSGKQPWCYTTDPCVRWEYCNLTQCS ETESGVLETPTVVPVPSMEAHSEAAPTEQTPVVRQCYHGNGQSY RGTFSTTVTGRTCQSWSSMTPHRHQRTPENYPNDGLTMNYCRN PDADTGPWCFTMDPSIRWEYCNLTRCSDTEGTVVAPPTVIQVPS LGPPSEQDCMFGNGKGYRGKKATTVTGTPCQEWAAQEPHRHST FIPGTNKWAGLEKNYCRNPDGDINGPWCYTMNPRKLFDYCDIPLCASSSFDCGKPQVEPKKCPGSIVGGCVAHPHSWPWQVSLRTRFG KHFCGGTLISPEWVLTAAHCLKKSSRPSSYKVILGAHQEVNLESH VQEIEVSRLFLEPTQADIALLKLSRPAVITDKVMPACLPSPDYMV TARTECYITGWGETQGTFGTGLLKEAQLLVIENEVCNHYKYICA EHLARGTDSCQGDSGGPLVCFEKDKYILQGVTSWGLGCARPNKPGVYARVSRFVTWIEGMMRNN。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自乳谷胱甘肽裂解酶 (UniProtKB-Q04760(LGUL_HUMAN)，其通过引用并入本文)的氨基酸序列或其变体。在一个具体例中，dTAG是衍生自氨基酸序列： (SEQ.ID.NO.:43)

MAEPQPPSGGLTDEAALSCCSDADPSTKDFLLQQTMLRVKDPKK SLDFYTRVLGMTLIQKCDFPIMKFSLYFLAYEDKNDIPKEKDEKI AWALSRKATLELTHNWGTEDDETQSYHNGNSDPRGFGHIGIAVP DVYSACKRFEELGVKFVKKPDDGKMKGLAFIQDPDGYWIEILNP NKMATLM。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自蛋白质afadin(UniProtKB- P55196(AFAD_HUMAN)，其通过引用并入本文)的氨基酸序列或其变体。在一个具体例中，dTAG是衍生自氨基酸序列：(SEQ.ID. NO.:44)

MSAGGRDEERRKLADIIHHWNANRLDLFEISQPTEDLEFHGVMR FYFQDKAAGNFATKCIRVSSTATTQDVIETLAEKFRPDMRMLSSP KYSLYEVHVSGERRLDIDEKPLVVQLNWNKDDREGRFVLKNEN DAIPPKKAQSNGPEKQEKEGVIQNFKRTLSKKEKKEKKKREKEA LRQASDKDDRPFQGEDVENSRLAAEVYKDMPETSFTRTISNPEV VMKRRRQQKLEKRMQEFRSSDGRPDSGGTLRIYADSLKPNIPYK TILLSTTDPADFAVAEALEKYGLEKENPKDYCIARV MLPPGAQHSDEKGAKEIILDDDECPLQIFREWPSDKGILVFQLKR RPPDHIPKKTKKHLEGKTPKGKERADGSGYGSTLPPEKLPYLVEL SPGRRNHFAYYNYHTYEDGSDSRDKPKLYRLQLSVTEVGTEKL DDNSIQLFGPGIQPHHCDLTNMDGVVTVTPRSMDAETYVEGQRI SETTMLQSGMKVQFGASHVFKFVDPSQDHALAKRSVDGGLMV KGPRHKPGIVQETTFDLGGDIHSGTALPTSKSTTRLDSDRVSSAS STAERGMVKPMIRVEQQPDYRRQESRTQDASGPELILPASIEFRE SSEDSFLSAIINYTNSSTVHFKLSPTYVLYMACRYVLSNQYRPDIS PTERTHKVIAVVNKMVSMMEGVIQKQKNIAGALAFWMANASEL LNFIKQDRDLSRITLDAQDVLAHLVQMAFKYLVHCLQSELNNY MPAFLDDPEENSLQRPKIDDVLHTLTGAMSLLRRCRVNAALTIQ LFSQLFHFINMWLFNRLVTDPDSGLCSHYWGAIIRQQLGHIEAW AEKQGLELAADCHLSRIVQATTLLTMDKYAPDDIPNINSTCFKLN SLQLQALLQNYHCAPDEPFIPTDLIENVVTVAENTADELARSDGR EVQLEEDPDLQLPFLLPEDGYSCDVVRNIPNGLQEFLDPLCQRGF CRLIPHTRSPGTWTIYFEGADYESHLLRENTELAQPLRKEPEIITV TLKKQNGMGLSIVAAKGAGQDKLGIYVKSVVKGGAADVDGRL AAGDQLLSVDGRSLVGLSQERAAELMTRTSSVVTLEVAKQGAIY HGLATLLNQPSPMMQRISDRRGSGKPRPKSEGFELYNNSTQNGS PESPQLPWAEYSEPKKLPGDDRLMKNRADHRSSPNVANQPPSPG GKSAYASGTTAKITSVSTGNLCTEEQTPPPRPEAYPIPTQTYTREY FTFPASKSQDRMAPPQNQWPNYEEKPHMHTDSNHSSIAIQRVTR SQEELREDKAYQLERHRIEAAMDRKSDSDMWINQSSSLDSSTSS QEHLNHSSKSVTPASTLTKSGPGRWKTPAAIPATPVAVSQPIRTD LPPPPPPPPVHYAGDFDGMSMDLPLPPPPSANQIGLPSAQVAAAE RRKREEHQRWYEKEKARLEEERERKRREQERKLGQMRTQSLNP APFSPLTAQQMKPEKPSTLQRPQETVIRELQPQQQPRTIERRDLQ YITVSKEELSSGDSLSPDPWKRDAKEKLEKQQQMHIVDMLSKEI QELQSKPDRSAEESDRLRKLMLEWQFQKRLQESKQKDEDDEEE EDDDVDTMLIMQRLEAERRARLQDEERRRQQQLEEMRKREAED RARQEEERRRQEEERTKRDAEEKRRQEEGYYSRLEAERRRQHDE AARRLLEPEAPGLCRPPLPRDYEPPSPSPAPGAPPPPPQRNASYLK TQVLSPDSLFTAKFVAYNEEEEEEDCSLAGPNSYPGSTGAAVGA HDACRDAKEKRSKSQDADSPGSSGAPENLTFKERQRLFSQGQDV SNKVKASRKLTELENELNTK。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自表皮生长因子受体(EGFR， UniProtKB P00533(EGFR_HUMAN)，其通过引用并入本文)的氨基酸序列或其变体。在一个具体例中，dTAG是衍生自，包括或是氨基酸序列：(SEQ.ID.NO.:53):(L858R)

GEAPNQALLRILKETEFKKIKVLGSGAFGTVYKGLWIPEGEKVKI PVAIKELREATSPKANKEILDEAYVMASVDNPHVCRLLGICLTST VQLITQLMPFGCLLDYVREHKDNIGSQYLLNWCVQIAKGMNYL EDRRLVHRDLAARNVLVKTPQHVKITDFGRAKLLGAEEKEYHA EGGKVPIKWMALESILHRIYTHQSDVWSYGVTVWELMTFGSKP YDGIPASEISSILEKGERLPQPPICTIDVYMIMVKCWMIDADSRPK FRELIIEFSKMARDPQRYLVIQGDERMHLPSPTDSNFYRALMDEE DMDDVVDADEYLIPQQG。

在一个具体例中，dTAG是衍生自，包括或是氨基酸序列： (SEQ.ID.NO.:54):(T790M)

GEAPNQALLRILKETEFKKIKVLGSGAFGTVYKGLWIPEGEKVKI PVAIKELREATSPKANKEILDEAYVMASVDNPHVCRLLGICLTST VQLIMQLMPFGCLLDYVREHKDNIGSQYLLNWCVQIAKGMNYL EDRRLVHRDLAARNVLVKTPQHVKITDFGRAKLLGAEEKEYHA EGGKVPIKWMALESILHRIYTHQSDVWSYGVTVWELMTFGSKP YDGIPASEISSILEKGERLPQPPICTIDVYMIMVKCWMIDADSRPK FRELIIEFSKMARDPQRYLVIQGDERMHLPSPTDSNFYRALMDEE DMDDVVDADEYLIPQQG。在一个具体例中，SEQ ID NO.:54在位置163处具有亮氨酸。

在一个具体例中，dTAG是衍生自，包括或是氨基酸序列： (SEQ.ID.NO.:55):(C797S)

GEAPNQALLRILKETEFKKIKVLGSGAFGTVYKGLWIPEGEKVKI PVAIKELREATSPKANKEILDEAYVMASVDNPHVCRLLGICLTST VQLIMQLMPFGSLLDYVREHKDNIGSQYLLNWCVQIAKGMNYL EDRRLVHRDLAARNVLVKTPQHVKITDFGRAKLLGAEEKEYHA EGGKVPIKWMALESILHRIYTHQSDVWSYGVTVWELMTFGSKP YDGIPASEISSILEKGERLPQPPICTIDVYMIMVKCWMIDADSRPK FRELIIEFSKMARDPQRYLVIQGDERMHLPSPTDSNFYRALMDEE DMDDVVDADEYLIPQQG。在一个具体例中，SEQ ID.NO.:55在位置163处具有亮氨酸。在一个具体例中，SEQ.ID.NO.:55在95 位具有苏氨酸。在一个具体例中，SEQ.ID.NO.:55在位置163处具有亮氨酸而在位置95处具有苏氨酸。

在一个具体例中，dTAG是衍生自，包括或是氨基酸序列： (SEQ.ID.NO.:56):(C790G)

GEAPNQALLRILKETEFKKIKVLGSGAFGTVYKGLWIPEGEKVKI PVAIKELREATSPKANKEILDEAYVMASVDNPHVCRLLGICLTST VQLIMQLMPFGCGLDYVREHKDNIGSQYLLNWCVQIAKGMNYL EDRRLVHRDLAARNVLVKTPQHVKITDFGRAKLLGAEEKEYHA EGGKVPIKWMALESILHRIYTHQSDVWSYGVTVWELMTFGSKP YDGIPASEISSILEKGERLPQPPICTIDVYMIMVKCWMIDADSRPK FRELIIEFSKMARDPQRYLVIQGDERMHLPSPTDSNFYRALMDEE DMDDVVDADEYLIPQQG。在一个具体例中，SEQ.ID.NO.:56在位置163处具有亮氨酸。在一个具体例中，SEQ.ID.NO.:56在位 95处具有苏氨酸。在一个具体例中，SEQ.ID.NO.:56在位置163 处具有亮氨酸而在位置95处具有苏氨酸。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自表皮生长因子受体(BCR- ABL或其变体)的氨基酸序列或其变体。在一个具体例中，dTAG是衍生自，包括或是氨基酸序列：(SEQ.ID.NO.:57):(T315I)

SPNYDKWEMERTDITMKHKLGGGQYGEVYEGVWKKYSLT VAVKTLKEDTMEVEEFLKEAAVMKEIKHPNLVQLLGVCTREPPF YIIIEFMTYGNLLDYLRECNRQEVNAVVLLYMATQISSAMEYLE KKNFIHRDLAARNCLVGENHLVKVADFGLSRLMTGDTYTAHAG AKFPIKWTAPESLAYNKFSIKSDVWAFGVLLWEIATYGMSPYPGIDLSQVYELLEKDYRMERPEGCPEKVYELMRACWQWNPSDRPSF AEIHQAFETMFQES。在一个具体例中，SEQ.ID.NO.:57在位置 87处具有苏氨酸。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自BCR-ABL(BCR-ABL)的氨基酸序列或其变体。在一个具体例中，dTAG是衍生自，包括或是氨基酸序列：(SEQ.ID.NO.:58)：

SPNYDKWEMERTDITMKHKLGGGQYGEVYEGVWKKYSLTVAV KTLKEDTMEVEEFLKEAAVMKEIKHPNLVQLLGVCTREPPFYIIT EFMTYGNLLDYLRECNRQEVNAVVLLYMATQISSAMEYLEKKN FIHRDLAARNCLVGENHLVKVADFGLSRLMTGDTYTAHAGAKF PIKWTAPESLAYNKFSIKSDVWAFGVLLWEIATYGMSPYPGIDLS QVYELLEKDYRMERPEGCPEKVYELMRACWQWNPSDRPSFAEI HQAFETMFQES。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自ALK(ALK，UniProtKB Q9UM73(ALK_HUMAN)，其通过引用并入本文)的氨基酸序列或其变体。在一个具体例中，dTAG是衍生自，包括或是氨基酸序列： (SEQ.ID.NO.:59)(L1196M):

ELQSPEYKLSKLRTSTIMTDYNPNYCFAGKTSSISDLKEVPR KNITLIRGLGHGAFGEVYEGQVSGMPNDPSPLQVAVKTLPEVCS EQDELDFLMEALIISKFNHQNIVRCIGVSLQSLPRFIMLELMAGG DLKSFLRETRPRPSQPSSLAMLDLLHVARDIACGCQYLEENHFIH RDIAARNCLLTCPGPGRVAKIGDFGMARDIYRAGYYRKGGCAM LPVKWMPPEAFMEGIFTSKTDTWSFGVLLWEIFSLGYMPYPSKS NQEVLEFVTSGGRMDPPKNCPGPVYRIMTQCWQHQPEDRPNFAI ILERIEYCTQDPDVINTALPIEYGPLVEEEEK。在一个具体例中，SEQ.ID.NO.:59在位置136处具有亮氨酸。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自JAK2(JAK2，UniProtKB O60674(JAK2_HUMAN)，其通过引用并入本文)的氨基酸序列或其变体。在一个具体例中，dTAG是衍生自，包括或是氨基酸序列： (SEQ.ID.NO.:60)(V617F):

VFHKIRNEDLIFNESLGQGTFTKIFKGVRREVGDYGQLHETE VLLKVLDKAHRNYSESFFEAASMMSKLSHKHLVLNYGVCFCGD ENILVQEFVKFGSLDTYLKKNKNCINILWKLEVAKQLAWAMHF LEENTLIHGNVCAKNILLIREEDRKTGNPPFIKLSDPGISITVLPKD ILQERIPWVPPECIENPKNLNLATDKWSFGTTLWEICSGGDKPLS ALDSQRKLQFYEDRHQLPAPKAAELANLINNCMDYEPDHRPSFR AIIRDLNSLFTPD。在一个具体例中，SEQ.ID.NO.:60在位置82 处具有缬氨酸。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自BRAF(BRAF，UniProtKB P15056(BRAF_HUMAN)，其通过引用并入本文)的氨基酸序列或其变体。在一个具体例中，dTAG是衍生自，包括或是氨基酸序列： (SEQ.ID.NO.:61)(V600E):

DWEIPDGQITVGQRIGSGSFGTVYKGKWHGDVAVKMLNVT APTPQQLQAFKNEVGVLRKTRHVNILLFMGYSTAPQLAIVTQWC EGSSLYHHLHASETKFEMKKLIDIARQTARGMDYLHAKSIIHRDL KSNNIFLHEDNTVKIGDFGLATEKSRWSGSHQFEQLSGSILWMA PEVIRMQDSNPYSFQSDVYAFGIVLYELMTGQLPYSNINNRDQII EMVGRGSLSPDLSKVRSNCPKRMKRLMAECLKKKRDERPSFPRI LAEIEELARE。在一个具体例中，SEQ.ID.NO.:61在位置152处具有缬氨酸。在一个具体例中，SEQ.ID.NO.:61在位置153处具有酪氨酸。在一个具体例中，SEQ.ID.NO.:61在位置152处具有缬氨酸。在一个具体例中，SEQ.ID.NO.:61在位置153处具有赖氨酸。在一个具体例中，SEQ.ID.NO.:61在位置152处具有缬氨酸，在位置153处具有赖氨酸。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自LRRK2蛋白(UniProtKB- Q5S007(LRRK2_HUMAN)，其通过引用并入本文)的氨基酸序列或其变体。在一个具体例中，dTAG是衍生自LRRK2氨基酸1328至 1511。在一个具体例中，dTAG是衍生自LRRK2氨基酸1328至 1511，其中氨基酸1441是半胱氨酸。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自PDGFRα蛋白(UniProtKB- P09619(PDGFR_HUMAN)，其通过引用并入本文)的氨基酸序列或其变体。在一个具体例中，dTAG是衍生自P09619的氨基酸600至 692。在一个具体例中，dTAG是衍生自P09619的氨基酸600至692，其中氨基酸674是异亮氨酸。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自RET蛋白(UniProtKB- P07949(RET_HUMAN)，其通过引用并入本文)的氨基酸序列或其变体。在一个具体例中，dTAG衍生自P07949的氨基酸724至1016。在一个具体例中，dTAG衍生自P07949的氨基酸724至1016，其中氨基酸691是丝氨酸。在一个具体例中，dTAG衍生自P07949的氨基酸724至1016，其中氨基酸749是苏氨酸。在一个具体例中， dTAG衍生自P07949的氨基酸724至1016，其中氨基酸762是谷氨酰胺。在一个具体例中，dTAG衍生自P07949的氨基酸724至1016，其中氨基酸791是苯丙氨酸。在一个具体例中，dTAG衍生自 P07949的氨基酸724至1016，其中氨基酸804是甲硫氨酸。在一个具体例中，dTAG衍生自P07949的氨基酸724至1016，其中氨基酸 918是苏氨酸。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自JAK3蛋白(UniProtKB- P52333(JAK3_HUMAN)，其通过引用并入本文)的氨基酸序列或其变体。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自ABL蛋白(UniProtKB- P00519(ABL_HUMAN)，其通过引用并入本文)的氨基酸序列或其变体。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自MEK1蛋白(UniProtKB- Q02750(MP2K1_HUMAN)，其通过引用并入本文)的氨基酸序列或其变体。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自KIT蛋白(UniProtKB- P10721(KIT_HUMAN)，其通过引用并入本文)的氨基酸序列或其变体。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自HIV逆转录酶蛋白 (UniProtKB-P04585(POL_HV1H2)，其通过引用并入本文)的氨基酸序列或其变体。

在一个具体例中，dTAG具有衍生自HIV整合酶蛋白 (UniProtKB-Q76353(Q76353_9HIV1)，其通过引用并入本文)的氨基酸序列或其变体。

B.感兴趣的蛋白质

如本文所考虑的，dTAG策略可用于在体内产生稳定表达的内源性蛋白质-dTAG杂合体，或者根据情况可以离体或体外，其是通过将dTAG核酸序列以5'-或3'-框内基因组***编码感兴趣的蛋白质的核酸序列。在框内***dTAG核酸序列后，细胞表达内源性蛋白质- dTAG杂合体，允许通过给药能够结合dTAG并因此降解内源性蛋白质-dTAG杂合体的异双功能性化合物，来调节内源性蛋白质-dTAG 杂合体的活性。在一个具体例中，内源性蛋白质-dTAG杂合体的活性降低。

在某些具体例中，编码dTAG的核酸可以在框架内基因组*** 与编码参与疾病的蛋白质的基因。涉及可以靶向dTAG***的病症的特定基因的非限制性实例包括作为非限制性实例，α-1抗胰蛋白酶 (A1AT)，载脂蛋白B(APOB)，血管生成素样蛋白3(ANGPTL3)，前蛋白，转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型(PCSK9)，载脂蛋白 C3(APOC3)，catenin(CTNNB1)，低密度脂蛋白受体(LDLR)，C反应蛋白(CRP)，载脂蛋白a(Apo(a))，因子VII，因子XI，抗凝血酶 III(SERPINC1)，磷脂酰肌醇聚糖A类(PIG-A)，C5，α-1抗胰蛋白酶(SERPINA1)，铁调素调节(TMPRSS6)，(δ-氨基乙酰丙酸合成酶 1(ALAS-1)，酰基CaA：二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)，miR-122， miR-21，miR-155，miR-34a，前激肽释放酶(KLKB1)，***生长因子(CCN2)，细胞间粘附分子1(ICAM-1)，胰高血糖素受体(GCGR)，糖皮质激素受体(GCCR)，蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP-1B)， c-Raf激酶(RAF1)，成纤维细胞生长因子受体4(FGFR4)，血管黏附分子-1(VCAM-1)，极晚期抗原-4(VLA-4)，运甲状腺素蛋白(TTR)，存活运动神经元2(SMN2)，生长激素受体(GHR)，肌张力障碍肌强直蛋白激酶(DMPK)，细胞核酸结合蛋白(CNBP或ZNF9)，凝聚素 (CLU)，真核转译起始因子4E(eIF-4e)，MDM2，MDM4，热休克蛋白27(HSP 27)，信号转导和转录激活因子3蛋白(STAT3))，血管内皮生长因子(VEGF)，驱动蛋白纺锤体蛋白(KIF11)，乙型肝炎基因组，雄激素受体(AR)，无调性同源物1(ATOH1)，血管内皮生长因子受体1(FLT1)，视网膜裂损1(RS1)，视网膜色素上皮特异性65kDa蛋白(RPE65)，Rab护送蛋白1(CHM)和钠通道、电压门控、X型α亚基(PN3或SCN10A)。可以通过dTAG***靶向的其他感兴趣的蛋白质包括与功能获得突变相关的蛋白质，例如，致癌蛋白质。

在特别具体例中，用于靶向的感兴趣的蛋白质是apoB-100， ANGPTL3，PCSK9，APOC3，CRP，ApoA，因子XI，因子VII，抗凝血酶III，磷脂酰肌醇聚糖A类(PIG-A)，补体的C5组分，α-1- 抗胰蛋白酶(A1AT)，TMPRSS6，ALAS-1，DGAT-2，KLB1， CCN2，ICAM，胰高血糖素受体，糖皮质激素受体，PTP-1B， FGFR4，VCAM-1，VLA-4，GCCR，TTR，SMN1，GHR，DMPK 或NAV1.8。

在一个具体例中，dTAG是5'或3'框内基因组整合到编码到与蛋白病相关的内源性蛋白质的基因中。在一个具体例中，dTAG是5'或 3'框内基因组整合到编码与选自框内基因组***(5'或3')的病症相关的内源性蛋白质的基因中。该编码内源性蛋白质的基因与下列相关：阿尔茨海默病(淀粉样β肽(Aβ)；Tau蛋白)，脑β-淀粉样血管病(淀粉样蛋白β肽(Aβ))，青光眼视网膜神经节细胞变性(淀粉样蛋白β肽 (Aβ))，朊病毒疾病(朊蛋白)，帕金森病和其他突触核蛋白病(α-突触核蛋白)，Tau蛋白病(微管相关蛋白tau(Tau蛋白))，额颞叶变性 (FTLD)(Ubi+、Tau-)(TDP-43)，FTLD-FUS(融合于肉瘤(FUS)蛋白)，肌萎缩侧索硬化症(ALS)(超氧化物歧化酶、TDP-43、FUS)，亨廷顿氏病和其他三联体重复疾病(蛋白质与串联谷氨酰胺扩增)，家族性英国痴呆症(ABri)，家族性丹麦痴呆症(Adan)，H伴有淀粉样变性的遗传性脑出血(冰岛)(HCHWA-I)(胱抑素C)， CADASIL(Notch3)，亚历山大病(胶质纤维酸性蛋白(GFAP))， Seipin蛋白病变(Seipin蛋白)，家族性淀粉样变性神经病，老年性系统性淀粉样变性(运甲状腺素蛋白)，Serpino蛋白病变(Serpin蛋白)， AL(轻链)淀粉样变性(原发性***性淀粉样变性)(单克隆免疫球蛋白轻链)，AH(重链)淀粉样变性(免疫球蛋白重链)，AA(继发性)淀粉样变性(淀粉样蛋白A蛋白)，II型糖尿病(胰岛淀粉样蛋白多肽(IAPP； amylin))，主动脉内侧淀粉样变性(Medin(乳黏素))，ApoAI淀粉样变性(载脂蛋白AI)，ApoAII淀粉样变性(载脂蛋白AII)，ApoAIV淀粉样变性(载脂蛋白AIV)，芬兰型家族性淀粉样变性(FAF)(凝溶胶蛋白)，溶菌酶淀粉样变性(溶菌酶)，纤维蛋白原淀粉样变性(纤维蛋白原)，透析淀粉样变性(β-2微球蛋白)，包涵体肌炎/肌病(淀粉样蛋白 β肽(Aβ))，白内障(结晶蛋白)，视网膜色素变性与视紫红质突变(视紫红质)，甲状腺髓样癌(降钙素)，心房性淀粉样变性(心房利钠因子)，垂体泌乳素瘤(催乳素)，遗传性晶格角膜营养不良(角膜透明质酸)，皮肤苔癣淀粉样变性(角蛋白)，马洛里体(角蛋白中间丝蛋白)，角膜乳铁蛋白淀粉样变性(乳铁蛋白)，肺泡蛋白沉积症(表面活性蛋白 C(SP-C))，牙源性(Pindborg)肿瘤淀粉样蛋白(牙源性成釉细胞相关蛋白)，***淀粉样蛋白(精胶蛋白I)，囊性纤维化(囊性纤维化跨膜传导调节因子(CFTR)蛋白)，镰状细胞病(血红蛋白)和重症病肌病 (CIM)(肌球蛋白泛素化的超蛋白水解状态)。

如本文所考虑的，通过将编码dTAG的核酸基因组框内***特定感兴趣的蛋白质，可以通过给药对dTAG特异的异双功能性化合物来实现对感兴趣的蛋白质的调节，该dTAG与蛋白质-dTAG杂交体结合，导致它的降解。由于以这种方式调节特定感兴趣的蛋白质的能力，这种策略可用于治疗其中细胞内某些阈值水平以上的蛋白质表达导致患病状态的病症。该技术的其他应用包括但不限于1.)蛋白质的靶向降解，其中病理学是功能获得突变的函数，2)蛋白质的靶向降解，其中病理学是扩增或增加的表达的函数，3)作为单基因疾病表现的蛋白质的靶向降解，4)蛋白质的靶向降解，其中遗传易感性表现出更长的时间并且通常在替代的生物补偿机制之后不再充分，例如但不限于高胆固醇血症和蛋白质病。

通过内源性蛋白质-dTAG杂合体的受控降解，蛋白质表达或活性动力学的有利变化可导致在有此需要的受试者中预防和/或治疗病症。

能够通过目前预期的方法治疗的示例性疾病和病症描述于例如题为“Methodsand Compositions for Prevention of treatment of a Disease”的美国申请案第20150329875号中，其通过引用并入本文。

在某些具体例中，靶蛋白参与脂质代谢。例如，高胆固醇血症是一种特征在于血液中胆固醇水平非常高的病症，已知会增加冠状动脉疾病的风险。家族性高胆固醇血症，高脂血症和家族性乳糜微粒血症是通过异常基因导致观察到的症状学的家族的遗传病症。编码LDL 受体(LDLR)，载脂蛋白B(APOB)，血管生成素样蛋白3(ANGPTL3) 和前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/kexin 9型(PCSK9)的基因的突变参与这些疾病。LDLR用于从血浆中去除LDL以便内化到细胞中。 LDLR是一种跨膜蛋白，定位于网格蛋白包被的凹坑，在那里它与ApoB-100(APOB的较长基因产物)和富含apoE的脂蛋白形成复合物。在该复合物的内吞作用后，它移动到内体，其中脂蛋白从复合物中释放出来，最终被溶酶体降解。然后可以将LDLR再循环回细胞表面。

apoB-100缺陷的患者，称为“家族性缺陷型载脂蛋白B”(FDB)， APOB中经常携带R3500Q突变，这使得LDL与LDLR结合的能力降低，血浆清除率降低，从而提高血浆脂肪酸水平(Innerarity)et al., (1987)PNAS USA 84:6919)。FDB通常被认为是常染色体显性病症，并且发生在大约1：700的欧洲血统人群中(Ginsburg and Willard (2012)Genomicand Personalized Medicine,volume 1and 2.Dational Press，London,page 507)。因此，在有apoB-100突变异型合子的 FDB患者中，通过在肝细胞的等位基因中框内***dTAG并给药异双功能性化合物，从而产生apo-100缺陷型蛋白质-dTAG杂合体的基因产物，特异性降解缺陷型apoB-100等位基因可导致疾病的纠正。

类似地，导致ANGPTL3水平升高的血管生成素样蛋白 3(ANGPTL3)过表达突变可引起受试者的高脂血症。ANGPTL3还可作为脂蛋白脂酶(LPL)和内皮脂肪酶(EL)的双重抑制剂，并增加啮齿动物的血浆甘油三酯和高密度脂蛋白胆固醇。ANGPTL3主要在肝脏中表达并分泌，通常用于增加甘油三酯，LDL胆固醇和HDL胆固醇的血浆水平，其中它直接作用于肝脏以调节肝细胞脂蛋白的分泌和清除(Musunuru et al,(2010)N Engl J Med 363:23p.2220)。因此，本发明的方法可用于通过使用本文所述的dTAG***策略靶向降解蛋白质来治疗与ANGPTL3过表达相关的高脂血症。

PCSK9是另一种编码蛋白质的基因，该蛋白质在胆固醇体内平衡中起主要调节作用。PCSK9与LDLR的表皮生长因子样重复 A(EGF-A)结构域结合，并诱导LDLR降解。已描述PCSK9(例如 S127R，P216L，D374Y和N157K)的常染色体显性，功能性突变的毒性增加，并且与高脂血症和家族性高胆固醇血症(FH)相关，这是由于LDLR降低的速率增加导致相应的增加。血浆LDL胆固醇 (Abifadel et al.(2003)Nat Gen 34(2):154)。此外，已发现功能丧失的PCSK9突变(例如Y142X，C679X和R46L)导致肝脏LDLR水平升高，血浆LDL胆固醇含量显着下降，导致发病率降低88％冠心病 (Cohen et al.,(2003)New Eng J Med 354(12):1264)。因此，本发明的方法和组合物可用于通过使用本文所述的dTAG***策略靶向降解PCSK9蛋白来治疗或预防高脂血症和/或FH。

家族性乳糜微粒血症综合征(FCS)的特征在于极高水平的血浆甘油三酯，并导致许多健康问题，例如腹痛，肝脏和脾脏肿大以及复发性急性胰腺炎。此外，有甘油三酯水平高的受试者没有FCS，但由于甘油三酯升高，有类似的健康问题。由APOC3基因编码的载脂蛋白C3或apo-CIII是极低脂蛋白(VLDL)，LDL，HDL和乳糜微粒的组分，并且通常通过抑制脂蛋白脂肪酶和肝脂酶来抑制脂解作用。 Apo-CIII抑制富含甘油三酯的颗粒的肝摄取，并且可以在患有高脂血症的患者中升高(Bobik,(2008)Circulation 118:702)并且是独立的心血管疾病风险因子。敲除小鼠中的APOC3基因导致动物与正常相比具有降低的血浆甘油三酯水平(Maeda et al.,(1994)J Biol Chem 269(38):23610)。因此，本发明的方法和组合物可用于通过使用本文所述的dTAG***策略靶向降解APOC3蛋白来预防或治疗患有脂质代谢紊乱(例如，家族性高胆固醇血症，高脂血症和家族性乳糜微粒血症)的受试者。

在其他具体例中，靶蛋白参与血管疾病，例如心血管疾病和冠状动脉疾病。与上面讨论的脂质代谢紊乱类似，冠状动脉疾病也可以由特定基因引起。例如，C-反应蛋白(CRP)是肝脏中产生的与炎性疾病相关的蛋白质。它是一种急性期蛋白，与死亡或垂死细胞表面表达的磷酸胆碱结合，其作用是激活补体***以帮助清除细胞。在慢性炎性疾病中，CRP水平升高可能通过促进和放大整体慢性炎症状态而加剧疾病症状。此外，已经在大鼠模型中显示CRP增加心肌和脑梗塞面积，当转译成人类患者时，可预测心脏病发作后更负面的预后。当将CRP抑制剂引入这些大鼠模型时，梗塞面积和心脏功能障碍降低 (Pepyset al.(2005)Nature 440(27):1217)。因此，抑制CRP可能对炎性疾病和冠状动脉疾病都有益。本发明的方法和组合物可用于通过使用本文所述的dTAG***策略靶向降解CRP蛋白来引起CRP表达的调节。

血浆脂蛋白(Lp(a))是包含载脂蛋白(a)(apo(a))的低密度脂蛋白颗粒，并且也是包括动脉粥样硬化在内的心血管疾病的独立危险因素。 Apo(a)通过apoB-100与LDL表面接触，通过二硫键连接，据报道，与Apo(a)水平升高相关的遗传多态性与心肌梗死的过度发生率相关 (Chasman et al.,(2009)Atherosclerosis 203(2):371)。血浆中Lp(a) 浓度在个体之间的浓度变化很大，其中这些浓度差异似乎是遗传决定的。apo(a)基因包含许多纤溶酶原kringle 4样重复，并且这些 kringle重复的数量与Lp(a)的血浆浓度成反比。设计用于对载脂蛋白 (a)产生免疫应答并引起抗体介导的Lp(a)清除的DNA疫苗方法证明 Lp(a)在小鼠中的动脉粥样硬化活性降低(Kyutoku et al.，(2013))Sci Rep 3doi:10.1038/srep1600)。因此，通过使用本文所述的dTAG插入策略靶向降解ApoA蛋白，本发明的方法和组合物可用于降低 ApoA蛋白的表达，导致Lp(a)的血浆浓度降低。

凝血障碍，通常被称为血栓形成倾向，可能在血管疾病中产生分枝。调节哺乳动物凝血的生化事件的复杂网络包括5种蛋白酶(因子 II，VII，IX和X以及蛋白C)，其与5种辅因子(组织因子，因子V，因子VIII，血栓调节蛋白和表面膜蛋白)相互作用以产生纤维蛋白，是凝块的主要成分。强有力的内源促凝血剂和血栓抗性力之间存在微妙的平衡，以确保血液的流动性，并且如果发生损伤则保持这些因子准备好诱导血液凝块。因子XI和因子VII的高血浆活性与高凝和血栓性疾病(冠状动脉梗塞，中风，深静脉血栓形成，肺栓塞)和患者预后差有关。已经证明，具有严重因子XI缺乏的人被保护免于缺血性脑损伤和中风(Saloman et al.(2008)Blood 111:4113)。同时，已经显示高水平的FXI与患者中更高的卒中事件发生率相关(Yang et al. (2006)Am J Clin Path 126:411)。类似地，高因子VII水平也与冠状动脉疾病相关，尽管这通过诸如如何测量因子VII以及分析哪种形式的蛋白质等其他考虑因素而变得复杂(Chan et al.(2008)Circulation 118:2286)。因此，本发明的方法和组合物可用于通过使用本文所述的dTAG***策略靶向降解因子XI和/或因子VII，而选择性降解与疾病相关的凝血因子(例如，因子VII和因子XI)来预防或治疗患有血栓形成疾病的受试者。。

如上所述，凝血级联的平衡是至关重要的。因此，除了凝血因子的重要性之外，这些因子的抑制剂也是关键的。患有血友病的患者缺乏凝血级联的一种或多种组分，因此具有降低的凝血能力。在该级联的最后步骤之一中，凝血酶作用于纤维蛋白原以产生作为凝块的主要成分的纤维蛋白。级联导致活性凝血酶的产生允许这种情况发生。为了保持***平衡，抗凝血酶(也称为抗凝血酶III，由SERPINC1基因编码)作用于凝血酶以抑制其作用。在许多血友病患者中，因子缺乏不是绝对的，并且存在一定程度的凝血。因此，基于抗凝血酶降解的方法可以允许凝血级联可能与哪个因子缺乏有关而在上游因子受限时，产生足够的凝固。已经使用源自血友病A患者的血液证明了这一点 (参见Di Micco et al.(2000)Eur J Pharmacol.March 10；391(1-2):1- 9.)。本发明的方法和组合物可用于通过使用本文所述的dTAG*** 策略靶向降解抗凝血酶III蛋白来治疗血友病患者，例如血友病A和血友病B。

靶蛋白质也可能参与血液病症(血液病症)。补体***是多种血液学条件下的关键参与者。阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)是由PIG-A 基因缺陷引起的溶血性疾病(参见Brodsky(2008)Blood Rev 22(2):65)。PIG-A基因产物磷脂酰肌醇聚糖A类是合成GPI锚定蛋白的第一步所必需的。在X染色体上发现PIG-A，并且PIG-A中的突变导致红细胞对补体导致的溶血敏感。值得注意的是，这些突变细胞缺乏GPI锚定蛋白CD55和CD59。CD59直接与补体相关的膜攻击复合物(或MAC)相互作用，通过阻断C9的聚集来防止裂解孔的形成，C9是孔组装的关键步骤。CD55的功能是加速C3转化酶的破坏，因此在没有CD55的情况下，存在更多的C3转化酶，导致更多的MAC形成。因此，缺乏这两种蛋白质导致突变红细胞的裂解增加。对于PNH患者，由于血栓形成增加引起的并发症是最大的问题 (Brodsky(2008)Blood Rev 22(2):65)。40％的PNH患者持续血栓形成，可导致中风和急性心血管疾病。因此，本发明的方法和组合物可用于通过使用本文所述的dTAG***策略靶向降解磷脂酰肌醇聚糖 A类(PIG A)来治疗和/或预防受试者中的PHN。

补体的C5成分的抑制已被批准用于治疗PNH和非典型溶血性 ***综合征(aHUS)，证实C5是重要的治疗靶标。当由于补体*** 的失调(先天免疫的一部分)导致细胞被替代途径破坏时，发生与 aHUS相关的红细胞的溶血。通常，破坏性C3bBb复合物在入侵细胞(例如细菌)的表面上形成，以加速其作为补体***中替代途径的一部分的破坏。C3bBb复合物可以结合另一个C3b以形成C3bBbC3b 复合物，然后该复合物充当C5转化酶。C5转化酶将C5切割成C5a 和C5b，并且C5b募集C6、C7、C8和C9以形成MAC。一组补体调节蛋白(例如CD35、CD46、CD55和CD59)位于身体本身细胞上，以抑制这些蛋白质的活性，从而保护它们。然而，当这些调节蛋白质存在不平衡时，C3bBb复合物可能不适当地形成(de Jorge etal. (2011)J Am Soc Nephrol 22:137)。除了过早破坏红细胞外，这种综合征还可能由于肾小球滤过装置的破坏和堵塞而导致肾脏疾病。当与具有补体调节蛋白突变的小鼠杂交时，显示C5阴性小鼠受到保护，该数据已被用于验证C5作为aHUS(de Jorge，同上)中的靶标以及与补体失调相关的其他疾病的想法。C5b特异性单克隆抗体依库珠单抗(eculizamab)已成功用于治疗aHUS(Gruppo and Rother,(2009)N Engl J Med 360；5 p544)和其他补体介导的疾病(例如阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)(Hillmen et al.,(2013)Br.J Haem 162:62))。因此，本发明的方法和组合物可用于调节C5的表达，从而通过使用本文所述的dTAG***策略通过靶向降解C5来预防或治疗与补体失调相关的疾病。

α-1-抗胰蛋白酶(A1AT)缺乏在欧洲血统的1500至3000人中发生约1例，但在亚洲血统的个体中很少见。α-1-抗胰蛋白酶蛋白是由 SERPINA1基因编码的蛋白酶抑制剂，用于保护细胞免受炎性细胞释放的蛋白酶的活性，包括中性粒细胞弹性蛋白酶，胰蛋白酶和蛋白酶-3(PR-3)。缺陷是由杂合子中的突变SERPINA1基因引起的常染色体共显性或隐性疾病，其中突变等位基因的表达减少或具有差的抑制活性的突变体A1AT蛋白的表达导致长期缺乏对中性粒细胞弹性蛋白酶的抑制，导致组织损伤。最常见的SERPINA1突变包含Glu342Lys取代(也称为Z等位基因)，其导致蛋白质在患者肝细胞的内质网中形成有序聚合物。这些内含物最终导致肝硬化，其只能通过肝移植治疗(Yusa et al.,(2011)Nature478 p.391)。肝细胞内的聚合导致血浆A1AT水平的严重降低，导致这种炎性疾病的风险增加。此外，A1AT缺乏与肺病有关，包括慢性阻塞性肺病(COPD)，肺气肿和慢性支气管炎(Tuder et al.(2010)Proc Am Thorac Soc 7(6): p.381)并且可能具有更广泛的抑制其他疾病的进展，包括1型和2型糖尿病，急性心肌梗死，类风湿性关节炎，炎症性肠病，囊性纤维化，移植排斥，移植物抗宿主病和多发性硬化症(Lewis(2012)Mol Med 18(1)p.957)。人口研究表明，为避免这些疾病，最低ATA1血浆阈值约为0.5mg/mL(正常血浆水平在非炎症状态下约为0.9至1.75 mg/ml)，及对于严重缺乏血浆A1AT肺气肿患者来说，目前的治疗方法主要通过使用支气管扩张剂等来减轻症状，虽然每周输注 A1AT也可作为选择。与A1AT相关的严重肺病最终也通过移植治疗。用于治疗A1AT缺陷的临床试验涉及多种方法，包括递送浓缩的A1AT蛋白，通过IM注射使用包含A1AT基因的AAV 构建体，以及在HIV中使用A1AT，仅列举一些。因此，本发明的组合物和方法可用于通过使用本文所述的dTAG***策略靶向降解 α-1-抗胰蛋白酶蛋白来治疗或预防与A1AT缺乏相关的疾病，从而消除可导致肝硬化的肝脏聚集体。

另一种感兴趣的肝脏靶标包括参与体内铁含量调节的任何蛋白质。铁对血红蛋白的产生至关重要，但过量会导致活性氧的产生。在依赖于输血的患者(例如某些血友病，血红蛋白病)中，继发性铁过载是常见的。铁调节激素铁调素及其受体和铁通道铁转运蛋白通过促进其细胞摄取来控制铁的膳食吸收，储存和组织分布。铁调素的调节在转录水平进行，并且对血浆中的铁浓度敏感，其中铁调素表达增加导致血浆铁浓度降低。通过涉及称为血幼素的受体的一系列受体-配体相互作用，铁调素基因被SMAD转录因子上调。铁相关的铁调素下调依次受称为TMPRSS6的蛋白酶的调节，该蛋白酶切割血幼素并阻止铁调素的上调(Ganz(2011)Blood 117:4425)。通过使用靶向TMRSS6 mRNA的抑制性RNA下调TMPSS6表达已显示导致小鼠模型中铁过载的减少(Schmidt et al.,(2013)Blood 121:1200)。因此，本发明的方法和组合物可用于通过使用本文所述的dTAG***策略靶向TMPRSS6以降解。

与体内铁利用途径相关的其他条件是卟啉症。这些疾病是由血红素合成中涉及的酶的许多缺陷引起的。急性间歇性卟啉症(AIP)是一种常染色体显性疾病，是第二常见的卟啉症，其发病率约为10万人中的5至10人。AIP是由羟甲基硅烷合成酶(HMBS合酶(HMBS)，也称为胆色素原-脱氨酶)缺乏引起的，其中HMBS基因的突变非常异质，包括错义和点突变(Solis et al.(1999)Mol Med 5：664)。可能威胁生命的AIP攻击可具有胃肠道，神经精神，心血管和神经系统表现。攻击有几个诱因，可能持续数天，并且经常需要住院治疗，并且可能由几种看似无关的因素引起，包括某些药物，感染，热量限制，吸烟，酒精和与***有关的荷尔蒙波动(Yasuda et al.(2010 年))Mol Ther 18(1):17)。HMB合酶是血红素合成途径的一部分，其中甘氨酸和琥珀酰-CoA通过δ-氨基乙酰丙酸合成酶1(ALAS-1)连接以制备氨基乙酰丙酸，然后氨基乙酰丙酸脱水酶(ALAD)作用以产生磷酸化纤维蛋白原。磷酸基肽原通过HMB合酶转化为羟甲基硅烷。该途径从那里继续，最终产生血红素(Ajioka et al.(2006)Biochim Biophys Acta 1762:723)。无论触发因素如何，所有攻击都会导致酶 δ-氨基乙酰丙酸合成酶1(ALAS-1)升高。这种酶是肝脏血红素合成途径中的第一种酶，当被诱导时，HMB合成酶的缺乏变为限速并且氨基乙酰丙酸和磷酸化纤维蛋白原前体积累(Yasuda，同上)。AIP患者的肝移植可以阻止发作，表明靶向肝脏可能对治疗有益。此外，在 AIP的小鼠模型中，小鼠只有30％的正常HMB合成酶水平，编码 HMB合成酶的转基因HMBS的***导致给予小鼠***时氨基乙酰丙酸和磷酸化蛋白原积累减少(Yasuda，同上)。设计用于抑制 ALAS-1的双股RNA也已显示在小鼠AIP模型中减少体内ALAS-1 表达并减少响应***治疗的磷酸胆碱原积累(参见美国专利公开案第20130281511号)。因此，本发明的方法和组合物可用于通过使用本文所述的dTAG***策略靶向降解ALAS-1来预防和治疗AIP。

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是世界范围内最常见的肝脏疾病，在西方人群中患病率为15％至30％，并且是由肝脏内甘油三酯积聚引起的。然而，超重人群的患病率增加到58％，肥胖人群的患病率增加到98％。非酒精性脂肪性肝炎(NASH)是其中已发生肝损伤的 NAFLD的更高级形式，并且可导致肝衰竭，门静脉高压症，肝癌和肝硬化(Schwengerand Allard(2014)World J Gastronen 20(7):1712)。证据似乎表明，在NALFD中观察到的肝脏甘油三酯积累与肝脏胰岛素抵抗密切相关，通常作为2型糖尿病和代谢综合征的一部分(Choi et al.(2017，J Biol Chem 282(31):22678)。酰基-CaA：二酰基甘油酰基转移酶(DGAT)通过促进具有长链的酰基Co A的sn-1,2二酰基甘油(DAG)的连接来催化甘油三酯合成的最后一步。有两种主要的同种型DGAT，即DGAT-1和DGAT-2。DGAT-1主要在小肠中表达，而DGAT-2主要表现为肝脏表达(其表达为胰岛素反应)。使用反义寡核苷酸在饮食诱导的NALFD大鼠中敲除DGAT-1或DGAT-2的表达显着改善DGAT-2敲低后的肝脂肪变，性但不改善DGAT-1敲除 (Choi，同上)。因此，本发明的材料和方法可用于改变DGAT-2的表达以治疗NASH和NALFD，以及通过使用本文所述的dTAG***策略靶向降解DGAT-2来降低肝胰岛素抗性。

进一步的血管靶标包括那些涉及遗传性血管性水肿(HAE)者。 HAE是一种常染色体显性遗传疾病，每50,000人中影响1人，这是 C1抑制剂水平降低的结果。患者在身体任何部位出现肿胀反复发作，其中肿瘤位于口咽部，喉部或腹部，发病率和死亡风险最高(参见， Tse andZuraw,(2013)Clev Clin J of Med 80(5):297)。由于过量产生缓激肽，该疾病由血浆外渗到组织中而发生。该机制似乎涉及通过激活因子XII切割前激肽释放酶(也称为PKK)，释放活性血浆激肽释放酶(其激活更多因子XII)。然后血浆激肽释放酶切割激肽原，释放缓激肽。然后缓激肽与内皮细胞上的B2缓激肽受体结合，增加内皮细胞的通透性。通常，C1抑制剂(由SERPING1编码)通过抑制血浆激肽释放酶和因子XII的活化来控制缓激肽的产生。HAE有三种类型，即以存在的C1抑制剂的数量和类型区别的I型和II型和与因子 XII中的Thr309Lys突变相关的III型(Prieto et al.(2009)Allergy 64(2):284)。I型HAE具有低水平的C1抑制剂，其似乎是由于少量 C1抑制蛋白的表达和破坏而导致的。1型占HAE患者的约85％。II 型患者具有正常水平的C1抑制剂，但C1抑制蛋白由于突变而无效(Tse andZuraw，同上)。已经表征了SERPING1中超过250个导致I 型HAE的突变，包括小的和大的***和缺失以及重复(Rijavec et al.,(2013)PLoS One 8(2):e56712)。由于HAE遗传基础的这种高度可变性，本发明的方法和组合物可用于通过在HAE的表现中靶向下游参与者来预防或治疗HAE。例如，靶向前激肽释放酶(KLKB1，在肝细胞中表达)以实现前激肽释放酶(缩写为PKK)表达的减少可导致缓激肽产生减少，而不考虑引起HAE的上游突变类型，从而导致血浆外渗减少。因此，本发明的方法和组合物可用于引起KLKB1表达的降低，以通过使用本文所述的dTAG***策略靶向降解KLKB1 来预防或治疗HAE。

靶标也可能与纤维化疾病有关。各种器官中的纤维化疾病是器官功能障碍的主要原因，并且可以作为对另一种潜在疾病的反应或作为患病个体中纤维化倾向的结果而发生。纤维化的标志是细胞外基质化合物如胶原蛋白和相关糖蛋白的不适当沉积。TGF-β在纤维化过程中起主要作用，诱导成纤维细胞合成细胞外基质(ECM)蛋白，并且它还抑制具有ECM分解活性的蛋白质的表达(Leask(2011)J Cell Commun Signal 5:125)。有一类ECM调节蛋白称为CNN蛋白(所谓的前三个成员，即CYR61(富含半胱氨酸的61/CCN1)、CTGF(结缔组织生长因子/CCN2)和NOV(肾母细胞瘤)过度表达/CCN3)。这些蛋白质调节多种细胞功能，包括细胞粘附，迁移，细胞凋亡，存活和基因表达。TGF-β强烈上调CCN2表达，其作为TGF-β的辅助因子协同作用且似乎是参与周细胞活化，这似乎是纤维化中必不可少的过程 (Leask同上)。CCN2在纤维化组织中过度表达，包括肺组织，也见于***性硬化症(硬皮病)患者的血浆中。又，通过使用反义寡核苷酸 (ASO)进行的CCN2表达减少了化学诱导的肝纤维化，输尿管梗阻引起的肾纤维化，皮肤伤口的纤维化瘢痕和肾间质纤维瘤部分肾切除术后的脓肿(Jun and Lau(2013)Nat Rev Drug Discov.10(12):945-963)。除了其促纤维化作用外，CCN2在癌症中可能是重要的，特别是在转移中。它可能通过诱导血管生成促进肿瘤生长，乳腺癌细胞中高水平的CCN2是骨转移潜能的标志(Jun和Lau，同上)。通过使用CCN2 调节化合物(例如，单克隆抗体或抑制性RNA)在各种纤维化，癌症，心血管疾病和视网膜病变模型中敲低CCN2表达的实验模型已经显示出许多这些疾病的临床进展的影响(Jun和Lau同上)。因此，本发明的方法和组合物可用于通过使用本文所述的dTAG***策略，通过靶向降解CCN2来降低CCN2的表达来预防或治疗纤维化，癌症，血管疾病和视网膜病。

在其他具体例中，靶标参与自身免疫疾病。自身免疫性疾病作为一类是常见的，仅在美国就有超过2300万人受到影响。有几种不同的类型，具有许多不同程度的严重程度和预后。通常，它们的特征在于产生针对各种自身抗原的自身抗体，导致针对自身的免疫应答。肠的自身免疫疾病可导致诸如溃疡性结肠炎和炎性/肠易激病(例如，克罗恩病)的病症。细胞表面糖蛋白细胞间粘附分子1(ICAM-1)在内皮细胞上表达并在炎症状态下上调，在移位到组织期间用作白细胞的结合蛋白。已发现特异性ICAM-1等位基因与克罗恩病(例如K469E等位基因，外显子6)或溃疡性结肠炎(例如G241R，外显子4)相关，并且可优先参与这些疾病中发现的慢性炎症诱导(Braun et al.,(2001) Clin Immunol.101(3):357-60)。在血管和糖尿病疾病的小鼠模型中敲除ICAM已证明该治疗方法的有用性(参见Bourdillon et al.,(2000) Ather Throm Vasc Bio 20:2630和Okada et al.,(2003)Diabetes 52:2586)。因此，本发明的方法和组合物可以通过使用本文所述的 dTAG***策略靶向降解ICAM而用于炎性疾病中ICAM表达的一般降低。

另一种最近被认为是自身免疫疾病的常见疾病是糖尿病。胰高血糖素是胰岛α细胞释放的一种肽激素，在调节肝脏葡萄糖生成中起着关键作用，具有深远的高血糖作用。此外，胰高血糖素激活糖异生所需的多种酶，尤其是用于将丙酮酸转化为磷酸烯醇丙酮酸的酶***，这是糖异生中的限速步骤。基于以下观察，已经提出高葡萄糖血症是糖尿病发病机理中的致病因素：1)从动物到人类研究的糖尿病高血糖症一直伴有相对或绝对的高葡萄糖血症；2)输注生长抑素抑制内源胰高血糖素释放，从而降低由四氧嘧啶或二氮嗪诱导的糖尿病患者的血糖水平；3)慢性胰高血糖素输注导致人类的肝胰岛素抗性(参见Liang et al.(2004)Diabetes 53(2):410)。胰高血糖素受体(由GCGR基因编码)主要在肝脏中表达，与对照相比，用靶向胰高血糖素受体的反义 RNA治疗糖尿病(db/db)小鼠导致血清葡萄糖水平，甘油三酯和脂肪酸显着降低(Liang等人，同上)。类似地，糖皮质激素(GC)增加肝脏糖异生，并在肝葡萄糖输出的调节中起重要作用。在db/db小鼠中，通过使用靶向反义RNA降低糖皮质激素受体(GCCR)表达导致进食和禁食葡萄糖水平降低约40％，血浆甘油三酯降低约50％(参见， Watts et al.(2005)Diabetes 54(6):1846)。因此，本发明的方法和组合物可用于通过使用本文所述的dTAG***策略，通过靶向降解降低胰高血糖素受体和/或糖皮质激素受体的表达来靶向胰高血糖素受体和/或糖皮质激素受体而预防或治疗糖尿病。

2型胰岛素抵抗糖尿病的另一个潜在目标是蛋白酪氨酸磷酸酶 1B(PTP-1B)。胰岛素抗性定义为细胞在葡萄糖摄取和组织利用方面对胰岛素起反应的能力降低。调节胰岛素信号传导的最重要的磷酸酶之一是PTP-1B，其通过直接去磷酸化来抑制胰岛素受体和胰岛素受体底物1。作为PTP-1B-/-(在两个等位基因处突变)的小鼠对胰岛素过敏并且对高脂肪饮食的体重增加具有抗性(参见Fernandez-Ruiz et al.,(2014)PLoS One 9(2):e90344)。因此，该靶标可用于糖尿病治疗和肥胖症。由于高度保守的活性位点袋，开发对该酶特异的抑制性小分子是有问题的，但是已经显示针对PTP-1B的反义寡核苷酸将肝脏和脂肪组织中的PTP-1B mRNA表达降低约50％并且在高血糖、胰岛素抗性ob/ob和db/db小鼠中产生葡萄糖降低的效果(其为在非人灵长类动物中重复的实验)(参见Swarbrick etal.,(2009)Endocrin 150:1670)。因此，本发明的方法和组合物可用于通过使用本文所述的dTAG***策略靶向降解PTP-1B来靶向PTP-1B，导致胰岛素敏感性增加。

发展为糖尿病胰岛素抵抗糖尿病的高风险因素是肥胖。全世界估计有超过10亿人超重(体重指数(BMI)≥25kg/m²，其中超过3亿人被认为是肥胖(BMI≧30kg/m²)，这意味着肥胖是今天对公共卫生的最大威胁其中之一(Lagerros (2013)TherAdv Gastroenterol 6(1):77)。肥胖与合并症如胰岛素抵抗II型糖尿病，血脂异常，高血压和心血管疾病密切相关。肥胖症通常始于饮食和运动的改变，但通常随着热量消耗的减少，观察到身体能量消耗的平行且混杂的减少(Yu et al.,(2013)PLoS One 8(7):e66923)。成纤维细胞生长因子受体4(FGFR4)已被证明在小鼠肥胖模型中具有抗肥胖作用。 FGFR4主要在肝脏中表达，它及其配体FGF19(在人体内)调节胆汁酸代谢。GFFR4/FGF19调节胆固醇的表达7α-羟化酶及其活性。此外，FGFR4和FGF19似乎参与脂质，碳水化合物或能量代谢。通过禁食降低肝脏FGFR4表达，并通过胰岛素增加肝脏FGFR4表达。与野生型小鼠相比，FGFR4缺失小鼠还响应于不同的营养条件而显示脂质谱的变化。用FGF 19治疗肥胖小鼠增加代谢率和改善肥胖、肝脂肪变性、胰岛素敏感性和血浆脂质水平，并且还抑制肝脏脂肪酸合成和糖异生，同时增加糖原合成。肥胖小鼠中FGFR4的反义减少还导致体重和肥胖减少、胰岛素敏感性和肝脏脂肪变性的改善以及血浆FGF15(小鼠等效的FGF19)水平，而没有任何明显的毒性(Yu等人，同上)。因此，本发明的方法和组合物可用于通过使用本文所述的 dTAG***策略，通过靶向降解降低FGFR4的表达来治疗肥胖症。

多发性硬化症(MS)是中枢神经***的慢性，致残性自身免疫疾病，其特征在于炎症、脱髓鞘和轴突破坏。与复发性MS相关的突发 (发生在85至95％的患者中)被认为与活化的淋巴细胞进入大脑有关。目前可用的治疗仅能够使复发率抑制约30％。炎症反应诱导血管粘附分子-1(VCAM-1)在血管内皮上的表达，并且淋巴细胞与VCAM-1 的粘附是允许活化的细胞通过进入脑的必需步骤。淋巴细胞对 VCAM-1的粘附是通过非常晚期的抗原-4(VLA-4，也称为α4β1整合素)与活化淋巴细胞表面的结合来介导的(Wolf et al.(2013)PLosOne 8(3):e58438)。这种相互作用的破坏一直是抗VLA-4特异性抗体和小分子拮抗剂的治疗用途背后的思想(Wolf等人，同上)。因此，本发明的材料和方法可用于通过使用本文所述的dTAG***策略的靶向降解来靶向VCAM-1或VLA-4表达。

另一种感兴趣的疾病是库欣病/综合征(CS)。在该疾病中，由于肾上腺的表达增加，患者的血清糖皮质激素水平升高。CS是一种罕见的疾病，发病率在每年1.8至2.4名患者/百万之间。内源性CS的最常见原因是产生ACTH的垂体腺瘤，在约70％的CS患者中可见。产生皮质醇的肾上腺腺瘤和产生异位ACTH的肿瘤较少见，各占约 10至15％。垂体源性CS患者的一线治疗是经蝶窦垂体手术(TSS)和产生皮质醇的肾上腺腺瘤的单侧肾上腺切除术。单侧肾上腺切除术在几乎所有产生皮质醇的肾上腺腺瘤患者中都是有效的，并且永久性肾上腺皮质功能不全是罕见的。相反，垂体功能减退症在TSS后是常见的，范围在13％和81％之间(参见，Ragnarsson and Johannsson(2013)Eur J Endocrin 169:139)。然而，在一些患者中，手术切除不成功，因此指示了药物治疗。一种方法是通过靶向糖皮质激素受体(GCCR)来抑制高皮质醇血症的活性，例如，使用米非司酮 (Mifepristone)(也称为RU486)，其为一种GCCR拮抗剂(参见 Johanssen and Allolio(2007)Eur J Endocrin 157:561)。然而，RU 486还有其他一些活动(最值得注意的是，在怀孕患者中诱导堕胎)。因此，本发明的方法和组合物可用于通过使用本文所述的dTAG插入策略，通过靶向降解降低表达来靶向GCCR。

转甲状腺素蛋白淀粉样变性(TTRA)是几种怀疑与错误折叠和聚集的蛋白质(淀粉样蛋白)相关的退行性疾病之一。运甲状腺素蛋白 (TTR)是在肝脏中产生的四聚体，分泌到血流中，以用于运输全视网膜结合蛋白。然而，在构象变化时，它变成淀粉样蛋白。部分展开暴露出延伸构象中的疏水残基片段，其最终在交叉β片层淀粉样蛋白结构之前，有效率地错误组装成基本上非结构化的球形聚集体(参见， Johnson et al.(2012)J Mol Biol421(2-3):183)。TTRA可发生在散发性和常染色体显性遗传形式的患者中，包括家族性淀粉样多发性神经病(FAP)和家族性淀粉样心肌病(FAC)。这些遗传形式通常较早发作并且涉及TTR基因中描述的超过100个点突变。通常，突变所具有的蛋白质越不稳定，就越有可能具有一定量的淀粉样蛋白病理学。形成的淀粉样蛋白导致FAC中的心脏组织或FAP中的外周和中枢神经组织的选择性破坏。治疗这些疾病的一些新的治疗策略，例如抑制性RNA策略，主要是试图减少TTR的量以降低蛋白质的聚集潜力 (Johnson等人，同上)。因此，通常通过使用本文所述的dTAG*** 策略的靶向降解，本发明的方法和组合物可用于靶向TTR以努力减少TTR蛋白的病理形式的量和/或降低TTR浓度。

还可以使用本发明的方法来治疗肌肉疾病。脊髓性肌萎缩症是由 SMN1基因突变引起的常染色体隐性遗传疾病，其编码“运动神经元存活”(SMN)蛋白，特征在于一般的肌肉萎缩和运动障碍。SMN蛋白参与剪接体机器的组分的组装，并且SMN1基因中的若干缺陷与导致成熟mRNA的外显子7被特异性排除的剪接缺陷相关。这些缺陷在脊髓运动神经元中尤为普遍，并且可引起脊髓性肌肉萎缩。SMN1 缺陷的严重性可以通过称为SMN2的SMN1的旁路来修改。SMN2 基因序列与外显子7和8中的少数单核苷酸多态性以及内含子序列中的几个单核苷酸多态性不同于SMN1。因此，通常通过使用本文所述的dTAG***策略的靶向降解，本发明的方法和组合物可用于靶向 SMN1以努力减少SMN1蛋白的病理形式的量和/或降低SMN1浓度。

生长激素(GH)分泌的失调可导致肢端肥大症，这是一种不成比例的骨骼，组织和器官生长的疾病，在40岁左右首次变得明显 (Roberts and Katznelson(2006)USEndocrine Disease:71)。它的发病率约为每百万例有5例，诊断需要确定GH分泌失调和IGF1水平升高。口服葡萄糖负荷后2小时内不能抑制GH分泌通常用于肢端肥大症的诊断。GH分泌的正常调节由脑下垂体进行。下丘脑GH释放激素(GHRH)、生长素释放肽和生长抑素通过垂体前叶生长激素细胞调节GH产生。编码GH受体或GHR的基因被广泛表达，当GH分子与GHR二聚体相互作用时，信号经由JAK2依赖性和独立的细胞内信号转导途径进行(参见，Melmed(2009)J Clin Invest 119(11):3189)。循环GH刺激***-1(IGF-1)的肝分泌。当良性垂体肿瘤导致GH分泌增加并因此导致IGF-1分泌增加时，发生肢端肥大症。与肢端肥大症相关的一个GHR突变在外显子3中具有框内缺失，其导致蛋白质中22个氨基酸的缺失。这种被称为d3- GHR的突变受体导致GH反应性增强。目前的疗法集中在通常通过手术切除垂体肿瘤的GH和IGF-1水平的正常化。由于GH诱导 IGF-1的分泌，靶向GHR是本发明方法和组合物的有吸引力的靶标。因此，本发明的方法和组合物可用于通过使用本文所述的dTAG插入策略通过靶向降解降低表达来靶向GHR。

与肌肉萎缩相关的另一种疾病是肌强直性营养不良，其是一种慢性疾病，特征在于肌肉萎缩、白内障、心脏传导缺陷、内分泌变化、多器官损伤和肌强直(自主收缩后长时间的肌肉收缩)。强直性肌营养不良的发生率约为每10万人中有13人，有两种形式的疾病，即1型肌强直性营养不良(也称为Steinert病、MMD1或DM1，并且是最常见)和2型肌强直性营养不良(MMD2或DM2)。两者都是由两个基因的3'非编码区(1型的DMPK基因(编码肌营养不良肌肉蛋白激酶)中的CTG中和2型的ZNF9基因(编码细胞核酸-结合蛋白)中的CCTG) 和DM1的异常扩增引起的遗传性常染色体显性疾病是成人中最常见的肌营养不良形式。这些突变导致RNA内含物或病灶中突变转录物的毒性核内积累(参见Caillet-Boudin et al.,(2014)Front.Mol. Neurosci doi:10.3389)。1型患者的CTG拷贝数大于50且具有不同的表型，范围从无症状到严重。已经使用反义RNA技术在体外引起突变体DMPK转录物的特异性破坏，其对DM1成肌细胞的增殖速率没有影响但恢复了它们的分化(Furling et al.(2003)Gene Therapy 10:795)。因此，本发明的方法和组合物可用于通过使用本文所述的dTAG***策略的靶向降解来靶向营养不良肌组织蛋白激酶或细胞核酸结合蛋白。

慢性疼痛是一个主要的健康问题，在他们的生命中的某个时间影响着8000万美国人，其具有显着的相关发病率和对个体生活质量的影响。慢性疼痛可由多种炎症和神经损伤事件引起，包括癌症，传染病，自身免疫相关综合征和手术。电压门控钠通道(VGSC)是调节神经元兴奋性的基础，这些通道的过度表达可以产生异常的自发放电模式，从而支持慢性疼痛。在神经***中至少有九种不同的VGSC亚型，并且每种亚型在功能上可以分类为对河豚毒素敏感或对河豚毒素具有抗性。包括Nav1.3、Nav1.7、Nav1.8和Nav1.9在内的神经元钠通道亚型与伤害性信息的处理有关。VGSC Nav1.8是一种抗河豚毒素的钠通道，其分布仅限于初级传入神经元，大多数含Nav1.8的传入神经传递伤害信号到脊髓的疼痛处理区域。炎症或神经损伤后 Nav1.8(由PN3编码)的表达、运输和再分布的变化被认为是传入神经敏感和疼痛产生的主要原因(参见Schuelert and McDougall(2012) ArthritisRes Ther 14:R5)。骨关节炎的啮齿动物模型已经证明，在脊髓中具有突触连接的外周神经上Nav1.8通道的抑制是伤害性感觉处理的有希望的治疗，并且可以有助于实现更明显和更持久的镇痛。因此，本发明的方法和组合物可用于通过使用本文所述的dTAG插入策略，通过靶向降解降低NAV1.8的局部表达来治疗慢性疼痛。

还可以如本文所述靶向癌症。癌症是一个通用术语，用于描述由于缺乏细胞生长调节而联合起来的许多特定疾病。由于有许多形式，涉及无数不同的细胞类型，还有许多与癌症有关的特定基因靶标。例如，由CLU基因编码的簇蛋白(也称为载脂蛋白J)是在蛋白水解切割成初级多肽CLU基因产物的两条链后组装的异二聚体蛋白。近年来，已发现有两种形式的凝聚素，分泌和高度糖基化形式(sCLU)和核形式(nCLU)，其中nCLU首先被合成为在细胞质中发现的前核形式 (pnCLU)。两个CLU表单之间的差异与CLU消息的可选拼接和消息转换期间的起始ATG的选择有关。sCLU的转译利用全长CLU mRNA中的第一个AUG，而pnCLU的转译是从剪接依赖性去除转录的前导区段和外显子1的全长mRNA后的第二个框内AUG开始的。sCLU形式似乎促进细胞存活，而nCLU形式与细胞凋亡相关。已经在许多肿瘤类型中发现了sCLU形式的蛋白质的过表达，包括前列腺癌，皮肤癌，胰腺癌，乳腺癌，肺癌和结肠癌，以及食道鳞状细胞癌和神经母细胞瘤。此外，一些癌症类型向高级别和转移性形式的进展导致sCLU水平升高(Shannan et al.(2006)Cell Death Dif 13:12)。在乳腺癌和***癌的I期研究中已经使用特异性反义寡核苷酸(ASO)与标准治疗组合引起沉默sCLU表达，仅在接受ASO和标准治疗剂(Shannon，同上)的患者中观察到凋亡增加。因此，本发明的方法和组合物可用于使用本文所述的dTAG***策略通过靶向降解来治疗标记有sCLU表达增加的癌症。

另一种似乎具有致癌作用的蛋白质是真核转译起始因子4E(eIF- 4E)。eIF3-4E与真核mRNA的M7GpppN帽(其中N是任何核苷酸) 结合，并且是形成eIF-4F复合物的限速成员。eIF-4E通常与eIF-4F 复合物中的eIF-4G复合，并且在正常生理条件下，eIF-4E的可用性受到称为4E-BP(用于从eIF-4G隔离eIF-4E)的抑制蛋白家族的结合的负调节。由于eIF-4E通常以低水平表达，mRNA竞争待转译的可用eIF-4E。具有短的非结构化5'UTR的mRNA被认为对转译更具竞争性，因为它们较少依赖于eIF-4F复合物中发现的解旋活性。然后高度结构的mRNA更依赖于eIF-4E的转译结合，因此当eIF3-4E过表达时，这些mRNA更容易转译。生长促进基因产物如细胞周期蛋白D1，VEGF，c-myc，FGF2，乙酰肝素酶，ODC和MMP9具有这些复杂的5'UTR(Mamane et al.(2004)Oncogene 23:3172,Fischer (2009)Cell Cycle 8(16):2535)。另外，eIF-4E可以在核孔复合物的修饰中起作用并导致这些相同mRNA转运到细胞质中的增加 (Culjikovic-Kraljacic et al.,(2012)Cell Reports 2 p.207)。eIF-4E与致癌细胞转化有关，并且在几种癌症类型中过表达，包括急性髓性白血病，结肠癌，乳腺癌，膀胱癌，肺癌，***癌，胃肠道癌，头颈癌，霍奇金淋巴瘤和神经母细胞瘤，并且水平升高与疾病等级越来越高。已经通过几种不同的方法尝试靶向eIF-4E，包括过表达4E-BP 和由其衍生的肽，开发用于预防eIF-4E:eIFG相互作用的小分子抑制剂:，以及eIF-4E特异性的反义寡核苷酸(ASO)(Jia et al.(2012)Med Res Rev 00，No.00:1-29)。ASO给药已证实体外肿瘤细胞中eIF- 4E表达的敲低，以及体内小鼠模型中的异种移植肿瘤中的表达。在这些小鼠模型中，eIF-4E的表达水平降低了80％而没有任何总蛋白质转译的降低并且没有任何明显的毒性，同时增加对化学治疗剂的化学敏感性，增加癌细胞凋亡和抑制肿瘤生长(Jia，同上)。因此，本发明的方法和组合物可用于治疗或预防各种癌症。可以使用本文所述的 dTAG***策略，通过降解来调节eIF-4F的表达。

经由受体VEGFR起作用的血管内皮受体(VEGF)在正常发育中起作用，并且还在癌症中的病理性血管发生中发挥作用。在人类中，存在五种不同的VEGF家族成员：VEGF-A(也称为VEGF)；胎盘生长因子(PIGF)、VEGF-B、VEGF-C和VEGF-D。VEGF-A还具有三种常见亚型：VEGF-121、VEGF-165和VEGF-189。各种VEGF在血管生成中具有不同的作用，VEGF-A主要参与正常血管生成以及肿瘤生长和转移，而VEGF-C和VEGF-D参与正常***生成和恶性***转移。此外，VEGF-A亚型在激素反应性肿瘤中也可具有特异性生长促进活性。基于该知识，许多抗体和小分子激酶抑制剂直接抑制VEGF-VEGFR相互作用或通过相互作用激活信号转导途径。然而，这些治疗剂通常具有显着且潜在麻烦的副作用特征，使得正在进行积极研究以开发具有增加的特异性的抑制剂(Shibuya，(2014)Biomol Ther 11(1):1-9)。因此，本发明的方法和组合物可用于通过使用本文所述的dTAG***策略通过降解靶向特定VEGF蛋白来预防或治疗受试者中的癌症。

另一种在几种癌症中起作用的蛋白质是由KIF11基因编码的驱动蛋白纺锤体蛋白(KSP)。目前使用的最成功的抗癌疗法靶向微管，其中这些试剂已用于治疗乳腺癌，肺癌，卵巢癌，膀胱癌和头颈癌。微管是有丝***纺锤体的一部分，因此靶向它们成功地抑制快速*** 的癌细胞，但微管也是细胞骨架的一部分，因此用这些试剂治疗也与严重的副作用有关。驱动蛋白，特别是驱动蛋白纺锤体蛋白，是一种与纺锤体纤维结合的运动蛋白，用于在细胞***的染色体分离过程中迫使纺锤体纤维分开。因此，使用KSP特异性抗有丝***剂靶向KSP将仅靶向***细胞，并且可能具有较少的副作用。消耗KSP的药剂选择性地导致有丝***中的细胞周期停滞，其在长时间后导致细胞凋亡。KSP在***组织中也很丰富，并且在乳腺，结肠，肺，卵巢和子宫的肿瘤中高度表达(Sarli andGiannis,(2008)ClinCancer Res 14:7583)。此外，正在进行临床试验，使用在肝脏受累的癌症患者中同时靶向KSP和VEGF的RNA干扰(Tabernero et al., (2013)Cancer Discovery 3:406)。因此，本发明的方法和组合物可用于通过使用本文所述的dTAG***策略靶向降解驱动蛋白纺锤体蛋白(KSP)来治疗或预防癌症。

热休克蛋白27(HSP 27，也称为热休克蛋白β-1或HSPB1)是另一种与癌症有关的蛋白质。由HSPB1基因编码的HSP 27是一种热休克蛋白，其最初的特征在于响应于热休克作为小伴侣蛋白，其促进受损蛋白质的适当重折叠。然而，正在进行的调查显示它还参与对细胞应激条件的反应，如氧化应激和化学应激，似乎具有抗细胞凋亡活性，并且能够在热休克和其他应激条件下调节肌动蛋白细胞骨架动力学(Vidyasagar)et al.(2012)Fibrogen Tis Rep 5(7))。此外，抑制 HSP 27可能在癌症的长期休眠中发挥作用，因为研究表明HSP 27 在血管生成的乳腺癌细胞中上调，并且体内HSP 27的抑制导致长期肿瘤休眠(Straume et al.(2012)Proc Natl Acad Sci USA 109(22):8699-8704)。肿瘤细胞中热休克蛋白的表达增加与p53功能的丧失和原癌基因如c-myc的上调有关。HSP 27的抗细胞凋亡活性可保护肿瘤细胞，并且已被证明与乳腺癌和白血病中的化疗耐药性有关(Vidysagar，同上)。因此，HSP 27可以是癌症治疗的合适靶标，其中蛋白质的抑制剂可以与已知的化学疗法组合使用以增强其活性。与单独的药剂相比，当与传统的化学治疗剂组合时，HSP 27抑制剂槲皮素已经显示出显着降低体内肿瘤体积。此外，目前在肺癌，卵巢癌，乳腺癌和胰腺癌(Vidyasagar，同上)的临床研究中评估HSP 27 抑制性ASO。因此，本发明的方法和组合物可用于通过使用本文所述的dTAG***策略，通过HSP 27的靶向降解抑制HSP 27表达来治疗癌症。

几种激酶一直是抗癌治疗研究的目标，因为它们通常是细胞生长的关键调节剂。然而，在信号传导途径的下游，突变激酶的作用常见于由STAT3基因编码的转录3蛋白或STAT3的信号转导和激活因子的上调。此外，似乎乙型肝炎和丙型肝炎都会激活Stat3，两者都与肝癌的发展有关。因此，HepB和HepC病毒可能破坏Stat3信号传导途径并促进肝细胞转化(Li et al.,(2006)Clin Cancer Res 12(23):7140)。

RAS蛋白是一类在细胞分化，增殖和存活中起作用的蛋白质。 RAS蛋白家族的各种成员已经涉及癌症，因为已经发现异常RAS信号传导在大约30％的所有癌症中发挥作用。KRAS蛋白(也称为V- Ki-ras2 Kirsten大鼠肉瘤病毒致癌基因同源物)是在正常组织信号传导中发挥基本功能的GTP酶。KRAS是一个有吸引力的癌症靶标，因为KRAS基因中的频繁点突变使得蛋白质具有组成型活性。因此， KRAS可以是癌症治疗的合适靶标，其中靶向KRAS蛋白功能的小分子可用于治疗优势，包括与已知化学疗法组合以增强其活性。在一个具体例中，本发明的方法和组合物可用于通过使用本文所述的 dTAG***策略，通过靶向降解KRAS调节KRAS表达来治疗癌症。

所有各种Stat蛋白都是转录因子，主要介导细胞因子和生长因子受体的信号传导。例如，IL6和IL11与它们各自的受体亚基结合并触发gp130的同源二聚化，该gp130是触发Stat3激活的跨膜受体。在经由生长因子受体的磷酸化活化后，STAT3蛋白质二聚化并穿过细胞核并以序列特异性方式与DNA结合，上调许多参与细胞增殖的基因。各种类型的肿瘤细胞通常具有导致STAT3过表达的激酶突变，因此不考虑每种特异性突变激酶下，STAT3表达的降低可能对多种来源的癌症有益(Jarnicki et al.(2010)Cell Div 5:14)。Stat3通过几种机制导致恶性肿瘤。它通过上调促存活/抗凋亡Bcl2蛋白抑制细胞凋亡，并主要通过刺激细胞周期蛋白B1，cdc2，c-myc，VEGF， H1F1α和细胞周期蛋白D1的表达以及通过抑制细胞周期抑制剂p21 来促进增殖。Stat3还通过诱导细胞外基质降解金属蛋白酶(包括MMP-2和MMP-9)促进肿瘤转移。在正常生理状态中，Stat3功能被转录抑制剂Socs3抑制，其通常由Stat3诱导以维持细胞中的生长平衡。然而，在恶性细胞中，Stat3过表达可以克服Socs3抑制。因此，本发明的方法和组合物可用于通过使用本文所述的dTAG***策略靶向降解Stat3来抑制Stat3功能并预防或治疗癌症。

***癌(PCa)是一种雄激素依赖性疾病，在美国仍然是导致死亡的主要原因之一，并且是男性癌症死亡的主要原因。虽然已经进行了多项研究，表明多达42％的***癌病例具有遗传联系(Mazaris and Tsiotras(2013)Nephro Urol Mon 5(3):792-800)，但已观察到几种类型的遗传模式(例如X连锁，常染色体显性遗传，常染色体隐性遗传)表明没有一个单一的基因或基因突变导致PCa的遗传。该癌症依赖于雄激素受体对生长和进展的活性(Mahmoud et al,(2013)PLoS One 8(10):e78479)。通常，PCa可以是一种进展缓慢的疾病，可以使用相当保守的方法治疗，但在约25至30％的病例中，癌症可能是导致患者死亡的侵袭性癌症。在转移性疾病的情况下，70至80％的患者最初对雄激素剥夺疗法起反应，但在后期阶段，肿瘤变得激素难治并且更具侵袭性，导致预后恶化(Mazaris和Tsiotras，同上)。激素难治性PCa不依赖于循环雄激素，而是通过AR扩增，生长因子失调和AR共扩辅助因素。另外，AR配体结合结构域中的突变可导致AR对极低循环雄激素水平过敏或对扩展的一组配体如***，孕激素，肾上腺素类固醇和抗雄激素敏感。尽管癌症依赖于AR的活性，但在AR配体结合结构域中经历这些类型突变的肿瘤细胞可能不再对抗雄激素疗法敏感。通常，AR存在于细胞质中并且被热休克蛋白结合，以防止其活化。在暴露于雄激素时，受体能够二聚化并进入细胞核以促进几种生长相关基因的表达。因此，本发明的方法和组合物可用于通过使用本文所述的dTAG***策略靶向雄激素受体的降解以在所有阶段治疗PCa。

C.dTAG的基因组框内***

如上所述，本发明的方法基于将dTAG基因组框内***表达感兴趣的内源性蛋白质的基因。如本文所考虑的，表达经5'-或3'框内 ***编码dTAG的核酸序列所得的核酸序列时，产生内源性蛋白质- dTAG杂合蛋白，其在给药特定的异双功能性化合物后可被靶标降解。

编码dTAG的核酸序列的框内***可以通过任何已知和有效的基因组编辑方法进行或实现。在一个方面，本发明利用CRISPR- Cas9***产生敲入的内源性蛋白质-dTAG融合蛋白，其由内源性基因座产生并且易于以配体依赖性、可逆性和剂量响应性方式降解。在某些具体例中，使用CRISPR-Cas9***以***存在于同源重组 (HR)“供体”序列中的dTAG的表达盒，其中在CRISPR-Cas内核化后的同源重组过程中，dTAG核酸序列用作***感兴趣的蛋白质的基因组基因座的“供体”序列。HR靶向载体在表达盒的5'和3'末端含有与靶向感兴趣的基因周围的基因组DNA同源的同源臂。通过将编码 dTAG的核酸序列与感兴趣的靶基因融合，所得融合蛋白含有被异双功能性化合物靶向的dTAG。

本发明提供了***感兴趣的靶基因框内的外源dTAG序列(也称为“供体序列”或“供体”或“转基因”)，并且所得融合蛋白含有被异双功能性化合物靶向的dTAG。显而易见的将是，供体序列不需要与放置它的基因组序列相同。供体序列可含有侧接两个同源区域的非同源序列，以允许在感兴趣的位置处有效率的HR。另外，供体序列可包含含有与细胞染色质中的感兴趣区域不同源的序列的载体分子。供体分子可含有几个与细胞染色质同源的不连续区域。例如，对于通常不存在于感兴趣区域中的序列的靶向***，例如，本发明的dTAG，所述序列可以存在于供体核酸分子中，并且侧接与感兴趣的区域的序列同源的区域。或者，可以通过非同源末端连接(NHEJ)机制将供体分子整合到切割的靶基因座中。参见例如U.S.2007/0207221和 U.S.2007/0326645，其通过引用方式并入本文。

用于***的供体dTAG编码序列可以是DNA或RNA，单股和/ 或双股，并且可以以线性或环状形式引入细胞中。参见例如 U.S.2010/0047805、U.S.2007/0281361和2011/0207221，其通过引用方式并入本文。供体序列可以以圆形或线性形式引入细胞中。如果以线性形式引入，可以通过本领域技术人员已知的方法保护供体序列的末端(例如，免于核酸外切降解)。例如，将一个或多个双脱氧核苷酸残基添加到线性分子的3'端和/或将自身互补的寡核苷酸连接到一端或两端。参见，例如，Chang et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.84, (1987):4959-4963和Nehls et al.,Science,272,(1996):886-889。用于保护外源多核苷酸免于降解的其他方法包括但不限于添加末端氨基和使用修饰的核苷酸间键，例如硫代磷酸酯，氨基磷酸酯和O-甲基核糖或脱氧核糖残基。

编码dTAG的供体多核苷酸可作为载体分子的一部分引入细胞中，该载体分子具有额外的序列，例如CRISPR-Cas序列，复制起点，启动子和编码抗生素抗性的基因。此外，供体多核苷酸可以作为裸核酸引入，作为与诸如脂质体或泊洛沙姆之类的试剂复合的核酸，或者可以通过病毒(例如，腺病毒，AAV，疱疹病毒，逆转录病毒，慢病毒和整合酶缺陷型慢病毒(IDLV))递送。

本发明利用了充分表征的***策略，例如CRISPR-Cas9***。通常，“CRISPR***”统称为涉及表达或引导CRISPR相关(“Cas”)基因活性的转录物和其他元件，包括编码Cas基因的序列，tracr(反式激活CRISPR)序列(例如tracrRNA或活性部分tracrRNA)，tracr配对序列(涵盖在内源CRISPR***的背景下的“直接重复”和tracrRNA 加工的部分直接重复)，引导序列(也称为在内源CRISPR***的的背景下的“间隔区”)，和/或来自CRISPR基因座的其他序列和转录物。 (参见，例如，Ruan,J.et al.“Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated transgene knockin at the H11 locus in pigs.”Sci.Rep.5, (2015):14253；and Park A,Won ST,Pentecost M,Bartkowski W,and Lee B“CRISPR/Cas9 AllowsEfficient and Complete Knock-In of a Destabilization Domain-Tagged EssentialProtein in a Human Cell Line,Allowing Rapid Knockdown of Protein Function.”PLoS ONE 9(4),(2014):e95101,both incorporated herein by reference，均通过引用方式并入本文)。

Cas核酸酶是一种众所周知的分子。例如，Cas-9核酸酶基因编码的蛋白质序列可以在SwissProt数据库中找到，登录号为Q99ZW2 -(SEQ.ID.NO.:52):

MDKKYSIGLDIGTNSVGWAVITDEYKVPSKKFKVLGNTDRHSIK KNLIGALLFDSGETAEATRLKRTARRRYTRRKNRICYLQEIFSNE MAKVDDSFFHRLEESFLVEEDKKHERHPIFGNIVDEVAYHEKYP TIYHLRKKLVDSTDKADLRLIYLALAHMIKFRGHFLIEGDLNPDN SDVDKLFIQLVQTYNQLFEENPINASGVDAKAILSARLSKSRRLE NLIAQLPGEKKNGLFGNLIALSLGLTPNFKSNFDLAEDAKLQLSK DTYDDDLDNLLAQIGDQYADLFLAAKNLSDAILLSDILRVNTEIT KAPLSASMIKRYDEHHQDLTLLKALVRQQLPEKYKEIFFDQSKN GYAGYIDGGASQEEFYKFIKPILEKMDGTEELLVKLNREDLLRK QRTFDNGSIPHQIHLGELHAILRRQEDFYPFLKDNREKIEKILTFRI PYYVGPLARGNSRFAWMTRKSEETITPWNFEEVVDKGASAQSFI ERMTNFDKNLPNEKVLPKHSLLYEYFTVYNELTKVKYVTEGMR KPAFLSGEQKKAIVDLLFKTNRKVTVKQLKEDYFKKIECFDSVEI SGVEDRFNASLGTYHDLLKIIKDKDFLDNEENEDILEDIVLTLTLF EDREMIEERLKTYAHLFDDKVMKQLKRRRYTGWGRLSRKLINGI RDKQSGKTILDFLKSDGFANRNFMQLIHDDSLTFKEDIQKAQVS GQGDSLHEHIANLAGSPAIKKGILQTVKVVDELVKVMGRHKPEN IVIEMARENQTTQKGQKNSRERMKRIEEGIKELGSQILKEHPVEN TQLQNEKLYLYYLQNGRDMYVDQELDINRLSDYDVDHIVPQSF LKDDSIDNKVLTRSDKNRGKSDNVPSEEVVKKMKNYWRQLLNA KLITQRKFDNLTKAERGGLSELDKAGFIKRQLVETRQITKHVAQI LDSRMNTKYDENDKLIREVKVITLKSKLVSDFRKDFQFYKVREI NNYHHAHDAYLNAVVGTALIKKYPKLESEFVYGDYKVYDVRK MIAKSEQEIGKATAKYFFYSNIMNFFKTEITLANGEIRKRPLIETN GETGEIVWDKGRDFATVRKVLSMPQVNIVKKTEVQTGGFSKESI LPKRNSDKLIARKKDWDPKKYGGFDSPTVAYSVLVVAKVEKGK SKKLKSVKELLGITIMERSSFEKNPIDFLEAKGYKEVKKDLIIKLP KYSLFELENGRKRMLASAGELQKGNELALPSKYVNFLYLASHYE KLKGSPEDNEQKQLFVEQHKHYLDEIIEQISEFSKRVILADANLD KVLSAYNKHRDKPIREQAENIIHLFTLTNLGAPAAFKYFDTTIDR KRYTSTKEVLDATLIHQSITGLYETRIDLSQLGGD。

在一些具体例中，CRISPR/Cas核酸酶或CRISPR/Cas核酸酶系统包括具有核酸酶功能(例如，两个核酸酶结构域)的序列特异性结合DNA的非编码RNA分子(引导)RNA和Cas蛋白(例如Cas9)。还包括编码dTAG的供体核苷酸，用于框内***感兴趣的蛋白质的基因组基因座。

在一些具体例中，CRISPR***的一种或多种元件衍生自I型， II型或III型CRISPR***。在一些具体例中，CRISPR***的一种或多种元件衍生自包含内源CRISPR***的特定生物，例如化脓性链球菌。

在一些具体例中，将Cas核酸酶和gRNA(包括对靶序列和固定的 tracrRNA特异的crRNA的融合物)和编码dTAG的供体序列引入细胞中。通常，gRNA的5'末端的靶位点使用互补碱基配对将Cas核酸酶靶向靶位点，例如基因。在一些具体例中，基于其位于原型间隔区相邻基序(PAM)序列的5'的位置选择靶位点，例如通常为NGG或NAG。在这方面，通过修饰引导RNA的前20个核苷酸以对应于靶DNA序列，将gRNA靶向所需序列。

在一些具体例中，CRISPR***在靶位点诱导DSB，然后将编码 dTAG的供体序列同源重组到感兴趣的蛋白质的基因组基因座中，如本文所讨论的。在其他具体例中，认为“切口酶”(nickases)的Cas9 变体用于在靶位点切割单股。在一些方面，使用成对的切口酶，例如，以提高特异性，各自由靶向序列的一对不同gRNA引导，使得在同时引入切口时，引入5'突出端。

通常，CRISPR***的特征在于促进靶序列位点处CRISPR复合物形成的元件。通常，在形成CRISPR复合物的背景下，“靶序列”通常是引导序列被设计为具有互补性的序列，其中靶序列和引导序列之间的杂交促进CRISPR复合物的形成，并且其中发生***编码dTAG的供体序列。如果存在足够的互补性以引起杂交并促进CRISPR复合物的形成，则不一定需要完全互补。

通常，在内源CRISPR***的背景下，CRISPR复合物(包含与靶序列杂交并与一种或多种Cas蛋白复合的引导序列)的形成导致一条或两条股在靶序列中或附近(例如，来自的2个，3个，4个，5个， 6个，7个，8个，9个，10个，20个，50个或更多个碱基对内)的切割。不希望受理论束缚，tracr序列可包含野生型tracr序列(例如，约或大于约20、26、32、45、48、54、63、67、85或更多个核苷酸的野生型tracr序列)的全部或部分或由其组成也可以形成CRISPR复合物的一部分，例如通过沿着至少一部分tracr序列杂交到可操作地连接到引导序列的tracr配对序列的全部或部分。在一些具体例中，tracr序列与tracr配对序列具有足够的互补性以杂交并参与CRISPR复合物的形成。

与靶序列一样，在一些具体例中，不一定需要完全互补。在一些具体例中，当最佳比对时，tracr序列沿着tracr配对序列的长度具有至少50％，60％，70％，80％，90％，95％或99％的序列互补性。在一些具体例中，将驱动CRISPR***的一种或多种元件的表达的一种或多种载体引入细胞中，使得CRISPR***的元件的表达引导在一个或多个靶位点形成CRISPR复合物。例如，Cas酶，与tracr 配对序列连接的引导序列和tracr序列可各自与分开的载体上的分离的调节元件可操作地连接。或者，可以将由相同或不同调节元件表达的两种或更多种元件组合在单一载体中，其中一种或多种另外的载体提供不包含在第一载体中的CRISPR***的任何组分。在一些具体例中，组合在单一载体中的CRISPR***元件可以以任何合适的方向排列，例如相对于第二组件的(“上游”)的5'位或相对于第二组件的 (“下游”)的3'位。一个元件的编码序列可以位于第二元件的编码序列的相同或相反的股上，并且以相同或相反的方向取向。在一些具体例中，单个启动子驱动编码CRISPR酶的转录物和一个或多个引导序列，tracr配对序列(任选地与引导序列可操作地连接)和嵌入一个或多个内含子序列内的tracr序列(例如，每个在不同的内含子中，两个或更多个在至少一个内含子中，或全部在单个内含子中)的表达。在一些具体例中，CRISPR酶，引导序列，tracr配对序列和tracr序列与相同的启动子可操作地连接并表达。

在一些具体例中，载体包含与编码CRISPR RNA引导的内切核酸酶的酶编码序列可操作地连接的调节元件。在一些具体例中，载体包含与编码CRISPR酶的酶编码序列可操作地连接的调节元件，例如Cas蛋白。Cas蛋白的非限制性实例包括Cas1，Cas1B，Cas2，Cas3，Cas4，Cas5，Cas6，Cas7，Cas8，Cas9(也称为CsnI和 Csx12)，Cas10，Csyl，Csy2，Csy3，CseI，Cse2，Cscl，Csc2，Csa5，Csn2，Csm2，Csm3，Csm4，Csm5，Csm6，Cmr1，Cmr3， Cmr4，Cmr5，Cmr6，Csbl，Csb2，Csb3，Csx17，Csx14，Csx10， Csx16，CsaX，Csx3，Csxl，Csx15，Csfl，Csf2，Csf3，Csf4， Cpf1，其同源物或其修饰形式(参见WO2015/2003334，其通过引用方式并入本文)。这些酶是已知的；例如，化脓性链球菌Cas9蛋白的氨基酸序列可以在登录号Q99ZW2的SwissProt数据库中找到(其通过引用并入本文)。

Cas蛋白通常包含至少一个RNA识别或结合结构域。此类结构域可与引导RNA(gRNA，下文更详细描述)相互作用。Cas蛋白还可以包含核酸酶结构域，例如核酸内切酶结构域(例如，DNase或 RNase结构域)，DNA结合结构域，解旋酶结构域，蛋白质-蛋白质相互作用结构域，二聚化结构域和其他结构域。核酸酶结构域具有核酸切割的催化活性。切割包括核酸分子的共价键的断裂。切割可以产生平末端或交错末端，并且它可以是单股或双股的。

Cas蛋白的实例包括Cas1，Cas1B，Cas2，Cas3，Cas4，Cas5， Cas5e(CasD)，Cas6，Cas6e，Cas6f，Cas7，Cas8al，Cas8a2， Cas8b，Cas8c，Cas9(CsnI或Csx12)，Cas10，Cas10d，CasF， CasG，CasH，Csyl，Csy2，Csy3，CseI(CasA)，Cse2(CasB)， Cse3(CasE)，Cse4(CasC)，Cscl，Csc2，Csa5，Csn2，Csm2， Csm3，Csm4，Csm5，Csm6，Cmr1，Cmr3，Cmr4，Cmr5，Cmr6， Csbl，Csb2，Csb3，Csx17，Csx14，Csx10，Csx16，Csx14，Csx3， Csx1，Csx15，Csf1，Csf2，Csf3，Csf4和Cul966，及其同源物或修饰形式(参见WO2015/232334，其通过引用并入本文)。

任何诱导切口或双股断裂成所需识别位点的Cas蛋白可用于本文揭露的方法和组合物中。

通常，引导序列是与靶多核苷酸序列具有足够互补性的任何多核苷酸序列，以与靶序列杂交并且将CRISPR复合物与靶序列直接序列特异性结合。在一些具体例中，当使用合适的比对算法最佳比对时，引导序列与其相应的靶序列之间的互补程度为约50％，60％，75％， 80％，85％，90％，95％，97.5％，99％或更多。

可以使用用于对准序列的任何合适的算法来确定最佳对准，其非限制性示例包括Smith-Waterman算法，Needleman-Wunsch算法，基于Burrows-Wheeler变换的算法(例如Burrows Wheeler Aligner)， Clustal W，Clustal X，BLAT，Novoalign(NovocraftTechnologies， ELAND(Illumina,San Diego,Calif.)，SOAP(可在 soap.genomics.org.cn获得)和Maq(可在maq.sourceforge.net获得)。在一些具体例中，引导序列的长度为约或大于约5、10、11、12、13、 14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、 29、30、35、40、45、50、57或更多的核苷酸，在一些具体例中，引导序列的长度小于约75、50、45、40、35、30、25、20、15、12 或更少的核苷酸。可以通过任何合适的测定来评估引导序列引导 CRISPR复合物与靶序列的序列特异性结合的能力。例如，CRISPR ***的组分足以形成CRISPR复合物，包括待测序的引导序列，可以提供给具有相应靶序列的细胞，例如通过用编码CRISPR序列组分的载体转染，然后评估靶序列内优先切割，例如通过本文所述的 Surveyor测定法。类似地，可以通过提供靶序列，CRISPR复合物的组分(包括待测序的引导序列和不同于测试引导序列的对照引导序列)，并比较在测试和对照引导序列反应之间的靶序列处的结合或切割速率，以评估在试管中靶多核苷酸序列的切割。

可以选择引导序列以靶向任何靶序列。在一些具体例中，靶序列是细胞基因组内的序列，特别是通过工程化内源性蛋白质-dTAG杂交体靶向受控降解的目的蛋白。示例性靶序列包括靶基因组中独特的靶序列，其提供dTAG供体核酸以框内取向***。在一些具体例中，选择引导序列以降低引导序列内的二级结构的程度。二级结构可以通过任何合适的多核苷酸折叠算法确定。

通常，tracr配对序列包括与tracr序列具有足够互补性的任何序列，以促进以下一者或多者：(1)在含有相应tracr序列的细胞中切除侧接tracr配对序列的引导序列；(2)在靶序列上形成CRISPR复合物，其中CRISPR复合物包含与tracr序列杂交的tracr配对序列。通常，互补程度参考tracr配对序列和tracr序列，沿着两个序列中较短的序列的长度的最佳比对。

如本文所考虑的，CRISPR-Cas***用于将编码dTAG的核酸序列与编码感兴趣的蛋白质的基因组序列框内***真核生物，例如人细胞中。在一些具体例中，该方法包括使CRISPR复合物结合感兴趣的靶蛋白的基因组序列以实现基因组序列的切割，其中CRISPR复合物包含复合在所述靶多核苷酸内与靶内序列杂交的引导序列的 CRISPR酶，其中所述引导序列与tracr配对序列连接，该tracr配对序列又与tracr序列杂交。

在一些方面，该方法包括通过引入编码dTAG的核酸来修饰多核苷酸在真核细胞中的表达。

在一些方面，将CRISPR-Cas***的多肽和供体序列给药或引入细胞。核酸通常以表达载体的形式给药，例如病毒表达载体。在一些方面，表达载体是逆转录病毒表达载体，腺病毒表达载体，DNA质粒表达载体或AAV表达载体。在一些方面，编码CRISPR-Cas*** 的一种或多种多核苷酸和递送至细胞的供体序列。在一些方面，递送是通过递送多于一种载体。

将核酸序列递送至如本文所述的细胞的方法描述于，例如，美国专利第8,586,526；6,453,242；6,503,717；6,534,261；6,599,692； 6,607,882；6,689,558；6,824,978；6,933,113；6,979,539；7,013,219；和 7,163,824号，所有这些专利的公开内容通过引用方式整体并入本文。

还可以使用含有编码一种或多种本文所述组合物的序列的载体递送如本文所述的各种多核苷酸。可以使用任何载体***，包括但不限于质粒载体，逆转录病毒载体，慢病毒载体，腺病毒载体，痘病毒载体；疱疹病毒载体和腺相关病毒载体等也参见美国专利第6,534,261； 6,607,882；6,824,978；6,933,113；6,979,539；7,013,219；和7,163,824 号，其通过引用方式整体并入本文。

非病毒递送核酸的方法包括脂质转染，核转染，显微注射，生物射弹，病毒体，脂质体，免疫脂质体，聚阳离子或脂质：核酸缀合物，裸DNA，人工病毒粒子和DNA的药剂增强摄取。脂转染(描述于例如美国专利第5,049,386、4,946,787；以及4,897,355)脂质转染试剂是市售的(例如Transfectam^TM和Lipofectin^TM)。适用于多核苷酸的有效受体-识别脂质转染的阳离子和中性脂质包括那些Feigner，WO 1991/17424和WO 1991/16024所具者。递送可以是细胞(例如体外或离体给药)或靶组织(例如体内给药)。

在一些具体例中，递送是通过使用基于RNA或DNA病毒的系统来递送核酸。一些方面的病毒载体可以向患者(体内)直接给药，或者它们可以用于体外或离体处理细胞，然后向患者给予给药。在一些具体例中，基于病毒的***包括用于基因转移的逆转录病毒，慢病毒，腺病毒，腺相关和单纯疱疹病毒载体。逆转录病毒的趋向性可以通过掺入外来包膜蛋白来改变，从而扩展靶细胞的潜在靶标群。慢病毒载体是能够转导或感染非***细胞并且通常产生高病毒滴度的逆转录病毒载体。逆转录病毒基因转移***的选择取决于靶组织。逆转录病毒载体由顺式作用长末端重复序列组成，具有高达6至10kb外源序列的包装能力。最小顺式作用LTR足以用于载体的复制和包装，然后将其用于将治疗基因整合到靶细胞中以提供永久性转基因表达。广泛使用的逆转录病毒载体包括基于鼠白血病病毒(MuLV)，长臂猿白血病病毒(GaLV)，猿猴免疫缺陷病毒(SIV)，人类免疫缺陷病毒(HIV) 及其组合的载体(参见，例如，Buchscher et al.,J.Virol.66, (1992):2731-2739；Johannetal.,J.Virol.66,(1992):1635-1640； Sommerfelt et al.,J.Virol.176,(1990):58-69；Wilson et al.,J.Virol. 63,(1989):2374-2378；Miller et al.,J.Virol.65,(1991):2220-2224；和PCT/US94/05700)。

在优选瞬时表达的应用中，可以使用基于腺病毒的***。基于腺病毒的载体在许多细胞类型中具有非常高的转导效率，并且不需要细胞***。使用这样的载体，已经获得了高滴度和高水平的表达。该载体可以在相对简单的***中大量生产。腺相关病毒(“AAV”)载体也用于用靶核酸转导细胞，例如，在核酸和肽的体外生产中，以及用于体内和离体基因治疗程序(参见，例如，West et al.,Virology 160, (1987):38-47；美国专利第4,797,368号；WO 1993/24641；Kotin, Human Gene Therapy 5,(1994):793-801；Muzyczka,J.Clin.Invest. 94,(1994):1351。重组AAV载体的构建描述于许多出版物中，包括美国专利第5,173,414号；Tratschin et al.,Mol.Cell.Biol.5, (1985):3251-3260；Tratschin,et al.,Mol.Cell.Biol.4, (1984):2072-2081；Hermonat&Muzyczka,PNAS 81,(1984):6466- 6470；以及Samulski et al.,J.Virol.63,(1989):3822-3828。

目前临床试验中至少有六种病毒载体方法可用于基因转移，其利用涉及通过***辅助细胞系的基因互补缺陷载体以产生转导剂的方法。

pLASN和MFG-S是已用于临床试验的逆转录病毒载体的实例 (Dunbar et al.,Blood 85,(1995):3048-305；Kohn et al.,Nat.Med.1, (1995):1017-1023；Malech etal.,PNAS 94(22),(1997):12133-12138)。 PA317/pLASN是基因治疗试验中使用的第一种治疗载体。(Blaese et al.,Science 270,(1995):475-480)。已经观察到MFG-S包装载体的转导效率为50％或更高。(Ellem et al.,Immunol Immunother.44(1), (1997):10-20；and Dranoff et al.,Hum.Gene Ther.1,(1997):111- 112)。

适用于导入本文所述多核苷酸的载体还包括非整合型慢病毒载体 (IDLV)。参见，例如，Naldini et al.Proc.Natl.Acad.Sci.93, (1996):11382-11388；Dull etal.J.Virol.72,(1998):8463-8471； Zuffery et al.J.Virol.72,(1998):9873-9880；Follenzi et al. Nature Genetics 25,(2000):217-222；以及U.S.2009/0117617。

重组腺相关病毒载体(rAAV)也可用于递送本文所述的组合物。所有载体均衍生自仅保留侧接转基因表达盒的AAV反向末端重复的质粒。有效率的基因转移和稳定的转基因传递是该载体***的关键特征。(Wagner et al.,Lancet 351,(1998):9117 1702-3,and Kearns et al.,Gene Ther.9,(1996):748-55)。其他AAV血清型，包括AAV1， AAV3，AAV4，AAV5，AAV6，AAV8，AAV9和AAVrh10，假型 AAV如AAV2/8，AAV2/5和AAV2/6及其所有变体，也可根据本发明使用。

复制缺陷型重组腺病毒载体(Ad)可以高滴度产生，并且容易感染许多不同的细胞类型。大多数腺病毒载体经过工程改造，使转基因取代Ad E1a，E1b和/或E3基因；随后，复制缺陷型载体在人类293细胞中繁殖，该细胞以反式提供缺失的基因功能。Ad载体可以在体内转导多种类型的组织，包括非***的分化细胞，例如那些在肝，肾和肌肉中发现者。常规Ad载体具有大的承载能力。在临床试验中使用Ad载体的实例涉及用于肌内注射的抗肿瘤免疫的多核苷酸疗法 (Sterman et al.,Hum.Gene Ther.7,(1998):1083-1089)。在临床试验中使用腺病毒载体进行基因转移的其他实例包括Rosenecker et al.,Infection 24(1),(1996):5-10；Sterman et al.,Hum.Gene Ther.9(7), (1998):1083-1089；Welsh et al.,Hum.Gene Ther.2,(1995):205-218； Alvarez et al.,Hum.GeneTher.5,(1997):597-613；Topf et al.,Gene Ther.5,(1998):507-513；Sterman et al.,Hum.Gene Ther.7, (1998):1083-1089。

包装细胞用于形成能够感染宿主细胞的病毒颗粒。这些细胞包括包装腺病毒的293个细胞，其包装逆转录病毒和ψ2细胞或PA317细胞。用于基因治疗的病毒载体通常由将核酸载体包装入病毒颗粒的生产细胞系产生。载体通常含有包装和随后整合到宿主中所需的最小病毒序列(如果适用)，其他病毒序列被编码待表达蛋白质的表达盒取代。缺失的病毒功能由包装细胞系反式提供。例如，用于基因治疗的 AAV载体通常仅具有来自AAV基因组的反向末端重复(ITR)序列，其是包装和整合到宿主基因组中所需的。病毒DNA包装在细胞系中，该细胞系含有编码其他AAV基因的辅助质粒，即rep和cap，但缺少ITR序列。细胞系也被作为辅助细胞的腺病毒感染。辅助病毒促进AAV载体的复制和来自辅助质粒的AAV基因的表达。由于缺乏 ITR序列，辅助质粒未以显着量包装。腺病毒的污染可以通过例如腺病毒比AAV更敏感的热处理来减少。

可以以特定组织类型的高度特异性递送载体。因此，通过在病毒外表面上用病毒外壳蛋白表达作为融合蛋白的配体，可以修饰病毒载体以对给定的细胞类型具有特异性。选择配体以对已知存在于感兴趣的细胞类型上的受体具有亲和力。例如，Han et al.,Proc.Natl. Acad.Sci.92,(1995):9747-9751报道了莫洛尼(Moloney)鼠白血病病毒可被修饰以表达与gp70融合的人类调蛋白，并且重组病毒感染某些表达人类表皮生长因子受体的人类乳腺癌细胞。该原理可以扩展到其他病毒-靶细胞对，其中靶细胞表达受体，和病毒表达包含细胞- 表面受体的配体的融合蛋白。例如，可以工程化丝状噬菌体以展示对几乎任何选择的细胞受体具有特异性结合亲和力的抗体片段(例如，FAB或Fv)。尽管以上描述主要适用于病毒载体，但相同的原理可应用于非病毒载体。可以将这些载体工程化为含有特异性摄取序列，其有利于特定靶细胞的摄取。

载体可通过给予个体受试者体内递送，通常通过全身给药(例如，静脉内，腹膜内，肌肉内，鞘内，气管内，皮下或颅内输注)或局部给药，如下所述。或者，可以将载体离体递送至细胞，例如从个体患者移出的细胞(例如，淋巴细胞，骨髓抽吸物，组织活检)或通用供体造血干细胞，然后通常在选择已并入载体的细胞后，将细胞重新植入患者体内。

含有核酸酶和/或供体构建体的载体(例如，逆转录病毒，腺病毒，脂质体等)也可以直接给予生物体以在体内转导细胞。或者，可以给药裸DNA。通过通常用于引入分子与血液或组织细胞最终接触的任何途径给药，包括但不限于注射，输注，局部给药和电穿孔。给药此类核酸的合适方法是本领域技术人员可获得的并且是公知的，并且尽管可以使用多于一种途径来给药特定组合物，但是特定途径通常可以提供比另一条途径更直接且更有效的反应。

在一些具体例中，由于将编码多肽的多核苷酸引入细胞中， CRISPR-Cas***的多肽在细胞中原位合成。在一些方面，CRISP- Cas***的多肽可以在细胞外产生，然后引入其中。如本文所述，用于将CRISPR-Cas多核苷酸构建体引入动物细胞的方法是已知的，并且作为非限制性实例包括其中多核苷酸构建体整合到细胞基因组中的稳定转化方法，其中多核苷酸构建体未整合到细胞基因组中的瞬时转化方法和病毒介导的方法。优选地，CRISPR-Cas多核苷酸被瞬时表达并且不整合到细胞的基因组中。在一些具体例中，可以通过例如重组病毒载体(例如逆转录病毒，腺病毒)，脂质体等将CRISPR-Cas多核苷酸引入细胞中。例如，在一些方面，瞬时转化方法包括显微注射，电穿孔或粒子轰击。在一些具体例中，鉴于在细胞中表达，CRISPR- Cas多核苷酸可包含在载体中，更特别是质粒或病毒中。

在一些具体例中，非CRISPR-CAS病毒和非基于病毒的基因转移方法可用于将编码dTAG的核酸在哺乳动物细胞或靶组织中的感兴趣的蛋白质的基因组基因座中框内***。这些方法可用于将编码ZFP，ZFN，TALE和/或TALEN***组分的核酸给予培养中的细胞，或用于宿主生物，包括用于感兴趣的蛋白质的框内***基因组基因座的编码dTAG的供体序列。

非病毒载体递送***包括DNA质粒，RNA(例如本文所述载体的转录物)，裸核酸和与递送载体复合的核酸，例如脂质体。病毒载体递送***包括DNA和RNA病毒，其在递送至细胞后具有附加型或整合的基因组。关于基因治疗程序的综述，参见Anderson, Science256,(1992):808-813；Nabel&Feigner,TIBTECH 11, (1993):211-217；Mitani&Caskey,TIBTECH 11,(1993):162-166； Dillon.TIBTECH 11,(1993):167-173；Miller,Nature357, (1992):455-460；Van Brunt,Biotechnology 6(10),(1988):1149-1154； Vigne,Restorative Neurology and Neuroscience 8,(1995):35-36； Kremer&Perricaudet,British Medical Bulletin 51(1),(1995):31-44；以及Yu et al.,Gene Therapy 1,(1994):13-26。

脂质：核酸复合物的制备，包括靶向脂质体，例如免疫脂质复合物，是本领域技术人员熟知的(参见，例如，Crystal,Science 270, (1995):404-410；Blaese et al.,CancerGene Ther.2,(1995):291-297； Behr et al.,Bioconjugate Chem.5,(1994):382-389；Remy et al., Bioconjugate Chem.5,(1994):647-654；Gao et al.,Gene Therapy 2,(1995):710-722；Ahmad et al.,Cancer Res.52,(1992):4817-4820；以及美国专利第4,186,183,4,217,344,4,235,871,4,261,975, 4,485,054,4,501,728,4,774,085,4,837,028和4,946,787号)。

另外的递送方法包括使用将待递送的核酸包装到EnGeneIC递送载体(EDV)中。使用双特异性抗体将这些EDV特异性递送至靶组织，其中抗体的一个臂对靶组织具有特异性，另一个臂对EDV具有特异性。抗体将EDV带到靶细胞表面，然后通过胞吞作用将EDV带入细胞。一旦进入细胞，就释放内容物(参见，MacDiarmid et al Nature Biotechnology 27(7),(2009):643)。

D.异双功能性化合物

本申请包括异双功能性化合物的用途，该异双功能性化合物具有 (i)与泛素连接酶结合的部分和(ii)与dTAG结合的靶向部分，该 dTAG已经与意欲用于泛素化和蛋白酶体降解的内源性蛋白融合。在一个具体例中，异双功能性化合物与突变的dTAG结合以对相应的内源性蛋白质具有选择性(即，dTAG靶向配体结合dTAG，但不显着结合天然存在的(并且在一些具体例中，将不显着结合宿主表达的突变或变异蛋白))。

采用泛素蛋白酶体途径(UPP)选择性靶向和降解蛋白质的策略已被用于蛋白质功能的转译后控制。异双功能性化合物是由靶蛋白结合配体和E3泛素连接酶配体组成。异双功能性化合物能够经由募集到 E3泛素连接酶和随后的泛素化来诱导蛋白酶体介导的所选蛋白质的降解。这些类似药物的分子提供了对蛋白质水平的可逆，剂量反应，可调节，时间控制的可能性。在Deshales等人于2000年9月提交的名称为“Proteolysis TargetingChimeric Pharmaceutical”的美国专利第7,041,298号中提供了这种化合物的早期描述，并于2006年5 月授予专利。Sakamoto等人(PNAS 98(15)(2001):8554-8559)，名称为“PROTACS:Chimeric Molecules that Target Proteins to the Skp1-Cullin F BoxComplex for Ubiquitination and Degradation,”本发明描述了一种异双功能性化合物，其由与能够结合F-盒蛋白β- TRCP的肽连接的MAP-AP-2的小分子结合物组成，其揭示内容也在美国专利7,041,298中提供。Sakamoto等人的出版物(Molecular and CellularProteomics 2(2003):1350-1358)，名称为“Development of PROTACS to Target Cancer-promoting Proteins for Ubiquitination and Degradation,”描述了一种类似的异双功能性化合物(PROTAC2)，它不是降解MAP-AP-2而是降解***和雄激素受体。Schneekloth等人的出版物(JACS 126(2004)：3748-3754)，名称为“Chemical Genetic Control ofProtein Levels:Selective in vivo Targeted Degradation”，描述了靶向FK506结合蛋白(FKBP12)的类似异双功能性化合物(PROTAC3)，并显示PROTAC2和PROTAC3用绿色荧光蛋白(GFP)成像击中每一个的目标。Schneekloth等人的出版物 (ChemBioChem 6(2005)40-46)，名称为“Chemical Approaches to Controlling Intracellular ProteinDegradation”使用该技术描述了当时领域的状态。Schneekloth等人的出版物(BMCL 18(22)(2008)： 5904-5908)，名称为“Targeted Intracellular Protein DegradationInduced by a Small Molecule:En Route to Chemical Proteomics”，描述了由PEG连接的两个小分子组成的异双功能性化合物通过同时结合雄激素受体和泛素E3连接酶降解雄激素受体。Crews等人的 WO2013/170147，名称为“Compounds Useful for PromotingProtein Degradation and Methods Using Same”，描述了包含与连接子共价结合的蛋白质降解部分的化合物，其中化合物的ClogP等于或高于1.5。 Buckley等人对上述出版物的综述(Angew.Chem.Int.Ed. 53(2014):2312-2330)，名称为“Small-Molecule Control ofIntracellular Protein Levels through Modulation of the Ubiquitin ProteosomeSystem”。转让给Arvinas Inc.的WO 2015/160845，名称为“Imide Based Modulators ofProteolysis and Associated methods of Use法”，描述了使用降解决定区域技术和沙利度胺来利用脑脊髓作为E3连接酶蛋白。J.Lu等人的下述出版物(Chemistry and Biol. 22(6)(2015):755-763)，名称为“Hijkacking the E3 Ubiquitin Ligase Cereblon toefficiently Target BDR4”，类似地描述了用于降解 BDR4的基于沙利度胺的化合物。描述该技术的其他出版物包括 Bondeson等人(Nature Chemical Biology 11(2015):611-617)， Gustafson等人(Angew.Chem.Int.Ed.54(2015):9659-9662)， Buckley等人(ACSChem.Bio.10(2015):1831-1837)，转让给Arvinas Inc.的US 2016/0058872，名称为“ImadeBased/modulators of Proteolysis and Associated Methods of Use”，转让给ArvinasInc.的 US 2016/0045607，名称为“Estrogen-related Receptor Alpha Based ProTACCompounds and Associated Methods of Use”，转让给耶鲁大学，葛兰素史克和Cambridge Enterprise Limited University of Cambridge的US 2014/0356322，名称为“Compounds and Methods for the Enhanced Degradation of Targeted Proteins&Other Polypeptides by an E3 Ubiquitin Ligase”，Lai等人(Angew.Chem. Int.Ed.55(2016):807-810)，Toure等人(Angew.Chem.Int.Ed. 55(2016):1966-1973)和转让给达纳-法柏癌症学院有限公司的US 2016/0176916，名称为“Methods to Induce TargetedProtein Degradation through Bifunctional Molecules”。

靶向蛋白质降解技术的其他描述包括Itoh等人(JACS 132(16) (2010):5820-5826)，名称为“Protein Hockdown Using Methyl Bestatin-Ligand Hybrid Molecules:Design and Synthesis of Inducers ofUbiquitination-Mediated Degradation ofCellular Retinoic Acid- Binding Proteins”，其描述了与利用E3泛素连接酶降解视黄酸结合蛋白的肽连接的小分子，Winter等人(Science 348(2015):1376-1381)，名称为“Phthalimide Conjugation as a Strategy for in vivo Target ProteinDegradation”，描述了基于沙利度胺的靶向蛋白质降解技术。

可用于本发明的异双功能性化合物可以是能够结合dTAG以诱导降解的任何异双功能性化合物。异双功能性化合物通常是本领域已知的，例如参见美国专利7,041,298；Sakamoto等人(PNAS,2001, 98(15):8554-8559)；Sakamoto等人(Molecular and CellularProteomics 2(2003)1350-1358)；Schneekloth等人(JACS 126 (2004):3748-3754)；Schneekloth等人(ChemBioChem 6(2005):40- 46)；Schneekloth等人(BMCL 18(22)(2008):5904-5908)；WO 2013/170147；Buckley等人(Angew.Chem.Int.Ed.53 (2014):2312-2330)；WO 2015/160845；Lu等人(Chemistry and Biol.22(6)(2015):755-763)；Bondeson等人(Nature Chemical Biology 11(2015):611-617)；Gustafson等人(Angew.Chem.Int.Ed. 54(2015):9659-9662)；Buckley等人(ACS Chem.Bio.10 (2015):1831-1837)；转让给Arvinas Inc.的U.S.2016/0058872，名称为“Imide BasedModulators of Proteolysis and Associated Methods of Use”，转让给Arvinas Inc.的U.S.2016/0045607，名称为”Estrogen-related Receptor Alpha Based PROTACCompounds and Associated Methods of Use”，转让给Yale University,GlaxoSmithKline,and Cambridge Enterprise Limited University of Cambridge的U.S.2014/0356322assigned to，名称为“Compounds and Methods for the EnhancedDegradation of Targeted Proteins& Other Polypeptides by an E3 UbiquitinLigase”，转让给达纳-法柏癌症学院有限公司的U.S.2016/0176916，名称为”Methods toInduce Targeted Protein Degradation Through Bifunctional Molecules”,Lai 等人(Angew.Chem.Int.Ed.55(2016):807-810)；Toure等人 (Angew.Chem.Int.Ed.55(2016):1966-1973)；Itoh等人(JACS 132(16)(2010):5820-5826)；以及Winter等人(Science 348(2015):1376-1381),其中的每一个都通过引用并入本文。

通常，适用于本申请的异双功能性化合物具有以下通式结构：

降解决定区域-连接子-dTAG靶向配体

其中连接子与降解决定区域和dTAG靶向配体共价结合，降解决定区域是能够结合泛素连接酶如E3泛素连接酶(例如，小脑蛋白) 的化合物，并且dTAG靶向配体能够结合内源性蛋白质-dTAG杂合蛋白上的dTAG。

在某些具体例中，本申请使用式I或式II的化合物：

其中：

连接子是一个与dTAG靶向配体和Y共价结合的基团；和

dTAG靶向配体能够与dTAG靶标结合或被dTAG靶标结合，从而允许加标签发生。

在某些具体例中，本申请提供式(I)化合物，或其对映异构体，非对映异构体，立体异构体或药学上可接受的盐，

其中：

连接子(L)是与dTAG靶向配体和Y共价结合的基团；和

dTAG靶向配体能够与dTAG靶向蛋白结合(binding to)或结合 (binds to)；

其中X1，X2，Y，R₁，R₂，R₂’，R₃，R₃’，R₄，R₅，m和n每一个如本文所定义。

在某些具体例中，本申请提供式(II)的化合物，或其对映异构体，非对映异构体，立体异构体或药学上可接受的盐，

其中：

连接子是一个与dTAG靶向配体和Y共价结合的基团；和

dTAG靶向配体能够与靶蛋白结合(binding to)或结合(binds to)；

在某些具体例中，本发明使用式III，式IV，式V，式VI，式 VII，式VIII和式IX的化合物：

其中：

连接子(L)是与dTAG靶向配体和Z2共价结合的基团；

dTAG靶向配体能够结合靶dTAG或被靶dTAG结合；

Z₂为键，烷基，-O，-C(O)NR₂，-NR₆C(O)，-NH或-NR₆；

R₆是H，烷基，-C(O)烷基或-C(O)H；

X₃独立地选自O，S和CH₂；

W₂独立地选自CH₂，CHR，C＝O，SO₂，NH和N-烷基；

Y₂独立地选自NH，N-烷基，N-芳基，N-杂芳基，N-环烷基， N-杂环基，O和S；

G和G’独立地选自H，任选被R’取代的烷基，OH，CH₂-杂环基，和任选被R’取代的芐基；

Q₁，Q₂，Q₃和Q₄独立地选自CH，N，CR’和N-氧化物。

A₂独立地选自烷基，环烷基，Cl和F；

R⁷选自：—CONR′R″，—OR′，—NR′R″，—SR′， —SO₂R′，—SO₂NR′R″，—CR′R″—，—CR′NR′R″—， -芳基，-杂芳基，-烷基，-环烷基，-杂环基，—P(O)(OR′)R″，— P(O)R′R″，—OP(O)(OR′)R″，—OP(O)R′R″，—Cl，—F， —Br，—I，—CF₃，—CN，—NR′SO₂NR′R″，—NR′CONR′ R″，—CONR′COR″，—NR′C(═N—CN)NR′R″，—C(═ N—CN)NR′R″，—NR′C(═N—CN)R″，—NR′C(═C— NO₂)NR′R″，—SO₂NR′COR″，—NO₂，—CO₂R′，—C(C═ N—OR′)R″,—CR′═CR′R″，—CCR′，—S(C═O)(C═N— R′)R″，—SF₅以及—OCF₃；

R’和R“独立地选自键，H，烷基，环烷基，芳基，杂芳基，杂环基。

用于本发明的dTAG靶向配体的非限制性实例包括：

以及

在一些具体例中，dTAG靶向配体靶向突变的内源性靶标或非内源性靶标。

降解决定区域

降解决定区域是将dTAG通过连接子和dTAG靶向配体连接到泛素连接酶以进行蛋白酶体降解的化合物部分。在某些具体例中，降解决定区域能结合(binding to)或结合(binds to)泛素连接酶的化合物。在进一步的具体例中，降解决定区域是结合E3泛素连接酶的化合物。在进一步的具体例中，降解决定区域是结合小脑蛋白的化合物。在进一步的具体例中，降解决定区域是沙利度胺或其衍生物或类似物。

在某些具体例中，降解决定区域是式D，式D0或式D’的部分：

或其对映异构体，非对映异构体或立体异构体，其中：

是

Y是键(CH₂)_1-6，(CH₂)_0-6-O，(CH₂)_0-6-C(O)NR₂’，(CH₂)_0-6- NR₂’C(O)，(CH₂)_0-6-NH，或(CH₂)_0-6-NR₂；

X是C(O)or C(R₃)₂；

X₁-X₂是C(R₃)＝N或C(R₃)₂-C(R₃)₂；

每个R₁独立地是卤素，OH，C₁-C₆烷基或C₁-C₆烷氧基；

R₂是C₁-C₆烷基C(O)-C₁-C₆烷基或C(O)-C₃-C₆环烷基；

R₂’是H或C₁-C₆烷基；

每个R₃独立地为H或C₁-C₃烷基；

每个R₃’独立地为C₁-C₃烷基；

每个R₄独立地为H或C₁-C₃烷基；；或两个R₄与它们所连接的碳原子一起形成C(O)，C3-C6碳环，或包含1或2个选自N和O的杂原子的4-、5-或6-元杂环；

R₅为H，氘，C₁-C₃烷基，F或Cl；

m为0、1、2或3；和

n为0、1或2；

其中该化合物与另一部分(例如化合物或连接子)经由共价键合。

在某些具体例中，降解决定区域是式D的部分，其中是

在某些具体例中，降解决定区域是式D的部分，其中X是C(O)。

在某些具体例中，降解决定区域是式D的部分，其中X是 C(R₃)₂；以及每个R₃是H。在某些具体例中，X是C(R₃)₂；R₃中的一个是H，另一个是选自甲基，乙基和丙基的C₁-C₃烷基。在某些具体例中，X是C(R₃)₂；每个R₃独立地选自甲基，乙基和丙基。

在某些具体例中，降解决定区域是式D的部分，其中X₁-X₂是 C(R₃)＝N。在某些具体例中，X₁-X₂是CH＝N。在某些具体例中， X₁-X₂是C(R3)＝N；R₃是选自甲基，乙基和丙基的C₁-C₃烷基。在某些具体例中，X₁-X₂是C(CH3)＝N。

在某些具体例中，降解决定区域是式D的部分，其中X₁-X₂是 C(R₃)₂-C(R₃)₂；及每个R₃是H。在某些具体例中，X₁-X₂是C(R₃)₂- C(R₃)₂；及R₃中的一个是H，另外三个R₃独立地是选自甲基，乙基和丙基的C₁-C₃烷基。在某些具体例中，及X₁-X₂是C(R₃)₂-C(R₃)₂； R₃中的两个是H，另外两个R₃独立地是选自甲基，乙基和丙基的 C1-C3烷基。在某些具体例中，X₁-X₂是C(R₃)₂-C(R₃)₂；R₃中的三个是H，剩余的R3是选自甲基，乙基和丙基的C₁-C₃烷基。

在某些具体例中，降解决定区域是式D的部分，其中Y是键。

在某些具体例中，降解决定区域是式D的部分，其中Y是 (CH₂)₁，(CH₂)₂，(CH₂)₃，(CH₂)₄，(CH₂)₅或(CH₂)₆。在某些具体例中，Y是(CH₂)₁，(CH₂)₂或(CH₂)₃。在某些具体例中，Y是(CH₂)₁或 (CH₂)₂。

在某些具体例中，降解决定区域是式D的部分，其中Y是O， CH₂-O，(CH₂)₂-O，(CH2)₃-O，(CH₂)₄-O，(CH₂)₅-O或(CH₂)₆-O。在某些具体例中，Y是O，CH₂-O，(CH₂)₂-O或(CH₂)₃-O。在某些具体例中，Y是O或CH₂-O。在某些具体例中，Y是O。

在某些具体例中，降解决定区域是式D的部分，其中Y是 C(O)NR₂’，CH₂-C(O)NR₂’,(CH₂)₂-C(O)NR₂’，(CH₂)₃-C(O)NR₂’， (CH₂)₄-C(O)NR₂’，(CH₂)₅-C(O)NR₂’或(CH₂)₆-C(O)NR₂’。在某些具体例中，Y是C(O)NR₂’，CH₂-C(O)NR₂’，(CH₂)2-C(O)NR₂’或 (CH₂)3-C(O)NR₂’。在某些具体例中，Y是C(O)NR₂’或CH₂- C(O)NR₂’。在某些具体例中，Y是C(O)NR₂’。

在某些具体例中，降解决定区域是式D的部分，其中Y是 NR₂’C(O)，CH₂-NR₂’C(O)，(CH₂)₂-NR₂’C(O)，(CH₂)₃-NR₂’C(O)， (CH₂)₄-NR₂’C(O)，(CH₂)₅-NR₂’C(O)或(CH₂)₆-NR₂’C(O)。在某些具体例中，Y是NR₂’C(O)，CH₂-NR₂’C(O)，(CH₂)₂-NR₂’C(O)或 (CH₂)₃-NR₂’C(O)。在某些具体例中，Y是NR₂’C(O)或CH₂- NR₂’C(O)。在某些具体例中，Y是NR₂’C(O)。

在某些具体例中，降解决定区域是式D的部分，其中R₂’是H。在某些具体例中，降解决定区域是式D的部分，其中R₂’选自甲基，乙基，丙基，丁基，异丁基，叔丁基，戊基，异戊基和己基。在某些具体例中，R₂’是选自甲基，乙基和丙基的C₁-C₃烷基。

在某些具体例中，降解决定区域是式D的部分，其中Y is Y是 NH，CH₂-NH，(CH₂)₂-NH，(CH₂)₃-NH，(CH₂)₄-NH，(CH₂)₅-NH 或(CH2)₆-NH。在某些具体例中，Y是NH，CH₂-NH，(CH₂)₂-NH， (CH₂)₃-NH。在某些具体例中，Y是NH或CH₂-NH。在某些具体例中，Y是NH。

在某些具体例中，降解决定区域是式D的部分，其中Y是NR₂， CH₂-NR₂，(CH₂)₂-NR₂，(CH₂)₃-NR₂，(CH₂)₄-NR₂，(CH₂)₅-NR₂或 (CH2)₆-NR₂。在某些具体例中，Y是NR₂、CH₂-NR₂、(CH₂)₂-NR₂或(CH₂)₃-NR₂。在某些具体例中，Y is NR2 or CH2-NR2.在某些具体例中，Y是NR₂。

在某些具体例中，降解决定区域是式D的部分，其中R₂选自甲基，乙基，丙基，丁基，异丁基，叔丁基，戊基，异戊基和己基。在某些具体例中，R₂选自甲基，乙基和丙基的C₁-C₃烷基。

在某些具体例中，降解决定区域是式D的部分，其中R₂选自 C(O)–甲基，C(O)–乙基，C(O)–丙基，C(O)–丁基，C(O)–异丁基， C(O)–叔丁基，C(O)–戊基，C(O)–异戊基和C(O)–己基。在某些具体例中，R₂是选自C(O)–甲基，C(O)–乙基和C(O)–丙基的C(O)– C₁-C₃烷基。

在某些具体例中，降解决定区域是式D的部分，其中R₂C(O)– 环甲基，C(O)–环乙基，C(O)–环丙基，C(O)–环丁基，C(O)–环戊基，和C(O)–环己基。在某些具体例中，R2是C(O)–环己基。

在某些具体例中，降解决定区域是式D的部分，其中R₃是H。

在某些具体例中，降解决定区域是式D的部分，其中R₃选自甲基，乙基和丙基的C₁-C₃烷基。在某些具体例中，R₃是甲基。

在某些具体例中，降解决定区域是式D的部分，其中n是0。

在某些具体例中，降解决定区域是式D的部分，其中n是1。

在某些具体例中，降解决定区域是式D的部分，其中n是2。

在某些具体例中，降解决定区域是式D的部分，其中每个R₃’独立地为选自甲基，乙基和丙基的C1-C3烷基。

在某些具体例中，降解决定区域是式D的部分，其中m是0。

在某些具体例中，降解决定区域是式D的部分，其中m是1。

在某些具体例中，降解决定区域是式D的部分，其中m是2。

在某些具体例中，降解决定区域是式D的部分，其中m是3。

在某些具体例中，降解决定区域是式D的部分，其中每个R₁独立地选自卤素(例如，F，Cl，Br和I)，OH，C₁-C₆烷基(例如甲基，乙基，丙基，丁基，异丁基，叔丁基，戊基，异戊基和己基)和C₁- C₆烷氧基(例如，甲氧基，乙氧基，丙氧基，丁氧基，异丁氧基，叔丁氧基和戊氧基)。在进一步的具体例中，降解决定区域是式D的部分，其中每个R₁独立地选自F，Cl，OH，甲基，乙基，丙基，丁基，异丁基，叔丁基，甲氧基和乙氧基。

在某些具体例中，降解决定区域是式D的部分，其中每个R₄是 H。

在某些具体例中，降解决定区域是式D的部分，其中每个R₄是 H，而其他的R₄是选自甲基，乙基和丙基的C₁-C₃烷基。

在某些具体例中，降解决定区域是式D的部分，其中每个R₄独立地是选自甲基，乙基和丙基的C₁-C₃烷基。

在某些具体例中，降解决定区域是式D的部分，其中两个R₄与它们所连接的碳原子一起形成C(O)。

在某些具体例中，降解决定区域是式D的部分，其中两个R₄与它们所连接的碳原子一起形成环丙基，环丁基，环戊基或环己基。

在某些具体例中，降解决定区域是式D的部分，其中两个R₄与它们所连接的碳原子一起形成选自氧杂环丁烷，氮杂环丁烷，四氢呋喃，吡咯烷，哌啶，哌嗪和吗啉的4-，5-或6-元杂环。在某些具体例中，两个R₄与它们所连接的碳原子一起形成氧杂环丁烷。

在某些具体例中，降解决定区域是式D的部分，其中R₅是H，氘或C1-C3烷基。在进一步的具体例中，R₅是(S)或(R)构型。在进一步的具体例中，R₅是(S)构型。在某些具体例中，降解决定区域是式D的部分，其中该化合物包含(S)-R₅和(R)-R₅的外消旋混合物。

在某些具体例中，降解决定区域是式D的部分，其中R₅是H。

在某些具体例中，降解决定区域是式D的部分，其中R₅是氘。

在某些具体例中，降解决定区域是式D的部分，其中R5是选自甲基，乙基和丙基的C₁-C₃烷基。在某些具体例中，R₅是甲基。

在某些具体例中，降解决定区域是式D的部分，其中R₅是F或 Cl。在进一步的具体例中，R₅是(S)或(R)构型。在进一步的具体例中， R₅是(R)构型。在某些具体例中，降解决定区域是式D的部分，其中该化合物包含(S)-R5和(R)-R5的外消旋混合物。在某些具体例中，R₅是F。

在某些具体例中，降解决定区域选自图21中的结构，其中X是 H，氘，C₁-C₃烷基或卤素；和R是连接子的连接点。

在某些具体例中，降解决定区域选自图22中的结构。

在某些具体例中，降解决定区域选自图23中的结构。

连接子

连接子将dTAG靶向配体与降解决定区域连接起来的键或化学基团。在某些具体例中，连接子是碳链。在某些具体例中，碳链任选地包括一个，两个，三个或更多个选自N，O和S的杂原子。在某些具体例中，碳链仅包含饱和链碳原子。在某些具体例中，碳链任选地包含两个或更多个不饱和链碳原子(例如，C＝C或C≡C)。在某些具体例中，碳链中的一个或多个链碳原子任选地被一个或多个取代基取代(例如，氧代，C₁-C₆烷基，C₂-C₆烯基，C₂-C₆炔基，C₁-C₃烷氧基，OH，卤素，NH₂，NH(C₁-C₃烷基)，N(C₁-C₃烷基)₂，CN， C₃-C₈环烷基，杂环基，苯基和杂芳基)。

在某些具体例中，连接子包括至少5个链原子(例如，C，O，N 和S)。在某些具体例中，连接子包含少于20个链原子(例如，C，O， N和S)。在某些具体例中，连接子包含5、6、7、8、9、10、11、 12、13、14、15、16、17、18或19个链原子(例如，C，O，N和S)。在某些具体例中，连接子包含5、7、9、11、13、15、17或19个链原子(例如，C，O，N和S)。在某些具体例中，连接子包含5、7、9 或11个链原子(例如，C，O，N和S)。在某些具体例中，连接子包含6、8、10、12、14、16或18个链原子(例如，C，O，N和S)。在某些具体例中，连接子包含6、8、10或12个链原子(例如，C，O， N和S)。

在某些具体例中，连接子是任选被非庞大取代基(例如，氧代， C₁-C₆烷基，C₂-C₆烯基，C₂-C₆炔基，C₁-C₃烷氧基，OH，卤素， NH₂，NH(C₁-C₃烷基)，N(C₁-C₃烷基)₂和CN)取代的碳链。在某些具体例中，非庞大的取代位于靠近降解决定区域的链碳原子上(即，碳原子与降解决定区域结合的碳原子至少分别为连接子中的3、4或 5个链原子))。

在某些具体例中，连接子属于公式L0：

或其对映异构体，非对映异构体或立体异构体

P1是选自0至12的整数；

P2是选自0至12的整数；

P3是选自1至6的整数；

每个W独立地为不存在，CH₂，O，S，NH或NR₅；

Z为不存在，CH₂，O，NH或NR₅；

每个R₅独立地是C1-C3烷基；和

Q为不存在或-CH₂C(O)NH-，

其中连接子以邻接Q的方式与降解决定区域共价键合，并以邻接Z的方式与dTAG靶向配体共价键合，及其中连接子中的链原子的总数小于20。

在某些具体例中，连接子-dTAG靶向配体(TL)具有式L1或L2 的结构：

或其对映异构体，非对映异构体或立体异构体，其中：

P1是选自0至12的整数；

P2是选自0至12的整数；

P3是选自1至6的整数；

每个W为独立地不存在，CH₂，O，S，NH或NR₅；

Z为不存在，CH₂，O，NH或NR₅；

每个R5独立地是C₁-C₃烷基；和

TL是dTAG靶向配体，

其中连接子以与降解决定区域共价键合。

在某些具体例中，p1是选自0至10的整数。

在某些具体例中，p1是选自2至10的整数。

在某些具体例中，p1选自1、2、3、4、5和6。

在某些具体例中，p1选自1、3和5。

在某些具体例中，p1选自1、2和3。

在某些具体例中，p1是3。

在某些具体例中，p2是选自0至10的整数。

在某些具体例中，p2选自0、1、2、3、4、5和6。

在某些具体例中，p2是选自0和1的整数。

在某些具体例中，p3是选自1至5的整数。

在某些具体例中，p3选自2、3、4和5。

在某些具体例中，p3选自1、2和3。

在某些具体例中，p3选自2和3。

在某些具体例中，至少一个W是CH₂。

在某些具体例中，至少有一个W是O。

在某些具体例中，至少有一个W是S。

在某些具体例中，至少有一个W是NH。

在某些具体例中，至少有一个W是NR₅；和R₅是选自甲基，乙基和丙基的C₁-C₃烷基。

在某些具体例中，W是O。

在某些具体例中，Z不存在。

在某些具体例中，Z是CH₂。

在某些具体例中，Z是O。

在某些具体例中，Z是NH。

在某些具体例中，Z是NR₅；和R₅是选自甲基，乙基和丙基的 C₁-C₃烷基。

在某些具体例中，Z是与连接子键合的dTAG靶向配体的一部分，即Z是由dTAG靶向配体的官能团与连接子反应形成的。

在某些具体例中，W是CH₂，Z是CH₂。

在某些具体例中，W是O，Z是CH₂。

在某些具体例中，W是CH₂，Z是O。

在某些具体例中，W是O，Z是O。

在某些具体例中，连接子-dTAG靶向配体具有从表L中选择的结构：

表L

其中Z，TL和p1每一个如上所述。

本文描述的任何一种降解决定区域可以与本文描述的任何一连接子共价结合。

在某些具体例中，本申请包括具有如下结构的降解决定区域-连接子(DL)：

其中每个变量如上式D0和式L0中所述，并且dTAG靶向配体以邻接Z的方式与DL共价键合。

在某些具体例中，本申请包括具有以下结构的降解决定区域-连接子(DL)：

其中每个变量如上式D和式L0中所述，并且dTAG靶向配体以邻接Z的方式与DL共价键合到DL。

本申请的一些具体例包含具有以下结构的双功能性化合物：

或其对映异构体，非对映异构体或立体异构体，其中每个变量如上式 D和式L0中所述，并且dTAG靶向配体在下文中描述。

本申请的其他具体例涉及具有以下结构的双功能性化合物：

本申请的某些具体例涉及具有以下结构之一的双功能性化合物：

在某些具体例中，连接子可以是聚乙二醇基，其大小范围为约 1至约12个乙二醇单元，1至约10个乙二醇单元，约2个约6个乙二醇单元，约2至5个乙二醇单元，约2至4个乙二醇单元。

在某些具体例中，连接子是基于SAR(结构-活性关系)和dTAG 靶向配体的X射线晶体学设计和优化的，以用于连接器的连接位置。

在某些具体例中，最佳连接子长度和组成因目标而异，并且可以基于与其目标结合的原始dTAG靶向配体的X射线结构来估计。还可以修饰连接子长度和组成以调节代谢稳定性和药代动力学(PK) 和药效学(PD)参数。

在dTAG靶向配体结合多个靶标的情况下，可以通过改变连接子长度来实现选择性，其中配体在不同的结合口袋中结合其一些靶标，例如比其它更深或更浅的结合口袋。

在另外的具体例中，用于本发明的异双功能性化合物包括化学连接子(L)。在某些具体例中，连接子基团L是包含一个或多个共价连接的A结构单元(例如，-A1…Aq-)的基团，其中A1是与降解决定区域中，dTAG靶向配体或其组合的至少一个偶合的基团。在某些具体例中，A1将降解决定区域，dTAG靶向配体或其组合直接连接到另一个降解决定区域，靶向配体或其组合。在其他具体例中，A1 通过Aq将降解决定区域，dTAG靶向配体或其组合间接连接另一个降解决定区域，dTAG靶向配体或其组合。

在某些具体例中，A₁至A_q每一个独立地为键，CRL₁RL₂，O， S，SO，SO₂，NR^L3，SO₂NR^L3，SONR^L3，CONR^L3，NR^L3CONR^L4， NR^L3SO₂NR^L4，CO，CR^L1＝CR^L2，C≡C，SiR^L1R^L2，P(O)R^L1， P(O)OR^L1，NR^L3C(＝NCN)NR^L4，NR^L3C(＝NCN)，NR^L3C(＝ CNO₂)NR^L4，任选经0至6个R^L1和/或R^L2基团取代的C_3-11环烷基，任选经0至6个R^L1和/或R^L2基团取代的C_3-11杂环基，任选经0至 6个R^L1和/或R^L2基团取代的芳基，任选经0至6个R^L1和/或R^L2基团取代的杂芳基，其中R^L1或R^L2每一个独立地可以与其他A基团连接以形成环烷基和/或杂环基部分，其可以进一步经0至4个R^L5基团取代；其中，

R^L1、R^L2、R^L3、R^L4以及R^L5每一个独立地为H、卤素、C_1-8烷基，OC_1-8烷基，SC_1-8烷基，NHC_1-8烷基，N(C_1-8烷基)₂， C_3-11环烷基，芳基，杂芳基，C_3-11杂环基，OC_1-8环烷基， SC_1-8环烷基，NHC_1-8环烷基，N(C_1-8环烷基)₂，N(C_1-8环烷基)(C_1-8烷基)，OH，NH₂，SH，SO₂C_1-8烷基，P(O)(OC_1-8烷基)(C_1-8烷基)，P(O)(OC_1-8烷基)₂，CC—C_1-8烷基，CCH， CH═CH(C_1-8烷基)，C(C_1-8烷基)＝CH(C_1-8烷基)，C(C_1-8烷基)＝C(C_1-8烷基)₂，Si(OH)₃，Si(C_1-8烷基)₃，Si(OH)(C_1-8烷基)₂，COC_1-8烷基，CO₂H，卤素，CN，CF₃，CHF₂，CH₂F， NO₂，SF₅，SO₂NHC_1-8烷基，SO₂N(C_1-8烷基)₂，SONHC_1-8烷基，SON(C_1-8烷基)₂，CONHC_1-8烷基，CON(C_1-8烷基)₂， N(C_1-8烷基)CONH(C_1-8烷基)，N(C_1-8烷基)CON(C_1-8烷基)₂， NHCONH(C_1-8烷基)，NHCON(C_1-8烷基)₂，NHCONH₂， N(C_1-8烷基)SO₂NH(C_1-8烷基)，N(C_1-8烷基)SO₂N(C_1-8烷基)₂， NH SO₂NH(C_1-8烷基)，NH SO₂N(C_1-8烷基)₂，NHSO₂NH₂。

在某些具体例中，q是大于或等于0的整数。在某些具体例中， q是大于或等于1的整数。

在某些具体例中，例如，其中q大于2，A_q是与降解决定区域连接的基团，A₁和Aq经由A的结构单元连接(A的结构单元数：q- 2)。

在某些具体例中，例如，其中q是2，A_q是与A₁和降解决定区域部分连接的基团。

例如，在q为1的情况下，连接子基团L的结构是-A₁-，并且A₁是与降解决定区域部分和dTAG靶向配体部分连接的基团。

在另外的具体例中，q是1至100、1至90、1至80、1至70、 1至60、1至50、1至40、1至30、1至20或1至10的整数。

在某些具体例中，连接子(L)选自图45中的结构。

在其他具体例中，连接子(L)选自图46中的结构，其中

表示

在另外的具体例中，连接子是任选取代的(聚)乙二醇，其具有1 至约100个乙二醇单元，约1至约50个乙二醇单元，1至约25个乙二醇单元，约1至10个乙二醇单元，1至约8个乙二醇单元和1和6 个乙二醇单元，2至4个乙二醇单元，或任选取代的烷基，其中散布有任选取代的O，N，S，P或Si原子。在某些实施例中，连接子被芳基，苯基，芐基，烷基，亚烷基或杂环基取代。在某些实施例中，连接子可以是不对称的或对称的。

在本文所述化合物的任何具体例中，连接子可以是如本文所述的任何合适的部分。在一个具体例中，连接基是经取代或未经取代的聚乙二醇基，其大小范围为约1至约12个乙二醇单元，1至约10个乙二醇单元，约2个约6个乙二醇单元，约2至5个乙二醇单元，约2至4个乙二醇单元。

虽然降解决定区域组和dTAG靶向配体基团可通过任何适合且对连接子化学稳定的基团共价连接到连接子基团，但连接子独立共价键合到降解决定区域基团和dTAG靶向配体基团组优选通过酰胺，酯，硫酯，酮基，氨基甲酸酯(carbamate)(氨基甲酸酯(urethane))，碳或醚，其中每个基团可以***降解决定区域基团和dTAG靶向配体基团的任何位置，以提供降解决定区域基团对泛素连接酶和靶标 dTAG上的dTAG靶向配体基团。(应注意，在降解决定区域基团靶向泛素连接酶的某些方面，用于降解的靶蛋白可以是泛素连接酶本身)。连接子可以与降解决定区域和/或dTAG靶向配体基团上的任选取代的烷基，亚烷基，烯基或炔基，芳基或杂环基连接。

在某些具体例中，“L”可以是具有4至24个直链原子的直链，直链中的碳原子可以被氧，氮，酰胺，氟化碳等取代，例如图26所示结构。

在某些实施例中，“L”可以是非直链，并且可以是脂族或芳族或杂芳族环状部分，“L”的一些实例包括，但不限于，图27的结构，其中X和Y独立地选自键，CR^L1R^L2，O，S，SO，SO₂，NR^L3， SO₂NR^L3，SONR^L3，CONR^L3，NR^L3CONR^L4，NR^L3SO²NR^L4，CO， CR^L1＝CR^L2，C≡C，SiR^L1R^L2，P(O)R^L1，P(O)OR^L1，NR^L3C(＝ NCN)NR^L4，NR^L3C(＝NCN)，NR^L3C(＝CNO₂)NR^L4，任选被经0至6个R^L1和/或R^L2基团取代的C3至11环烷基，任选被经0至6个 R^L1取代的C_3-11杂环基和/或R^L2基团，任选被经0至6个R^L1和/或 R^L2基团取代的芳基，任选被经0至6个R^L1和/或R^L2基团取代的杂芳基，其中R^L1或R^L2每一个独立地可以与其他A基团连接形成环烷基和/或杂环基部分，其可进一步经0至4个R^L5基团取代。

dTAG靶向配体

dTAG靶向配体(TL)能够与dTAG结合或被dTAG靶标结合，其允许发生泛素标记；

如本文所设想的，本发明的基因组包括位于细胞质中的异双功能性化合物靶向蛋白(dTAG)。基因组的异双功能性化合物靶向蛋白是异双功能性化合物可以结合的任何氨基酸序列，当与异双功能性化合物接触时导致dTAG杂合蛋白的降解。优选地，dTAG不应干扰 CAR的功能。在一个具体例中，dTAG是非内源肽，导致异双功能性化合物选择性并允许在给药异双功能性化合物时避免脱靶效应。在一个具体例中，dTAG是衍生自内源性蛋白质的氨基酸序列，其已被修饰以使异双功能性化合物仅结合修饰的氨基酸序列，而不结合内源性表达的蛋白质。在一个具体例中，dTAG是内源性表达的蛋白质。可以通过配体结合用于异双功能性化合物的任何氨基酸序列结构域可以用作本文设想的dTAG。

在特定的具体例中，用于本发明的dTAG，包括但不限于衍生自内源性表达的蛋白质的氨基酸序列，例如FK506结合蛋白- 12(FKBP12)，含溴结构域的蛋白质4(BRD4)，CREB结合蛋白 (CREBBP)和转录激活因子BRG1(SMARCA4)或其变体。如本文所设想的，“变体”意指任何变体，例如取代，删除或添加一个或几个至多个氨基酸，条件是该变体基本上保留与原始序列相同的功能，其在这种情况下提供异双功能性化合物配体结合。在其他具体例中，本发明中吾等的dTAG可包含例如激素受体，例如***受体蛋白，雄激素受体蛋白，类视黄醇x受体(RXR)蛋白和二氢叶酸还原酶 (DHFR)，包括细菌DHFR，细菌脱氢酶和变体。

在一个具体例中，dTAG是本文鉴定的任何蛋白质的一部分。例如，dTAG可以是BRD4的BD1结构域或BRD4的BD2结构域。在一个具体例中，本文鉴定的靶向亲本dTAG的靶向配体替代地用于靶向部分。在一个具体例中，表T中的BRD4靶向配体可用于靶向BD1dTAG。在另一个具体例中，表T中的BRD4靶向配体可用于靶向BD2 dTAG。

本申请的一些具体例包括靶向dTAG的TL，包括但不限于衍生自Hsp90抑制剂，激酶抑制剂，MDM2抑制剂，靶向含人类BET 溴结构域的蛋白质的化合物，靶向胞质信号传导蛋白FKBP12的化合物，HDAC抑制剂，人类赖氨酸甲基转移酶抑制剂，血管生成抑制剂，免疫抑制化合物和靶向芳烃受体(AHR)的化合物。

在某些具体例中，dTAG靶向配体是能够结合(binding to)或结合(binds to)衍生自激酶的dTAG的化合物，含有BET溴结构域的蛋白质，细胞溶质信号蛋白(例如，FKBP12)，核蛋白质，组蛋白去乙酰化酶，赖氨酸甲基转移酶，调节血管生成的蛋白质，调节免疫应答的蛋白质，芳香烃受体(AHR)，***受体，雄激素受体，糖皮质激素受体或转录因子(例如，SMARCA4，SMARCA2，TRIM24)。

在某些具体例中，dTAG是衍生自dTAG靶向配体能够结合 (binding)或结合(bindsto)的激酶，包括但不限于酪氨酸激酶(例如， AATK，ABL，ABL2，ALK，AXL，BLK)。，BMX，BTK，CSF1R，CSK，DDR1，DDR2，EGFR，EPHA1，EPHA2，EPHA3， EPHA4，EPHA5，EPHA6，EPHA7，EPHA8，EPHA10，EPHB1， EPHB2，EPHB3，EPHB4，EPHB6，ERBB2，ERBB3，ERBB4， FER，FES，FGFR1，FGFR2，FGFR3，FGFR4，FGR，FLT1， FLT3，FLT4，FRK，FYN，GSG2，HCK，IGF1R，ILK，INSR， INSRR，IRAK4，ITK，JAK1，JAK2，JAK3，KDR，KIT，KSR1， LCK，LMTK2，LMTK3，LTK，LYN，MATK，MERTK，MET，MLTK，MST1R，MUSK，NPR1，NTRK1，NTRK2，NTRK3， PDGFRA，PDGFRB，PLK4，PTK2，PTK2B，PTK6，PTK7， RET，ROR1，ROR2，ROS1，RYK，SGK493，SRC，SRMS， STYK1，SYK，TEC，TEK，TEX14，TIE1，TNK1，TNK2，TNNI3K，TXK，TYK2，TYRO3，YES1或ZAP70)，丝氨酸/苏氨酸激酶(如酪蛋白激酶2，蛋白激酶A，蛋白激酶B，蛋白激酶C， Raf激酶，CaM激酶，AKT1，AKT2，AKT3，ALK1，ALK2，ALK3，ALK4，Aurora A，Aurora B，Aurora C，CHK1，CHK2， CLK1，CLK2，CLK3，DAPK1，DAPK2，DAPK3，DMPK， ERK1，ERK2，ERK5，GCK，GSK3，HIPK，KHS1，LKB1， LOK，MAPKAPK2，MAPKAPK，MNK1，MSSK1，MST1， MST2，MST4，NDR，NEK2，NEK3，NEK6，NEK7，NEK9， NEK11，PAK1，PAK2，PAK3，PAK4，PAK5，PAK6，PIM1， PIM2，PLK1，RIP2，RIP5，RSK1，RSK2，SGK2，SGK3，SIK1，STK33，TAO1，TAO2，TGF-β，TLK2，TSSK1，TSSK2，ULK1 或ULK2)，细胞周期蛋白依赖性激酶(例如Cdk1至-Cdk11)和富含亮氨酸的重复激酶(例如LRRK2)。

在某些实施例中，dTAG是衍生自含有dTAG靶向配体能够结合(binding)或结合(binds)的溴结构域的BET蛋白，包括但不限于 ASH1L，ATAD2，BAZ1A，BAZ1B，BAZ2A，BAZ2B，BRD1， BRD2，BRD3，BRD4，BRD5，BRD6，BRD7，BRD8，BRD9， BRD10，BRDT，BRPF1，BRPF3，BRWD3，CECR2，CREBBP， EP300，FALZ，GCN5L2，KIAA1240，LOC93349，MLL，PB1， PCAF，PHIP，PRKCBP1，SMARCA2，SMARCA4，SP100， SP110，SP140，TAF1，TAF1L，TIF1a，TRIM28，TRIM33， TRIM66，WDR9，ZMYND11和MLL4。在某些具体例中，含有 BET溴结构域的蛋白质是BRD4。

在某些具体例中，dTAG是衍生自dTAG靶向配体能够结合 (binding)或结合(binds)的核蛋白，包括但不限于BRD2，BRD3， BRD4，触角足同源域蛋白，BRCA1，BRCA2，增强CCAAT的结合蛋白，组蛋白，多梳(Polymcomb)基团蛋白，高迁移率蛋白，端粒结合蛋白，FANCA，FANCD2，FANCE，FANCF，肝细胞核因子， Mad2，NF-κB，核受体辅激活因子，CREB结合蛋白，p55，p107， p130，Rb蛋白，p53，c-fos，c-jun，c-mdm2，c-myc和c-rel。

在某些具体例中，dTAG靶向配体选自激酶抑制剂，含有BET 溴结构域的蛋白质抑制剂，细胞溶质信号蛋白FKBP12配体，HDAC 抑制剂，赖氨酸甲基转移酶抑制剂，血管生成抑制剂，免疫抑制化合物，以及芳烃受体(AHR)抑制剂。

在某些具体例中，dTAG靶向配体是SERM(选择性***受体调节剂)或SERD(选择性***受体降解剂)。SERM和SERD的非限制性实例在转让给Astra Zeneca的WO2014/191726，转让给 Olema Pharmaceuticals的WO2013/090921、WO2014/203129、 WO2014/313232和US2013/0178445以及转让给Seragon Pharmaceuticals的美国专利第9,078,871、8,853,423和8,703,810号，以及US 2015/0005286、WO 2014/205136和WO 2014/205138中提供。

另外的dTAG靶向配体包括，例如，与内源性蛋白质结合的任何部分(与靶标dTAG结合)。说明性dTAG靶向配体包括小分子 dTAG靶向配体：Hsp90抑制剂，激酶抑制剂，HDM2和MDM2抑制剂，靶向含有人类BET溴结构域的蛋白质的化合物，HDAC抑制剂，人赖氨酸甲基转移酶抑制剂，血管生成抑制剂，核激素受体化合物，免疫抑制化合物和靶向芳烃受体(AHR)的化合物等等。此类小分子靶标dTAG结合部分还包括这些组合物的药学上可接受的盐，对映异构体，溶剂化物和多晶型物，以及可靶向目标dTAG的其他小分子。

在一些具体例中，dTAG靶向配体是Ubc9 SUMO E2连接酶 5F6D靶向配体，包括但不限于彼等描述于“Insights Into the Allosteric Inhibition of the SUMO E2 EnzymeUbc9.”by Hewitt, W.M.,et.al.(2016)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.55:5703-5707者。

在另一个具体例中，dTAG靶向配体是Tank1靶向配体，包括但不限于彼等描述于“Structure of human tankyrase 1in complex with small-molecule inhibitors PJ34and XAV939.”Kirby,C.A., Cheung,A.,Fazal,A.,Shultz,M.D.,Stams,T,(2012)ActaCrystallogr.,Sect.F 68:115-118；和“Structure-Efficiency Relationship of[1,2,4]Triazol-3-ylamines as Novel Nicotinamide Isosteres that Inhibit Tankyrases.”Shultz,M.D.,et al.(2013) J.Med.Chem.56:7049-7059者。

在另一个具体例中，dTAG靶向配体是pp60 Src靶向配体的 SH2结构域，包括但不限于彼等描述于“Requirements for Specific Binding of Low Affinity InhibitorFragments to the SH2 Domain of pp60Src Are Identical to Those for HighAffinity Binding of Full Length Inhibitors”Gudrun Lange,et al.,J.Med.Chem.2003,46, 5184-5195者。

在另一个具体例中，dTAG靶向配体是Sec7结构域靶向配体，包括但不限于彼等描述于“The Lysosomal Protein Saposin B Binds Chloroquine.”Huta,B.P.,et al.,(2016)Chemmedchem 11:277者。

在另一个具体例中，dTAG靶向配体是鞘脂-B靶向配体，包括但不限于彼等描述于“The structure of cytomegalovirus immune modulator UL141 highlightsstructural Ig-fold versatility for receptor binding”I.Nemcovicova andD.M.Zajonc Acta Cryst.(2014).D70, 851-862者。

在另一个具体例中，dTAG靶向配体是蛋白S100-A7 2OWS靶向配体，包括但不限于彼等描述于“2WOS STRUCTURE OF HUMAN S100A7 IN COMPLEX WITH 2,6ANS”DOI:10.2210/pdb2wos/pdb；and“Identification and Characterization of Binding Siteson S100A7,a Participant in Cancer and Inflammation Pathways.”Leon,R.,Murray,et al.,(2009)Biochemistry 48:10591- 10600者。

在另一个具体例中，dTAG靶向配体是磷脂酶A2靶向配体，包括但不限于彼等描述于“Structure-based design of the first potent and selective inhibitor ofhuman non-pancreatic secretory phospholipase A2“Schevitz,R.W.,et al.,Nat.Struct.Biol.1995,2, 458-465者。

在另一个具体例中，dTAG靶向配体是PHIP靶向配体，包括但不限于彼等描述于“APoised Fragment Library Enables Rapid Synthetic Expansion Yielding the FirstReported Inhibitors of PHIP(2),an Atypical Bromodomain”Krojer,T.；etal.Chem.Sci. 2016,7,2322–2330者。

在另一个具体例中，dTAG靶向配体是PDZ靶向配体，包括但不限于彼等描述于“Discovery of Low-Molecular-Weight Ligands for the AF6 PDZ Domain”MangeshJoshi,et al.Angew.Chem.Int.Ed. 2006,45,3790-3795者。

在另一个具体例中，dTAG靶向配体是PARP15靶向配体，包括但不限于彼等描述于“Structural Basis for Lack of ADP- ribosyltransferase Activity in Poly(ADP-ribose)Polymerase-13/Zinc Finger Antiviral Protein.”Karlberg,T.,et al.,(2015)J.Biol.Chem. 290:7336-7344者。

在另一个具体例中，dTAG靶向配体是PARP14靶向配体，包括但不限于彼等描述于“Discovery of Ligands for ADP- Ribosyltransferases via Docking-Based VirtualScreening.“Andersson,C.D.,et al.,(2012)J.Med.Chem.55:7706- 7718.；“Family-widechemical profiling and structural analysis of PARP and tankyrase inhibitors.”Wahlberg,E.,et al.(2012) Nat.Biotechnol.30:283-288.；“Discovery of Ligands forADP- Ribosyltransferases via Docking-Based Virtual Screening. “Andersson,C.D.,et al.(2012)J.Med.Chem.55:7706-7718者。

在另一个具体例中，dTAG靶向配体是MTH1靶向配体，包括但不限于彼等描述于“MTH1 inhibition eradicates cancer by preventing sanitation of the dNTP pool”Helge Gad,et.al.Nature, 2014,508,215-221者。

在另一个具体例中，dTAG靶向配体是mPGES-1靶向配体，包括但不限于彼等描述于“Crystal Structures of mPGES-1 Inhibitor Complexes Form a Basis for theRational Design of Potent Analgesic and Anti-Inflammatory Therapeutics.”Luz,J.G.,et al.,(2015) J.Med.Chem.58:4727-4737者。

在另一个具体例中，dTAG靶向配体是FLAP-5-脂氧酶激活蛋白靶向配体，包括但不限于彼等描述于“Crystal structure of inhibitor-bound human 5-lipoxygenase-activating protein.”Ferguson, A.D.,McKeever,B.M.,Xu,S.,Wisniewski,D.,Miller,D.K.,Yamin, T.T.,Spencer,R.H.,Chu,L.,Ujjainwalla,F.,Cunningham,B.R., Evans,J.F.,Becker,J.W.(2007)Science 317:510-512者。

在另一个具体例中，dTAG靶向配体是FA结合蛋白靶向配体，包括但不限于彼等描述于“A Real-World Perspective on Molecular Design.”Kuhn,B.；etal.J.Med.Chem.2016,59,4087–4102者。

在另一个具体例中，dTAG靶向配体是BCL2靶向配体，包括但不限于彼等描述于“ABT-199,a potent and selective BCL-2 inhibitor,achieves antitumor activitywhile sparing platelets.”Souers, A.J.,et al.(2013)NAT.MED.(N.Y.)19:202-208者。

在另一个具体例中，dTAG靶向配体是EGFR靶向配体。在一个具体例中，dTAG靶向配体选自厄洛替尼(erlotinib)(Tarceva)，吉非替尼(gefitinib)(Iressa)，阿法替尼(Afatinib)(Gilotrif)，罗西替尼 (rociletinib)(CO-1686)，奥西米替尼(osimertinib)(Tagrisso)，奥莫替尼(olmutinib)(Olita)，纳曲替尼(naquotinib)(ASP8273)，纳扎替尼(nazartinib)(EGF816)，PF-06747775(Pfizer)，依扣替尼 (icotinib)(BPI-2009)，奈拉替尼(neratinib)(HKI-272；PB272)；阿替替尼(avitinib)(AC0010)，EAI045，塔罗索替尼(tarloxotinib)(TH- 4000；PR-610)，PF-06459988(Pfizer)，替沙替尼 (tesevatinib)(XL647；EXEL-7647；KD-019)，产司替尼(transtinib)， WZ-3146，WZ8040，CNX-2006，和达克替尼(dacomitinib)(PF- 00299804；Pfizer)。可以在任何不干扰配体与EGFR结合的位置将连接子置于这些靶向配体上。连接子结合位置的非限制性实例在下表 T中提供。在一个具体例中，EGFR靶向配体结合EGFR的L858R 突变体。在另一个具体例中，EGFR靶向配体结合EGFR的T790M 突变体。在另一个具体例中，EGFR靶向配体结合EGFR的C797G 或C797S突变体。在一个具体例中，EGFR靶向配体选自厄洛替尼，吉非替尼，阿法替尼，奈拉替尼和达克替尼，并结合EGFR的 L858R突变体。在另一个具体例中，EGFR靶向配体选自奥西米替尼，罗西替尼，奥莫替尼，纳曲替尼，纳扎替尼，PF-06747775，依扣替尼，奈拉替尼，阿替替尼，塔罗索替尼，PF-0645998，替沙替尼，产司替尼，WZ-3146，WZ8040和CNX-2006。并结合EGFR的T790M突变体。在另一个具体例中，EGFR靶向配体是EAI045并且结合EGFR的C797G或C797S突变体。

任何能与dTAG靶向配体基团结合并作用于泛素连接酶或被泛素连接酶降解的蛋白质是本发明的靶蛋白质。通常，用作dTAG的内源靶蛋白可包含例如结构蛋白，受体，酶，细胞表面蛋白，与细胞整合功能相关的蛋白质，包括参与下述活性的蛋白质：催化活性，芳香酶活性，运动活性，解旋酶活性，代谢过程(合成代谢和分解代谢)，抗氧化活性，蛋白质水解，生物合成，具有激酶活性的蛋白质，氧化还原酶活性，转移酶活性，水解酶活性，裂解酶活性，异构酶活性，连接酶活性，酶调节剂活性，信号转导活性，结构分子活性，结合活性(蛋白质，脂质碳水化合物)，受体活性，细胞运动性，膜融合，细胞通讯，生物过程调节，发育，细胞分化，对刺激的反应，行为蛋白，细胞粘附蛋白，参与细胞的蛋白质死亡，参与运输的蛋白质(包括蛋白质转运蛋白)，核转运，离子转运蛋白活性，通道转运蛋白活性，载体活性，通透酶活性，分泌活性，电子转运蛋白活性，发病机制，分子伴侣调节活性，核酸结合活性，转录调节活性，细胞外组织和生物发生活性，转译调节活性。

更具体地，许多用于人治疗的药物靶标表示dTAG靶标，蛋白质靶标或dTAG靶向配体可以结合并并入根据本发明的化合物中。这些包括可用于在多种多基因疾病中恢复功能的蛋白质，包括例如 B7.1和B7，TINFR1m，TNFR2，NADPH氧化酶，BclIBax和凋亡途径中的其他配对，C5a受体，H MG-CoA还原酶，PDE V磷酸二酯酶类型，PDE IV磷酸二酯酶4型，PDEI，PDEII，PDEIII，角鲨烯环化酶抑制剂，CXCR1，CXCR2，一氧化氮(NO)合成酶，环加氧酶1，环加氧酶2,5HT受体，多巴胺受体，G蛋白，即Gq，组胺受体，5-脂氧合酶，类胰蛋白酶丝氨酸蛋白酶，胸苷酸合成酶，嘌呤核苷磷酸化酶，GAPDH锥虫，糖原磷酸化酶，碳酸酐酶，趋化因子受体，JAW STAT，RXR及类似物，HIV 1蛋白酶，HIV 1整合酶，流感，神经氨酸酶，乙型肝炎逆转录酶，钠通道，多重耐药性(MDR)，蛋白质P-糖蛋白(和MRP)，酪氨酸激酶，CD23，CD124，酪氨酸激酶p56 lck，CD4，CD5，IL-2受体，IL-1受体，TNF-αR，ICAM1， Cat+通道，VCAM，VLA-4整合素，选择素，CD40/CD40L，新型激酶和受体，肌苷一磷酸脱氢酶，p38 MAP激酶， RaslRaflMEWERK途径，白细胞介素-1转换酶，半胱天冬酶，HCV， NS3蛋白酶，HCV NS3RNA解旋酶，甘氨酰胺核糖核苷酸甲酰转移酶，鼻病毒3C蛋白酶，单纯疱疹病毒-1(HSV-I)，蛋白酶，鉅细胞病毒(CMV)蛋白酶，聚(ADP-核糖)聚合酶，细胞周期蛋白依赖性激酶，血管内皮生长因子，催产素受体，微粒体转运蛋白抑制剂，胆汁酸转运抑制剂，5α还原酶抑制剂，血管紧张素11，甘氨酸受体，去甲肾上腺素再摄取受体，内皮素受体，神经肽Y和受体，***受体，雄激素受体，腺苷受体，腺苷激酶和AMP脱氨酶，嘌呤能受体 (P2Y1，P2Y2，P2Y4，P2Y6，P2X1-7)，法呢基转移酶，香叶基香叶基转移酶，NGF的TrkA受体，β-淀粉样蛋白，酪氨酸激酶Flk- IIKDR，玻连蛋白受体，整合素受体，Her-21neu，端粒酶抑制，细胞溶质磷脂酶A2和EGF受体酪氨酸激酶。可用作dTAG的其他蛋白质靶标包括例如蜕皮激素20-单加氧酶，GABA门控氯离子通道的离子通道，乙酰胆碱酯酶，电压敏感性钠通道蛋白质，钙释放通道和氯离子通道。用作dTAG的其他靶蛋白包括乙酰辅酶A羧化酶，腺苷酸琥珀酸合成酶，原卟啉原氧化酶和烯醇丙酮酰莽草酸磷酸合酶。

在一个具体例中，通过筛选配体库来选择dTAG和dTAG靶向配体对。这种筛选在Duong-Ly等人的“Kinase Inhibitor Reveals Unexpected Opportunities to InhibitDisease-Associated Mutant Kinases”；Cell Reports 14,772-781 2016年2月2日中举例说明。

卤代烷烃脱卤素酵素是根据本发明的特定化合物的另一个靶标，其可以用作dTAG。本发明的含有氯代烷烃肽结合部分(C1-C12通常约为C2-C10烷基卤素基团)的化合物可用于抑制和/或降解用于融合蛋白或相关诊断蛋白的卤代烷脱卤素酶，如2011年12月6日提交的PCT/US2012/063401，2012年6月14日公布为 WO2012/078559，其内容通过引用方式于此并入本文。

dTAG靶向配体的非限制性实例显示在下表T中，并且表示能够靶向可用作dTAG的蛋白质或氨基酸序列的dTAG靶向配体。

表T：

A.BRD dTAG靶向配体：

如本文所用的BRD dTAG靶向配体，包括但不限于：

以及

其中：

R是连接子连接的位点；以及

R’：是甲基或乙基。

B.CREBBP dTAG靶向配体：

本文使用的CREBBP dTAG靶向配体，包括但不限于：

以及

其中：

R是连接子连接的位点；

A是N或CH；以及

m是0、1、2、3、4、5、6、7或8。

C.SMARCA4、PB1和/或SMARCA2 dTAG靶向配体：

本文使用的SMARCA4，PB1和/或SMARCA2 dTAG靶向配体，包括但不限于：

以及

其中：

R是连接子连接的位点；以及

A是N或CH；以及

m是0、1、2、3、4、5、6、7或8。

D.TRIM24和/或BRPF1 dTAG靶向配体：

本文使用的TRIM24和/或BRPF1 dTAG靶向配体，包括但不限于：

以及

其中：

R是连接子连接的位点；以及

m是0、1、2、3、4、5、6、7或8。

E.糖皮质激素受体dTAG靶向配体:

本文使用的糖皮质激素dTAG靶向配体，包括但不限于：

以及

其中：

R是连接子连接的位点。

F.***和/或雄激素受体dTAG靶向配体：

本文使用的***和/或雄激素dTAG靶向配体，包括但不限于：

以及

其中：

R是连接子连接的位点。

G.DOT1L dTAG靶向配体:

本文使用的DOT1L dTAG靶向配体，包括但不限于：

以及

其中：

R是连接子连接的位点；

A是N或CH；以及

m是0、1、2、3、4,、5、6、7或8。

H.Ras dTAG靶向配体：

如本文所用的Ras dTAG靶向配体，包括但不限于：

以及

其中：

R是连接子连接的位点。

I.RasG12C dTAG靶向配体:

本文使用的RasG12C dTAG靶向配体，包括但不限于：

以及

其中：

R是连接子连接的位点。

J.Her3 dTAG靶向配体：

本文使用的Her3 dTAG靶向配体，包括但不限于：

以及

其中：

R是连接子连接的位点；

R’是或

K.Bcl-2or Bcl-XL dTAG靶向配体：

本文使用的Bcl-2或Bcl-XL dTAG靶向配体，包括但不限于：

以及

其中：

R是连接子连接的位点。

L.HDAC dTAG靶向配体：

如本文所用的HDAC dTAG靶向配体，包括但不限于：

其中：

R是连接子连接的位点。

M.PPAR-γdTAG靶向配体：

本文使用的PPAR-γdTAG靶向配体，包括但不限于：

以及

其中：

R是连接子连接的位点。

N.RXR dTAG靶向配体：

本文使用的RXR dTAG靶向配体，包括但不限于：

以及

其中：

R是连接子连接的位点。

O.DHFR dTAG靶向配体：

本文使用的DHFR dTAG靶向配体，包括但不限于：

以及

其中：

R是连接子连接的位点。

P.EGFR dTAG靶向配体：

本文使用的EGFR dTAG靶向配体，包括但不限于：

1.靶向L858R突变EGFR的靶向配体，包括厄洛替尼，吉非替尼，阿法替尼，奈拉替尼和达克替尼。

其中：

R是连接子连接的位点。

2.靶向T790M突变体EGFR的配体靶向，包括奥西米替尼，罗西替尼，奥莫替尼，纳曲替尼，纳扎替尼，PF-06747775，依扣替尼，奈拉替尼，阿替替尼，塔罗索替尼，PF-0645998，替沙替尼，产司替尼，WZ-3146，WZ8040和CNX-2006：

其中：

R是连接子连接的位点。

3.靶向C797S突变体EGFR的靶向配体，包括EAI045：

其中：

R是连接子连接的位点。

Q.BCR-ABL dTAG靶向配体：

本文使用的BCR-ABL dTAG靶向配体，包括但不限于：

1.靶向T315I突变体BCR-ABL(PDB#3CS9)的靶向配体，包括尼洛替尼(Nilotinib)和达沙替尼(Dasatinib)：

其中：

R是连接子连接的位点。

2.靶向BCR-ABL的靶向配体，包括尼洛替尼，达沙替尼，普纳替尼(Ponatinib)和波舒替尼(Bosutinib)：

其中：

R是连接子连接的位点。

R.ALK dTAG靶向配体：

本文使用的ALK dTAG靶向配体，包括但不限于：

1.靶向L1196M突变ALK(PDB#4MKC)的靶向配体，包括色瑞替尼(Ceritinib)：

其中：

R是连接子连接的位点。

S.JAK2 dTAG靶向配体：

本文使用的JAK2 dTAG靶向配体，包括但不限于：

1.靶向针对V617F突变体JAK2的配体，包括鲁索利替尼 (Ruxolitinib)：

其中：

R是连接子连接的位点。

T.BRAF dTAG靶向配体：

本文使用的BRAF dTAG靶向配体，包括但不限于：

1.靶向V600E突变体BRAF(PBD#3OG7)的靶向配体，包括威罗菲尼(Vemurafenib)：

其中：

R是连接子连接的位点。

2.针对靶向BRAF的配体，包括达拉菲尼(Dabrafenib)：

其中：

R是连接子连接的位点。

U.LRRK2 dTAG靶向配体本文使用的LRRK2 dTAG靶向配体，包括但不限于：

1.靶向R1441C突变体LRRK2的靶向配体，包括：

其中：

R是连接子连接的位点。

2.靶向G2019S突变体LRRK2的配体靶向，包括：

其中:：

R是连接子连接的位点。

3.靶向I2020T突变体LRRK2的靶向配体，包括：

其中：

R是连接子连接的位点。

V.PDGFRαdTAG靶向配体：

本文使用的PDGFRαdTAG靶向配体，包括但不限于：

1.靶向T674I突变PDGFRα的靶向配体，包括AG-1478， CHEMBL94431，Dovitinib，厄洛替尼，吉非替尼，伊马替尼 (imatinib)，Janex 1，帕唑帕尼(Pazopanib)，PD153035，索拉菲尼 (Sorafenib)，舒尼替尼(Sunitinib)，WHI-P180：

其中：

R是连接子连接的位点。

W.RET dTAG靶向配体：

本文使用的RET dTAG靶向配体，包括但不限于：

1.靶向G691S突变体RET的靶向配体，包括陶扎色替(tozasertib)

其中：

R是连接子连接的位点。

2.靶向R749T突变体RET的靶向配体，包括陶扎色替

其中：

R是连接子连接的位点。

3.靶向E762Q突变体RET的靶向配体，包括陶扎色替

其中：

R是连接子连接的位点。

4.靶向Y791F突变体RET的靶向配体，包括陶扎色替

其中：

R是连接子连接的位点。

5.靶向V804M突变体RET的靶向配体，包括陶扎色替

其中：

R是连接子连接的位点。

6.靶向M918T突变体RET的靶向配体，包括陶扎色替

其中：

R是连接子连接的位点。

X.热休克蛋白90(HSP90)dTAG靶向配体:

本文使用的热休克蛋白90(HSP90)dTAG靶向配体，包括但不限于：

1.在Vallee et al.,“Tricyclic Series of Heat Shock Protein 90(HSP90)Inhibitors Part I：Discovery of Tricyclic Imidazo[4,5-C] Pyridinesas PotentInhibitors of the HSP90 Molcular Chaperone (2011)J.Med.Chem.54:7206中鉴定的HSP90抑制剂，包含(N-[4- (3H-咪唑并[4,5-C]吡啶-2-基)-9H-芴-9-基]-琥珀酰胺)：

，其中连接子基团L或-(L-降解决定区域)基团经由例如末端酰胺基团连接而衍生化；

2.HSP90抑制剂p54(修饰的)(8-[(2,4-二甲基苯基)硫烷基]-3]戊-4-炔 -1-基-3H-嘌呤-6-胺)：

其中连接子基团L或-(L-降解决定区域)基团经由例如末端乙炔基连接而衍生化；

3.在Brough et al.,“4,5-Diarylisoxazole HSP90 Chaperone Inhibitors:Potential Therapeutic Agents for the treatment of Cancer,”J.Med. CHEM.Vol:51,page:196(2008)中鉴定的HSP90抑制剂(经修饰)，包括具有下示结构的化合物2GJ(5-[2,4-二羟基-5-(1-甲基乙基)苯基]- 正乙基-4-[4-(吗啉-4-基甲基)苯基]异恶唑-3-甲酰胺)：

其中连接子基团L或-(L-降解决定区域)基团经由例如(在胺上或在胺上的烷基上的)酰胺基团连接而衍生化；

4.在Wright et al.,“Structure-Activity Relationships in Purine-BasedInhibitor Binding to HSP90 Isoforms,”Chem Biol.2004 June；11(6): 775-85中鉴定的HSP90抑制剂(经修饰)，包括具有下示结构的 HSP90抑制剂PU3：

其中连接子基团L或-(L-降解决定区域)经由例如丁基连接而衍生化；和

5.HSP90抑制剂格尔德霉素(geldanamycin)((4E，6Z，8S，9S，10E， 12S，13R，14S，16R)-13-羟基-8,14,19-三甲氧基-4,10,12,16-四甲基-3,20,22-三氧代-2-氮杂双环[16.3.1](衍生化)或其任何衍生物(如 17-烷基氨基-17-去甲氧基格尔德霉素(“17-AAG”)或17-(2-二甲基氨基乙基)氨基-17)-去甲氧基格尔纳霉素(“17-DMAG”))(衍生化，其中连接子基团L或-(L-降解决定区域)基团经由例如酰胺基连接)。

Y.激酶和磷酸酶dTAG靶向配体:

本文使用的激酶和磷酸酶dTAG靶向配体，包括但不限于：

1.厄洛替尼衍生物酪氨酸激酶抑制剂:

其中R是经由例如醚基连接的连接子基团L或-(L-降解决定区域)基团；

2.激酶抑制剂舒尼替尼(衍生化):

其中R是连接子基团L或-(L-降解决定区域)基团连接例如吡咯部分而衍生化；

3.激酶抑制剂索拉非尼(衍生化)：

其中R是连接子基团L或-(L-降解决定区域)基团连接例如酰胺部分而衍生化；

4.激酶抑制剂达沙替尼(desatinib)(衍生化)：

其中R是连接子基团L或-(L-降解决定区域)连接例如嘧啶而衍生化；

5.激酶抑制剂拉帕替尼(lapatinib)(衍生化)：

其中连接子基团L或-(L-降解决定区域)基团经由例如磺酰基甲基的末端甲基连接而衍生化；

6.激酶抑制剂U09-CX-5279(衍生化)：

其中L或-(L-降解决定区域)基团经由例如胺(苯胺)，羧酸或胺α与环丙基或环丙基连接而衍生化；

7.在Millan et al.,Design and Synthesis of Inhaled P38 Inhibitors forthe treatment of Chronic Obstructive Pulmonary Disease,J.MED. CHEM.Vol:54,page:7797(2011)中鉴定的激酶抑制剂，包括具有下示结构的激酶抑制剂Y1W和Y1X(衍生化)：

YIX(1-乙基-3-(2-{[3-(1-甲基乙基)[1,2,4]***并[4,3-a]吡啶-6-基]硫烷基}苄基)脲，其中连接子基团L或-(L-降解决定区域)基团经由例如异丙基连接而衍生化；

1-(3-叔丁基-1-苯基-1H-吡唑-5-基)-3-(2-{[3-(1-甲基乙基)-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡啶-6-基]硫烷基}苄基)脲，其中连接子基团L或-(L-降解决定区域)基团例如优选经由异丙基或叔丁基连接而衍生化；

8.在Schenkel et al.,Discovery of Potent and Highly SelectiveThienopyridine Janus Kinase 2Inhibitors J.Med.Chem.,2011, 54(24),pp 8440-8450中鉴定的激酶抑制剂，包括具有下示结构的化合物6TP和0TP(衍生化)：

4-氨基-2-[4-(叔丁基氨磺酰基)苯基]-N-甲基噻吩并[3,2-c]吡啶-7-甲酰胺噻吩并吡啶19，其中连接子基团L或-(L-降解决定区域)基团经由例如与酰胺部分结合的末端甲基连接而衍生化：

4-氨基-N-甲基-2-[4-(吗啉-4-基)苯基]噻吩并[3,2-c]吡啶-7-甲酰胺噻吩并吡啶8，其中连接子基团L或-(L-降解决定区域)基团经由例如与酰胺部分结合的末端甲基连接而衍生化；

9.在Van Eis et al.“2,6-Naphthyridines as potent and selectiveihibitors of the novel protein kinase C isozymes,”Biorg.Med.Chem. Lett.2011Dec.15；21(24):7367-72中鉴定的激酶抑制剂，包括具有下示结构的激酶抑制剂07U：

2-甲基N～1～-[3-(吡啶-4-基)-2,6-萘啶-1-基]丙烷-1,2-二胺，其中连接子基团L或-(L-降解决定区域)基团例如经由仲胺或末端氨基连接而衍生化；

10.Lountos et al.,“Structural Characterization of Inhibitor Complexeswith Checkpoint Kinase 2(Chk2),Drug Target for Cancer Therapy,”J.STRUCT.BIOL.Vol:176，pag：292(2011)中鉴定的激酶抑制剂，包括具有下示结构的激酶抑制剂YCF：

，其中连接子基团L或-(L-降解决定区域)基团经由例如末端羟基中的任一个连接而衍生化；

11.Lountos et al.,“Structural Characterization of Inhibitor Complexeswith Checkpoint Kinase 2(Chk2),a Drug Target for Cancer Therapy,”J.STRUCT.BIOL.Vol:176,pag:292(2011)中鉴定的激酶抑制剂，包括具有下示结构的激酶抑制剂XK9和NXP(衍生化)：

N-{4-[(1E)-N-(N-羟基甲脒基)乙烷肼基]苯基}-7-硝基-1H-吲哚-2-甲酰胺

N-{4-[(1E)-N-脒基乙基重氮基]苯基}-1H-吲哚-3-甲酰胺，其中连接子基团L或-(L-降解决定区域)基团例如经由末端羟基(XK9)或腙基 (NXP)连接而衍生化；

12.激酶抑制剂阿法替尼(衍生化)(N-[4-[(3-氯-4-氟苯基)氨基]-7- [[(3S)-四氢-3-呋喃基]氧基]-6-喹唑啉基]-4(二甲基氨基)-2-丁烯酰胺)(其中连接子基团L或-(L-降解决定区域)基团例如经由脂族胺基连接而衍生化)；

13.激酶抑制剂福坦替尼(fostamatinib)(衍生化)([6-({5-氟-2-[(3,4,5- 三甲氧基苯基)氨基]嘧啶-4-基}氨基)-2,2-二甲基-3-氧代-2,3-二氢- 4H-吡啶并[3,2-b]-1,4-恶嗪-4-基]甲基磷酸二钠六水合物)(其中连接子基团L或-(L-降解决定区域)基团例如经由甲氧基连接而衍生化)；

14.激酶抑制剂吉非替尼(衍生化)(N-(3-氯-4-氟-苯基)-7-甲氧基-6-(3- 吗啉-4-基丙氧基)喹唑啉-4-胺)：

，其中连接子基团L或-(L-降解决定区域)基团经由例如甲氧基或醚基连接而衍生化；

15.激酶抑制剂仑伐替尼(lenvatinib)(衍生化)(4-[3-氯-4-(环丙基氨基甲酰基氨基)苯氧基]-7-甲氧基-喹啉-6-甲酰胺)(其中连接子基团L或 -(L-降解决定区域))例如经由环丙基连接而衍生化)；

16.激酶抑制剂凡德他尼(vandetanib)(衍生的)(N-(4-溴-2-氟苯基)-6- 甲氧基-7-[(1-甲基哌啶-4-基)甲氧基]喹唑啉-4-胺)(其中连接子基团L 或-(L-降解决定区域)基团例如经由甲氧基或羟基连接而衍生化)；

17.激酶抑制剂威罗菲尼(衍生化)(丙烷-1-磺酸{3-[5-(4-氯苯基)-1H- 吡咯并[2,3-b]吡啶-3-羰基]-2,4-二氟-苯基}-酰胺)，其中连接子基团 L或-(L-降解决定区域)基团例如经由磺酰基连接而衍生化；

18.激酶抑制剂Gleevec(衍生化)

，其中R作为连接子基团L或-(L-降解决定区域)基团例如经由酰胺基或经由苯胺基团连接而衍生化；

19.激酶抑制剂帕唑帕尼(衍生化)(VEGFR3抑制剂)：

，其中R是连接子基团L或-(L-降解决定区域)基团例如连接到苯基部分或经由苯胺基团而衍生化；

20.激酶抑制剂AT-9283(衍生化的)Aurora激酶抑制剂

其中R是例如连接到苯基部分的连接子基团L或-(L-降解决定区域) 基团)；

21.激酶抑制剂TAE684(衍生的)ALK抑制剂

22.激酶抑制剂尼罗他尼(nilotanib)(衍生的)Abl抑制剂:

，其中R是连接子基团L或-(L-降解决定区域)基团例如连接苯基部分或苯胺基团而衍生化；

23.激酶抑制剂NVP-BSK805(衍生的)JAK2抑制剂

，其中R是连接子基团L或-(L-降解决定区域)基团例如连接苯基部分或二唑基而衍生化；

24.激酶抑制剂克唑替尼衍生的Alk抑制剂

，其中R是连接子基团L或-(L-降解决定区域)基团例如连接苯基部分或二唑基衍生化；

25.激酶抑制剂JNJ FMS(衍生化)抑制剂

衍生化，其中R是-(L-降解决定区域)例如连接到苯基部分的连接子基团L或-(L-降解决定区域)基团；

26.激酶抑制剂福瑞替尼(foretinib)(衍生化)Met抑制剂

衍生化，其中R是-(L-降解决定区域)例如连接苯基部分或喹啉部分上的羟基或醚基团的连接子基团L或-(L-降解决定区域)基团；

27.变构蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂PTP1B(衍生化):

，其中连接子基团L或-(L-降解决定区域)基团连接例如所示R处而衍生化；

28.SHP-2酪氨酸磷酸酶结构域的抑制剂(衍生化):

，其中例如在R处连接连接子基团L或-(L-降解决定区域)基团而衍生化；

29.BRAF(BRAFV600E)/MEK的抑制剂(衍生化的):

其中，例如在R处连接连接子基团L或-(L-降解决定区域)基团而衍生化；

30.酪氨酸激酶ABL的抑制剂(衍生化的)

31.激酶抑制剂OSI-027(衍生的)mTORC1/2抑制剂

32.激酶抑制剂OSI-930(衍生化的)c-Kit/KDR抑制剂

其中，例如在R处连接连接子基团L或-(L-降解决定区域)基团而衍生化；和

33.激酶抑制剂OSI-906(衍生的)IGF1R/IR抑制剂

其中，例如在R处连接连接子基团L或-(L-降解决定区域)基团而衍生化。

其中，在I至XVII章中描述的任何具体例中，“R”表示连接哌嗪部分上的连接子基团L或-(L-降解决定区域)基团的位点。

Z.HDM2和/或MDM2 dTAG靶向配体：

本文使用的HDM2和/或MDM2 dTAG靶向配体，包括但不限于：

1.Vassilev,et al.,In vivo activation of the p53 pathway by small-molecule antagonists of MDM2,SCIENCE vol:303,pag:844-848 (2004),andSchneekloth,et al.,Targeted intracellular protein degradation induced by asmall molecule:En route to chemical proteomics,Bioorg.Med.Chem.Lett.18(2008)5904-5908中鉴定的 HDM2/MDM2抑制剂，包含(或另外)如下所述的化合物nutlin-3，nutlin-2和nutlin-1(衍生化)，以及其所有衍生物和类似物:

(其中，在连接子基团L或-(L-降解决定区域)基团连接例如甲氧基或羟基而衍生化)；

(其中，在连接子基团L或-(L-降解决定区域)基团连接例如在甲氧基或羟基衍生化)；

(其中，在连接子基团L或-(L-降解决定区域)基团例如经由甲氧基或作为羟基连接而衍生化)；和

2.反式-4-碘-4'-硼烷基-查耳酮

(衍生化，其中连接子基团L或连接子基团L或-(L-降解决定区域)基团例如通过羟基连接。

AA.人类含BET溴结构域的蛋白质dTAG靶向配体：

在某些具体例中，“dTAG靶向配体”可以是与溴-和额外终端域 (BET)蛋白BRD2，BRD3和BRD4结合的配体。靶向人类含BET溴结构域的蛋白质的化合物包括但不限于与如下所述靶标相关的化合物，其中“R”或“连接子”表示连接子基团L或-(L-降解决定区域)基团连接的位点，例如:

1.JQ1,Filippakopoulos et al.Selective inhibition of BETbromodomains.Nature(2010):

2.I-BET,Nicodeme et al.Suppression of Inflammation by a SyntheticHistone Mimic.Nature(2010).Chung et al.Discovery and Characterization ofSmall Molecule Inhibitors of the BET Family Bromodomains.J.Med Chem.(2011):

3.描述于Hewings et al.3,5-Dimethylisoxazoles Act as Acetyl-lysineBromodomain Ligands.J.Med.Chem.(2011)54 6761-6770的化合物。

4.I-BET151,Dawson et al.Inhibition of BET Recruitment to Chromatin asan Effective Treatment for MLL-fusion Leukemia. Nature(2011):

5.咔唑型(US 2015/0256700)

6.吡咯并吡啶类型(US 2015/0148342)

7.四氢喹啉类型(WO 2015/074064)

8.***吡嗪类型(WO 2015/067770)

9.吡啶酮类(WO 2015/022332)

10.喹唑啉酮类(WO 2015/015318)

11.二氢吡啶嗪酮类(WO 2015/011084)

(其中，在每种情况下，R或L或连接子指定用以例如连接连接子基团L或-(L-降解决定区域)基团的连接位点)。

BB.HDAC dTAG靶向配体：

如本文所用的HDAC dTAG靶向配体包括但不限于:

1.Finnin,M.S.et al.Structures of Histone Deacetylase Homologue Boundto the TSA and SAHA Inhibitors.Nature 40,188-193(1999)。

(其中，“R”表示连接位点以例如连接连接子基团L或-(L-降解决定区域)基团而衍生化)；和

2.由PCT WO0222577的式(I)定义的化合物(“脱酰酶抑制剂”)(其中，连接子基团L或-(L-降解决定区域)基团例如经由羟基连接而衍生化)；

CC.人类赖氨酸甲基转移酶dTAG靶向配体：

本文使用的人类赖氨酸甲基转移酶dTAG靶向配体包括但不限于:

1.Chang et al.Structural Basis for G9a-Like protein LysineMethyltransferase Inhibition by BIX-1294.Nat.Struct.Biol.(2009) 16(3)312。

(其中，“R”指定用于连接例如连接子基团L或-(L-降解决定区域)基团的位点而衍生化)；

2.Liu,F.et al Discovery of a 2,4-Diamino-7- aminoalkoxyquinazoline asa Potent and Selective Inhibitor of Histone Methyltransferase G9a.J.Med.Chem.(2009)52(24)7950。

(其中，“R”指定用于连接例如连接子基团L或-(L-降解决定区域)基团的潜在位点而衍生化)；

3.阿扎胞苷(衍生化)(4-氨基-1-(3-D-呋喃核糖基-1,3,5-三嗪-2(1H)- 酮)(其中连接子基团L或-(L-降解决定区域)例如经由羟基或氨基连接基团而衍生化)；和

4.地西他滨(衍生化)(4-氨基-1-(2-脱氧-b-D-赤型-戊呋喃糖基)-1,3,5- 三嗪-2(1H)-酮)(其中连接子基团L或-(L-降解决定区域)基团例如经由羟基或氨基连接而衍生化)。

DD.通过功能组织的dTAG靶向配体

血管生成抑制剂：

血管生成抑制剂，包括但不限于：

1.Sakamoto,et al.,Development of Protacs to target cancer- promotingproteins for ubiquitination and degradation,Mol Cell Proteomics 2003December；2(12):1350-8中描述的GA-1(衍生化)及其衍生物和类似物，其具有如结构和与接合物的结合；

2.Rodriguez-Gonzalez,et al.,Targeting steroid hormone receptors forubiquitination and degradation in breast and prostate cancer, Oncogene(2008)27,7201-7211中描述的***(衍生化)，其可以与连接子基团L或-(L-降解决定区域)基团结合；

3.Sakamoto,et al.,Development of Protacs to target cancer- promotingproteins for ubiquitination and degradation,Mol Cell Proteomics 2003December；2(12):1350-中描述的***、睾酮(衍生化的)和相关衍生物，包括但不限于DHT及其衍生物和类似物；和

4.Sakamoto,et al.,Protacs:chimeric molecules that target proteins tothe Skp1-Cullin-F box complex for ubiquitination and degradation Proc NatlAcad Sci USA.2001 Jul.17；98(15):8554-9和美国专利第 7,208,157号中描述的卵巢素、烟曲霉素(fumagillin)(衍生化)及其衍生物和类似物，其具有结构和与连接子基团L或-(L-降解决定区域) 基团的结合。

免疫抑制化合物：

免疫抑制化合物，包括但不限于：

1.Schneekloth,et al.,Chemical Genetic Control of Protein Levels:Selective in Vivo Targeted Degradation,J.AM.CHEM.SOC.2004, 126,3748-3754中描述的AP21998(衍生化)，其具有结构和与连接子基团L或-(L-降解决定区域)基团的结合，如Schneekloth等人，化学遗传控制蛋白质水平：选择性体内通常所述。有针对性的退化，J。 AM。CHEM。SOC。2004,126,3748-3754；

2.糖皮质激素(例如，氢化可的松(hydrocortisone)，强的松 (prednisone)，***龙(prednisolone)和甲基***龙 (methylprednisolone))(其中连接子基团L或-(L-降解决定区域)基团结合例如任何羟基而衍生化)和倍氯米松(二丙酸倍氯米松)(衍生自链接基团)基团或-(L-降解决定区域)与例如丙酸酯结合；

3.甲氨蝶呤(其中连接子基团或-(L-降解决定区域)基团可以结合例如末端羟基中的任一个而衍生化)；

4.环孢菌素(衍生化，其中连接子基团或-(L-降解决定区域)基团可结合例如丁基的任一个而衍生化)；

5.他克莫司(tacrolimus)(FK-506)和雷帕霉素(衍生化，其中连接子基团L或-(L-降解决定区域)基团可结合例如在甲氧基的任一个)；和

6.放线菌素(actinomycin)(衍生化，其中连接子基团L或-(L-降解决定区域)基团可结合例如异丙基的任一个)。

EE.芳基烃受体(AHR)dTAG靶向配体：

本文使用的AHR dTAG靶向配体，包括但不限于：

1.Lee,et al.,Targeted Degradation of the Aryl Hydrocarbon Receptor bythe PROTAC Approach:A Useful Chemical Genetic Tool,Chem Bio Chem Volume 8,Issue 17,pages 2058-2062,Nov.23, 2007)中一般说明的芹菜素(以与连接子基团L或-(L-降解决定区域) 基团结合的方式衍生化；和

2.Boitano,et al.,Aryl Hydrocarbon Receptor Antagonists Promote theExpansion of Human Hematopoietic Stem Cells,Science 10 Sep. 2010:Vol.329no.5997 pp.1345-1348中描述的SR1和LGC006(使得连接子基团L或-(L-降解决定区域)结合而衍生化)。

FF.RAF dTAG靶向配体：

本文使用的RAF dTAG靶向配体，包括但不限于：

(其中，例如，“R”指定连接子基团L或-(L-降解决定区域)基团连接的位点而衍生化)。

GG.FKBP dTAG靶向配体：

本文使用的FKBP dTAG靶向配体，包括但不限于：

(其中，“R”指定连接子基团L或-(L-降解决定区域)基团连接的位点而衍生化)。

HH.雄激素受体(AR)dTAG靶向配体：

本文使用的AR dTAG靶向配体，包括但不限于：

1.RU59063雄激素受体的配体(衍生化)

2.

2.雄激素受体的SARM配体(衍生化)

(衍生化，其中“R”表示连接子基团L或-(L-降解决定区域)基团连接的位点)。

3.雄激素受体配体DHT(衍生化)

4.MDV3100配体(衍生化)

5.ARN-509配体(衍生化)

6.六氢苯并异恶唑

7.四甲基环丁烷

II.***受体(ER)dTAG靶向配体：

如本文所用的ER dTAG靶向配体，包括但不限于：

1.***受体配体

2.

JJ.甲状腺激素受体(TR)dTAG靶向配体：

本文使用的TR dTAG靶向配体，包括但不限于：

1.甲状腺激素受体配体(衍生化)

2.

(其中，“R”指定连接子基团L或-(L-降解决定区域)基团连接的位点， MOMO表示甲氧基甲氧基而衍生化)。

KK.HIV蛋白酶dTAG靶向配体：

本文使用的HIV蛋白酶dTAG靶向配体，包括但不限于：

1.HIV蛋白酶抑制剂(衍生化)

2.

(其中，“R”指定连接子基团L或-(L-降解决定区域)基团连接的位点而衍生化)。参见J.Med.Chem.2010,53,521-538。

2.HIV蛋白酶抑制剂

(其中，“R”指定连接子基团L或-(L-降解决定区域)基团连接的潜在位点而衍生化)。参见J.Med.Chem.2010,53,521-538。

LL.HIV整合酶dTAG靶向配体：

本文使用的HIV整合酶dTAG靶向配体，包括但不限于：

1.HIV整合酶抑制剂(衍生化)

(其中，“R”指定连接子基团L或-(L-降解决定区域)基团连接的位点而衍生化)。参见J.Med.Chem.2010,53,6466。

2.HIV整合酶抑制剂(衍生化)

3.HIV整合酶抑制剂(衍生化)

MM.HCV蛋白酶dTAG靶向配体：

本文使用的HCV蛋白酶dTAG靶向配体，包括但不限于：

1.HCV蛋白酶抑制剂(衍生化)

NN.酰基-蛋白硫酯酶-1和-2(APT1和APT2)dTAG靶向配体：本文使用的酰基-蛋白质硫酯酶-1和-2(APT1和APT2)dTAG靶向配体，包括但不限于：

1.APT1和APT2的抑制剂(衍生化)

(其中“R”指定连接子基团L或-(L-降解决定区域)基团连接的位点而衍生化)。参见，Angew.Chem.Int.Ed.2011,50,9838-9842，其中 L是如本文另外描述的连接基团，并且该降解决定区域基团如本文中另外描述的，使得连接子将降解决定区域基团结合dTAG靶向配体基团，如本文中另外描述的。

OO.BCL2 dTAG靶向配体：

本文使用的BCL2 dTAG靶向配体，包括但不限于：

以及

其中:

R是连接子连接的位点。

PP.BCL-XL dTAG靶向配体：

本文使用的BCL-XL dTAG靶向配体，包括但不限于：

以及

其中:

R是连接子连接的位点。

QQ.FA结合蛋白dTAG靶向配体：

本文使用的FA dTAG靶向配体，包括但不限于：以及

其中:

R是连接子连接的位点。

RR.FLAP-5-脂氧合酶激活蛋白dTAG靶向配体：

如本文所用的FLAP-5-脂氧合酶活化蛋白dTAG靶向配体，包括但不限于：

其中:

R是连接子连接的位点。

SS.HDAC6 Zn指结构域dTAG靶向配体：

本文使用的HDAC6 Zn指结构域dTAG靶向配体，包括但不限于：

其中:

R是连接子连接的位点。

TT.三环结构域V 4BVV dTAG靶向配体：

本文使用的三环结构域V 4BVV dTAG靶向配体，包括但不限于：

其中:

R是连接子连接的位点。

UU.乳酰谷胱甘肽裂解酶dTAG靶向配体：

如本文所用的乳酰谷胱甘肽裂解酶dTAG靶向配体，包括但不限于：

其中:

R是连接子连接的位点。

VV.mPGES-1 dTAG靶向配体：

本文使用的mPGES-1 dTAG靶向配体，包括但不限于：

以及

其中:

R是连接子连接的位点。

WW.MTH1 dTAG靶向配体：

本文使用的MTH1 dTAG靶向配体，包括但不限于：

以及

其中:

R是连接子连接的位点。

XX.PARP14 dTAG靶向配体：

本文使用的PARP14 dTAG靶向配体，包括但不限于：

以及

其中:

R是连接子连接的位点。

YY.PARP15 dTAG靶向配体：

本文使用的PARP15 dTAG靶向配体，包括但不限于：

以及

其中:

R是连接子连接的位点。

ZZ.PDZ域dTAG靶向配体：

本文使用的PDZ结构域dTAG靶向配体，包括但不限于：

以及

其中:

R和R’是连接子连接的位点。

AAA.PHIP dTAG靶向配体：

本文使用的PHIP dTAG靶向配体，包括但不限于：

其中:

R是连接子连接的位点。

BBB.磷脂酶A2结构域dTAG靶向配体：

本文使用的磷脂酶A2结构域dTAG靶向配体，包括但不限于：以及

其中:

R是连接子连接的位点。

CCC.蛋白质S100-A7 2WOS dTAG靶向配体：

本文使用的蛋白质S100-A7 2WOS dTAG靶向配体，包括但不限于：

以及

其中:

R是连接子连接的位点。

DDD.鞘脂激活蛋白-B dTAG靶向配体：

本文使用的鞘脂激活蛋白-B dTAG靶向配体，包括但不限于：

以及

其中:

R是连接子连接的位点。

EEE.Sec7 dTAG靶向配体：

本文使用的Sec7 dTAG靶向配体，包括但不限于：

以及

其中:

R是连接子连接的位点。

FFF.pp60 Src dTAG靶向配体的SH2结构域：

本文使用的pp60 Src dTAG靶向配体的SH2结构域，包括但不限于：

以及

其中:

R是连接子连接的位点。

GGG.Tank1 dTAG瞄准配体：

本文使用的Tank1 dTAG靶向配体，包括但不限于：

以及

其中:

R是连接子连接的位点。

HHH.Ubc9 SUMO E2连接酶SF6D dTAG靶向配体：

本文使用的Ubc9 SUMO E2连接酶SF6D dTAG靶向配体，包括但不限于：

以及

其中：

R是连接子连接的位点。

III.Src(c-Src)dTAG靶向配体：

本文使用的Src dTAG靶向配体，包括但不限于：

1.Src靶向配体，包括AP23464：

其中:

R是连接子连接的位点。

2.Src-AS1和/或Src AS2靶向配体包括：

3.

其中:

R是连接子连接的位点。

JJJ.JAK3 dTAG靶向配体：

本文使用的JAK3 dTAG靶向配体，包括但不限于：

1.针对以JAK3为目标的配体，包括托法替尼(Tofacitinib)：

其中:

R是连接子连接的位点。

KKK.Abl dTAG针对配体：

本文使用的Abl dTAG靶向配体，包括但不限于：

1.针对以Abl为目标的配体，包括托法替尼和普纳替尼：

2

其中:

R是连接子连接的位点。

LLL.MEK1 dTAG靶向配体：

本文使用的MEK1 dTAG靶向配体，包括但不限于：

1.针对以MEK1为目标的配体，包括PD318088，曲美替尼 (Trametinib)和G-573：

其中:

R是连接子连接的位点。

MMM.KIT dTAG靶向配体：

本文使用的KIT dTAG dTAG靶向配体，包括但不限于：

1.针对以KIT为目标的配体，包括瑞格非尼(Regorafenib)：

2.

其中:

R是连接子连接的位点。

NNN.HIV逆转录酶dTAG靶向配体：

本文使用的HIV逆转录酶dTAG靶向配体，包括但不限于：

1.靶向HIV逆转录酶的靶向配体，包括依法韦仑，替诺福韦，恩曲他滨(Emtricitabine)，利托那韦，拉替拉韦(Raltegravir)和瑞塔滋 (Atazanavir)：

其中:

R是连接子连接的位点。

OOO.HIV蛋白酶Dtag靶向配体：

本文使用的HIV蛋白酶dTAG靶向配体，包括但不限于：

1.HIV蛋白酶的靶向配体，包括利托那韦，拉替拉韦和瑞塔滋：

其中:

R是连接子连接的位点。

在一个具体例中，表T的任何上述dTAG靶向配体用于靶向本文所述任何dTAG。

许多dTag靶向配体能够结合多于一种dTAG，例如，阿法替尼结合EGFR，ErbB2和ErbB4蛋白。这允许许多蛋白质的双重攻击，如表Z中所示。在一个具体例中，dTAG靶向配体选自表Z中的 “dTAG靶向配体”柱，dTAG选自相应的“dTAG”行。

表Z.dTAG靶向配体和相应的dTAG

在某些具体例中，本申请包括含有表1中所示的dTAG靶向配体的化合物。

表1.dTAG靶向配体1-6

在某些具体例中，dTAG靶向配体是式TL-I的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中：是

A¹是S或C＝C；

A²是NRa5或O；

nn1为0、1或2；

每个Ra¹独立地为C₁-C₃烷基，(CH₂)_0-3-CN，(CH₂)_0-3-卤素， (CH₂)_0-3-OH，(CH₂)_0-3-C₁-C₃烷氧基，C(O)NRa⁵L，OL，NRa⁵L或 L；

Ra²为H，C₁-C₆烷基，(CH₂)_0-3-杂环基，(CH₂)_0-3-苯基或L，其中该杂环基包含一个饱和的5-或6-元环和1至2个选自N，O和S 的杂原子，并且任选地经C₁-C₃烷基，L或C(O)L取代，并且其中苯基任选地经C₁-C₃烷基，CN，卤素，OH，C₁-C₃或L烷氧基取代；

nn2为0、1、2或3；

每个Ra³独立地为C₁-C₃烷基，(CH₂)_0-3-CN，(CH₂)_0-3-卤素，L 或C(O)NRa⁵L；

Ra⁴是C₁-C₃烷基；

Ra⁵是H或C₁-C₃烷基；和

L是一个连接子，

条件是式TL-I的化合物仅经一个L取代。

在某些实施例中，是

在某些具体例中，A¹是S。

在某些具体例中，A¹是C＝C。

在某些具体例中，A²是NRa⁵。在进一步的具体例中，Ra⁵是H。在其他具体例中，Ra⁵是C₁-C₃烷基(例如甲基，乙基，丙基或异丙基)。在进一步的具体例中，Ra⁵是甲基。

在某些具体例中，A²是O。

在某些具体例中，nn1为0。

在某些具体例中，nn1是1。

在某些具体例中，nn1是2。

在某些具体例中，至少一个Ra¹是C₁-C₃烷基(例如甲基，乙基，丙基或异丙基)。在进一步的具体例中，至少一个Ra¹是甲基。在进一步的具体例中，两个Ra¹是甲基。

在某些具体例中，至少一个Ra¹是CN，(CH₂)-CN，(CH₂)₂-CN 或(CH₂₎₃-CN。在进一步的具体例中，至少一个Ra¹是(CH₂)-CN。

在某些具体例中，至少一个Ra¹是卤素(例如F，Cl或Br)， (CH₂)-卤素，(CH₂)₂-卤素或(CH₂)₃-卤素。在进一步的具体例中，至少一个Ra¹是Cl，(CH₂)-Cl，(CH₂)₂-Cl或(CH₂)₃-Cl。

在某些具体例中，至少一个Ra¹是OH，(CH₂)-OH，(CH₂)₂- OH或(CH₂)₃-OH。

在某些具体例中，至少一个Ra¹是C₁-C₃烷氧基(例如，甲氧基，乙氧基或丙氧基)，(CH₂)-C₁-C₃烷氧基，(CH₂)₂-C₁-C₃烷氧基或 (CH₂)₃-C₁-C₃烷氧基。在某些具体例中，至少一个Ra¹是甲氧基。

在某些具体例中，一个Ra¹是C(O)NRa⁵L。在进一步的具体例中，Ra⁵是H。在其他具体例中，Ra⁵是C₁-C₃烷基(例如甲基，乙基，丙基或异丙基)。

在某些具体例中，一个Ra¹是OL。

在某些具体例中，一个Ra¹是NRa⁵L。在进一步的具体例中， Ra⁵是H。在其他具体例中，Ra⁵是C₁-C₃烷基(例如甲基，乙基，丙基或异丙基)。在其他具体例中，Ra⁵是甲基。

在某些具体例中，一个Ra¹是L。

在某些具体例中，Ra²是H。

在某些具体例中，R^a2是直链C₁-C₆或支链C₃-C₆烷基(例如甲基，乙基，丙基，异丙基，丁基，异丁基，叔丁基，戊基或己基)。在进一步的具体例中，Ra²是甲基，乙基或叔丁基。

在某些具体例中，Ra²是杂环基，(CH₂)-杂环基，(CH₂)₂-杂环基或(CH₂)₃-杂环基。在进一步的具体例中，Ra²是(CH₂)₃-杂环基。在进一步的具体例中，杂环基是选自吡咯烷基，吡唑烷基，咪唑烷基，恶唑烷基，异恶唑烷基，噻唑烷基，异噻唑烷基，哌啶基，哌嗪基，六氢嘧啶基，吗啉基和硫代吗啉基。在进一步的具体例中，杂环基是哌嗪基。

在某些具体例中，杂环基经C₁-C₃烷基(例如甲基，乙基，丙基或异丙基)取代。

在某些具体例中，杂环基经C(O)L取代。

在某些具体例中，杂环基经L取代。

在某些具体例中，Ra²是苯基，(CH₂)-苯基，(CH₂)₂-苯基或 (CH₂)₃-苯基。在进一步的具体例中，Ra²是苯基。

在某些具体例中，苯基经C₁-C₃烷基(例如甲基，乙基，丙基或异丙基)取代。在某些具体例中，苯基经CN取代。在某些具体例中，苯基经卤素(例如F，Cl或Br)取代。在某些具体例中，苯基经OH取代。在某些具体例中，苯基经C₁-C₃烷氧基(例如甲氧基，乙氧基或丙氧基)取代。

在某些具体例中，苯基经L取代。

在某些具体例中，Ra²是L。

在某些具体例中，nn2为0。

在某些具体例中，nn2是1。

在某些具体例中，nn2是2。在某些实施例中，nn2是3。

在某些具体例中，至少一个Ra³是C₁-C₃烷基(例如甲基，乙基，丙基或异丙基)。在进一步的具体例中，至少一个Ra 3是甲基。

在某些具体例中，至少一个Ra³是CN，(CH₂)-CN，(CH₂)₂-CN 或(CH₂)₃-CN。在进一步的具体例中，至少一个Ra³是CN。

在某些具体例中，至少一个Ra³是卤素(例如F，Cl或Br)， (CH₂)-卤素，(CH₂)₂-卤素或(CH2)3-卤素。在进一步的具体例中，至少一个Ra³是Cl，(CH₂)-Cl，(CH₂)₂-Cl或(CH₂)₃-Cl。在进一步的具体例中，至少一个Ra³是Cl。

在某些具体例中，一个Ra³是L。

在某些具体例中，一个Ra³是C(O)NRa⁵L。在进一步的具体例中，Ra⁵是H。在其他具体例中，Ra⁵是C₁-C₃烷基(例如甲基，乙基，丙基或异丙基)。

在某些具体例中，Ra⁴是C₁-C₃烷基(例如甲基，乙基，丙基或异丙基)。在进一步的具体例中，Ra⁴是甲基。

在某些具体例中，Ra⁵是H。

在某些具体例中，Ra⁵是C₁-C₃烷基(例如甲基，乙基，丙基或异丙基)。在进一步的具体例中，Ra⁵是甲基。

在某些具体例中，是和A¹是S。

在某些具体例中，是和A¹是C＝C。

在某些实施例中，是和A¹是C＝C。

在某些具体例中，A²是NH，并且Ra²是(CH2)_0-3-杂环基。在进一步的具体例中，Ra²是(CH₂)₃-杂环基。在进一步的具体例中，杂环基是哌嗪基。在进一步的具体例中，杂环基被C₁-C₃烷基，L或 C(O)L取代。

在某些具体例中，A²是NH，并且Ra²是(CH₂)_0-3-苯基。在进一步的具体例中，Ra²是苯基。在进一步的具体例中，苯基被OH或 L取代。

在某些具体例中，A²是NH，Ra²是L。

在某些具体例中，A²是NH，并且Ra²是H或C₁-C₆烷基。在进一步的具体例中，Ra²是C₁-C₄烷基。

在某些具体例中，A²是O，并且Ra²是H或C₁-C₆烷基。在进一步的具体例中，Ra²是C₁-C₄烷基。

在某些具体例中，dTAG靶向配体是式TL-I1的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中A²，Ra¹，Ra²，Ra³，Ra⁴，Ra⁵，nn1 和nn2每一个如上式TL-1中所定义。

A²，Ra¹，Ra²，Ra³，Ra⁴，Ra⁵，nn1和nn2中的每一个可以选自上述式TL-1中所述的部分。A²，Ra¹，Ra²，Ra³，Ra⁴，Ra⁵，nn¹和nn²的一个定义的每个部分可以与A²，Ra¹，Ra²，Ra³，Ra⁴，Ra⁵， nn1和nn25中的其他部分者定义的任何部分合并，如上式TL-1中所述。

在某些具体例中，dTAG靶向配体是式TL-I1a至TL-I1d的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中：

每个Ra⁶独立地为C₁-C₃烷基，(CH₂)_0-3-CN，(CH₂)_0-3-卤素， (CH₂)_0-3-OH或(CH₂)_0-3-C₁-C₃烷氧基；

Ra⁷是(CH₂)_0-3-杂环基，(CH₂)_0-3-苯基或L，其中杂环基包含一个饱和的5-或6-元环和1至2个选自N，O和S的杂原子，并且经L或C(O)L取代，并且其中该苯基经L取代；

Ra⁸为H，C₁-C₆烷基，(CH₂)_0-3-杂环基或(CH₂)_0-3-苯基，其中该杂环基包含一个饱和的5-或6-元环和1至2个选自N，O和S的杂原子，并且任选经C₁-C₃烷基取代，并且其中该苯基任选经C₁-C₃烷基，CN，卤素，OH或C₁-C₃烷氧基取代；

Ra¹⁰为C₁-C₃烷基，(CH₂)_0-3-CN或(CH₂)_0-3-卤素；和

A2，Ra⁴，Ra⁵，nn1和L每一个如上式TL-1中所定义。

在某些具体例中，nn1是0。

在某些具体例中，nn1是1。

在某些具体例中，nn1是2。

在某些具体例中，至少一个Ra⁶是C₁-C₃烷基(例如甲基，乙基，丙基或异丙基)。在进一步的具体例中，至少一个Ra⁶是甲基。在进一步的具体例中，两个Ra⁶是甲基。

在某些具体例中，至少一个Ra⁶是CN，(CH₂)-CN，(CH₂)₂-CN 或(CH₂)₃-CN。在进一步的具体例中，至少一个Ra⁶是(CH₂)-CN。

在某些具体例中，至少一个Ra⁶是卤素(例如F，Cl或Br)， (CH₂)-卤素，(CH₂)₂-卤素或(CH₂)₃-卤素。在进一步的具体例中，至少一个Ra⁶是Cl，(CH₂)-Cl，(CH₂)₂-Cl或(CH₂)₃-Cl。

在某些具体例中，至少一个Ra⁶是OH，(CH₂)-OH，(CH₂)₂- OH或(CH₂)₃-OH。

在某些具体例中，至少一个Ra⁶是C₁-C₃烷氧基(例如，甲氧基，乙氧基或丙氧基)，(CH₂)-C₁-C₃烷氧基，(CH₂)₂-C₁-C₃烷氧基或 (CH₂)₃-C₁-C₃烷氧基。在某些具体例中，至少一个Ra⁶是甲氧基。

在某些具体例中，Ra⁷是杂环基，(CH₂)-杂环基，(CH₂)₂-杂环基或(CH₂)₃-杂环基。在进一步的具体例中，Ra⁷是(CH₂)₃-杂环基。在进一步的具体例中，杂环基是选自吡咯烷基，吡唑烷基，咪唑烷基，恶唑烷基，异恶唑烷基，噻唑烷基，异噻唑烷基，哌啶基，哌嗪基，六氢嘧啶基，吗啉基和硫代吗啉基。在进一步的具体例中，杂环基是哌嗪基。

在某些具体例中，杂环基经C(O)L取代。

在某些具体例中，杂环基经L取代。

在某些具体例中，Ra⁷是苯基，(CH₂)-苯基，(CH₂)₂-苯基或 (CH₂)₃-苯基。在进一步的具体例中，Ra⁷是苯基。

在某些具体例中，Ra⁷是L。

在某些具体例中，Ra⁸是H。

在某些具体例中，Ra⁸是直链C₁-C₆或支链C₃-C₆烷基(例如甲基，乙基，丙基，异丙基，丁基，异丁基，叔丁基，戊基或己基)。在进一步的具体例中，Ra⁸是甲基，乙基或叔丁基。

在某些具体例中，Ra⁸是杂环基，(CH₂)-杂环基，(CH₂)₂-杂环基或(CH₂)₃-杂环基。在进一步的具体例中，Ra⁸是(CH₂)₃-杂环基。在进一步的具体例中，杂环基是选自吡咯烷基，吡唑烷基，咪唑烷基，恶唑烷基，异恶唑烷基，噻唑烷基，异噻唑烷基，哌啶基，哌嗪基，六氢嘧啶基，吗啉基和硫代吗啉基。在进一步的具体例中，杂环基是哌嗪基。

在某些具体例中，Ra⁸是苯基，(CH₂)-苯基，(CH₂)₂-苯基或 (CH₂)₃-苯基。在进一步的具体例中，Ra⁸是苯基。

在某些具体例中，苯基经C¹-C³烷基(例如甲基，乙基，丙基或异丙基)取代。在某些具体例中，苯基经CN取代。在某些具体例中，苯基经卤素(例如F，Cl或Br)取代。在某些具体例中，苯基经OH取代。在某些具体例中，苯基经C₁-C₃烷氧基(例如甲氧基，乙氧基或丙氧基)取代。

在某些具体例中，Ra¹⁰是C₁-C₃烷基(例如甲基，乙基，丙基或异丙基)。

在某些具体例中，Ra¹⁰是CN，(CH₂)-CN，(CH₂)₂-CN或 (CH₂)₃-CN。

在某些具体例中，Ra¹⁰是卤素(例如，F，Cl或Br)，(CH₂)-卤素，(CH₂)₂-卤素或(CH₂)₃-卤素。在进一步的具体例中，Ra¹⁰是Cl， (CH₂)-Cl，(CH₂)₂-Cl或(CH₂)₃-Cl。在进一步的具体例中，Ra¹⁰是Cl。

A²，Ra⁴，Ra⁵和nn1中的每一个可以选自上述式TL-1中所述的部分。A²，Ra⁴，Ra⁵，Ra⁶，Ra⁷，Ra⁸，Ra¹⁰和nn1中的一个定义的每个部分可以与为A²，Ra⁴，Ra⁵，Ra⁶，Ra⁷，Ra⁸，Ra¹⁰和nn1中的其他者定义的任何部分组合，如上所述和式TL-1中所述。

在某些具体例中，dTAG靶向配体是式TL-I2的化合物：

A²，Ra¹，Ra²，Ra³，Ra⁴，Ra⁵，nn1和nn2中的每一个可以选自上述式TL-1中所述的部分。A²，Ra¹，Ra²，Ra³，Ra⁴，Ra⁵，nn1 和nn2中的一个的定义的每个部分可以与为A²，Ra¹，Ra²，Ra³， Ra⁴，Ra⁵，nn1和nn2中的其他部分定义的任何部分组合，如上式 TL-1中所述。

在某些具体例中，dTAG靶向配体是式TL-I2a至TL-I2c的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中A²，Ra⁴，Ra⁵，nn1和L每一个如上式TL-1中所定义，并且Ra⁶，Ra⁷，Ra⁸和Ra¹⁰每一个如上式TL- I1a至TL-I1d中所定义。

A²，Ra⁴，Ra⁵和nn1中的每一个可以选自上述式TL-1中所述的部分，并且Ra⁶，Ra⁷，Ra⁸和Ra¹⁰中的每一个可以选自上述式 TL-I1a至TL-I1d中所述的部分。A²，Ra⁴，Ra⁵，Ra⁶，Ra⁷，Ra⁸和 Ra¹⁰和nn1中的一个定义的每个部分可以与为A²，Ra⁴，Ra⁵，Ra⁶， Ra⁷，Ra⁸和Ra¹⁰和nn1中的其他部分定义的任何部分组合，如上式 TL-1和TL-I1a至TL-I1d中所述。

在某些具体例中，dTAG靶向配体是式TL-I3的化合物：

或其药学上可接受的盐。

A²，Ra¹，Ra²，Ra³，Ra⁴，Ra⁵，nn1和nn2每一个如上式TL- 1中所定义。A²，Ra¹，Ra²，Ra³，Ra⁴，Ra⁵，nn1和nn2中的每一个可以选自上述式TL-1中所述的部分。A²，Ra¹，Ra²，Ra³，Ra⁴，Ra⁵，nn1和nn2中的一个定义的每个部分可以与A²，Ra¹，Ra²， Ra³，Ra⁴，Ra⁵，nn1和nn2中的其他部分定义的任何部分合并，如上式TL-1中所述。

在某些具体例中，dTAG靶向配体是式TL-I3a至TL-I3c的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中：

Ra⁹是C(O)NRa⁵L，OL，NRa⁵L或L；

A²，Ra⁴，Ra⁵，nn1和L每一个如上式TL-1中所定义；和

Ra⁶，Ra⁷，Ra⁸和Ra¹⁰每一个如上式TL-I1a-TL-I1d中所定义。

在某些具体例中，Ra⁹是C(O)NRa⁵L。在进一步的具体例中， Ra⁵是H。在其他具体例中，Ra⁵是C₁-C₃烷基(例如甲基，乙基，丙基或异丙基)。

在某些具体例中，Ra⁹是OL。

在某些具体例中，Ra⁹是NRa⁵L。在进一步的具体例中，Ra⁵是 H。在其他具体例中，Ra⁵是C₁-C₃烷基(例如甲基，乙基，丙基或异丙基)。在其他具体例中，Ra⁵是甲基。

在某些具体例中，Ra⁹是L。

A²，Ra⁴，Ra⁵和nn1中的每一个可以选自上述式TL-1中所述的部分，并且Ra⁶，Ra⁷，Ra⁸和Ra¹⁰中的每一个可以选自上述式 TL-I1a至TL-I1d中所述的部分。A²，Ra⁴，Ra⁵，Ra⁶，Ra⁷，Ra⁸， Ra⁹，Ra¹⁰和nn1中的一个定义的每个部分可以与为A²，Ra⁴，Ra⁵， Ra6，Ra⁷，Ra⁸，Ra⁹，Ra¹⁰和nn1的其他者定义的任何部分合并，如上所述和式TL-I和TL-I1a至TL-I1d中所述。

在某些具体例中，dTAG靶向配体是式TL-VI的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中：

Rf¹是C(O)NRf²L，OL，NRf²L或L；

Rf²独立地为H或C₁-C₃烷基；和

L是连接子。

在某些具体例中，Rf¹是C(O)NRf²L。在进一步的具体例中， Rf²是H。在其他具体例中，Rf²是C₁-C₃烷基(例如甲基，乙基，丙基或异丙基)。

在某些具体例中，Rf¹是OL。

在某些具体例中，Rf¹是NRe⁴L。在进一步的具体例中，Rf²是 H。在其他具体例中，Rf²是C₁-C₃烷基(例如甲基，乙基，丙基或异丙基)。在其他具体例中，Rf²是甲基。

在某些具体例中，Rf¹是L。

在某些具体例中，dTAG靶向配体是式TL-VII的化合物：

或其药学上可接受的盐，其中：

T₇为CH₂或CH₂CH₂；

Rg¹为C(O)Rg⁵或(CH2)1-3Rg⁶；

nn10是0、1、2或3；

nn11为0、1、2或3；

每个Rg²独立地是C₁-C₃烷基，C₁-C3烷氧基，CN或卤素；

Rg³为C(O)NRg⁴L，OL，NRg⁴L，L，O-(CH₂)_1-3-C(O)NRg⁴L，或NHC(O)-(CH₂)_1-3-C(O)NRg⁴L；

Rg⁴为H或C₁-C₃烷基；

Rg⁵是C₁-C₆烷基；

Rg⁶是任选经C₁-C₃烷基，C₁-C₃烷氧基，CN或卤素取代的苯基；和

L是连接子。

在某些具体例中，T⁷是CH₂。

在某些具体例中，T⁷是CH₂CH₂。

在某些具体例中，Rg¹是C(O)Rg⁵。

在某些具体例中，Rg¹是(CH₂)-Rg⁶，(CH₂)₂-Rg⁶或(CH₂)₃- Rg⁶。

在某些具体例中，Rg⁵是直链C₁-C₆或支链C₃-C₆烷基(例如甲基，乙基，丙基，异丙基，丁基，异丁基，叔丁基，戊基或己基)。

在某些具体例中，Rg⁶是未取代的苯基。

在某些具体例中，Rg⁶是被一个，两个，三个或更多个取代基取代的苯基，所述取代基独立地选自C₁-C₃烷基(例如甲基，乙基，丙基或异丙基)，C₁-C₃烷氧基(例如，甲氧基，乙氧基或丙氧基)， CN和卤素(例如F，Cl或Br)。

在某些具体例中，nn10是0。

在某些具体例中，nn10是1。

在某些具体例中，nn10是2。

在某些具体例中，nn10是3。

在某些具体例中，nn11是0。

在某些具体例中，nn11是1。

在某些具体例中，nn11是2。

在某些具体例中，nn11是3。

在某些具体例中，至少一个Rg²是C₁-C₃烷基(例如甲基，乙基，丙基或异丙基)。在进一步的具体例中，至少一个Rg²是甲基。

在某些具体例中，至少一个Rg²是C₁-C₃烷氧基(例如甲氧基，乙氧基或丙氧基)。在进一步的具体例中，至少一个Rg²是甲氧基。

在某些具体例中，至少一个Rg²是CN。

在某些具体例中，至少一个Rg²是卤素(例如，F，Cl或Br)。

在某些具体例中，Rg³是C(O)NRg⁴L。在进一步的具体例中， Rg⁴是H，在其他具体例中，Rg⁴是C₁-C₃烷基(例如甲基，乙基，丙基或异丙基)。

在某些具体例中，Rg³是OL。

在某些具体例中，Rg³是NRg⁴L。在进一步的具体例中，Rg⁴是H。在其他具体例中，Rg⁴是C₁-C₃烷基(例如甲基，乙基，丙基或异丙基)。在其他具体例中，Rg⁴是甲基。

在某些具体例中，Rg³是L。

在某些具体例中，Rg³是O-(CH₂)-C(O)NRg⁴L，O-(CH₂)₂- C(O)NRg4L或O-(CH₂)₃-C(O)NRg⁴L。在进一步的具体例中，Rg³是 O-(CH₂)-C(O)NRg⁴L。在进一步的具体例中，Rg⁴是H。在其他具体例中，Rg⁴是C₁-C₃烷基(例如甲基，乙基，丙基或异丙基)。

在某些具体例中，Rg³是NHC(O)-(CH₂)-C(O)NRg⁴L， NHC(O)-(CH₂)₂-C(O)NRg⁴L，或NHC(O)-(CH₂)₃-C(O)NRg⁴L。在进一步的具体例中，Rg³是NHC(O)-(CH₂)-C(O)NRg⁴L，NHC(O)-(CH₂)₂-C(O)NRg⁴L。在进一步的具体例中，Rg³是NHC(O)-(CH₂)₂- C(O)NRg⁴L。在进一步的具体例中，Rg⁴是H。在其他具体例中， Rg⁴是C₁-C₃烷基(例如甲基，乙基，丙基或异丙基)。

在某些实施方式中，dTAG靶向配体是选自图28所示的结构，其中R是连接连接子的位点。

在某些具体例中，dTAG靶向配体或靶标是基于存在(已知的 dTAG结合部分)和能够开发具有可容纳连接子的功能性位置的有效和选择性配体的能力来选择的。一些具体例涉及具有较低选择性的 dTAG靶向配体，其可以受益于与蛋白质组学结合的降解作为化合物选择性或靶标ID的量度。

本申请的一些具体例涉及CAR的30％至100％的降解或损失。某些具体例涉及CAR的50至100％的损失。其他具体例涉及CAR 的75至95％的损失。

用于本发明的异双功能性化合物的非限制性实例包括那些图29、 30、31和32所示者。

图29提供了用于本发明的具体异双功能性化合物。

图30提供了用于本发明的具体异双功能性化合物，其中上述结构中的X是选自F，Cl，Br和I的卤素。

图31提供了用于本发明的具体异双功能性化合物。

图32提供了用于本发明的具体异双功能性化合物，

其中：R^AR1是选自：以及和

R^AR2是选自：以及

用于本发明的其他化合物包括图33的结构。

一些前述异双功能性化合物包括一个或多个不对称中心，因此可以以各种异构形式存在，例如立体异构体和/或非对映异构体。因此，化合物和其药物组合物可以是单独对映异构体，非对映异构体或几何异构体的形式，或可以是立体异构体混合物的形式。在某些具体例中，本申请的化合物是对映体纯的化合物。在某些其他具体例中，提供了立体异构体或非对映异构体的混合物。

此外，除非另有说明，否则如本文所述的某些异双功能性化合物可具有一个或多个双键，其可以Z或E异构体存在。本申请还包括作为实质上不含其它异构体的单独异构体的化合物，或者作为各种异构体的混合物，例如立体异构体的外消旋混合物。除了上述化合物本身之外，本申请还包括这些异双功能性化合物的药学上可接受的衍生物和包含一种或多种本申请化合物和一种或多种药学上可接受的赋形剂或添加剂的组合物。

本申请的异双功能性化合物可以通过在不同条件下结晶化合物来制备，并且可以作为构成本申请一部分的化合物的多晶型物之一或其组合存在。例如，可以使用不同溶剂或不同溶剂混合物进行重结晶来鉴定和/或制备不同的多晶型物；通过在不同温度下进行结晶；或者通过使用各种冷却模式，从结晶期间的非常快速到非常慢的冷却。多晶型物也可以通过加热或熔化化合物然后逐渐或快速冷却来获得。多晶型物的存在可以通过固体探针NMR光谱法，IR光谱法，差示扫描量热法，粉末X射线衍射图和/或其他技术来确定。因此，本申请包括异双功能性化合物，其衍生物，其互变异构形式，其立体异构体，其多晶型物，其药学上可接受的盐，其药学上可接受的溶剂化物和含有该化合物的药学上可接受的组合物。

异双功能性化合物的一般合成

本文所述的异双功能性化合物可通过本领域技术人员已知的方法制备。在一个非限制性实例中，所揭露的异双功能性化合物可通过以下方案制备。

反应图1

反应图2

如反应图1所示，用于本发明的异双功能性化合物可通过化学结合降解决定区域和连接子，随后加入dTAG靶向配体来制备。类似地，在反应图2中，通过首先化学组合dTAG靶向配体和连接子，然后加入降解决定区域，以制备用于本发明的异双功能性化合物。

如上和如下反应图中所示，本领域技术人员可以通过各种方法和化学反应容易地合成用于本发明的异双功能性化合物。

反应图3

反应图3：在步骤1中，亲核的降解决定区域置换连接子上的离去基团以制备降解决定区域连接子片段。在步骤2中，通过本领域已知的方法除去保护基团以释放连接子上的亲核位点。在步骤3 中，亲核的降解决定区域连接子片段置换dTAG靶向配体上的离去基团，以形成用于本发明的化合物。在另一个具体例中，步骤1和/ 或步骤2通过偶联反应而不是亲核攻击完成。

反应图4

反应图4：在步骤1中，亲核dTAG靶向配体置换连接子上的离去基团以制备dTAG靶向配体连接子片段。在步骤2中，通过本领域已知的方法除去保护基团以释放连接子上的亲核位点。在步骤 3中，亲核dTAG靶向配体连接子片段取代降解决定区域上的离去基团以形成用于本发明的化合物。在另一个具体例中，步骤1和/或步骤2通过偶联反应而不是亲核攻击完成。

反应图5

反应图6

反应图5和反应图6：在步骤1中，亲核的降解决定区域置换连接子上的离去基团以制备降解决定区域连接子片段。在步骤2中，通过本领域已知的方法除去保护基团以释放连接子上的亲核位点。在步骤3中，亲核的降解决定区域连接子片段置换dTAG靶向配体上的离去基团以形成式I或式II的化合物。在另一个具体例中，步骤 1和/或步骤2通过偶联反应而不是亲核攻击完成。

a)使(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯或其类似物(例如，n＝1至20)(1) 或其类似物(例如，n＝1至20)与氯乙酰氯在合适的条件下反应以产生(2-(2-氯乙酰氨基)乙基)氨基甲酸叔丁酯或其类似物(例如，n＝1 至20)(2)；

b)在合适的条件下使(2-(2-氯乙酰氨基)乙基)氨基甲酸叔丁酯或其类似物(2)与3-羟基邻苯二甲酸二甲酯反应，以提供3-(2-((2-((叔丁氧基羰基)氨基))乙基)氨基)-2-氧代乙氧基)邻苯二甲酸酯或其类似物(3)；

c)使3-(2-((2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙基)氨基)-2-氧代乙氧基)邻苯二甲酸二甲酯或其类似物(3)与强碱反应，然后与3-氨基哌啶-2,6反应- 二酮盐酸盐反应，以生成(2-(2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰氨基)乙基)氨基甲酸叔丁酯或其类似物(4)；

d)使化合物(4)脱保护，以提供二氨基乙酰基-O-沙利度胺三氟乙酸盐或其类似物(5)；

e)使化合物(5)与dTAG靶向配体的酸衍生物(化合物(6))在合适的条件下反应，以得到双功能性化合物(7)。

在某些具体例中，上述方法在溶液相中进行。在某些其他具体例中，上述方法在固相上进行。在某些具体例中，合成方法适用于高通量技术或通常用于组合化学的技术。

异双功能性化合物的代表性合成

除非另有说明，否则起始材料可以商业获得，或者由熟悉本领域的任何人通过实验室合成容易地获得。以下一般性描述的是合成通常描述的化合物和本文亚类和种类的方法和一般指导。

合成例1'：IMiD衍生物和降解决定区域的合成

通用程序I：IMiD冷凝

2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-羟基异吲哚啉-1,3-二酮(D-1)

在20mL玻璃小瓶中，将3-羟基邻苯二甲酸酐(500mg，3.05 mmol，1当量)，乙酸钾(927mg，9.44mmol，3.1当量)和3-氨基哌啶-2,6-二酮盐酸盐(552mg，3.35mmol，1.1当量)于乙酸(10.2 mL，0.3M)的混合物加热至90℃过夜。将黑色反应混合物冷却至室温并用水稀释至20mL，随后在冰上冷却30分钟。将得到的浆液转移到50mL Falcon管中，将其以3500rpm离心5分钟。弃去上清液，将黑色固体转移至含有甲醇的250mL RBF中并真空浓缩。通过快速柱色谱法(CH₂Cl₂：MeOH(9：1))在硅胶上纯化残余物，得到标题化合物，为白色固体(619mg，74％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆) δ11.07(s,1H),7.65(dd,J＝8.4,6.8Hz,1H),7.31(d,J＝6.8Hz, 1H),7.24(d,J＝8.4Hz,1H),5.06(dd,J＝12.8,5.4Hz,1H),2.94– 2.82(m,1H),2.64–2.43(m,2H),2.08–1.97(m,1H)；计算 C₁₃H₁₁N₂O₅[M+H]⁺ 275.07的MS(ESI)，实测为275.26。

2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-硝基异吲哚啉-1,3-二酮(D-10)

按照通用方法I使用3-硝基邻苯二甲酸酐(300mg，1.55mmol， 1当量)，乙酸钾(473mg，4.82mmol，3.1当量)和3-氨基哌啶-2,6- 二酮盐酸盐(281mg，1.71mmol)通过快速柱色谱(CH₂Cl₂：MeOH(9： 1))在硅胶上纯化，得到标题化合物，为浅黄色固体(280mg，59％)。¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ11.17(s,1H),8.35(d,J＝8.1Hz, 1H),8.24(d,J＝7.5Hz,1H),8.14–8.10(m,1H),5.20(dd,J＝12.9, 5.5Hz,1H),2.93–2.84(m,1H),2.64–2.45(m,2H),2.11–2.04 (m,1H)；计算C₁₃H₁₀N₃O₆[M+H]⁺ 304.06的MS(ESI)，实测为 304.19。

2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-5-硝基异吲哚啉-1,3-二酮(D-2)

按照通用方法I，使用4-硝基邻苯二甲酸酐(300mg，1.55 mmol)，乙酸钾(473mg，4.82mmol)和3-氨基哌啶-2,6-二酮盐酸盐 (281mg，1.71mmol)，通过快速柱色谱法(CH₂Cl₂：MeOH(30：1)) 在硅胶上纯化后，得到标题化合物，为白色固体(409mg，87％)。 ¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ11.18(s,1H),8.68(dd,J＝8.1,1.9 Hz,1H),8.56(d,J＝1.9Hz,1H),8.19(d,J＝8.1Hz,1H),5.24(dd, J＝12.9,5.4Hz,1H),2.90(ddd,J＝17.2,13.9,5.5Hz,1H),2.69– 2.48(m,2H),2.14–2.05(m,1H)；计算C₁₃H₁₀N₃O₆[M+H]⁺ 304.06 的MS(ESI)，实测为304.19。

2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮(D-6)

按照通用方法I，使用邻苯二甲酸酐(155mg，1.05mmol)，乙酸钾(318mg，3.24mmol)和3-氨基哌啶-2,6-二酮盐酸盐(189mg， 1.15mmol)，通过快速柱色谱法(CH2Cl₂：MeOH(15：1))在硅胶上纯化后，得到标题化合物，为白色固体(235mg，87％)。¹HNMR (500MHz,DMSO-d₆)δ11.13(s,1H),8.00–7.76(m,4H),5.16(dd, J＝12.8,5.4Hz,1H),2.89(ddd,J＝16.8,13.7,5.4Hz,1H),2.65– 2.42(m,2H),2.12–1.99(m,1H)；计算计算C₁₃H₁₁N₂O₄[M+H]⁺ 259.07的MS(ESI)，实测为259.23。

2-(2,5-二氧代吡咯烷-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮(D-7)

按照通用方法I，使用邻苯二甲酸酐(90mg，0.608mmol)，乙酸钾(185mg，1.88mmol)和3-氨基吡咯烷-2,5-二酮盐酸盐(101mg， 0.668mmol)，通过快速柱色谱法(CH₂Cl₂：MeOH(14：1))在硅胶上纯化后，得到标题化合物，为白色固体(95mg，64％)。计算C₁₂H₉N₂O₄[M+H]⁺ 245.06的MS(ESI)，实测为45.26。

2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-5-羧酸(D-13)

按照通用方法I，使用1,2,4-苯三甲酸酐(200mg，1.04mmol)，乙酸钾(317mg，3.23mmol)和3-氨基哌啶-2,6-二酮盐酸盐(188mg， 1.15mmol)。通过快速柱色谱法(CH₂Cl₂：MeOH(9：1))在硅胶上纯化后，得到标题化合物，为白色固体(178mg，57％)。计算 C₁₄H₁₁N₂O₆[M+H]⁺ 303.06的MS(ESI)，实测为303.24。

2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-氟异二氢吲哚-1,3-二酮(D-14)

按照通用方法I，使用3-氟邻苯二甲酸酐(200mg，1.20mmol)，乙酸钾(366mg，3.73mmol)和3-氨基哌啶-2,6-二酮盐酸盐(218mg， 1.32mmol)，通过快速柱色谱法(CH2Cl2：MeOH(50：1))在硅胶上纯化后，得到标题化合物，为白色固体(288mg，86％)。¹HNMR (500MHz,DMSO-d₆)δ11.15(s,1H),7.96(ddd,J＝8.3,7.3,4.5Hz, 1H),7.82–7.71(m,2H),5.17(dd,J＝13.0,5.4Hz,1H),2.90(ddd, J＝17.1,13.9,5.4Hz,1H),2.65–2.47(m,2H),2.10–2.04(m,1H), 计算C₁₃H₁₀FN₂O₄[M+H]⁺ 277.06的MS(ESI)，实测为277.25。

2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-甲基异吲哚啉-1,3-二酮(D-19)

按照通用方法I，使用3-甲基邻苯二甲酸酐(150mg，0.925 mmol)，乙酸钾(281mg，2.87mmol)和3-氨基哌啶-2,6-二酮盐酸盐 (167mg，1.02mmol)，通过快速柱色谱法(CH₂Cl₂：MeOH(15：1)) 在硅胶上纯化后，得到标题化合物，为白色固体(168mg，67％)。计算C₁₄H₁₃N₂O₄[M+H]⁺ 273.09的MS(ESI)，实测为273.24。

2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-5-氟异二氢吲哚-1,3-二酮(D-24)

按照通用方法I，使用4-氟邻苯二甲酸酐(200mg，1.20mmol)，乙酸钾(366mg，3.73mmol)和3-氨基哌啶-2,6-二酮盐酸盐(218mg， 1.32mmol)，通过快速柱色谱法(CH₂Cl₂：MeOH(15：1))在硅胶上纯化后，得到标题化合物，为白色固体(254mg，76％)。计算C₁₃H₁₀FN₂O₄[M+H]⁺ 277.06的MS(ESI)，实测为277.24。

2-(2,6-二氧代哌啶-4-基)异吲哚啉-1,3-二酮(D-43)

按照通用方法I，使用邻苯二甲酸酐(60mg，0.311mmol)，乙酸钾(95mg，0.963mmol)和4-氨基哌啶-2,6-二酮盐酸盐(56mg， 0.342mmol)，通过快速柱色谱法(CH2Cl2：MeOH(9：1))在硅胶上纯化后，得到标题化合物，为白色固体(40mg，43％)。计算C₁₃H₁₁N₂O₄[M+H]⁺ 259.07的MS(ESI)，实测为259.18。

通用程序II：还原芳族硝基

4-氨基-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮(D-4)

将2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-硝基异吲哚啉-1,3-二酮(173mg， 0.854mmol)，Pd(OAc)₂(12.8mg，0.0854mmol，10mol％)氟化钾 (66mg，1.71mmol，2当量)于THF：水(8：1)(5.7mL，0.1M)的溶液在室温搅拌。缓慢加入三乙基硅烷(365μL，3.41mmol，4当量)，将得到的黑色溶液在室温搅拌1小时。将反应混合物通过硅藻土垫过滤，用乙酸乙酯过量洗涤。将滤液真空浓缩，并将残余物通过快速柱色谱法(CH₂Cl₂：MeOH(7：1))在硅胶上纯化，得到标题化合物，为黄色粉末(72mg，46％)。¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ11.08(s, 1H),7.47(dd,J＝8.5,7.0Hz,1H),7.06–6.95(m,1H),6.59–6.44 (m,1H),5.04(dd,J＝12.7,5.4Hz,1H),2.93–2.82(m,1H),2.64– 2.45(m,2H),2.05–1.98(m,1H)；计算C₁₃H₁₁N₃O₄[M+H]⁺ 274.08 的MS(ESI)，实测为274.23。

2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-5-硝基异吲哚-1,3-二酮(D-8)

按照通用方法II，使用2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-5-硝基异吲哚啉-1,3-二酮(100mg，0.330mmol)，Pd(OAc)₂(7.4mg，0.033mmol) 氟化钾(38mg，0.660mmol)和三乙基硅烷(211μL，1.32mmol，通过快速柱色谱法(CH2Cl2：MeOH(9：1)))在硅胶上纯化，得到标题化合物，为黄色固体(33mg，37％)。¹H NMR(500MHz,DMSO- d₆)δ11.05(s,1H),7.52(d,J＝8.2Hz,1H),6.94(d,J＝2.0Hz,1H), 6.83(dd,J＝8.2,2.0Hz,1H),6.55(s,2H),5.01(dd,J＝12.8,5.4 Hz,1H),2.86(ddd,J＝16.9,13.9,5.5Hz,1H),2.68–2.43(m,2H), 2.03–1.93(m,1H)；计算C₁₃H₁₂N₃O₄[M+H]⁺ 274.08的MS(ESI)，实测为274.59。

4-氨基-2-(1-苄基-2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮(D-12)

按照通用方法II，使用2-(1-苄基-2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-硝基异吲哚啉-1,3-二酮(48mg，0.122mmol)，Pd(OAc)₂(2.7mg，0.0122 mmol)，氟化钾(14mg，0.244mmol)和三乙基硅烷(78μL，0.488 mmol，通过快速柱色谱法(0至100％己烷于EtOAc)在硅胶上纯化后，得到标题化合物，为黄色固体(7mg，16％)。计算C₂₀H₁₈N₃O₄ [M+H]⁺ 364.13的MS(ESI)，实测为364.34。

3-(5-氨基-2-甲基-4-氧代喹唑啉-3(4H)-基)哌啶-2,6-二酮(D-17)

按照通用方法II，使用3-(2-甲基-5-硝基-4-氧代喹唑啉-3(4H)- 基)哌啶-2,6-二酮(21mg，0.0664mmol)，Pd(OAc)₂(1.5mg，0.0066 mmol)，氟化钾(7.7mg，0.133mmol)和三乙基硅烷(42μL，0.266 mmol)，通过制备型HPLC纯化，得到标题化合物，为白色固体(7 mg，37％)。计算C₁₄H₁₅N₄O₃[M+H]⁺ 287.11的MS(ESI)，实测为 287.30。

3-(7-氨基-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶-2,6-二酮(D-41)

按照通用方法II，使用3-(7-硝基-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶- 2,6-二酮(11mg，0.038mmol)，Pd(OAc)₂(0.9mg，0.0038mmol)，氟化钾(4.4mg，0.076mmol)和三乙基硅烷(24μL，0.152mmol，通过快速柱色谱法(0至10％MeOH的CH₂Cl₂溶液)在硅胶上纯化后，得到标题化合物，为黄色固体(2mg，21％)。计算C₁₃H₁₄N₃O₃ [M+H]⁺ 260.10的MS(ESI)，实测为260.52。

通用程序III：苯胺的酰化

N-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-5-基)乙酰胺(D-5)

在4mL玻璃小瓶中，将5-氨基-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮(30mg，0.110mmol，1当量)和乙酰氯(26μL，0.220 mmol，2当量)于THF(1.8mL，0.1M)溶液的混合物加热至回流过夜。过滤反应混合物，滤饼用Et₂O洗涤，得到标题化合物，为白色固体(27mg，47％)，无需进一步纯化即可使用。¹H NMR(500MHz, DMSO-d₆)δ11.11(s,1H),10.63(s,1H),8.24(d,J＝1.5Hz,1H), 7.91–7.83(m,2H),5.11(dd,J＝12.8,5.4Hz,1H),2.88(ddd,J＝ 17.0,13.8,5.4Hz,1H),2.63–2.46(m,2H),2.13(s,3H),2.09– 2.00(m,1H)；计算C₁₅H₁₄N₃O₅[M+H]⁺ 316.09的MS(ESI)，实测为316.23。

N-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-氧代异吲哚啉-4-基)乙酰胺(D-3)

按照通用方法III，使用4-氨基-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮(50mg，0.183mmol)和乙酰氯(26μL，0.366mmol)，得到标题化合物，为白色固体(10mg，17％)。¹H NMR(500MHz, DMSO-d₆)δ11.14(s,1H),9.73(s,1H),8.44(d,J＝8.4Hz,1H), 7.83(dd,J＝8.4,7.3Hz,1H),7.62(d,J＝7.2Hz,1H),5.14(dd,J＝ 12.9,5.4Hz,1H),2.90(ddd,J＝17.1,13.9,5.4Hz,1H),2.66–2.45 (m,2H),2.19(s,3H),2.14–2.00(m,1H)；计算C₁₅H₁₄N₃O₅ [M+H]⁺ 316.09的MS(ESI)，实测为316.27。

2-氯-N-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-5-基)乙酰胺 (D-32)

按照通用方法III，使用5-氨基-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮(10mg，0.0366mmol)和氯乙酰氯(6μL，0.0732mmol)，得到标题化合物，为白色固体(7.1mg，55％)。计算C₁₅H₁₃ClN₃O₅ [M+H]⁺ 350.05的MS(ESI)，实测为350.23。

2-氯-N-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚-4-基)乙酰胺(D-34)

按照通用方法III，使用3-(4-氨基-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶- 2,6-二酮(20mg，0.0771mmol)和氯乙酰氯(12μL，0.154mmol)，得到标题化合物，为白色固体(14.9mg，56％)。¹H NMR(500MHz, DMSO-d₆)δ11.02(s,1H),10.20(s,1H),7.81(dd,J＝7.7,1.3Hz, 1H),7.65–7.47(m,2H),5.16(dd,J＝13.3,5.1Hz,1H),4.45–4.34 (m,2H),4.33(s,2H),3.00–2.85(m,1H),2.68–2.56(m,1H),2.41 –2.28(m,1H),2.09–1.97(m,1H)；计算C₁₅H₁₅ClN₃O₄[M+H]⁺ 336.07的MS(ESI)，实测为336.31。

N-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚-4-基)丙烯酰胺(D-35)

按照通用方法III，使用3-(4-氨基-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶- 2,6-二酮(20mg，0.0771mmol)和丙烯酰氯(13μL，0.154mmol)，得到标题化合物，为白色固体(18毫克，76％)。¹H NMR(500MHz, DMSO-d₆)δ15.77(s,1H),14.81(s,1H),12.65(dd,J＝7.4,1.6Hz, 1H),12.37–12.18(m,2H),11.28(dd,J＝17.0,10.2Hz,1H),11.06 (dd,J＝17.0,1.9Hz,1H),10.57(dd,J＝10.2,1.9Hz,1H),9.91(dd, J＝13.3,5.1Hz,1H),9.24–9.05(m,2H),7.67(ddd,J＝17.2,13.7, 5.5Hz,1H),7.36(dt,J＝17.3,3.8Hz,1H),7.20–7.03(m,1H), 6.83–6.72(m,1H)；计算C₁₆H₁₆N₃O₄[M+H]⁺ 314.11的MS(ESI)，实测为314.24。

N-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-5-基)丙烯酰胺(D- 36)

按照通用方法III，使用5-氨基-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮(10mg，0.0366mmol)和丙烯酰氯(6μL，0.0732mmol)，得到标题化合物，为白色固体(8.8mg，73％)。¹H NMR(500MHz, DMSO-d₆)δ11.12(s,1H),10.83(s,1H),8.33(d,J＝1.8Hz,1H),7.99(dd,J＝8.2,1.9Hz,1H),7.90(d,J＝8.2Hz,1H),6.48(dd,J＝ 17.0,10.1Hz,1H),6.36(dd,J＝17.0,1.9Hz,1H),5.88(dd,J＝ 10.0,1.9Hz,1H),5.13(dd,J＝12.8,5.5Hz,1H),2.95–2.84(m, 1H),2.67–2.46(m,2H),2.09–2.01(m,1H)；计算C₁₆H₁₄N₃O₅ [M+H]⁺ 328.09的MS(ESI)，实测为328.23。

N-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚-4-基)乙酰胺(D-37)

按照通用方法III，使用3-(4-氨基-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶- 2,6-二酮(20mg，0.0771mmol)和乙酰氯(11μL，0.154mmol)，得到标题化合物。白色固体(17毫克，71％)。MS(ESI)计算C₁₅H₁₆N₃O₄ [M+H]⁺ 302.11，实测为301.99.

N-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚-4-基)环丙烷甲酰胺(D-38)

按照通用方法III，使用3-(4-氨基-1-氧代异吲哚啉-2-基)哌啶- 2,6-二酮(20mg，0.0771mmol)和环丙烷甲酰氯(11μL，0.154 mmol)，得到标题化合物，为白色固体(19毫克，75％)。¹H NMR (500MHz,DMSO-d₆)δ11.01(s,1H),10.06(s,1H),7.84(dd,J＝ 7.2,1.9Hz,1H),7.66–7.38(m,2H),5.14(dd,J＝13.3,5.1Hz,1H), 4.52–4.30(m,2H),2.92(ddd,J＝17.3,13.6,5.4Hz,1H),2.64– 2.54(m,1H),2.45–2.27(m,1H),2.08–1.95(m,1H),1.93–1.83 (m,1H),0.90–0.75(m,4H)；计算C₁₇H₁₈N₃O₄[M+H]⁺ 328.13的 MS(ESI)，实测为328.00。

通用程序IV：喹唑啉酮缩合

3-(2-甲基-4-氧代喹唑啉-3(4H)-基)哌啶-2,6-二酮(D-9)

在20mL玻璃小瓶中，将邻氨基苯甲酸(100mg，0.729 mmol，1当量)，乙酸(42μL，0.729mmol，1当量)和 P(OPh)₃(479μL，1.82mmol，2.5当量)于吡啶(1.0uL，0.7M)加热至 90℃。4小时后，将反应混合物冷却至室温，加入3-氨基哌啶-2,6- 二酮盐酸盐(144mg，0.875mmol，1.2当量)。将反应混合物再加热至90℃，保持1.5小时，然后在室温搅拌过夜。将反应混合物溶于 EtOAc(15mL)和水(15mL)中。用盐水(2×25mL)洗涤有机层，用 Na₂SO₄干燥并真空浓缩。通过快速柱色谱法(0-5％MeOH的CH₂Cl₂溶液)在硅胶上纯化残余物，得到标题化合物，为白色固体(79mg， 40％)。¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ11.03(s,1H),8.03(dd,J＝7.9,1.5Hz,1H),7.82(ddd,J＝8.5,7.1,1.6Hz,1H),7.62(dd,J＝ 8.3,1.1Hz,1H),7.50(ddd,J＝8.1,7.1,1.1Hz,1H),5.27(dd,J＝ 11.5,5.7Hz,1H),2.92–2.78(m,1H),2.73–2.56(m,5H),2.26–2.06(m,1H)；计算C₁₄H₁₄N₃O₃[M+H]⁺ 272.10的MS(ESI)，实测为272.33。

3-(2-甲基-4-氧代喹唑啉-3(4H)-基)吡咯烷-2,5-二酮(D-11)

按照通用方法IV，使用邻氨基苯甲酸(200mg，1.46mmol)，乙酸(84μL，1.46mmol)，P(OPh)₃(959μL，3.65mmol)和3-氨基吡咯烷-2,5-二酮盐酸盐(263mg，1.75mmol)，通过快速柱色谱法 (CH₂Cl₂：MeOH(15：1))在硅胶上纯化，得到标题化合物，为白色固体(25mg，7％)。计算C₁₃H₁₂N₃O₃[M+H]⁺ 258.09的MS(ESI)，实测为258.22。

3-(5-氟-2-甲基-4-氧代喹唑啉-3(4H)-基)哌啶-2,6-二酮(D-66)

按照通用方法IV，使用6-氟邻氨基苯甲酸(100mg，0.645 mmol)，乙酸(37μL，0.644mmol)，P(OPh)₃(424μL，1.61mmol)和 3-氨基哌啶-2,6-二酮盐酸盐(127mg，0.774mmol)，通过快速柱色谱法(0至10％MeOH于CH₂Cl₂)在硅胶上纯化，得到标题化合物，为白色固体(70mg，38％)。¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ11.03(s, 1H),7.84–7.76(m,1H),7.44(dd,J＝8.2,1.0Hz,1H),7.25(ddd,J ＝11.1,8.2,1.0Hz,1H),5.24(dd,J＝11.3,5.7Hz,1H),2.90–2.75 (m,1H),2.62(s,3H),2.61–2.56(m,2H),2.20–2.12(m,1H)；计算C₁₄H₁₃FN₃O₃[M+H]⁺ 290.09的MS(ESI)，实测为290.27。

3-(2-甲基-5-硝基-4-氧代喹唑啉-3(4H)-基)哌啶-2,6-二酮(D-67)

按照通用方法IV，使用6-硝基邻氨基苯甲酸(100mg，0.549 mmol)，乙酸(31μL，0.549mmol)，P(OPh)₃(361μL，1.37mmol)和 3-氨基哌啶-2,6-二酮盐酸盐(108mg，0.659mmol)，通过快速柱色谱法(0至10％MeOH于CH₂Cl₂)在硅胶上纯化，得到标题化合物，为白色固体(29mg，17％)。计算C₁₄H₁₃N₄O₅[M+H]⁺ 317.09的MS (ESI)，实测为317.58。

通用程序V：酰胺偶联

N-苄基-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-5-甲酰胺(D-15)

在4mL玻璃小瓶中，将2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-5-羧酸(10mg，0.033mmol，1当量)，HATU(13mg， 0.033mmol，1当量)，DIPEA(17μL，0.099mmol，3当量)和苄胺 (4μL，0.036mmol，1.1当量)于DMF(331μL，0.1M)的溶液在室温搅拌过夜。将反应混合物用MeOH稀释至4mL，过滤，然后通过制备型HPLC纯化，得到标题化合物，为白色固体(6mg，46％)。计算C₂₁H₁₈N₃O₅[M+H]⁺ 392.12的MS(ESI)，实测为392.33。

通用程序VI：亲核芳香族取代

4-(苄基氨基)-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮(D-16)

在4mL玻璃小瓶中，将2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-氟异吲哚啉-1,3-二酮(10mg，0.036mmol，1当量)，苄胺(4.4μL，0.040 mmol，1.1当量)和DIPEA(13μL，0.072mmol，2当量)在 NMP(362μL，0.1M)中加热至90℃过夜。将反应混合物冷却至室温并溶于EtOAc(15mL)中。将有机层用NaHCO₃(水性)(15mL)，水 (15mL)和盐水(3×15mL)洗涤，随后经Na₂SO₄干燥并真空浓缩。通过快速柱色谱法(0至100％EtOAc于己烷)在硅胶上纯化残余物，得到标题化合物，为黄色薄膜(5mg，38％)。¹H NMR(500MHz,氯仿 -d)δ8.10(s,1H),7.44(dd,J＝8.5,7.1Hz,1H),7.40–7.25(m,5H), 7.12(d,J＝7.1Hz,1H),6.84(d,J＝8.5Hz,1H),6.71(t,J＝5.9Hz, 1H),4.93(dd,J＝12.3,5.3Hz,1H),4.51(d,J＝5.9Hz,2H),2.93–2.66(m,3H),2.21–2.07(m,1H)；计算C₂₀H₁₈N₃O₄[M+H]⁺ 364.13 的MS(ESI)，实测为364.31。

2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-(异丙基氨基)异吲哚啉-1,3-二酮(D-18)

按照通用方法VI，使用2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-氟异吲哚啉 -1,3-二酮(30mg，0.109mmol)，异丙胺(10μL，0.119mmol)和 DIPEA(21μL，0.119mmol)，通过快速柱色谱法在硅胶上纯化()，得到标题化合物，为黄色薄膜(11mg，32％)(0至100％EtOAc于己烷)。计算C₁₆H₁₈N₃O₄[M+H]⁺ 316.13的MS(ESI)，实测为316.65。

4-(二乙氨基)-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮(D-21)

按照通用方法VI，使用2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-氟异吲哚啉 -1,3-二酮(30mg，0.109mmol)，二乙胺(11μL，0.130mmol)和 DIPEA(32μL)，通过快速柱色谱法(0-100％EtOAc于己烷)在硅胶上纯化，得到标题化合物，为黄色薄膜(28mg，97％)。计算C₁₇H₂₀N₃O₄[M+H]⁺ 330.14的MS(ESI)，实测为330.62。

5-(苄基氨基)-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮(D-25)

按照通用方法VI，使用2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-5-氟异吲哚啉 -1,3-二酮(30mg，0.109mmol)，苄胺(13μL，0.119mmol)和 DIPEA(38μL，0.217mmol)，通过快速柱色谱法(0至100％EtOAc 于己烷)在硅胶上纯化，得到标题化合物，为黄色薄膜(6mg，15％)。计算C₂₀H₁₈N₃O₄[M+H]⁺ 364.13的MS(ESI)，实测为364.34。

2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-5-(异丙基氨基)异吲哚啉-1,3-二酮(D-26)

按照通用方法VI，使用2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-5-氟异二氢吲哚-1,3-二酮(30mg，0.109mmol)，异丙胺(11μL，0.130mmol)和 DIPEA(38μL，0.127mmol)，通过快速柱色谱法(0至100％EtOAc 于己烷)在硅胶上纯化，得到标题化合物，为黄色薄膜(6mg，17％)。¹H NMR(500MHz,氯仿-d)δ8.00(s,1H),7.53(d,J＝8.3Hz,1H), 6.87(d,J＝2.1Hz,1H),6.64(dd,J＝8.3,2.2Hz,1H),4.86(dd,J＝ 12.3,5.4Hz,1H),4.30(d,J＝7.8Hz,1H),2.86–2.58(m,3H),2.12 –2.01(m,1H),1.26–1.15(m,6H)；计算C₁₆H₁₈N₃O₄[M+H]⁺ 316.13的MS(ESI)，实测为316.30。

5-(二乙氨基)-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮(D-27)

按照通用方法VI，使用2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-5-氟异吲哚啉 -1,3-二酮(30mg，0.109mmol)，二乙胺(14μL，0.130mmol)和 DIPEA(38μLμL，0.127mmol)，通过快速柱色谱法(0至100％ EtOAc于己烷)在纯化硅胶上，得到标题化合物，为黄色薄膜(6mg，31％)。¹H NMR(500MHz,氯仿-d)δ8.08(s,1H),7.57(d,J＝8.6 Hz,1H),6.98(d,J＝2.4Hz,1H),6.72(dd,J＝8.7,2.4Hz,1H),4.90 –4.80(m,1H),3.40(q,J＝7.1Hz,4H),2.89–2.61(m,3H),2.11– 2.01(m,1H),1.16(t,J＝7.1Hz,6H)；计算C₁₇H₂₀N₃O₄[M+H]⁺ 330.14的MS(ESI)，实测为330.69。

2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-5-((呋喃-2-基甲基)氨基)异吲哚啉-1,3-二酮 (D-28)

按照通用方法VI，使用2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-5-氟异吲哚啉 -1,3-二酮(50mg，0.181mmol)，糠胺(18μL，0.199mmol)和 DIPEA(63μL，0.362mmol)，通过快速柱色谱法(0至5％MeOH于 CH₂Cl₂)在硅胶上纯化，得到标题化合物，为黄色薄膜(8mg，13％)。计算C₁₈H₁₆N₃O₄[M+H]⁺ 354.11的MS(ESI)，实测为354.25。

(2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-氧代异吲哚啉-4-基)氨基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(D-29)

按照通用方法VI，使用2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-氟异二氢吲哚-1,3-二酮(50mg，0.181mmol)，1-Boc-乙二胺(32mg，0.199 mmol)和DIPEA(63μL，0.362mmol)，通过快速柱色谱法(0至10％ MeOH于CH2Cl₂)在硅胶上纯化后，得到标题化合物，为黄色薄膜(31mg，41％)。¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ8.08(bs,1H),7.50 (dd,J＝8.5,7.1Hz,1H),7.12(d,J＝7.1Hz,1H),6.98(d,J＝8.5 Hz,1H),6.39(t,J＝6.1Hz,1H),4.96–4.87(m,1H),4.83(bs,1H), 3.50–3.41(m,2H),3.41–3.35(m,2H),2.92–2.66(m,3H),2.16– 2.09(m,1H),1.45(s,9H)；计算C₂₀H₂₅N₄O₆[M+H]⁺ 417.18的MS (ESI)，实测为417.58。

(2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-5-基)氨基)乙基) 氨基甲酸叔丁酯(D-30)

按照通用方法VI，使用2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-5-氟异二氢吲哚-1,3-二酮(50mg，0.181mmol)，1-Boc-乙二胺(32mg，0.199 mmol)和DIPEA(63μL，0.362mmol)，通过快速柱色谱法(0至10％ MeOH于CH₂Cl₂)在硅胶上纯化，得到标题化合物，得到标题化合物，为黄色薄膜(22mg，29％)。计算C₂₀H₂₅N₄O₆[M+H]⁺ 417.18的MS (ESI)，实测为417.32。

2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-((呋喃-2-基甲基)氨基)异吲哚啉-1,3-二酮 (D-31)

按照通用方法VI，使用2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-氟异吲哚啉 -1,3-二酮(19.5mg，0.0706mmol)，糠胺(7μL，0.078mmol)和 DIPEA(25μL，0.141mmol)，通过快速柱色谱法(0至2.5％MeOH 于CH₂Cl₂)在硅胶上纯化，得到标题化合物，为黄色薄膜(19mg， 76％)。计算C₁₈H₁₆N₃O₄[M+H]⁺ 354.11的MS(ESI)，实测为 354.27.

3-(5-(苄基氨基)-2-甲基-4-氧代喹唑啉-3(4H)-基)哌啶-2,6-二酮(D-39)

除了将反应混合物加热至170℃而不是90℃之外，按照通用方法VI，使用3-(5-氟-2-甲基-4-氧代喹唑啉-3(4H)-基)哌啶-2,6-二酮 (30mg，0.104mmol)，苄胺(13μL，0.114mmol)和DIPEA(36μL， 0.207mmol)，通过快速柱色谱(0至10％MeOH于CH₂Cl₂)在硅胶上纯化，得到标题化合物，为白色固体(15mg，38％)。¹H NMR(500 MHz,氯仿-d)δ8.73(t,J＝5.7Hz,1H),8.39(s,1H),7.41(t,J＝8.1 Hz,1H),7.39–7.19(m,5H),6.77(d,J＝7.7Hz,1H),6.41(d,J＝ 8.3Hz,1H),4.67(dd,J＝11.5,5.9Hz,1H),4.43(d,J＝5.7Hz,2H), 3.03–2.79(m,2H),2.72–2.61(m,1H),2.60(s,3H),2.15–2.07 (m,1H)；计算C₂₁H₂₁N₄O₃[M+H]⁺377.16的MS(ESI)，实测为 377.02。

3-(5-(异丙基氨基)-2-甲基-4-氧代喹唑啉-3(4H)-基)哌啶-2,6-二酮(D- 40)

除了将反应混合物加热至170℃而不是90℃之外，按照通用方法VI，使用3-(5-氟-2-甲基-4-氧代喹唑啉-3(4H)-基)哌啶-2,6-酮(30 mg，0.104mmol)，异丙胺(10μL，0.114mmol)和DIPEA(36μL， 0.207mmol)，通过快速柱色谱法在硅胶上(0至10％MeOH于CH₂Cl₂)纯化，，得到标题化合物，为白色固体(5mg，15％)。¹H NMR(500MHz,氯仿-d)δ8.31(s,1H),8.21(d,J＝7.2Hz,1H), 7.50–7.37(m,1H),6.70(dd,J＝7.9,0.9Hz,1H),6.47(d,J＝8.4 Hz,1H),4.65(dd,J＝11.4,5.9Hz,1H),3.69–3.56(m,1H),3.03– 2.80(m,3H),2.58(s,3H),2.14–2.03(m,1H),1.27(d,J＝2.7Hz, 3H),1.26(d,J＝2.7Hz,3H)；计算C₁₇H₂₁N₄O₃[M+H]⁺ 329.16的 MS(ESI)，实测为329.97。

2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-((2-羟乙基)氨基)异吲哚啉-1,3-二酮(D- 68)

按照通用方法VI，使用2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-氟异吲哚啉 -1,3-二酮(30mg，0.109mmol)，氨基乙醇(7μL，0.119mmol)和 DIPEA(38μL，0.217mmol)，通过快速柱色谱法(0至5％MeOH于 CH₂Cl₂)在硅胶上纯化，得到标题化合物，为黄色薄膜(6mg，18％)。 ¹HNMR(500MHz,氯仿-d)δ8.26(s,1H),7.50(dd,J＝8.5,7.1Hz, 1H),7.12(d,J＝7.0Hz,1H),6.95(d,J＝8.5Hz,1H),6.50(t,J＝ 5.9Hz,1H),4.97–4.85(m,1H),3.94–3.79(m,2H),3.47(q,J＝5.5Hz,2H),3.03–2.68(m,3H),2.19–2.04(m,1H)；计算 C₁₅H₁₆N₃O₅[M+H]⁺ 318.11的MS(ESI)，实测为318.22。

4-(环丙基氨基)-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮(D47)

按照通用方法VI，使用2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-氟异二氢吲哚-1,3-二酮(20mg，0.0724mmol)，环丙胺(6μL，0.080mmol)和 DIPEA(25μL，0.141mmol)，通过快速柱色谱法(0至5％MeOH于 CH₂Cl₂)在硅胶上纯化，得到标题化合物，为黄色薄膜(16mg，70％)。 ¹HNMR(500MHz,氯仿-d)δ8.05(s,1H),7.53(dd,J＝8.5,7.1Hz, 1H),7.33–7.21(m,1H),7.15(dd,J＝7.1,0.7Hz,1H),6.44(bs, 1H),4.95–4.85(m,1H),2.98–2.66(m,3H),2.62–2.50(m,1H), 2.19–2.06(m,1H),0.92–0.78(m,2H),0.67–0.56(m,2H)；计算 C₁₆H₁₆N₃O₄[M+H]⁺314.11的MS(ESI)，实测为314.54。

4-((2-(1H-吲哚-3-基)乙基)氨基)-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉- 1,3-二酮(D-48)

按照通用方法VI，使用2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-氟异吲哚啉 -1,3-二酮(20mg，0.0724mmol)，色胺(13mg，0.080mmol)和 DIPEA(25μL，0.144mmol)通过硅胶快速柱色谱法(0至10％MeOH 于CH₂Cl₂)纯化，得到标题化合物，为黄色薄膜(10mg，33％)。¹H NMR(500MHz,氯仿-d)δ8.14(s,1H),8.11(s,1H),7.65–7.55(m, 1H),7.45(dd,J＝8.6,7.1Hz,1H),7.37(dt,J＝8.2,0.9Hz,1H), 7.21(ddd,J＝8.2,7.0,1.2Hz,1H),7.16–7.04(m,3H),6.88(d,J＝ 8.5Hz,1H),6.34(t,J＝5.6Hz,1H),4.89(dd,J＝12.4,5.4Hz,1H), 3.59(td,J＝6.8,5.5Hz,2H),3.19–3.03(m,2H),2.93–2.64(m, 3H),2.14–2.04(m,1H)；计算C₂₃H₂₁N₄O₄[M+H]⁺ 417.16的MS (ESI)，实测为417.26。

2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-((4-羟基苯乙基)氨基)异吲哚啉-1,3-二酮 (D-49)

按照通用方法VI，使用2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-氟异吲哚啉 -1,3-二酮(20mg，0.0724mmol)，酪胺(11mg，0.080mmol)和 DIPEA(25μL，0.144mmol)，通过快速柱色谱法(0至5％MeOH于 CH₂Cl₂)在硅胶上纯化，得到标题化合物，为黄色薄膜(15mg，54％)。 ¹HNMR(500MHz,氯仿-d)δ8.20(s,1H),7.51(dd,J＝8.5,7.1Hz, 1H),7.17–7.08(m,2H),6.90(d,J＝8.5Hz,1H),6.85–6.72(m, 2H),4.95–4.90(m,1H),3.52–3.46(m,2H),2.97–2.87(m,2H), 2.86–2.72(m,2H),2.21–2.09(m,1H)；计算C₂₁H₂₀N₃O₅[M+H]⁺ 394.14的MS(ESI)，实测为394.25。

4-((2-(1H-咪唑-2-基)乙基)氨基)-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉- 1,3-二酮(D-50)

按照通用方法VI，使用2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-氟异吲哚啉 -1,3-二酮(20mg，0.0724mmol)，组胺(15mg，0.080mmol)和 DIPEA(25μL，0.144mmol)，通过快速柱色谱法(0至10％MeOH于 CH₂Cl₂)在硅胶上纯化，得到标题化合物，为黄色薄膜(5mg，19％)。 ¹HNMR(500MHz,氯仿-d)δ8.19(s,1H),7.61(d,J＝1.2Hz,1H), 7.47(dd,J＝8.5,7.1Hz,1H),7.07(d,J＝6.9Hz,1H),6.96–6.83 (m,2H),6.39(t,J＝5.7Hz,1H),4.97–4.79(m,1H),3.59(q,J＝ 6.5Hz,2H),2.95(t,J＝6.6Hz,2H),2.92–2.62(m,2H),2.16– 2.04(m,1H)；；计算C₁₈H₁₈N₅O₄[M+H]⁺ 368.14的MS(ESI)，实测为368.47。

通用方法VII：伯胺的酰化

N-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-氧代异吲哚啉-4-基)甲基)环丙烷甲酰胺(D-22)

在4mL玻璃小瓶中，将4-(氨基甲基)-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基) 异吲哚啉-1,3-二酮(25mg，0.087mmol，1当量)和DIPEA(30μL， 0.174mmol，2当量)于MeCN(250μL，0.35M)冷却至0℃。缓慢加入环丙烷甲酰氯环丙烷假酰氯(8.7μL，0.096mmol)，并将反应混合物在室温搅拌过夜。过滤单离产物，得到标题化合物，为白色固体 (4.8mg，15％)，无需进一步纯化即可使用。计算C₁₈H₁₈N₃O₅ [M+H]⁺ 356.12的MS(ESI)，实测为356.32。

N-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)甲基)乙酰胺 (D-23)

按照通用方法VII，使用4-(氨基甲基)-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基) 异吲哚啉-1,3-二酮(25mg，0.087mmol)，DIPEA(30μL，0.174 mmol)和乙酰基氯化物(7μL，0.096mmol)，得到标题化合物，为白色固体(4.5mg，16％)。¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ11.13(s, 1H),8.47(t,J＝6.0Hz,1H),7.88–7.76(m,2H),7.70(dt,J＝7.3, 1.1Hz,1H),5.15(dd,J＝12.7,5.4Hz,1H),4.69(d,J＝6.0Hz,2H), 2.90(ddd,J＝16.8,13.8,5.4Hz,1H),2.64–2.44(m,2H),2.15– 2.01(m,1H),1.92(s,3H)；计算C₁₆H₁₆N₃O₅[M+H]⁺ 330.11的MS (ESI)，实测为330.05。

2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-氧代异吲哚啉-4-基)氨基)乙-1-铵- 2,2,2-三氟乙酸盐(D-33)

在搅拌的(2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-氧代异吲哚啉-4-基) 氨基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(205mg，0.492mmol，1当量)于二氯甲烷(2.25mL)溶液中加入三氟乙酸(0.250mL)。将反应混合物在室温搅拌4小时，然后真空除去挥发物。得到标题化合物，为黄色固体 (226mg，>95％)，其不经进一步纯化即可使用。¹H NMR(500 MHz,MeOD)δ7.64(d,J＝1.4Hz,1H),7.27–7.05(m,2H),5.10 (dd,J＝12.5,5.5Hz,1H),3.70(t,J＝6.0Hz,2H),3.50–3.42(m, 2H),3.22(t,J＝6.0Hz,1H),2.93–2.85(m,1H),2.80–2.69(m, 2H),2.17–2.10(m,1H)；计算C₁₅H₁₇N₄O₄[M+H]⁺ 317.12的MS (ESI)，实测为317.53。

通用方法VIII：苯酚烷基化

2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-((4-(吗啉代甲基)苄基)氧)异吲哚啉-1,3- 二酮(D-45)

在4mL玻璃小瓶中，将2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-羟基异吲哚啉-1,3-二酮(30mg，0.109mmol，1当量)和K₂CO₃(15mg， 0.109mmol，1当量)于DMF(365μL，0.3M)在室温搅拌。加入4- (4-(溴甲基)苄基)吗啉(30mg，0.109mmol，1当量)于DMF(200μL)，将反应混合物在室温搅拌4天。将反应混合物溶于水(15mL)和 EtOAc(15mL)中，用盐水(3×15mL)洗涤有机层，用Na₂SO₄干燥并真空浓缩。通过快速柱色谱法(0至10％MeOH于CH₂Cl₂)在硅胶上纯化残余物，得到标题化合物，为白色固体(20mg，40％)。¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ11.10(s,1H),7.82(dd,J＝8.5,7.2Hz, 1H),7.60(d,J＝8.5Hz,1H),7.50–7.42(m,3H),7.35(d,J＝8.1 Hz,2H),5.35(s,2H),5.09(dd,J＝12.8,5.5Hz,1H),3.64–3.51(m, 4H),3.46(s,2H),2.88(ddd,J＝17.0,14.1,5.4Hz,1H),2.63–2.47 (m,2H),2.38–2.31(m,4H),2.07–1.99(m,1H)；计算C₂₅H₂₆N₃O₆ [M+H]⁺ 464.18的MS(ESI)，实测为464.00。

4-(苄氧基)-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮(D-46)

按照通用方法VIII，使用2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-羟基异吲哚啉-1,3-二酮(30mg，0.109mmol)，K₂CO₃(15mg，0.109mmol)和苄基溴(8μL，0.109mmol)，通过快速柱色谱法(0至10％MeOH于 CH₂Cl₂溶液)在硅胶上纯化后，得到标题化合物，为白色固体(8mg，20％)。¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ11.10(s,1H),7.83(dd,J＝ 8.5,7.3Hz,1H),7.60(d,J＝8.5Hz,1H),7.53–7.50(m,2H),7.47 (d,J＝7.2Hz,1H),7.45–7.39(m,2H),7.38–7.32(m,1H),5.38(s, 2H),5.09(dd,J＝12.8,5.5Hz,1H),2.88(ddd,J＝16.9,13.8,5.5 Hz,1H),2.64–2.46(m,2H),2.07–1.99(m,1H)；计算C₂₀H₁₇N₂O₅ [M+H]⁺ 365.11的MS(ESI)，实测为365.21。

2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-氧代异吲哚啉-4-基)氨基)乙基4-甲基苯磺酸盐(D-44)

在4mL玻璃小瓶中，将2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-((2-羟乙基) 氨基)异吲哚啉-1,3-二酮(7mg，0.0221mmol，1当量)和Et₃N(3μL， 0.033mmol，1.5当量)于CH₂Cl₂(200μL)在室温搅拌。加入甲苯磺酰氯(6mg，0.026mmol，1.2当量)的CH₂Cl₂(100μL)，并将反应混合物在室温搅拌过夜。将反应混合物真空浓缩，并将残余物通过快速柱色谱法(0至10％MeOH于CH₂Cl₂)在硅胶上纯化，得到标题化合物，为白色固体(4mg，40％)。¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ 11.13(s,1H),7.64–7.59(m,2H),7.46(dd,J＝8.6,7.1Hz,1H), 7.33–7.27(m,2H),7.04–6.93(m,2H),6.58(t,J＝6.4Hz,1H), 5.09(dd,J＝12.7,5.4Hz,1H),4.15(t,J＝5.1Hz,2H),3.65–3.52 (m,2H),2.97–2.83(m,1H),2.67–2.46(m,2H),2.27(s,3H),2.12 –2.02(m,1H)；计算C₂₂H₂₂N₃O₇S[M+H]⁺ 472.12的MS(ESI)，实测为472.39。

(R)-4-羟基-2-(3-甲基-2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮(D-52)

将羟基异苯并呋喃-1,3-二酮(147.08mg，0.896mmol，1当量) 加入(R)-3-氨基-3-甲基哌啶-2,6-二酮盐酸(127.32mg，0.896mmol， 1当量)中。然后将吡啶(3.584mL，0.25M)加入混合物中，并将其在 110℃搅拌17小时。将混合物用甲醇稀释，并在减压下浓缩。通过柱色谱(ISCO，24g二氧化硅柱，0至10％MeOH/DCM，25分钟梯度)纯化粗物质，得到白色油状物(110.9mg，42.63％收率)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.95(s,1H),7.61(dd,J＝8.4,7.2Hz, 1H),7.27–7.14(m,2H),2.73–2.63(m,1H),2.57–2.51(m,1H), 2.04–1.97(m,1H),1.86(s,3H)。

LCMS 289(M+H)。

(S)-4-羟基-2-(3-甲基-2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮(D-53)

将4-羟基异苯并呋喃-1,3-二酮(148.99mg，0.907mmol，1当量)加入(S)-3-氨基-3-甲基哌啶-2,6-二酮盐酸(128.97mg，0.907 mmol，1当量)。然后将吡啶(3.628mL，0.25M)加入混合物中，并将其在110℃搅拌17小时。将混合物用甲醇稀释，并在减压下浓缩。通过柱色谱(ISCO，24g二氧化硅柱，0至10％MeOH/DCM，25分钟梯度)纯化粗物质，得到白色油状物(150mg，57.4％收率)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ10.95(s,1H),7.62(dd,J＝8.4,7.2Hz,1H),7.27–7.16(m,2H),2.75–2.62(m,1H),2.55(dd,J＝14.0,4.3 Hz,1H),2.05–1.96(m,1H),1.86(s,3H).LCMS 289(M+H)。

(S)-2-((2-(3-甲基-2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酸(D-55)

向TFA(0.63mL，0.1M)加入(S)-2-((2-(3-甲基-2,6-二氧代哌啶- 3-基)-1,3-氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酸叔丁酯(25.4mg，0.063 mmol，1当量)，并将混合物在50℃搅拌1小时。然后将混合物用甲醇稀释并在减压下浓缩，得到白色粉末(20.5mg，93.9％收率)，其不经进一步纯化而继续使用。¹H NMR(500MHz,甲醇-d₄)δ7.81 –7.75(m,1H),7.50(d,J＝7.3Hz,1H),7.45(d,J＝8.6Hz,2H), 7.43–7.37(m,3H),5.09(dd,J＝12.8,5.5Hz,1H),4.76(s,2H), 4.63(dd,J＝9.1,5.2Hz,1H),3.66–3.55(m,30H),3.51–3.41(m, 5H),2.90–2.83(m,1H),2.79–2.71(m,2H),2.69(s,3H),2.43(s, 3H),2.14(ddt,J＝10.5,5.5,3.2Hz,1H),1.69(s,3H).LCMS 347 (M+H)。

(R)-2-((2-(3-甲基-2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基) 氧基)乙酸(D-54)

向TFA(1.78mL，0.1M)加入(R)-2-((2-(3-甲基-2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酸叔丁基酯(71.3mg，0.178 mmol，1当量)，并将混合物在50℃搅拌1小时。然后将混合物用甲醇稀释并在减压下浓缩，得到白色粉末(47.2mg，76.63％收率)，其不经进一步纯化而继续使用。¹H NMR(400MHz,甲醇-d₄)δ7.72 (ddd,J＝8.5,7.3,5.0Hz,1H),7.46–7.42(m,1H),7.30(dd,J＝8.6, 4.5Hz,1H),4.94(d,J＝5.3Hz,2H),2.81–2.56(m,2H),2.24– 2.07(m,1H),2.00(s,2H),0.90(t,J＝6.5Hz,2H).LCMS 347 (M+H)。

4,7-二氯-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮(D-51)

将4,7-二氯异苯并呋喃-1,3-二酮(434.6mg，2.002mmol，1当量)加入3-氨基哌啶-2,6-二酮盐酸(362.6mg，2.203mmol，1.1当量)。然后将乙酸钾(609.07mg，6.206mmol，3.1当量)和乙酸(6.67mL， 0.3M)加入混合物中，并将其在90℃搅拌18小时。将混合物冷却至室温，用去离子水稀释并离心5分钟。将沉淀物用甲醇稀释，并在减压下浓缩。通过柱色谱(ISCO，12g二氧化硅柱，0至10％MeOH/DCM，25分钟梯度)纯化粗物质，得到白色粉末(160.4mg， 24.5％收率)。¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ11.15(s,1H),7.91 (s,2H),5.17(dd,J＝12.9,5.4Hz,1H),2.88(ddd,J＝17.2,13.9,5.4 Hz,1H),2.68–2.54(m,1H),2.05(ddd,J＝10.5,5.4,2.7Hz,1H). LCMS 328(M+H)。

合成例1：dBET1的合成

(1)JQ-酸的合成

在室温，将JQ1(1.0g，2.19mmol，1当量)溶解在甲酸(11mL， 0.2M)中并搅拌75小时。减压下浓缩混合物，得到黄色固体(0.99g，定量收率)，其不经纯化而使用。¹H NMR(400MHz,甲醇-d₄)δ7.50 –7.36(m,4H),4.59(t,J＝7.1Hz,1H),3.51(d,J＝7.1Hz,2H),2.70(s,3H),2.45(s,3H),1.71(s,3H).LCMS 401.33(M+H)。

根据先前公布的方法合成N-(4-氨基丁基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸酯(Fischer et al.,Nature 512(2014):49)。

(2)dBET1的合成

在室温，将JQ-酸(11.3mg，0.0281mmol，1当量)和N-(4-氨基丁基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-氧代异吲哚啉-4-基)氧基) 乙酰胺三氟乙酸酯(14.5mg，0.0281mmol，1当量)溶解在 DMF(0.28mL，0.1M)中。然后加入DIPEA(14.7微升，0.0843mmol，3当量)和HATU(10.7mg，0.0281mmol，1当量)，将混合物搅拌19小时。然后将混合物通过制备型HPLC纯化，得到 dBET1，为黄色固体(15.90mg，0.0202mmol，72％)。¹H NMR(400MHz,甲醇-d₄)δ7.77(dd,J＝8.3,7.5Hz,1H),7.49(d,J＝7.3 Hz,1H),7.47–7.37(m,5H),5.07(dd,J＝12.5,5.4Hz,1H),4.74(s, 2H),4.69(dd,J＝8.7,5.5Hz,1H),3.43–3.32(m,3H),3.29–3.25 (m,2H),2.87–2.62(m,7H),2.43(s,3H),2.13–2.04(m,1H),1.72 –1.58(m,7H)。¹³C NMR(100MHz,cd₃od)δ174.41,172.33, 171.27,171.25,169.87,168.22,167.76,166.73,166.70,156.26, 138.40,138.23,137.44,134.83,133.92,133.40,132.30,132.28, 131.97,131.50,129.87,121.85,119.31,118.00,69.53,54.90,50.54,40.09,39.83,38.40,32.12,27.74,27.65,23.61,14.42,12.97,11.57. LCMS 785.44(M+H)。

合成例2：dBET4的合成

在室温，将0.1M N-(4-氨基丁基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3- 基)-1,3-氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸酯于DMF(0.438 mL)的溶液加入(R)-JQ-酸(以与JQ-酸类似的方法从(R)-JQ1制备)(14.63mg，0.0365mmol，1当量)0.0438mmol 1.2当量)。加入DIPEA(19.1微升，0.1095mmol，3当量)和HATU(15.3mg， 0.0402mmol，1.1当量)，将混合物搅拌24小时，然后用MeOH稀释，并减压下浓缩。通过制备型HPLC纯化粗物质，得到黄色固体(20.64mg，0.0263mmol，72％)。¹H NMR(400MHz,甲醇-d₄)δ 7.79(dd,J＝8.4,7.4Hz,1H),7.51(d,J＝7.3Hz,1H),7.47–7.39 (m,5H),5.11–5.06(m,1H),4.75(s,2H),4.68(dd,J＝8.8,5.5Hz, 1H),3.47–3.31(m,5H),2.83–2.65(m,7H),2.44(s,3H),2.13– 2.06(m,1H),1.68(s,3H),1.67–1.60(m,4H).¹³C NMR(100MHz, cd₃od)δ174.43,172.40,171.29,169.92,168.24,167.82,166.71, 156.31,153.14,138.38,138.24,137.54,134.88,133.86,133.44, 132.29,132.00,131.49,129.88,122.46,121.90,119.38,118.02, 69.59,54.96,50.55,40.09,39.84,38.45,32.14,27.75,27.65,23.62, 14.41,12.96,11.56.MS 785.48(M+H)。

合成例3：dBET3的合成

在室温，将0.1M N-(2-氨基乙基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3- 基)-1,3-氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸酯于DMF(0.475 mL，0.0475mmol，1.2当量)的溶液加入Q-酸(15.86mg，0.0396 mmol，1当量)。然后加入DIPEA(20.7微升，0.1188mmol，3当量) 和HATU(16.5mg，0.0435mmol，1.1当量)，将混合物搅拌24小时，然后通过制备型HPLC纯化，得到黄色固体(22.14mg，0.0292 mmol，74％)。¹H NMR(400MHz,甲醇-d₄)δ7.82–7.75(m,1H),7.52–7.32(m,6H),5.04(dd,J＝11.6,5.5Hz,1H),4.76(d,J＝3.2 Hz,2H),4.66(d,J＝6.6Hz,1H),3.58–3.35(m,6H),2.78–2.58 (m,6H),2.48–2.41(m,3H),2.11–2.02(m,1H),1.70(d,J＝11.8 Hz,3H)。¹³C NMR(100MHz,cd₃od)δ174.38,171.26,171.19, 170.26,168.86,168.21,167.76,166.72,156.27,153.14,138.44, 138.36,138.19,134.87,133.71,132.31,131.57,131.51,129.90, 129.86,121.81,119.36,117.95,69.48,54.83,50.52,40.09,39.76, 38.30,32.09,23.63,14.40,11.61.LCMS 757.41(M+H)。

合成例4：dBET5的合成

在室温，将0.1M N-(6-氨基己基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3- 基)-1,3-氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸酯在DMF中的溶液(0.247mL，0.0247mmol，1当量)加入JQ-酸(9.9mg，0.0247 mmol，1当量)中。然后加入DIPEA(12.9微升，0.0741mmol，3当量)和HATU(9.4mg，0.0247mmol，1当量)。将混合物搅拌21小时，然后用MeOH稀释并减压下浓缩。通过制备型HPLC纯化粗物质，得到黄色固体(13.56mg，0.0167mmol，67％)。¹H NMR(400MHz,甲醇-d₄)δ7.82–7.78(m,1H),7.53(dd,J＝7.3,2.0Hz,1H), 7.49–7.37(m,5H),5.10(dt,J＝12.4,5.3Hz,1H),4.76(s,2H), 4.70(dd,J＝8.7,5.5Hz,1H),3.42–3.33(m,2H),3.25(dt,J＝12.3, 6.0Hz,3H),2.87–2.67(m,7H),2.48–2.42(m,3H),2.14–2.09(m, 1H),1.69(d,J＝4.8Hz,3H),1.58(s,4H),1.42(d,J＝5.2Hz,4H)。 ¹³C NMR(100MHz,cd₃od)δ174.51,171.31,171.26,169.82,168.27, 168.26,167.75,156.26,150.46,138.20,134.92,133.92,133.47, 132.34,132.01,131.52,129.88,121.69,119.34,117.95,111.42, 69.39,54.97,50.56,40.39,40.00,38.40,32.15,30.46,30.16,27.58, 27.48,23.64,14.41,12.96,11.55.LCMS 813.38。

合成例5：dBET6的合成

在室温，将0.1M N-(8-氨基辛基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3- 基)-1,3-氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸酯于DMF(0.191 mL，0.0191mmol，1当量)的溶液下，将)加入JQ-酸(7.66mg， 0.0191mmol，1当量)中。加入DIPEA(10微升，0.0574mmol，3当量)和HATU(7.3mg，0.0191mmol，1当量)，将混合物搅拌22小时，用MeOH稀释，并减压下浓缩。通过制备型HPLC纯化粗物质，得到奶油色固体。(8.53mg，0.0101mmol，53％)。¹H NMR(400 MHz,甲醇-d₄)δ7.80(dd,J＝8.4,7.4Hz,1H),7.53(d,J＝7.4Hz, 1H),7.49–7.36(m,5H),5.10(dt,J＝12.3,5.3Hz,1H),4.75(s,2H), 4.69(dd,J＝8.8,5.3Hz,1H),3.42(dd,J＝15.0,8.9Hz,1H),3.30– 3.18(m,4H),2.90–2.64(m,7H),2.45(s,3H),2.13(dtt,J＝10.8, 5.2,2.6Hz,1H),1.71(d,J＝4.4Hz,3H),1.56(d,J＝6.2Hz,4H), 1.33(d,J＝17.1Hz,8H)。¹³CNMR(100MHz,cd₃od)δ174.50, 172.38,171.30,169.81,168.28,167.74,166.64,156.25,138.38, 138.20,137.55,134.92,133.88,133.42,132.27,132.02,131.50, 129.85,121.66,119.30,117.95,69.37,55.01,50.58,40.51,40.12, 38.44,32.18,30.46,30.33,30.27,30.21,27.91,27.81,23.63,14.42, 12.96,11.55.LCMS 841.64(M+H)。

合成例6：dBET9的合成

在室温，将0.1M N-(3-(2-(2-(3-氨基丙氧基)乙氧基)乙氧基)丙基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸酯于DMF(0.321mL，0.0321mmol，1当量)的溶液，加入JQ-酸(12.87mg，0.0321mmol，1当量)。加入DIPEA(16.8微升， 0.0963mmol，3当量)和HATU(12.2mg，0.0321mmol，1当量)，将混合物搅拌24小时，用MeOH稀释，并减压下浓缩。通过制备型HPLC纯化粗物质，得到黄色油状物。(16.11mg，0.0176mmol， 55％)。

¹H NMR(400MHz,甲醇-d₄)δ7.79(dd,J＝8.4,7.4Hz,1H),7.52(d, J＝7.2Hz,1H),7.49–7.36(m,5H),5.10(dd,J＝12.5,5.5Hz,1H), 4.78–4.67(m,3H),3.64–3.52(m,11H),3.48–3.32(m,6H),2.94 –2.64(m,7H),2.52–2.43(m,3H),2.18–2.08(m,1H),1.81(p,J＝6.3Hz,4H),1.73–1.67(m,3H).LCMS 918.45(M+H)。

合成例7：dBET17的合成

在室温，将0.1M N-(4-氨基丁基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3- 基)-1,3-氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸酯于DMF的溶液 (0.281mL，0.0281mmol，1当量)加入(S)-2-(4-(4-氰基苯基)-2,3,9- 三甲基-6H-噻吩并[3,2-f][1,2,4]***并[4,3-a][1,4]二氮杂环庚三烯- 6-基)乙酸(11mg，0.0281mmol，1当量)。加入DIPEA(14.7微升，0.0843mmol，3当量)和HATU(10.7mg，0.0281mmol，1当量)，将混合物搅拌24小时，用EtOAc稀释，用饱和碳酸氢钠，水和盐水洗涤。将有机层用硫酸钠干燥，过滤并浓缩。通过柱色谱(ISCO， 4g硅胶柱0至10％MeOH/DCM)纯化，得到白色固体(14.12mg， 0.0182mmol，65％)。

¹H NMR(400MHz,甲醇-d₄)δ7.82–7.72(m,3H),7.61(dd,J＝8.5, 2.0Hz,2H),7.51(d,J＝7.9Hz,1H),7.44–7.40(m,1H),5.11– 5.05(m,1H),4.76(s,2H),4.66(dd,J＝9.0,5.1Hz,1H),3.48–3.32 (m,4H),3.30–3.23(m,1H),2.87–2.61(m,7H),2.43(s,3H),2.10(dt,J＝10.7,5.2Hz,1H),1.70–1.59(m,7H).¹³C NMR(100MHz, cd₃od)δ174.42,172.65,171.27,169.92,168.25,167.80,165.88, 156.31,143.55,138.24,134.88,133.92,133.50,133.39,131.72, 131.46,130.55,121.93,119.39,119.21,118.02,115.17,69.59,55.50, 50.55,40.10,39.83,38.86,32.11,27.78,27.67,23.62,14.41,12.91,11.64.LCMS 776.39(M+H)。

合成例8：dBET15的合成

将N-(6-氨基己基)-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-5-甲酰胺三氟乙酸盐(13.29mg，0.258mmol，1当量)和JQ-酸 (10.3mg，0.0258mmol，1当量)溶于DMF(0.26mL)中。加入 DIPEA(13.5微升，0.0775mmol，3当量)，然后加入HATU(9.8mg，0.0258mmol，1当量)，并将混合物在室温搅拌。24小时后，将该物质用DCM稀释，并通过柱色谱(ISCO，0至15％MeOH/DCM)纯化，然后通过制备型HPLC纯化，得到浅黄色固体(11.44mg，0.0146 mmol，57％)。

¹H NMR(400MHz,甲醇-d₄)δ8.29–8.23(m,2H),7.93(dd,J＝8.1, 4.2Hz,1H),7.50–7.34(m,4H),5.17–5.11(m,1H),4.75–4.69(m, 1H),3.53–3.32(m,6H),3.25(dd,J＝13.8,6.7Hz,1H),2.90–2.67 (m,6H),2.49–2.38(m,3H),2.18–2.10(m,1H),1.64(d,J＝22.4 Hz,6H),1.47(s,4H).¹³C NMR(100MHz,cd₃od)δ174.48,171.17, 168.05,168.03,167.99,167.70,166.63,141.81,138.40,137.47, 135.09,134.77,134.74,133.96,133.94,133.38,132.24,132.05, 131.44,129.85,124.57,123.12,123.09,54.98,50.78,40.88,40.08, 38.37,32.13,30.40,30.23,27.34,27.26,23.58,14.40,12.96,11.54. LCMS783.43(M+H).

合成例9：dBET2的合成

(1)(R)-4-((8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5,6,7,8-四氢蝶啶-2-基)氨基)-3-甲氧基苯甲酸乙酯的合成

将(R)-2-氯-8-环戊基-7-乙基-5-甲基-7,8-二氢蝶啶-6(5H)-酮 (44.2mg，0.15mmol，1当量)，4-氨基-3-甲氧基苯甲酸乙酯(35.1 mg，0.18mmol，1.2当量)，Pd₂dba₃(6.9mg，0.0075mmol， 5mol％)，XPhos(10.7mg，0.0225mmol，15mol％)和碳酸钾(82.9 mg，0.60mmol，4当量)溶于tBuOH(1.5mL，0.1M)中，并加热至 100℃。21小时后，将混合物冷却至室温，通过硅藻土过滤，用 DCM洗涤并减压下浓缩。通过柱色谱(ISCO，4g硅胶柱，0至100％EtOAc/己烷，经18分钟梯度)纯化，得到黄色油状物(52.3mg， 0.115mmol，77％)。¹H NMR(400MHz,氯仿-d)δ8.57(d,J＝8.5 Hz,1H),7.69(td,J＝6.2,2.9Hz,2H),7.54(d,J＝1.8Hz,1H),4.52 (t,J＝7.9Hz,1H),4.37(q,J＝7.1Hz,2H),4.23(dd,J＝7.9,3.7Hz, 1H),3.97(s,3H),3.33(s,3H),2.20–2.12(m,1H),2.03–1.97(m, 1H),1.86(ddd,J＝13.9,7.6,3.6Hz,4H),1.78–1.65(m,4H),1.40 (t,J＝7.1Hz,3H),0.88(t,J＝7.5Hz,3H).LCMS454.32(M+H)。

(2)(R)-4-((8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5,6,7,8-四氢蝶啶-2-基)氨基)-3-甲氧基苯甲酸的合成

将(R)-4-((8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5,6,7,8-四氢蝶啶-2- 基)氨基)-3-甲氧基苯甲酸乙酯(73.8mg，0.163mmol，1当量)和 LiOH(11.7mg，0.489mmol，3当量)溶于MeOH(0.82mL)、 THF(1.63mL)和水(0.82mL)中。20小时后，再加入0.82mL水，将混合物再搅拌24小时，然后通过制备型HPLC纯化，得到奶油色固体(53mg，0.125mmol，76％)。¹H NMR(400MHz,甲醇-d₄)δ 7.97(d,J＝8.4Hz,1H),7.67(dd,J＝8.3,1.6Hz,1H),7.64–7.59 (m,2H),4.38(dd,J＝7.0,3.2Hz,1H),4.36–4.29(m,1H),3.94(s, 3H),3.30(s,3H),2.13–1.98(m,2H),1.95–1.87(m,2H),1.87– 1.76(m,2H),1.73–1.57(m,4H),0.86(t,J＝7.5Hz,3H).¹³C NMR (100MHz,cd₃od)δ168.67,163.72,153.59,150.74,150.60,130.95, 127.88,125.97,123.14,121.68,116.75,112.35,61.76,61.66,56.31, 29.40,29.00,28.68,28.21,23.57,23.41,8.69.LCMS 426.45(M+H)。

(3)dBET2的合成

在室温，将0.1M N-(4-氨基丁基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3- 基)-1,3-氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸酯于DMF(0.183 mL，0.0183mmol，1.2当量)的溶液加入(R)-4-((8-环戊基-7-乙基-5- 甲基-6-氧代-5,6,7,8-四氢蝶啶-2-基)氨基)3-甲氧基苯甲酸(6.48mg， 0.0152mmol，1当量)。加入DIPEA(7.9微升，0.0456mmol，3当量)和HATU(6.4mg，0.0168mmol，1.1当量)，将混合物搅拌23小时，然后通过制备型HPLC纯化，得到黄色固体(9.44mg，0.0102 mmol，67％)。¹H NMR(400MHz,甲醇-d₄)δ7.84–7.77(m,2H), 7.58(d,J＝1.8Hz,2H),7.53–7.46(m,2H),7.42(d,J＝8.4Hz, 1H),5.11–5.05(m,1H),4.76(s,2H),4.48(dd,J＝6.5,3.1Hz,1H), 4.33–4.24(m,1H),3.95(s,3H),3.49–3.35(m,4H),2.97(d,J＝ 10.5Hz,3H),2.89–2.65(m,5H),2.17–1.99(m,4H),1.89(dd,J＝ 14.5,7.3Hz,2H),1.69–1.54(m,6H),1.36(dt,J＝7.6,3.9Hz,1H), 0.85(t,J＝7.5Hz,3H)。¹³C NMR(100MHz,cd₃od)δ176.52, 174.48,173.05,171.34,169.99,168.91,168.25,167.80,164.58,156.34,154.48,153.10,150.63,138.22,134.89,133.96,129.53, 123.93,121.87,120.78,119.36,117.99,111.54,69.55,63.29,63.10, 56.68,50.55,40.71,39.86,32.15,29.43,29.26,28.73,28.63,27.81, 27.77,24.25,23.63,8.47.LCMS 810.58(M+H)。

合成例10：dBET7的合成

在室温，将0.1M N-(6-氨基己基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3- 基)-1,3-氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸酯于DMF(0.186 mL，将0.0186mmol 1当量)的溶液加入(R)-4-((8-环戊基-7-乙基-5- 甲基-6-氧代-5,6,7,8-四氢蝶啶-2-基)氨基)-3-甲氧基苯甲酸(7.9mg， 0.0186mmol，1当量)。加入DIPEA(9.7微升，0.0557mmol，3当量)和HATU(7.1mg，0.0186mmol，1当量)，将混合物搅拌19小时，然后通过制备型HPLC纯化，得到所需的三氟乙酸盐，为黄色固体 (13.62mg，0.0143mmol，77％)。

¹H NMR(400MHz,甲醇-d₄)δ7.80(t,J＝8.3Hz,2H),7.61–7.57 (m,2H),7.55–7.49(m,2H),7.42(d,J＝8.4Hz,1H),5.13(dd,J＝ 12.6,5.5Hz,1H),4.75(s,2H),4.48(dd,J＝6.5,3.2Hz,1H),4.33–4.24(m,1H),3.97(s,3H),3.40(t,J＝7.1Hz,2H),3.34(d,J＝6.7Hz,2H),3.30(s,3H),2.98(d,J＝8.5Hz,1H),2.89–2.82(m,1H), 2.79–2.63(m,3H),2.17–2.00(m,4H),1.91(dt,J＝14.4,7.1Hz, 3H),1.61(dt,J＝13.4,6.6Hz,7H),1.47–1.41(m,3H),0.86(t,J＝ 7.5Hz,3H).¹³C NMR(100MHz,cd₃od)δ174.54,171.37,169.84, 168.84,168.27,167.74,164.59,156.26,154.47,153.18,150.69, 138.19,134.91,134.05,129.47,124.78,124.01,121.65,120.77, 119.29,117.92,117.86,111.55,69.34,63.31,63.13,56.67,50.53, 40.97,39.96,32.16,30.42,30.19,29.42,29.26,28.72,28.62,27.65, 27.46,24.26,23.65,8.47.LCMS 838.60(M+H).

合成例11：dBET8的合成

在室温，将0.1M N-(8-氨基辛基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3- 基)-1,3-氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸酯于DMF(0.186 mL，0.0186mmo，1当量)的溶液加入(R)-4-((8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5,6,7,8-四氢蝶啶-2-基)氨基)-3-甲氧基苯甲酸(7.9mg， 0.0186mmol，1当量)。加入DIPEA(9.7微升，0.0557mmol，3当量)和HATU(7.1mg，0.0186mmol，1当量)，将混合物搅拌16小时，然后通过制备型HPLC纯化，得到所需的三氟乙酸酯，作为米白色固体(7.15mg，0.007296mmol，39％)。

¹H NMR(400MHz,甲醇-d₄)δ7.83–7.77(m,2H),7.61–7.56(m, 2H),7.55–7.50(m,2H),7.42(d,J＝8.5Hz,1H),5.13(dd,J＝12.6, 5.5Hz,1H),4.75(s,2H),4.49(dd,J＝6.6,3.3Hz,1H),4.33–4.24 (m,1H),3.97(s,3H),3.39(t,J＝7.1Hz,2H),3.34–3.32(m,2H),3.30(s,3H),3.01–2.83(m,2H),2.82–2.65(m,3H),2.17–2.01 (m,4H),1.91(dt,J＝14.2,7.4Hz,1H),1.68–1.54(m,7H),1.37(s, 7H),0.86(t,J＝7.5Hz,3H)。¹³C NMR(100MHz,cd₃od)δ174.52, 171.35,169.81,168.85,168.28,167.74,164.58,156.27,154.47,153.89,150.64,138.19,134.93,134.18,129.52,129.41,124.91, 123.83,121.67,120.76,119.31,117.95,117.89,111.57,69.37,63.37, 63.17,56.67,50.58,41.12,40.12,32.19,30.43,30.28,30.22,30.19, 29.40,29.25,28.71,28.62,27.94,27.75,24.29,23.65,8.46.LCMS 866.56(M+H)。

合成例12：dBET10的合成

在室温，将0.1M N-(3-(2-(2-(3-氨基丙氧基)乙氧基)乙氧基)丙基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-甲基-1-氧基) 乙酰胺三氟乙酸酯于DMF(0.172mL，0.0172mmol，1当量)的溶液加入(R)-4-((8-环戊基-7-乙基-5-甲基-6-氧代-5,6,7,8-四氢蝶啶-2-基) 氨基)-3-甲氧基苯甲酸(7.3mg，0.0172mmol，1当量)。加入 DIPEA(9.0微升，0.0515mmol，3当量)和HATU(6.5mg，0.0172 mmol，1当量)，将混合物搅拌23小时，然后通过制备型HPLC纯化，得到所需的三氟乙酸盐，作为关闭白油(10.7mg，0.0101mmol，59％)。

¹H NMR(400MHz,甲醇-d₄)δ7.78(d,J＝8.3Hz,1H),7.75(dd,J＝ 8.4,7.4Hz,1H),7.56–7.51(m,2H),7.49–7.44(m,2H),7.36(d,J ＝8.4Hz,1H),5.08(dd,J＝12.4,5.4Hz,1H),4.69(s,2H),4.44(dd, J＝6.7,3.2Hz,1H),4.30–4.21(m,1H),3.92(s,3H),3.59–3.42(m,12H),3.35(t,J＝6.7Hz,2H),3.25(s,3H),2.95–2.64(m,5H), 2.13–1.95(m,4H),1.91–1.71(m,7H),1.65–1.48(m,4H),0.81(t, J＝7.5Hz,3H)。¹³C NMR(100MHz,cd₃od)δ174.50,171.35, 169.83,168.77,168.25,167.68,164.57,156.26,154.47,153.05, 150.59,138.19,134.92,133.89,129.53,124.57,123.98,121.72, 120.75,119.26,117.95,117.86,111.54,71.51,71.46,71.28,71.20, 70.18,69.65,69.41,63.27,63.07,56.71,50.57,38.84,37.59,32.17, 30.41,30.32,29.46,29.26,28.73,28.64,24.27,23.65,8.49.LCMS 942.62(M+H)。

合成例13：dBET16的合成

在室温，将0.1M N-(4-氨基丁基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)- 1,3-氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸酯于DMF(0.402mL， 0.0402mmol，1当量)的溶液加入(R)-4-((4-环戊基-1,3-二甲基-2-氧代-1,2,3,4-四氢吡啶并[2,3-b]吡嗪-6-基)氨基)-3-甲氧基苯甲酸(16.55 mg，0.0402mmol，1当量)。加入DIPEA(21微升，0.1206mmol， 3当量)和HATU(15.3mg，0.0402mmol，1当量)，将混合物搅拌 21小时，然后通过制备型HPLC纯化，然后进行柱色谱(ISCO，12g) NH₂-硅胶柱，0至15％MeOH/DCM，20分钟梯度)，得到HPLC，以得到棕色固体(10.63mg，0.0134mmol，33％)。

¹H NMR(400MHz,甲醇-d₄)δ8.22(d,J＝8.4Hz,1H),7.78(dd,J＝ 8.4,7.4Hz,1H),7.73–7.68(m,1H),7.49(d,J＝7.4Hz,2H),7.46 –7.39(m,2H),6.98(d,J＝8.8Hz,1H),5.97–5.87(m,1H),5.06 (dd,J＝12.6,5.4Hz,1H),4.76(s,2H),3.98(s,3H),3.61(s,2H),3.44–3.36(m,4H),2.92(s,1H),2.78(dd,J＝14.3,5.2Hz,1H), 2.68(ddd,J＝17.7,8.2,4.5Hz,2H),2.36–2.26(m,2H),2.10– 1.90(m,5H),1.76–1.62(m,6H),1.31(d,J＝16.0Hz,4H).LCMS 795.38(M+H)。

合成例14：dBET11的合成

(1)4-((5,11-二甲基-6-氧代-6,11-二氢-5H-苯并[e]嘧啶并[5,4- b][1,4]二氮杂环庚三烯-2-基)氨基)-3-甲氧基苯甲酸乙酯的合成

将2-氯-5,11-二甲基-5H-苯并[e]嘧啶并[5,4-b][1,4]二氮杂环庚三烯-6(11H)-酮(82.4mg，0.30mmol，1当量)，4-氨基-3-甲氧基苯甲酸乙酯(70.3mg，0.36mmol，1.2当量)Pd₂dba₃(13.7mg，0.015 mmol，5mol％)，XPhos(21.5mg，0.045mmol，15mol％)和碳酸钾 (166mg，1.2mmol，4当量)溶于tBuOH(3.0mL)中并加热至100℃。 17小时后，将混合物冷却至室温并通过硅藻土过滤。通过柱色谱(ISCO，12g硅胶柱，0至100％EtOAc/己烷，19分钟梯度)纯化混合物，得到灰白色固体(64.3mg，0.148mmol，49％)。

¹H NMR(400MHz,50％cd₃od/cdcl₃)δ8.51(d,J＝8.5Hz,1H), 8.17(s,1H),7.73(ddd,J＝18.7,8.1,1.7Hz,2H),7.52(d,J＝1.8 Hz,1H),7.46–7.41(m,1H),7.15–7.10(m,2H),4.34(q,J＝7.1 Hz,4H),3.95(s,3H),3.47(s,3H),3.43(s,3H),1.38(t,J＝7.1Hz,3H).¹³C NMR(100MHz,50％cd₃od/cdcl₃)δ169.28,167.39,164.29, 155.64,151.75,149.73,147.45,146.22,133.88,133.18,132.37, 126.44,124.29,123.70,123.36,122.26,120.58,118.05,116.83, 110.82,61.34,56.20,38.62,36.25,14.51.LCMS 434.33(M+H).

(2)4-((5,11-二甲基-6-氧代-6,11-二氢-5H-苯并[e]嘧啶并[5,4- b][1,4]二氮杂环庚三烯-2-基)氨基)-3-甲氧基苯甲酸的合成

将4-((5,11-二甲基-6-氧代-6,11-二氢-5H-苯并[e]嘧啶并[5,4- b][1,4]二氮杂环庚三烯-2-基)氨基)-3-甲氧基苯甲酸乙酯(108.9mg， 0.251mmol，1当量)和LiOH(18mg)溶解在THF(2.5mL)和水(1.25 mL)中。24小时后，加入MeOH(0.63mL)以改善溶解度)并再搅拌 24小时，然后用MeOH稀释，并通过制备型HPLC纯化，得到浅黄色固体(41.31mg)。

¹H NMR(400MHz,甲醇-d₄)δ8.51(d,J＝8.5Hz,1H),8.22(s,1H), 7.73(ddd,J＝11.8,8.1,1.7Hz,2H),7.57(d,J＝1.8Hz,1H),7.49– 7.44(m,1H),7.19–7.11(m,2H),3.97(s,3H),3.48(s,3H),3.45(s, 3H)。LCMS 406.32(M+H)。

(3)dBET11的合成

在室温，将0.1M N-(4-氨基丁基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)- 1,3-氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸酯于DMF(0.190mL， 0.0190mmol，1当量)的溶液加入4-((5,11-二甲基-6-氧代-6,11-二氢-5H-苯并[e]嘧啶并[5,4-b][1,4]二氮杂环庚三烯-2-基)氨基)-3-甲氧基苯甲酸(7.71mg，0.0190mmol，1当量)。加入DIPEA(9.9微升，0.0571mmol，3当量)和HATU(7.2mg，0.0190mmol，1当量)，将混合物搅拌22小时，然后通过制备型HPLC纯化，得到HPLC，得到所需的三氟乙酸盐，为奶油色固体(6.72mg，0.00744mmol， 39％)。

¹H NMR(400MHz,甲醇-d₄)δ8.46(d,J＝8.3Hz,1H),8.21(s,1H), 7.79–7.73(m,2H),7.52(d,J＝7.1Hz,1H),7.50–7.43(m,3H), 7.33(d,J＝8.2Hz,1H),7.15(dd,J＝7.7,5.9Hz,2H),4.98(dd,J＝ 12.0,5.5Hz,1H),4.69(s,2H),3.97(s,3H),3.49(s,3H),3.46–3.34 (m,7H),2.81–2.67(m,3H),2.13–2.08(m,1H),1.69(dt,J＝6.6, 3.5Hz,4H).¹³C NMR(100MHz,cd₃od)δ173.40,170.10,169.68, 169.00,168.85,167.60,167.15,164.77,156.01,155.42,151.83, 150.03,148.21,137.82,134.12,133.48,132.58,132.52,128.11, 126.72,124.54,122.33,121.06,120.63,118.77,118.38,117.94, 117.62,109.67,68.90,56.33,49.96,40.16,39.48,38.72,36.34, 31.82,27.24,23.16.LCMS790.48(M+H)。

合成例15：dBET12的合成

在室温，将0.1M N-(3-(2-(2-(3-氨基丙氧基)乙氧基)乙氧基)丙基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉)4-甲基-1-氧基) 乙酰胺三氟乙酸酯于DMF(0.186mL，0.0186mmol，1当量)的溶液加入4-((5,11-二甲基-6-氧代-6,11-二氢-5H-苯并[e]嘧啶并[5,4- b][1,4]二氮杂环庚三烯-2-基)氨基)-3-甲氧基苯甲酸(7.53mg，0.0186mmol，1当量)。加入DIPEA(9.7微升，0.0557mmol，3当量)和 HATU(7.1mg，0.0186mmol，1当量)，将混合物搅拌22小时，然后通过制备型HPLC纯化，得到HPLC，得到所需的三氟乙酸盐，为奶油色固体(7.50mg，0.00724mmol，39％)。

¹H NMR(400MHz,甲醇-d₄)δ8.46(d,J＝8.9Hz,1H),8.21(s,1H), 7.73(dd,J＝15.2,7.8Hz,2H),7.50–7.42(m,3H),7.28(d,J＝8.5 Hz,1H),7.15(t,J＝7.7Hz,2H),5.01(dd,J＝11.8,5.8Hz,1H), 4.68(s,2H),3.97(s,3H),3.67–3.58(m,7H),3.58–3.43(m,10H), 3.39(t,J＝6.8Hz,2H),3.35(s,2H),2.97(s,1H),2.84–2.70(m, 3H),2.16–2.07(m,1H),1.93–1.76(m,4H).LCMS 922.57(M+H).

合成例16：dBET13的合成

将0.1M N-(4-氨基丁基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸酯于DMF(0.501mL，0.0501 mmol 1当量)的溶液加入2-((2-(4-(3,5-二甲基异恶唑-4-基)苯基)咪唑并[1,2-a]吡嗪-3-基)氨基)乙酸(如在McKeown etal.,J.Med.Chem, 2014,57,9019中所合成的)(18.22mg，0.0501mmol，1当量)在室温合成。加入DIPEA(26.3微升，0.150mmol，3当量)和 HATU(19.0mg，0.0501mmol，1当量)，将混合物搅拌21小时，然后通过制备型HPLC纯化，得到HPLC，得到所需的三氟乙酸盐，为深黄色油状物(29.66mg，0.0344mmol，69％)。¹H NMR(400MHz, 甲醇-d₄)δ9.09(s,1H),8.65(d,J＝5.2Hz,1H),8.14–8.06(m,2H), 7.94–7.88(m,1H),7.80–7.74(m,1H),7.59–7.47(m,3H),7.40 (dd,J＝8.4,4.7Hz,1H),5.11–5.06(m,1H),4.72(d,J＝9.8Hz, 2H),3.90(s,2H),3.25–3.22(m,1H),3.12(t,J＝6.4Hz,1H),2.96 (s,2H),2.89–2.79(m,1H),2.76–2.62(m,2H),2.48–2.42(m, 3H),2.29(s,3H),2.10(ddq,J＝10.2,5.3,2.7Hz,1H),1.49–1.45 (m,2H),1.37(dd,J＝6.7,3.6Hz,2H).¹³C NMR(100MHz,cd₃od) δ174.45,171.98,171.35,169.88,168.17,167.85,167.40,159.88, 156.28,141.82,138.26,135.85,134.82,133.09,132.06,130.75, 129.67,122.07,121.94,119.30,118.98,118.06,117.24,69.56,50.56, 40.05,39.73,32.13,27.53,23.62,18.71,17.28,11.64,10.85.LCMS 748.49(M+H)。

合成例17：dBET14的合成

在室温，将0.1M N-(3-(2-(2-(3-氨基丙氧基)乙氧基)乙氧基)丙基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸盐于DMF(0.510mL，0.0510mmol，1当量)溶液加入2 -((2-(4-(3,5-二甲基异恶唑-4-基)苯基)咪唑并[1,2-α]吡嗪-3-基)氨基) 乙酸(如McKeown et al.,J.Med.Chem,2014,57,9019中合成)(18.52mg，0.0510mmol，1当量)。加入DIPEA(26.6微升， 0.153mmol，3当量)和HATU(19.4mg，0.0510mmol，1当量)，将混合物搅拌22小时，然后通过制备型HPLC纯化，得到HPLC，得到所需的三氟乙酸盐，为深黄色油状物(32.63mg，0.0328mmol， 64％)。

¹H NMR(400MHz,甲醇-d₄)δ9.09(s,1H),8.66(d,J＝5.4Hz,1H), 8.17–8.08(m,2H),7.92(d,J＝5.6Hz,1H),7.77(dd,J＝8.4,7.4 Hz,1H),7.60–7.47(m,3H),7.39(d,J＝8.4Hz,1H),5.09(dd,J＝ 12.4,5.5Hz,1H),4.71(s,2H),3.91(s,2H),3.62–3.46(m,10H),3.38(dt,J＝16.0,6.4Hz,3H),3.18(t,J＝6.8Hz,2H),2.97(s,1H), 2.89–2.81(m,1H),2.78–2.66(m,2H),2.47(s,3H),2.31(s,3H), 2.16–2.08(m,1H),1.79(dt,J＝12.8,6.5Hz,2H),1.64(t,J＝6.3 Hz,2H).¹³C NMR(100MHz,cd₃od)δ174.48,171.88,171.34, 169.80,168.22,167.69,167.42,159.87,156.24,141.87,138.21, 135.89,134.88,133.13,132.04,130.76,129.67,122.08,121.69, 119.20,117.94,117.23,71.44,71.22,71.10,69.92,69.62,69.38, 50.57,49.64,38.11,37.55,32.16,30.30,30.20,23.63,11.67,10.88. LCMS 880.46(M+H)。

合成例18：dBET18的合成

(1)(S)-4-(3-(2-(4-(4-氯苯基)-2,3,9-三甲基-6H-噻吩并[3,2-f][1,2,4]***并[4,3-α][1,4]二氮杂环庚三烯-6-基)乙酰氨基)丙基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯的合成

在室温，将JQ-酸(176.6mg，0.441mmol，1当量)溶于 DMF(4.4mL)。加入HATU(176mg，0.463mmol，1.05当量)，然后加入DIPEA(0.23mL)，1.32mmol，3当量)。10分钟后，加入4- (3-氨基丙基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(118mg，0.485mmol，1.1当量)的 DMF(0.44mL)溶液。24小时后，将混合物用半饱和碳酸氢钠稀释，用DCM萃取两次，用EtOAc萃取一次。将合并的有机层用硫酸钠干燥，过滤并浓缩。通过柱色谱法纯化(ISCO，24g硅胶柱，0-15％MeOH/DCM，23分钟梯度)，得到黄色油状物(325.5mg，定量收率)。 ¹H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.67(t,J＝5.3Hz,1H),7.41–7.28 (m,4H),4.58(dd,J＝7.5,5.9Hz,1H),3.52–3.23(m,8H),2.63(s, 9H),2.37(s,3H),1.80–1.69(m,2H),1.64(s,3H),1.42(s,9H).¹³C NMR(100MHz,cdcl₃)δ171.41,164.35,155.62,154.45,150.20, 136.92,136.64,132.19,131.14,130.98,130.42,129.98,128.80, 80.24,56.11,54.32,52.70,38.96,37.85,28.42,25.17,14.43,13.16, 11.82.LCMS 626.36(M+H)。

(2)(S)-2-(4-(4-氯苯基)-2,3,9-三甲基-6H-噻吩并[3,2-f][1,2,4]***并 [4,3-a][1,4]二氮杂环庚三烯-6-基)-N-(3-(哌嗪-1-基)丙基)乙酰胺的合成

将(S)-4-(3-(2-(4-(4-氯苯基)-2,3,9-三甲基-6H-噻吩并[3,2-f] [1,2,4]***并[4,3-a][1,4]二氮杂环庚三烯-6-基)乙酰氨基)丙基)哌嗪- 1-羧酸叔丁酯(325.5mg)溶于DCM(5mL)和MeOH(0.5mL)。加入 4M HCl的二恶烷溶液(1mL)，将混合物搅拌16小时，然后在氮气流下浓缩，得到黄色固体(231.8mg)，其无需进一步纯化即可使用。

¹H NMR(400MHz,甲醇-d₄)δ7.64–7.53(m,4H),5.05(t,J＝7.1 Hz,1H),3.81–3.66(m,6H),3.62–3.33(m,9H),3.30(p,J＝1.6 Hz,1H),2.94(s,3H),2.51(s,3H),2.09(dq,J＝11.8,6.1Hz,2H), 1.72(s,3H).¹³C NMR(100MHz,cd₃od)δ171.78,169.38,155.83, 154.03,152.14,140.55,136.33,134.58,134.53,133.33,132.73, 130.89,130.38,56.07,53.54,41.96,37.22,36.23,25.11,14.48, 13.14,11.68.LCMS 526.29(M+H)。

(3)(S)-(6-(4-(3-(2-(4-(4-氯苯基)-2,3,9-三甲基-6H-噻吩并[3,2-f] [1,2,4]***并[4,3-α][1,4]二氮杂环庚三烯-6-基)乙酰氨基)丙基)哌嗪- 1-基)-6-氧代己基)氨基甲酸叔丁酯的合成

将(S)-2-(4-(4-氯苯基)-2,3,9-三甲基-6H-噻吩并[3,2-f]的[1,2,4] ***并[4,3-a][1,4]二氮杂环庚三烯-6-基)-N-(3-(哌嗪-1-基)丙基)乙酰胺(62.1mg)和6-((叔丁氧基羰基)氨基)己酸(24.0mg，0.1037mmol， 1当量)溶解于DMF(1mL)。加入DIPEA(72.2微升，0.4147mmol， 4当量)，然后加入HATU(39.4mg，0.1037mmol，1当量)，将混合物搅拌25小时。将混合物用半饱和碳酸氢钠稀释，并用DCM萃取三次。将合并的有机层用硫酸钠干燥，过滤并浓缩。通过柱色谱 (ISCO，4g硅胶柱，0至15％MeOH/DCM，15分钟梯度)纯化，得到黄色油状物(71.75mg，0.0970mmol，94％)。

¹H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.61(s,1H),7.43–7.28(m,4H),4.63 (s,1H),4.61–4.56(m,1H),3.82–3.21(m,10H),3.11–3.01(m, 2H),2.61(d,J＝24.3Hz,9H),2.38(s,3H),2.28(t,J＝7.4Hz,2H), 1.73(dq,J＝13.8,7.4Hz,2H),1.63–1.55(m,2H),1.53–1.24(m,14H).¹³C NMR(100MHz,cdcl₃)δ171.63,171.11,164.34,156.17, 155.66,150.21,136.96,136.72,132.25,131.14,131.01,130.47, 130.00,128.85,79.11,56.42,54.46,53.06,52.82,45.04,41.02, 40.47,39.29,38.33,33.00,29.90,28.54,26.60,25.29,24.86,14.47, 13.20,11.86.LCMS 739.37(M+H)。

(4)(S)-N-(3-(4-(6-氨基己酰基)哌嗪-1-基)丙基)-2-(4-(4-氯苯基)- 2,3,9-三甲基-6H-噻吩并[3,2-f][1,2,4]***并[4,3-α][1,4]二氮杂环庚三烯-6-基)乙酰胺的合成

将(S)-(6-(4-(3-(2-(4-(4-氯苯基)-2,3,9-三甲基-6H-噻吩并[3,2- f][1,2,4]***并[4,3-a][1,4]二氮杂环庚三烯-6-基)乙酰氨基)丙基)哌嗪 -1-基)-6-氧代己基)氨基甲酸叔丁酯(71.75mg，0.0970mmol，1当量) 溶于DCM(2mL)和MeOH(0.2mL)中。加入4M HCl于二恶烷(0.49 mL)的溶液，将混合物搅拌2小时，然后在氮气流下浓缩，然后真空，得到黄色泡沫(59.8mg，0.0840mmol，87％)。

¹H NMR(400MHz,甲醇-d₄)δ7.68–7.53(m,4H),5.04(d,J＝6.6 Hz,1H),4.66(d,J＝13.6Hz,1H),4.23(d,J＝13.6Hz,1H),3.63– 3.34(m,7H),3.29–3.00(m,5H),2.95(d,J＝6.0Hz,5H),2.51(d, J＝9.2Hz,5H),2.08(s,2H),1.77–1.62(m,7H),1.45(dt,J＝15.3,8.6Hz,2H).¹³C NMR(100MHz,cd₃od)δ173.77,171.84,169.35, 155.85,153.99,140.56,136.40,134.58,133.35,132.70,130.39, 55.83,53.57,52.92,52.70,43.57,40.55,39.67,37.33,36.25,33.17, 28.26,26.94,25.33,25.26,14.49,13.15,11.65.LCMS639.35(M+H)。

(5)dBET18的合成

将(S)-N-(3-(4-(6-氨基己酰基)哌嗪-1-基)丙基)-2-(4-(4-氯苯基)- 2,3,9-三甲基-6H-噻吩并[3,2-f][1,2,4]***并[4,3-a][1,4]二氮杂环庚三烯-6-基)乙酰胺二盐酸盐(20.0mg，0.0281mmol，1当量)和2-((2- (2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酸(9.32mg， 0.0281mmol，1当量)溶于DMF(0.281mL)。加入DIPEA(19.6微升，0.1124mmol，4当量)，然后加入HATU(10.7mg，0.0281 mmol，1当量)。24小时后，将混合物用MeOH稀释，并通过制备型HPLC纯化，得到所需的三氟乙酸盐。

¹H NMR(400MHz,甲醇-d₄)δ7.83–7.79(m,1H),7.54(d,J＝7.1 Hz,1H),7.45(q,J＝8.8Hz,5H),5.12(dd,J＝12.5,5.4Hz,1H), 4.76(s,2H),4.68(t,J＝7.3Hz,1H),3.59–3.32(m,8H),3.28– 3.18(m,4H),2.87(ddd,J＝19.0,14.7,5.3Hz,2H),2.80–2.65(m, 6H),2.44(d,J＝6.8Hz,5H),2.33–2.25(m,1H),2.14(dd,J＝9.8, 4.9Hz,1H),2.06–1.89(m,3H),1.70(s,3H),1.61(dq,J＝14.4,7.3, 6.9Hz,4H),1.45–1.37(m,2H).¹³C NMR(100MHz,cd₃od)δ 174.52,173.97,173.69,171.44,169.88,168.26,167.83,166.72, 156.36,138.28,137.84,134.89,133.52,132.12,131.83,131.38, 129.89,121.87,119.32,118.01,69.52,55.64,55.03,52.79,50.58, 43.69,39.77,38.57,36.89,33.47,32.16,29.93,27.34,25.76,25.45, 23.63,14.39,12.94,11.66.LCMS 953.43(M+H)。

合成例19：dBET19的合成

在室温，将0.1M N-(4-氨基丁基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)- 1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸酯于DMF(235微升， 0.0235mmol，1当量)的溶液加入(S)-2-(4-(4-氯苯基)-2-(氰基甲基)- 3,9-二甲基-6H-噻吩并[3,2-f][1,2,4]***并[4,3-a][1,4]二氮杂环庚三烯-6-基)乙酸(10mg，0.0235mmol，1当量)。加入DIPEA(12.3微升，0.0704mmol，3当量)和HATU(8.9mg，0.0235mmol，1当量)，将混合物搅拌18.5小时。然后将混合物用EtOAc稀释并用饱和碳酸氢钠、水和盐水洗涤。将有机层用硫酸钠干燥，过滤并减压下浓缩。通过柱色谱(ISCO，4g硅胶柱，0至10％MeOH/DCM，25分钟梯度) 纯化，得到所需产物，为白色固体(12.96mg，0.0160mmol，68％)。 ¹H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.80(dd,J＝8.4,7.4Hz,1H),7.55– 7.37(m,6H),5.14–5.06(m,1H),4.77(d,J＝1.5Hz,2H),4.64(dd, J＝8.0,5.6Hz,1H),3.45–3.32(m,5H),3.29–3.21(m,2H),2.83– 2.66(m,6H),2.58(s,3H),2.14–2.06(m,1H),1.71–1.57(m,4H). LCMS 810.30,M+H)。

合成例20：dBET20的合成

在室温，将3-((2-((4-(4-(4-氨基丁酰基)哌嗪-1-基)苯基)氨基)- 5-甲基嘧啶-4-基)氨基)-N-(叔丁基)苯磺酰胺三氟乙酸酯(7.41mg， 0.0107mmol，1当量)和2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酸(3.6mg，0.0107mmol，1当量)溶于DMF(214 微升，0.05M)。加入DIPEA(5.6微升，0.0321mmol，3当量)和 HATU(4.1mg，0.0107mmol，1当量)。22.5小时后，将混合物用 MeOH稀释，并通过制备型HPLC纯化，得到所需产物，为棕色残余物(6.27mg，0.00701mmol，65％)。¹H NMR(500MHz,甲醇-d₄) δ8.06(s,1H),7.84–7.75(m,3H),7.65(s,1H),7.55(t,J＝7.8Hz, 2H),7.45(d,J＝8.4Hz,1H),7.25–7.20(m,2H),6.99(d,J＝8.8 Hz,2H),5.11(dd,J＝12.5,5.4Hz,1H),4.78(s,2H),3.79–3.66(m, 4H),3.40(t,J＝6.6Hz,2H),3.24–3.13(m,4H),2.82–2.68(m, 3H),2.52(t,J＝7.4Hz,2H),2.24–2.19(m,3H),2.12(dd,J＝10.2, 5.1Hz,1H),1.92(dd,J＝13.4,6.4Hz,2H),1.18(s,9H).LCMS 895.63(M+H)。

合成例21：dBET21的合成

在室温，将0.1M 4-((10-氨基癸基)氧基)-2-(2,6-二氧代哌啶-3- 基)异吲哚啉-1,3-二酮三氟乙酸盐于DMF(232微升，0.0232mmol， 1当量)的溶液加入JQ-酸(9.3mg，0.0232mmol，1当量)。加入 DIPEA(12.1微升，0.0696mmol，3当量)和HATU(8.8mg，0.0232mmol，1当量)，并将混合物搅拌18小时。然后将混合物用EtOAc 稀释，并用饱和碳酸氢钠、水和盐水洗涤。将有机层用硫酸钠干燥，过滤并减压下浓缩。通过制备型HPLC纯化，然后通过柱色谱 (ISCO，4g硅胶柱，0至10％MeOH/DCM，25分钟梯度)纯化，得到所需产物，为灰白色残余物(1.84mg，0.00235mmol，10％)。¹H NMR(500MHz,甲醇-d₄)δ7.77–7.73(m,1H),7.50–7.33(m,6H), 5.09(dd,J＝12.5,5.5Hz,1H),4.62(s,1H),4.21(t,J＝6.4Hz,2H), 3.36(s,2H),2.87–2.67(m,6H),2.44(s,3H),1.88–1.82(m,2H), 1.70(s,3H),1.58(s,4H),1.29(s,8H).LCMS 784.51(M+H)。

合成例22：dBET22的合成

在室温，将0.1M N-(4-氨基丁基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)- 1,3-氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸酯于DMF(247微升， 0.0247mmol，1当量)的溶液加入(S)-4-(4-氯苯基)-6-(2-甲氧基-2-氧代乙基)-3,9-二甲基-6H-噻吩并[3,2-f][1,2,4]***并[4,3-a][1,4]二氮杂环庚三烯-2-羧酸(10.98mg，0.0247mmol，1当量)。加入 DIPEA(12.9微升，0.0740mmol，3当量)和HATU(9.4mg，0.0247 mmol，1当量)。然后将混合物搅拌21小时，然后用EtOAc稀释并用饱和碳酸氢钠、水和盐水洗涤。将有机层用硫酸钠干燥，过滤并减压下浓缩。通过柱色谱法纯化(ISCO，4g硅胶柱，0至10％ MeOH/DCM，25分钟梯度)，得到所需产物，为白色固体(9.79mg， 0.0118mmol，48％)。¹H NMR(400MHz,甲醇-d₄)δ7.80(dd,J＝ 8.4,7.4Hz,1H),7.51(dd,J＝7.1,1.5Hz,1H),7.48–7.34(m,5H), 5.11(ddd,J＝12.4,5.4,3.5Hz,1H),4.76(s,2H),4.69(td,J＝7.2, 1.4Hz,1H),3.76(s,3H),3.55(d,J＝7.2Hz,2H),3.48–3.33(m, 4H),2.93–2.82(m,1H),2.78–2.64(m,5H),2.14–2.07(m,1H),1.96(d,J＝0.9Hz,3H),1.66(s,4H).LCMS 829.39(M+H)。

合成例23：dBET23的合成

在室温，将0.1M N-(8-氨基辛基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)- 1,3-氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸酯于DMF(220微升， 0.0220mmol，1当量)的溶液加入(S)-4-(4-氯苯基)-6-(2-甲氧基-2-氧代乙基)-3,9-二甲基-6H-噻吩并[3,2-f])[1,2,4]***并[4,3-a][1,4]二氮杂环庚三烯-2-羧酸(9.87mg，0.0220mmol，1当量)。加入 DIPEA(11.5微升，0.0660mmol，3当量)和HATU(8.4mg，0.0220 mmol，1当量)。然后将混合物搅拌21小时，然后用EtOAc稀释，并用饱和碳酸氢钠、水和盐水洗涤。将有机层用硫酸钠干燥，过滤并减压下浓缩。通过柱色谱(ISCO，4g硅胶柱，0至10％MeOH/DCM， 25分钟梯度)纯化，得到所需产物，为白色固体(8.84mg，0.00998 mmol，45％)。¹H NMR(400MHz,甲醇-d₄)δ7.81(dd,J＝8.4,7.4 Hz,1H),7.53(d,J＝7.3Hz,1H),7.50–7.39(m,5H),5.12(dd,J＝ 12.6,5.4Hz,1H),4.75(s,2H),4.68(t,J＝7.2Hz,1H),3.76(s,3H), 3.54(d,J＝7.2Hz,2H),3.39–3.32(m,3H),3.29(s,1H),2.90– 2.83(m,1H),2.79–2.68(m,5H),2.14(dd,J＝8.9,3.7Hz,1H),1.99(s,3H),1.65–1.53(m,4H),1.36(d,J＝6.5Hz,8H).LCMS 885.47(M+H)。

合成例24：dBET24的合成

步骤1：(2-(2-(2-(2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉- 4-基)氧基)乙酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯的合成

将2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酸(200mg，0.602mmol，1当量)溶于DMF(6.0mL，0.1M)。依次加入HATU(228.9mg，0.602mmol，1当量)，DIPEA(0.315mL， 1.81mmol，3当量)和N-Boc-2,2'-(亚乙二氧基)二乙胺(0.143mL，0.602mmol，1当量)。6小时后，加入另外的HATU(114mg，0.30 mmol，0.5当量)以确保反应完全。再过24小时后，将混合物用 EtOAc稀释，并用饱和碳酸氢钠、水和盐水洗涤两次。将合并的有机层用硫酸钠干燥，过滤并减压下浓缩。通过柱色谱(ISCO，12g硅胶柱，0至15％MeOH/DCM，15分钟梯度)纯化，得到所需产物，为黄色油状物(0.25g，0.44mmol，74％)。¹HNMR(400MHz,甲醇 -d₄)δ7.82–7.75(m,1H),7.51(d,J＝7.4Hz,1H),7.41(d,J＝8.5 Hz,1H),5.13(dd,J＝12.4,5.5Hz,1H),4.76(s,2H),3.66–3.58(m, 6H),3.53–3.45(m,4H),3.19(t,J＝5.6Hz,2H),2.95–2.83(m, 1H),2.80–2.67(m,2H),2.19–2.12(m,1H),1.41(s,9H).LCMS 563.34(M+H)。

步骤2：N-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶 -3-基)-1,3-氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸酯的合成

将(2-(2-(2-(2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-氧代异吲哚啉-4- 基)氧基)乙酰氨基)乙氧基)乙氧基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(0.25g，0.44 mmol，1当量)溶于TFA(4.5mL)，并加热至50℃。3小时后，将混合物冷却至室温，用MeOH稀释，并减压下浓缩。通过制备型 HPLC纯化，得到所需产物，为褐色固体(0.197g，0.342mmol， 77％)。¹H NMR(400MHz,甲醇-d₄)δ7.81(ddd,J＝8.4,7.4,1.1 Hz,1H),7.55–7.50(m,1H),7.43(d,J＝8.5Hz,1H),5.13(dd,J＝ 12.7,5.5Hz,1H),4.78(s,2H),3.74–3.66(m,6H),3.64(t,J＝5.4Hz,2H),3.52(t,J＝5.3Hz,2H),3.14–3.08(m,2H),2.89(ddd,J＝ 17.5,13.9,5.2Hz,1H),2.80–2.66(m,2H),2.16(dtd,J＝13.0,5.7, 2.7Hz,1H).LCMS 463.36(M+H)。

步骤2:dBET24的合成

将0.1M N-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-氧代异吲哚啉-4-基)乙酰胺三氟乙酸酯于DMF(0.324mL，0.0324mmol，1当量)的溶液加入JQ-酸(13.0mg， 0.324mmol，1当量)。然后加入DIPEA(16.9微升，0.0972mmol， 3当量)和HATU(12.3mg，0.0324mmol，1当量)，并将混合物在室温搅拌18小时。然后将混合物用EtOAc稀释，并用饱和碳酸氢钠、水和盐水洗涤。然后将有机层用硫酸钠干燥，过滤并减压下浓缩。通过柱色谱法(ISCO，4g硅胶柱，0至10％MeOH/DCM，25分钟梯度)纯化，得到所需产物，为灰白色固体(20.0mg，0.0236mmol， 73％)。¹H NMR(400MHz,甲醇-d₄)δ7.77–7.72(m,1H),7.49(d, J＝7.4Hz,1H),7.45–7.35(m,5H),5.09(ddd,J＝12.3,5.4,3.7Hz, 1H),4.76(s,2H),4.60(dd,J＝8.9,5.3Hz,1H),3.68–3.62(m,6H), 3.59(t,J＝5.6Hz,2H),3.54–3.48(m,2H),3.47–3.35(m,4H), 2.84(ddd,J＝19.4,9.9,4.6Hz,1H),2.77–2.69(m,2H),2.68(d,J ＝1.8Hz,3H),2.43(s,3H),2.12(dt,J＝9.8,5.3Hz,1H),1.68(s, 3H).LCMS845.39(M+H)。

合成例25：dBET25的合成

在室温，将0.1M N-(4-氨基丁基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)- 1,3-氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸酯于DMF(183微升， 0.0183mmol，1当量)的溶液加入(S)-4-(4-氯苯基)-6-(2-甲氧基-2-氧代乙基)-2,9-二甲基-6H-噻吩并[3,2-f])[1,2,4]***并[4,3-a][1,4]二氮杂环庚三烯-3-羧酸(8.16mg，0.0183mmol，1当量)。加入DIPEA(9.6微升，0.0550mmol，3当量)和HATU(7.0mg，0.0183mmol，1当量)。然后将混合物搅拌23小时，然后用EtOAc稀释，并用饱和碳酸氢钠、水和盐水洗涤。将有机层用硫酸钠干燥，过滤并减压下浓缩。通过柱色谱(ISCO，4g硅胶柱，0至10％MeOH/DCM，25分钟梯度)纯化，得到所需产物，为黄色固体(4.39mg，0.00529mmol， 29％)。¹H NMR(400MHz,甲醇-d₄)δ7.82(dd,J＝8.4,7.4Hz,1H), 7.55(d,J＝7.3Hz,1H),7.45(d,J＝8.2Hz,1H),7.43–7.31(m, 4H),5.16–5.10(m,1H),4.77(d,J＝1.5Hz,2H),4.56(s,1H),3.74 (d,J＝1.8Hz,3H),3.66–3.60(m,1H),3.50(dd,J＝16.5,7.3Hz, 1H),3.37–3.32(m,1H),3.28(s,3H),2.85(t,J＝7.2Hz,2H),2.75 (d,J＝7.8Hz,1H),2.71(d,J＝0.9Hz,3H),2.59(d,J＝1.0Hz,3H), 2.18–2.10(m,1H),1.36–1.24(m,4H).LCMS 829.38(M+H)。

合成例26：dBET26的合成

在室温，将0.1M N-(8-氨基辛基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)- 1,3-氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸酯于DMF(186微升， 0.0186mmol，1当量)的溶液加入(S)-4-(4-氯苯基)-6-(2-甲氧基-2-氧代乙基)-2,9-二甲基-6H-噻吩并[3,2-f])[1,2,4]***并[4,3-a][1,4]二氮杂环庚三烯-3-羧酸(8.26mg，0.0186mmol，1当量)。加入 DIPEA(9.7微升，0.0557mmol，3当量)和HATU(7.1mg，0.0186 mmol，1当量)。然后将混合物搅拌23小时，然后用EtOAc稀释，并用饱和碳酸氢钠、水和盐水洗涤。将有机层用硫酸钠干燥，过滤并减压下浓缩。通过柱色谱法(ISCO，4g硅胶柱，0至10％MeOH/DCM，25分钟梯度)纯化，得到所需产物，为奶油色固体 (6.34mg，0.00716mmol，38％)。¹H NMR(400MHz,甲醇-d₄)δ 7.83–7.78(m,1H),7.53(dd,J＝7.3,2.2Hz,1H),7.45–7.38(m, 3H),7.32(dd,J＝8.5,1.3Hz,2H),5.16–5.08(m,1H),4.76(s,2H), 4.56(s,1H),3.75(s,3H),3.66(dd,J＝15.9,8.7Hz,1H),3.50(dd,J ＝16.9,6.9Hz,1H),3.32(d,J＝2.8Hz,4H),2.84–2.74(m,3H), 2.70(d,J＝1.1Hz,3H),2.66–2.54(m,3H),2.14(d,J＝5.3Hz, 1H),1.62–1.22(m,12H).LCMS 885.48(M+H)。

合成例27：dBET27的合成

将0.1M 4-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基) 异吲哚啉-1,3-二酮三氟乙酸酯于DMF(257微升，0.0257mmol，1 当量)的溶液加入JQ-酸(10.3mg，0.0257mmol，1当量)。然后加入 DIPEA(13.4微升，0.0771mmol，3当量)和HATU(9.8mg，0.0257 mmol，1当量)，并将混合物在室温搅拌18小时。然后将混合物用 EtOAc稀释，并用饱和碳酸氢钠、水和盐水洗涤。然后将有机层用硫酸钠干燥，过滤并减压下浓缩。通过柱色谱法(ISCO，4g硅胶柱， 0至10％MeOH/DCM，25分钟梯度)纯化，得到所需产物，为白色固体(14.53mg，0.0195mmol，76％)。¹H NMR(400MHz,甲醇-d₄) δ7.75(ddd,J＝8.5,7.3,1.3Hz,1H),7.47–7.30(m,6H),5.00(ddd, J＝25.4,12.2,5.2Hz,1H),4.61(td,J＝9.4,5.0Hz,1H),4.36(q,J ＝4.8Hz,2H),3.96–3.89(m,2H),3.74(q,J＝5.6Hz,2H),3.53–3.41(m,3H),3.30–3.24(m,1H),2.78–2.53(m,6H),2.41(d,J＝ 3.9Hz,3H),2.09–1.98(m,1H),1.67(d,J＝5.0Hz,3H)。

合成例28：dBET28的合成

将0.1M 4-(4-氨基丁氧基)-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉- 1,3-二酮三氟乙酸酯于DMF(202微升，0.0202mmol，1当量)的溶液加入JQ中-酸(8.1mg，0.0202mmol，1当量)。然后加入 DIPEA(10.6微升，0.0606mmol，3当量)和HATU(7.7mg，0.0202 mmol，1当量)，并将混合物在室温搅拌18.5小时。然后将混合物用EtOAc稀释，并用饱和碳酸氢钠、水和盐水洗涤。然后将有机层用硫酸钠干燥，过滤并减压下浓缩。通过柱色谱法(ISCO，4g硅胶柱，0至10％MeOH/DCM，25分钟梯度)纯化，得到所需产物，为奶油色固体(10.46mg，0.0144mmol，71％)。¹H NMR(400MHz, 甲醇-d₄)δ7.76(t,J＝7.5Hz,1H),7.43(td,J＝6.5,2.5Hz,4H), 7.34(t,J＝8.8Hz,2H),5.08–4.98(m,1H),4.64(td,J＝9.1,5.0Hz, 1H),4.26(t,J＝5.3Hz,2H),3.57–3.32(m,4H),2.84–2.59(m, 6H),2.45–2.37(m,3H),2.08–2.01(m,1H),2.00–1.91(m,2H), 1.82(dq,J＝13.8,6.9Hz,2H),1.68(d,J＝11.7Hz,3H).LCMS728.38(M+H)。

合成例29：dBET29的合成

将0.1M 4-((6-氨基己基)氧基)-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮于DMF(205微升，0.0205mmol，1当量)中的溶液加入 JQ-酸(8.2mg，0.0205mmol，1当量)。然后加入DIPEA(10.7微升， 0.0614mmol，3当量)和HATU(7.8mg，0.0205mmol，1当量)，并将混合物在室温搅拌19小时。然后将混合物用EtOAc稀释并用饱和碳酸氢钠，水和盐水洗涤。然后将有机层用硫酸钠干燥，过滤并减压下浓缩。通过柱色谱(ISCO，4g硅胶柱，0至10％MeOH/DCM，25 分钟梯度)纯化，得到所需产物，为白色固体(8.04mg，0.0106mmol， 52％)。¹HNMR(400MHz,甲醇-d₄)δ7.75–7.71(m,1H),7.51– 7.34(m,6H),5.07(ddd,J＝12.1,5.4,2.4Hz,1H),4.62(dd,J＝9.0, 5.2Hz,1H),4.22(t,J＝6.4Hz,2H),3.44–3.32(m,2H),3.29–3.21(m,2H),2.88–2.65(m,6H),2.43(s,3H),2.13–2.06(m,1H), 1.86(dt,J＝13.9,6.7Hz,2H),1.68(s,3H),1.59(dq,J＝14.2,7.0 Hz,4H),1.54–1.45(m,2H).LCMS 756.40(M+H).

合成例30：dBET30的合成

在室温，将0.1M N-(4-氨基丁基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3- 基)-1,3-氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸酯于DMF(163微升，0.0163mmol，1当量)的溶液加入(S)-4-(4-氯苯基)-3,9-二甲基- 6-(2-((3-(4-甲基哌嗪-1-基)丙基)氨基))-2-氧代乙基)-6H-噻吩并[3,2- f][1,2,4]***并[4,3-a][1,4]二氮杂环庚三烯-2-羧酸(9.31mg，0.0163 mmol，1eq)。加入DIPEA(8.5微升，0.0490mmol，3当量)和 HATU(6.2mg，0.0163mmol，1当量)。然后将混合物搅拌23.5小时，然后通过制备型HPLC纯化，得到所需产物，为黄色油状物 (11.48mg，0.0107mmol，66％)。¹H NMR(400MHz,甲醇-d₄)δ 7.82–7.78(m,1H),7.54–7.35(m,6H),5.09(td,J＝12.7,5.4Hz, 1H),4.77–4.70(m,3H),3.56–3.31(m,12H),3.23(dd,J＝8.0,6.0 Hz,3H),3.05(d,J＝3.2Hz,2H),2.93–2.81(m,5H),2.78–2.63 (m,5H),2.15–2.05(m,2H),1.96–1.86(m,4H),1.68(s,4H). LCMS 954.55(M+H)。

合成例31：dBET31的合成

在室温，将0.1M N-(8-氨基辛基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)- 1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸酯于DMF(153微升， 0.0153mmol，1当量)的溶液加入(S)-4-(4-氯苯基)-3,9-二甲基-6-(2- ((3-(4-甲基哌嗪-1-基)丙基)氨基))-2-氧代乙基)-6H-噻吩并[3,2- f][1,2,4]***并[4,3-a][1,4]二氮杂环庚三烯-2-羧酸(8.7mg，0.0153 mmol，1当量)。加入DIPEA(7.9微升，0.0458mmol，3当量)和 HATU(5.8mg，0.0153mmol，1当量)。然后将混合物搅拌25小时，然后通过制备型HPLC纯化，得到所需产物，为棕色油(不像大便棕色，而是有点像砖色)(9.52mg，0.00847mmol，55％)。¹H NMR(400MHz,甲醇-d₄)δ7.81(dd,J＝8.4,7.4Hz,1H),7.59–7.40(m, 6H),5.12(dd,J＝12.5,5.4Hz,1H),4.75(s,2H),4.71(t,J＝7.4Hz, 1H),3.53–3.34(m,8H),3.29–3.11(m,6H),3.03–2.61(m,13H), 2.15(s,1H),2.01–1.84(m,5H),1.59(s,4H),1.37(s,8H).LCMS1010.62(M+H)。

合成例32：dBET32的合成

在室温，将0.1M N-(4-氨基丁基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)- 1,3-氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸酯于DMF(180微升， 0.0180mmol，1当量)的溶液)加入4-(4-(4-((4-((3-(N-(叔丁基)氨磺酰基)苯基)氨基)-5-甲基嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌嗪-1-基)-4-氧代丁酸 (10.7mg，0.0180mmol，1当量)。加入DIPEA(9.4微升，0.0539 mmol，3当量)和HATU(6.8mg，0.0180mmol，1当量)，并将混合物搅拌19小时。然后将混合物用甲醇稀释，并通过制备型HPLC纯化，得到所需产物，为棕色油状物(4.40mg，0.00449mmol，25％)。 ¹H NMR(500MHz,甲醇-d₄)δ8.08(d,J＝13.6Hz,1H),7.84–7.76 (m,3H),7.63(s,1H),7.57–7.51(m,2H),7.41(d,J＝8.4Hz,1H), 7.22(td,J＝6.7,2.2Hz,2H),7.03–6.97(m,2H),5.14(dd,J＝12.5, 5.5Hz,1H),4.76(d,J＝16.8Hz,2H),3.72(dt,J＝10.0,5.2Hz,4H),3.34–3.33(m,1H),3.23–3.12(m,5H),2.97(dd,J＝8.8,4.0 Hz,3H),2.80–2.69(m,4H),2.64(dd,J＝7.6,5.5Hz,1H),2.50(t, J＝6.8Hz,1H),2.22(dd,J＝2.4,0.9Hz,3H),2.17–2.11(m,1H), 1.67–1.52(m,4H),1.18(d,J＝0.8Hz,9H).LCMS 980.64(M+H)。

合成例33：dBET33的合成

在室温，将0.1M N-(8-氨基辛基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)- 1,3-氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸酯于DMF(188微升，0.0188mmol，1当量)的溶液加入4-(4-(4-((4-((3-(N-(叔丁基)氨磺酰基)苯基)氨基)-5-甲基嘧啶-2-基)氨基)苯基)哌嗪-1-基)-4-氧代丁酸 (10.8mg，0.0188mmol，1当量)。加入DIPEA(9.8微升，0.0564 mmol，3当量)和HATU(7.1mg，0.0188mmol，1当量)，将混合物搅拌23小时。然后将混合物用甲醇稀释，并通过制备型HPLC纯化，得到所需产物，为棕色残余物(7.41mg，0.00715mmol，38％)。¹HNMR(500MHz,甲醇-d₄)δ8.06(s,1H),7.80(ddd,J＝10.5,7.6,3.2 Hz,3H),7.65(d,J＝4.5Hz,1H),7.57–7.51(m,2H),7.41(dd,J＝ 8.4,2.9Hz,1H),7.25(td,J＝6.7,2.9Hz,2H),7.02(t,J＝8.0Hz, 2H),5.16–5.09(m,1H),4.75(d,J＝9.5Hz,2H),3.76(dq,J＝16.0,5.3Hz,4H),3.29–3.12(m,7H),3.00–2.67(m,7H),2.51(t,J＝ 6.8Hz,1H),2.22(d,J＝3.1Hz,3H),2.13(dtd,J＝10.4,5.7,3.1Hz, 1H),1.59–1.52(m,2H),1.51–1.43(m,2H),1.32(t,J＝16.6Hz, 8H),1.18(d,J＝1.3Hz,9H).LCMS 1036.69(M+H)。

合成例34：dBET34的合成

在室温，将0.1M N-(3-(2-(2-(3-氨基丙氧基)乙氧基)乙氧基)丙基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二恶吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸酯于DMF(173微升，0.0173mmol，1当量)的溶液加入4-(4- (4-((4-((3-(N-(叔丁基)氨磺酰基)苯基)氨基)-5-甲基嘧啶-2-基)氨基) 苯基)哌嗪-1-基)-4-氧代丁酸(10.3mg，0.0173mmol，1当量)。加入DIPEA(9.0微升，0.0519mmol，3当量)和HATU(6.6mg，0.0173 mmol，1当量)，并将混合物搅拌25小时。然后将混合物用甲醇稀释，并通过制备型HPLC纯化，得到所需产物，为棕色残余物(7.99 mg，0.00718mmol，42％)。¹H NMR(500MHz,甲醇-d₄)δ8.06(s, 1H),7.83–7.76(m,3H),7.65(s,1H),7.58–7.50(m,2H),7.43(dd, J＝17.7,8.4Hz,1H),7.27–7.21(m,2H),7.02(t,J＝8.0Hz,2H), 5.13(dt,J＝12.7,5.2Hz,1H),4.76(d,J＝12.4Hz,2H),3.73(q,J＝6.3Hz,4H),3.63–3.49(m,10H),3.41(q,J＝6.6Hz,2H),3.27– 3.15(m,5H),3.01–2.81(m,4H),2.79–2.63(m,5H),2.50(t,J＝ 6.8Hz,1H),2.22(d,J＝2.3Hz,3H),2.17–2.11(m,1H),1.88– 1.70(m,4H),1.18(d,J＝1.2Hz,9H).LCMS 1112.74(M+H)。

合成例35：dBET35的合成

将0.1M N-(4-氨基丁基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚-4-基)氨基)乙酰胺三氟乙酸酯于DMF(185微升，0.0185 mmol，1当量)的溶液加入JQ-酸(7.4mg，0.0185mmol，1当量)。然后加入DIPEA(9.6微升，0.0554mmol，3当量)和HATU(7.0mg，0.0185mmol，1当量)，并将混合物在室温搅拌17小时。然后将混合物用EtOAc稀释，并用饱和碳酸氢钠、水和盐水洗涤。然后将有机层用硫酸钠干燥，过滤并减压下浓缩。通过柱色谱(ISCO，4g硅胶柱，0至15％MeOH/DCM，25分钟梯度)纯化，得到所需产物，为白色固体(2.71mg，0.00351mmol，19％)。¹H NMR(500MHz, 甲醇-d₄)δ7.48–7.37(m,4H),7.34(t,J＝7.8Hz,1H),7.14(dd,J＝ 7.4,2.4Hz,1H),6.67(d,J＝8.1Hz,1H),5.14(td,J＝13.5,5.2Hz, 1H),4.66–4.60(m,1H),4.59(d,J＝8.3Hz,2H),4.43–4.31(m, 2H),3.88(s,2H),3.25(dd,J＝14.8,7.1Hz,4H),2.94–2.72(m, 3H),2.68(d,J＝4.9Hz,3H),2.49–2.40(m,4H),2.21–2.12(m, 1H),1.68(s,3H),1.53(s,4H).LCMS 770.51(M+H)。

合成例36：dBET36的合成

将0.1M N-(4-氨基丁基)-2-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-氧代异吲哚啉-4-基)乙酰胺三氟乙酸酯于DMF(222微升，0.0222mmol， 1当量)的溶液加入JQ-酸(8.9mg，0.0222mmol，1当量)。然后加入DIPEA(11.6微升，0.0666mmol，3当量)和HATU(8.4mg，0.0222mmol，1当量)，并将混合物在室温搅拌17.5小时。然后将混合物用EtOAc稀释，并用饱和碳酸氢钠、水和盐水洗涤。然后将有机层用硫酸钠干燥，过滤并减压下浓缩。通过柱色谱(ISCO，4g 硅胶柱，0至15％MeOH/DCM，25分钟梯度)纯化，得到所需产物，为白色固体(12.42mg，0.0156mmol，70％)。¹H NMR(500MHz, 甲醇-d₄)δ7.80–7.74(m,2H),7.68(d,J＝6.8Hz,1H),7.42(q,J＝ 8.7Hz,4H),5.11(dt,J＝12.3,4.6Hz,1H),4.63(dd,J＝8.8,5.5Hz, 1H),4.10–4.00(m,2H),3.39(ddd,J＝14.9,8.8,2.5Hz,1H),3.30 –3.21(m,5H),2.88–2.76(m,1H),2.74–2.65(m,5H),2.44(s, 3H),2.15–2.08(m,1H),1.69(s,3H),1.63–1.55(m,4H).LCMS 769.49(M+H)。

合成例37：dBET37的合成

将0.1M 6-氨基-N-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-氧代异吲哚啉 -4-基)甲基)己酰胺三氟乙酸酯于DMF(195微升，0.0195mmol，1 当量)的溶液加入JQ-酸(7.8mg，0.0195mmol，1当量)中。然后加入DIPEA(10.2微升，0.0584mmol，3当量)和HATU(7.4mg，0.0195mmol，1当量)，并将混合物在室温搅拌18小时。然后将混合物用EtOAc稀释，并用饱和碳酸氢钠、水和盐水洗涤。然后将有机层用硫酸钠干燥，过滤并减压下浓缩。通过柱色谱(ISCO，4g硅胶柱，0至15％MeOH/DCM，25分钟梯度)纯化，得到所需产物，为白色固体(11.83mg，0.0151mmol，77％)。¹H NMR(500MHz, 甲醇-d₄)δ7.78–7.74(m,2H),7.71(dd,J＝5.3,3.5Hz,1H),7.42 (q,J＝8.5Hz,4H),5.13(dd,J＝12.6,5.5Hz,1H),4.82(s,2H), 4.63(dd,J＝8.8,5.5Hz,1H),3.40(ddd,J＝15.0,8.8,1.6Hz,1H), 3.30–3.21(m,3H),2.86(ddd,J＝18.4,14.6,4.8Hz,1H),2.74(ddd, J＝13.8,10.1,2.8Hz,2H),2.69(s,3H),2.44(s,3H),2.30(t,J＝7.4 Hz,2H),2.13(dtd,J＝12.9,4.9,2.3Hz,1H),1.74–1.64(m,5H),1.59(p,J＝7.0Hz,2H),1.46–1.38(m,2H).LCMS 783.47(M+H)。

合成例38：dBET38的合成

步骤1：(3-(3-(2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-氧代异吲哚啉-4-基) 氧基)乙酰氨基)丙氧基)丙基叔丁基酯的合成)氨基甲酸酯

将(3-(3-氨基丙氧基)丙基)氨基甲酸叔丁酯(134.5mg，0.579 mmol，1当量)溶于DMF(5.79mL，0.05M)中，然后加入2-((2- (2,6-二氧代哌啶)-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酸(192.38 mg，0.579mmol，1当量)。加入DIPEA(0.28mL，1.74mmol，3 当量)和HATU(153.61mg，0.579mmol，1当量)，并将混合物在室温搅拌18小时。然后将混合物用EtOAc稀释并用饱和碳酸氢钠，水和盐水洗涤。用硫酸钠干燥有机层，过滤并浓缩，得到黄色油状物 (157.1mg)。通过柱色谱(ISCO，12g二氧化硅柱，0至15％ MeOH/DCM，25分钟梯度)纯化粗物质，得到黄色油状物(121.3mg， 0.222mmol，38.27％)。¹H NMR(400MHz,甲醇-d₄)δ7.78(dd,J ＝8.4,7.4Hz,1H),7.50(d,J＝7.3Hz,1H),7.41(d,J＝8.5Hz,1H), 5.13(dd,J＝12.4,5.5Hz,1H),4.75(s,2H),3.53–3.37(m,6H), 3.14–3.07(m,2H),2.94–2.88(m,1H),2.79–2.68(m,2H),2.16 (ddd,J＝12.8,6.6,2.7Hz,1H),1.81(p,J＝6.4Hz,2H),1.73–1.65(m,2H),1.40(s,9H).LCMS 547.6(M+H).

步骤2：N-(3-(3-氨基丙氧基)丙基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)- 1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸盐的合成

将TFA(2.22ml，0.1M)加入(3-(3-(2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3- 基)-1,3-氧代异吲哚啉-4-基)氧基乙酰氨基)丙氧基)丙基)氨基甲酸叔丁酯(121.3mg，0.222mmol，1当量)，将混合物在50℃搅拌2小时。然后将混合物溶解在MeOH中并在减压下浓缩，得到棕色油状物 (114.1mg)，其不经进一步纯化而继续使用。¹H NMR(400MHz,甲醇-d₄)δ7.81–7.74(m,1H),7.50(d,J＝7.3Hz,1H),7.41(d,J＝ 8.5Hz,1H),5.12(dd,J＝12.7,5.5Hz,1H),4.76(s,2H),3.57–3.52 (m,2H),3.48(t,J＝5.9Hz,2H),3.40(t,J＝6.6Hz,2H),3.06(t,J＝ 6.5Hz,2H),2.87(ddd,J＝14.1,10.1,7.0Hz,1H),2.79–2.65(m, 2H),2.15(dtd,J＝12.8,5.5,2.6Hz,1H),1.92(dt,J＝11.7,5.9Hz, 2H),1.81(p,J＝6.3Hz,2H).LCMS 447.2(M+H)。

步骤3：合成dBET38

在室温，将0.1M N-(3-(3-氨基丙氧基)丙基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸酯于 DMF(0.215mL，0.0215mmol，1当量)的溶液加入JQ-酸(8.6mg， 0.0215mmol，1当量)。加入DIPEA(11.2微升，0.0644mmol，3当量)和HATU(8.2mg，0.0215mmol，1当量)。19小时后，将混合物用EtOAc稀释，并用饱和碳酸氢钠、水和盐水洗涤。将合并的有机层用硫酸钠干燥，过滤并减压下浓缩。通过柱色谱(ISCO，4g硅胶柱，0至15％MeOH/DCM，25分钟梯度)纯化，得到所需产物，为奶油色固体(10.6mg，0.0127mmol，59％)。¹H NMR(500MHz, 甲醇-d₄)δ7.79–7.74(m,1H),7.50(d,J＝8.1Hz,1H),7.46–7.36 (m,5H),5.11(ddd,J＝12.4,5.5,1.7Hz,1H),4.73(s,2H),4.62(ddd, J＝8.7,5.4,1.4Hz,1H),3.50(q,J＝6.3Hz,4H),3.43(t,J＝6.5Hz, 2H),3.41–3.32(m,3H),3.29–3.24(m,1H),2.85(ddd,J＝18.3, 14.6,4.2Hz,1H),2.77–2.65(m,5H),2.43(s,3H),2.17–2.09(m, 1H),1.80(h,J＝6.4Hz,4H),1.68(s,3H).LCMS 829.32(M+H)。

合成例39：dBET39的合成

在室温，将0.1M 4-((10-氨基癸基)氧基)-2-(2,6-二氧代哌啶-3- 基)异吲哚啉-1,3-二酮三氟乙酸酯于DMF(0.212mL，0.0212mmol， 1当量)的溶液加入JQ-酸(8.5mg，0.0212mmol，1当量)。加入 DIPEA(11.1微升，0.0636mmol，3当量)和HATU(8.1mg，0.0212mmol，1当量)。19小时后，将混合物用EtOAc稀释，并用饱和碳酸氢钠、水和盐水洗涤。将合并的有机层用硫酸钠干燥，过滤并减压下浓缩。通过柱色谱(ISCO，4g硅胶柱，0至15％MeOH/DCM，25 分钟梯度)和制备型HPLC纯化，得到所需产物(0.39mg，0.00048 mmol，2.3％)。¹H NMR(500MHz,甲醇-d₄)δ7.77–7.73(m,1H), 7.56–7.31(m,6H),5.11–5.06(m,1H),4.62(dd,J＝9.2,5.0Hz, 1H),4.58(s,2H),4.21(t,J＝6.3Hz,2H),3.42–3.38(m,1H),3.24 –3.20(m,1H),2.90–2.68(m,6H),2.45(d,J＝6.7Hz,3H),2.11(s, 1H),1.83(dd,J＝14.7,6.6Hz,2H),1.70(s,3H),1.61–1.49(m, 4H),1.32(d,J＝23.2Hz,10H).LCMS 812.60(M+H)。

合成例40：dBET40的合成

在室温，将0.1M 4-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)-2- (2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚啉-1,3-二酮三氟乙酸酯于DMF溶液 (0.242mL，0.0242mmol，1当量)加入JQ-酸(9.7mg，0.0242mmol，1当量)。加入DIPEA(12.6微升，0.0726mmol，3当量)和 HATU(9.2mg，0.0242mmol，1当量)。22小时后，将混合物用 EtOAc稀释，并用饱和碳酸氢钠、水和盐水洗涤。将合并的有机层用硫酸钠干燥，过滤并减压下浓缩。通过柱色谱(ISCO，4g硅胶柱， 0至10％MeOH/DCM，25分钟梯度)和制备型HPLC纯化，得到所需产物，为棕色油状物(4.74mg，0.00601mmol，25％)。¹H NMR (500MHz,甲醇-d₄)δ7.77–7.67(m,1H),7.52–7.36(m,5H),5.09 –5.03(m,1H),4.64(d,J＝4.8Hz,1H),4.40–4.32(m,2H),3.97– 3.88(m,2H),3.81–3.74(m,2H),3.69–3.60(m,5H),3.55–3.38 (m,4H),2.89–2.54(m,6H),2.45(d,J＝5.9Hz,3H),2.11(s,1H), 1.70(d,J＝8.6Hz,3H).LCMS 788.42(M+H)。

合成例41：dBET41的合成

步骤1：(4-((2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基) 氧基)乙酰氨基)甲基)苄基)氨基甲酸叔丁酯的合成

将(4-(氨基甲基)苄基)氨基甲酸叔丁酯(183.14mg，0.755mmol， 1当量)溶于DMF(15.1mL，0.05M)中并加入2-((2-(2,6-二氧代哌啶 -3-酮)(α)-3,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酸(250.90mg，0.755 mmol，1当量)。加入DIPEA(0.374mL，2.265mmol，3当量)和HATU(296.67mg，0.755mmol，1当量)，并将混合物在室温搅拌 20小时。然后将混合物用EtOAc稀释并用饱和碳酸氢钠，水和盐水洗涤。将有机层用硫酸钠干燥，过滤并浓缩，得到浅棕色油状物。通过柱色谱(ISCO，12g二氧化硅柱，0至15％MeOH/DCM，25分钟梯度)纯化粗物质，得到浅棕色油状物(373.1mg，0.678mmol， 89.8％)。¹H NMR(500MHz,DMSO-d₆)δ11.10(s,2H),8.48(t,J＝ 5.8Hz,1H),7.80(dd,J＝8.4,7.3Hz,1H),7.49(d,J＝7.2Hz,1H), 7.40(d,J＝8.6Hz,1H),7.26–7.08(m,4H),5.11(dd,J＝12.9,5.4 Hz,1H),4.86(s,2H),4.33(d,J＝3.9Hz,2H),4.09(d,J＝5.3Hz, 2H),2.65–2.51(m,3H),2.07–1.99(m,1H),1.38(s,9H).LCMS 551.5(M+H)。

步骤2：N-(4-(氨基甲基)苄基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸盐的合成

将TFA(6.77mL，0.1M)加入(4-((2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3- 基)-1,3-氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰氨基)甲基)苄基)氨基甲酸叔丁酯(373.1mg，0.677mmol，1当量)酯中。，将混合物在50℃搅拌 1.5小时。然后将混合物溶解在MeOH中并在减压下浓缩，得到棕色油状物(270.29mg)，其不经进一步纯化而继续使用。¹H NMR(500 MHz,DMSO-d₆)δ11.11(s,1H),8.55(t,J＝6.2Hz,1H),8.07(s, 3H),7.81(dd,J＝8.5,7.3Hz,1H),7.51(d,J＝7.2Hz,1H),7.40(dd, J＝14.9,8.3Hz,3H),7.31(d,J＝8.2Hz,2H),5.11(dd,J＝12.9,5.4Hz,1H),4.87(s,2H),4.37(d,J＝6.1Hz,2H),4.01(q,J＝5.8 Hz,2H),2.66–2.51(m,3H),2.07–1.99(m,1H).LCMS 451.3 (M+H)。

步骤3：合成dBET41

在室温，将0.1M N-(4-(氨基甲基)苄基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶 -3-基)-1,3-氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸盐于DMF中 (0.237mL，0.0237mmol，1当量)的溶液加入JQ-酸(9.5mg， 0.0237mmol，1当量)中。23小时后，将混合物用EtOAc稀释并用饱和碳酸氢钠，水和盐水洗涤。将有机层用硫酸钠干燥，过滤并减压下浓缩。通过柱色谱法(ISCO，4g硅胶柱，0至10％MeOH/DCM， 25分钟梯度)纯化，得到所需产物，为奶油色固体(11.8mg，0.0142 mmol，60％)。¹H NMR(500MHz,甲醇-d₄)δ7.80–7.75(m,1H), 7.51(dd,J＝7.3,1.5Hz,1H),7.41(d,J＝8.4Hz,1H),7.36(d,J＝2.2Hz,4H),7.34–7.28(m,4H),5.10–5.00(m,1H),4.82(s,2H), 4.67–4.64(m,1H),4.61–4.42(m,4H),4.34(dd,J＝14.9,12.8Hz, 1H),3.49(ddd,J＝14.8,9.5,5.2Hz,1H),2.83–2.75(m,1H),2.73 –2.61(m,5H),2.44–2.39(m,3H),2.06(ddq,J＝9.8,4.7,2.6Hz, 1H),1.66(d,J＝4.2Hz,3H).LCMS832.92(M+H)。

合成例42：dBET42的合成

将0.1M 5-氨基-N-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-4- 基)戊酰胺三氟乙酸酯于DMF(222微升，0.0222mmol，1当量)的溶液加入JQ-酸(8.9mg，0.0222mmol，1当量)。然后加入 DIPEA(11.6微升，0.0666mmol，3当量)和HATU(8.4mg，0.0222 mmol，1当量)，并将混合物在室温搅拌24小时。然后将混合物用 EtOAc稀释，并用饱和碳酸氢钠、水和盐水洗涤。然后将有机层用硫酸钠干燥，过滤并减压下浓缩。通过柱色谱(ISCO，4g硅胶柱，0 至10％MeOH/DCM，25分钟梯度)纯化，得到所需产物，为白色固体(12.23mg，0.0165mmol，74％)。¹H NMR(500MHz,甲醇-d₄)δ 7.76–7.71(m,1H),7.66–7.62(m,1H),7.51(td,J＝7.8,2.5Hz, 1H),7.45–7.35(m,4H),5.11(ddd,J＝13.2,11.3,5.2Hz,1H),4.63 (ddd,J＝8.8,5.7,3.2Hz,1H),4.47(s,2H),3.45–3.32(m,3H), 3.30–3.27(m,1H),2.90–2.80(m,1H),2.73–2.63(m,4H),2.49(t, J＝7.4Hz,2H),2.46–2.38(m,4H),2.11(ddtd,J＝12.8,10.5,5.3, 2.3Hz,1H),1.84–1.75(m,2H),1.66(dd,J＝16.2,7.6Hz,5H). LCMS 741.46(M+H)。

合成例43：dBET43的合成

将0.1M 7-氨基-N-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚-4-基) 庚酰胺三氟乙酸酯于DMF(227微升，0.0227mmol，1当量)的溶液加入JQ-酸(9.1mg，0.0227mmol，1当量)。然后加入DIPEA(11.9 微升，0.0681mmol，3当量)和HATU(8.6mg，0.0227mmol，1当量)，并将混合物在室温搅拌25.5小时。然后将混合物用EtOAc稀释，并用饱和碳酸氢钠、水和盐水洗涤。然后将有机层用硫酸钠干燥，过滤并减压下浓缩。通过柱色谱法(ISCO，4g硅胶柱，0至10％ MeOH/DCM，25分钟梯度)纯化，得到所需产物，为灰白色固体 (12.58mg，0.0164mmol，72％)。¹H NMR(500MHz,甲醇-d₄)δ 7.71(d,J＝7.9Hz,1H),7.64(d,J＝7.4Hz,1H),7.51(t,J＝7.8Hz, 1H),7.46–7.38(m,4H),5.14(ddd,J＝13.3,5.2,2.2Hz,1H),4.62(ddd,J＝8.6,5.6,2.1Hz,1H),4.49–4.45(m,2H),3.39(ddd,J＝ 14.9,8.7,1.3Hz,1H),3.30–3.24(m,3H),2.93–2.83(m,1H),2.79 –2.65(m,4H),2.50–2.40(m,6H),2.16(ddq,J＝9.9,5.2,2.6Hz, 1H),1.78–1.70(m,2H),1.68(d,J＝2.1Hz,3H),1.63–1.57(m, 2H),1.50–1.42(m,4H).LCMS 769.55(M+H)。

合成例44：dBET44的合成

将0.1M 8-氨基-N-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1-氧代异吲哚啉-4- 基)辛酰胺三氟乙酸酯于DMF(217微升，0.0217mmol，1当量)的溶液加入JQ-酸(8.7mg，0.0217mmol，1当量)。然后加入 DIPEA(11.3微升，0.0651mmol，3当量)和HATU(8.3mg，0.0217 mmol，1当量)，并将混合物在室温搅拌20.5小时。然后将混合物用EtOAc稀释，并用饱和碳酸氢钠、水和盐水洗涤。然后将有机层用硫酸钠干燥，过滤并减压下浓缩。通过柱色谱(ISCO，4g硅胶柱， 0-10％MeOH/DCM，25分钟梯度)纯化，得到所需产物，为奶油色固体(14.28mg，0.0182mmol，84％)。¹H NMR(500MHz,甲醇-d₄) δ7.72–7.68(m,1H),7.64(d,J＝7.5Hz,1H),7.51(t,J＝7.7Hz, 1H),7.46–7.39(m,4H),5.14(dt,J＝13.3,5.0Hz,1H),4.62(dd,J ＝8.8,5.4Hz,1H),4.48–4.44(m,2H),3.40(ddd,J＝14.9,8.8,0.9 Hz,1H),3.26(dt,J＝13.2,6.9Hz,3H),2.88(ddd,J＝18.7,13.5, 5.4Hz,1H),2.75(dddd,J＝17.6,7.1,4.5,2.4Hz,1H),2.68(d,J＝ 2.2Hz,3H),2.49–2.39(m,6H),2.17(ddt,J＝9.8,5.3,2.3Hz,1H),1.76–1.70(m,2H),1.70–1.67(m,3H),1.61–1.54(m,2H),1.42 (s,6H).LCMS 783.53(M+H)。

合成例45：dBET45的合成

在室温，将0.1M N-(8-氨基辛基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)- 1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸酯于DMF(268微升， 0.0268mmol，1当量)的溶液加入(R)-4-((4-环戊基-1,3-二甲基-2-氧代-1,2,3,4-四氢吡啶并[2,3-b]吡嗪-)6-基)氨基)-3-甲氧基苯甲酸(11.0 mg，0.0268mmol，1当量)。然后加入DIPEA(14.0微升，0.0804mmol，3当量)和HATU(10.2mg，0.0268mmol，1当量)，将混合物搅拌18.5小时。然后将混合物用甲醇稀释，并通过制备型HPLC 纯化，得到所需产物，为深棕色固体(10.44mg，0.0108mmol， 40％)。¹H NMR(500MHz,甲醇-d₄)δ8.38(d,J＝8.4Hz,1H), 7.80–7.75(m,1H),7.55–7.48(m,1H),7.48–7.35(m,3H),7.27 (d,J＝8.3Hz,1H),6.45(d,J＝8.2Hz,1H),5.12(dd,J＝12.5,5.5 Hz,1H),4.72(d,J＝5.1Hz,2H),4.53(s,1H),4.28(d,J＝6.8Hz, 1H),3.98(d,J＝4.1Hz,3H),3.48–3.33(m,4H),2.90–2.82(m, 1H),2.80–2.69(m,2H),2.18–2.01(m,4H),1.88–1.52(m,10H), 1.34(d,J＝42.9Hz,10H),1.17(d,J＝6.8Hz,3H).LCMS851.67 (M+H)。

合成例46：dBET46的合成

在室温，将0.1M N-(3-(2-(2-(3-氨基丙氧基)乙氧基)乙氧基)丙基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸酯于DMF(256微升，0.0256mmol，1当量)的溶液加入至 (R)-4-((4-环戊基-1,3-二甲基-2-氧代-1,2,3,4-四氢吡啶并[2,3-b]吡嗪- 6-基)氨基)-3-甲氧基苯甲酸(10.5mg，0.0256mmol，1当量)。然后加入DIPEA(13.4微升，0.0767mmol，3当量)和HATU(9.7mg， 0.0256mmol，1当量)，将混合物搅拌20小时。然后将混合物用甲醇稀释，并通过制备型HPLC纯化，得到所需产物，为深棕色固体 (13.69mg，0.0132mmol，51％)。¹H NMR(500MHz,甲醇-d₄)δ 8.28–8.24(m,1H),7.74–7.71(m,1H),7.49(dd,J＝7.3,3.7Hz, 1H),7.39–7.34(m,2H),7.28–7.25(m,1H),7.14–7.10(m,1H), 6.34(d,J＝8.3Hz,1H),5.01–4.97(m,1H),4.62(s,2H),4.25(q,J ＝6.7Hz,1H),3.95(d,J＝5.4Hz,3H),3.60(ddd,J＝9.0,6.1,1.6 Hz,8H),3.53–3.46(m,6H),3.40–3.37(m,2H),2.78(td,J＝11.1, 6.6Hz,3H),2.16–2.00(m,4H),1.84(ddt,J＝33.5,13.0,6.4Hz,7H),1.75–1.60(m,6H),1.17(d,J＝6.8Hz,3H).LCMS 927.74 (M+H)。

合成例47：dBET50的合成

在室温，将0.1M N-(3-(2-(2-(3-氨基丙氧基)乙氧基)乙氧基)丙基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸酯于DMF(200微升，0.0200mmol，1当量)的溶液加入 (S)-4-(4-氯苯基)-6-(2-甲氧基-2-氧代乙基)-3,9-二甲基-6H-噻吩并 [3,2-f][1,2,4]***并[4,3-a][1,4]二氮杂环庚三烯-2-羧酸(8.9mg，0.020mmol，1当量)。加入DIPEA(10.5微升，0.060mmol，3当量)和HATU(7.6mg，0.020mmol，1当量)。然后将混合物搅拌17 小时，然后用EtOAc稀释，并用饱和碳酸氢钠、水和盐水洗涤。将有机层用硫酸钠干燥，过滤并减压下浓缩。通过柱色谱法纯化(ISCO， 4g硅胶柱，0至10％MeOH/DCM，25分钟梯度)，得到所需产物，为奶油色固体(9.31mg，0.00968mmol，48％)。¹HNMR(500 MHz,甲醇-d₄)δ7.82–7.78(m,1H),7.52(dd,J＝7.1,1.6Hz,1H), 7.49–7.40(m,5H),5.10(ddd,J＝12.8,5.5,2.9Hz,1H),4.74(s, 2H),4.67(t,J＝7.1Hz,1H),3.76(s,3H),3.62–3.50(m,14H),3.49 –3.43(m,2H),3.40(q,J＝6.5Hz,2H),2.87(ddd,J＝17.6,14.0, 5.3Hz,1H),2.79–2.67(m,5H),2.12(ddq,J＝10.3,5.4,2.9Hz, 1H),2.00(s,3H),1.86(q,J＝6.3Hz,2H),1.80(p,J＝6.4Hz,2H)。 LCMS 961.67(M+H)。

合成例48：dBET51的合成

在室温，将0.1M N-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙基)-2-((2- (2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸酯于DMF(200微升，0.0200mmol，1当量)的溶液加入(S)-4-(4-氯苯基)-6-(2-甲氧基-2-氧代乙基)-3,9-二甲基-6H-噻吩并[3,2-f][1,2,4] ***并[4,3-a][1,4]二氮杂环庚三烯-2-羧酸(8.9mg，0.020mmol，1 当量)。加入DIPEA(10.5微升，0.060mmol，3当量)和HATU(7.6 mg，0.020mmol，1当量)。然后将混合物搅拌17小时，然后用 EtOAc稀释并用饱和碳酸氢钠、水和盐水洗涤。将有机层用硫酸钠干燥，过滤并减压下浓缩。通过柱色谱(ISCO，4g硅胶柱，0至10％ MeOH/DCM，25分钟梯度)纯化，得到所需产物，为灰白色固体 (8.38mg，0.00942mmol，47％)。¹HNMR(500MHz,甲醇-d₄)δ 7.80(dd,J＝8.4,7.4Hz,1H),7.52(dd,J＝7.2,1.3Hz,1H),7.48–7.38(m,5H),5.08(ddd,J＝12.7,5.5,1.6Hz,1H),4.74(d,J＝2.7 Hz,2H),4.66(t,J＝7.1Hz,1H),3.75(d,J＝3.0Hz,3H),3.65(t,J ＝4.1Hz,6H),3.59(t,J＝5.3Hz,2H),3.57–3.49(m,4H),3.49– 3.40(m,2H),2.93–2.84(m,1H),2.78–2.64(m,5H),2.15–2.09 (m,1H),2.00(d,J＝0.9Hz,3H).LCMS 889.58(M+H)。

合成例49：dBET52的合成

在室温，将0.1M N-(2-(2-(2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸酯于DMF(200微升，0.020mmol，1当量)的溶液加入 JQ-酸(8.0mg，0.020mmol，1当量)。加入DIPEA(10.5微升， 0.060mmol，3当量)和HATU(7.6mg，0.020mmol，1当量)。17.5 小时后，将混合物用EtOAc稀释并用饱和碳酸氢钠、水和盐水洗涤。将合并的有机层用硫酸钠干燥，过滤并减压下浓缩。通过柱色谱法纯化(ISCO，4g硅胶柱，0至10％MeOH/DCM，25分钟梯度)，得到所需产物，为无色残余物(9.12mg，0.01025mmol，51％)。¹H NMR(500MHz,甲醇-d₄)δ7.77(t,J＝7.9Hz,1H),7.50(dd,J＝ 7.3,1.5Hz,1H),7.47–7.36(m,5H),5.09(ddd,J＝13.0,7.6,5.5 Hz,1H),4.76(s,2H),4.62(dd,J＝9.1,5.1Hz,1H),3.62(ddt,J＝ 17.3,11.2,6.5Hz,12H),3.52–3.41(m,5H),3.28(d,J＝5.1Hz, 1H),2.90–2.81(m,1H),2.79–2.66(m,5H),2.44(s,3H),2.16– 2.09(m,1H),1.69(s,3H).LCMS 889.38(M+H)。

合成例50：dBET53的合成

在室温，将0.1M N-(14-氨基-3,6,9,12-四氧杂十四烷基)-2-((2- (2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸酯的溶液于DMF(200微升，0.020mmol，1当量)加入JQ-酸(8.0mg， 0.020mmol，1当量)。加入DIPEA(10.5微升，0.060mmol，3当量) 和HATU(7.6mg，0.020mmol，1当量)。17.5小时后，再加入 HATU(7.6mg)和DIPEA(10.5微升)，将混合物再搅拌5小时。将混合物用EtOAc稀释，并用饱和碳酸氢钠、水和盐水洗涤。将合并的有机层用硫酸钠干燥，过滤并减压下浓缩。通过柱色谱(ISCO，4g硅胶柱，0至10％MeOH/DCM，25分钟梯度)纯化，得到所需产物 (3.66mg)。¹H NMR(500MHz,甲醇-d₄)δ7.79(dd,J＝8.4,7.4Hz, 1H),7.51(d,J＝7.3Hz,1H),7.45(d,J＝7.7Hz,2H),7.43–7.36 (m,3H),5.08(ddd,J＝12.7,5.5,2.2Hz,1H),4.78–4.74(m,2H), 4.62(dd,J＝9.1,5.1Hz,1H),3.70–3.51(m,16H),3.50–3.41(m, 5H),3.27(dd,J＝5.1,2.3Hz,1H),2.87(ddt,J＝18.2,9.5,4.9Hz, 1H),2.78–2.66(m,5H),2.44(s,3H),2.16–2.09(m,1H),1.69(s, 3H).LCMS 933.43(M+H)。

合成例51：dBET54的合成

在室温，将0.1M N-(17-氨基-3,6,9,12,15-五氧杂十七烷基)-2- ((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸酯于DMF(200微升，0.020mmol，1当量)的溶液加入JQ-酸 (8.0mg，0.020mmol，1当量)。加入DIPEA(10.5微升，0.060 mmol，3当量)和HATU(7.6mg，0.020mmol，1当量)。16小时后，将混合物用EtOAc稀释，并用饱和碳酸氢钠、水和盐水洗涤。将合并的有机层用硫酸钠干燥，过滤并减压下浓缩。通过柱色谱(ISCO， 4g硅胶柱，0至10％MeOH/DCM，25分钟梯度)纯化，得到所需产物(6.27mg，0.00641mmol，32％)。¹H NMR(500MHz,甲醇-d₄) δ7.81–7.76(m,1H),7.51(d,J＝7.1Hz,1H),7.47–7.38(m,5H), 5.09(dd,J＝12.6,5.5Hz,1H),4.77(s,2H),4.62(dd,J＝8.8,5.0 Hz,1H),3.67–3.55(m,20H),3.46(ddd,J＝20.1,10.2,4.7Hz,5H), 3.28(d,J＝5.1Hz,1H),2.91–2.83(m,1H),2.78–2.68(m,5H), 2.44(s,3H),2.16–2.10(m,1H),1.72–1.66(m,3H).LCMS 977.50 (M+H)。

合成例52：dBET55的合成

在室温，将0.1M N-(29-氨基-3,6,9,12,15,18,21,24,27-壬氧基二十九烷基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-氧代异吲哚啉-4-基)氧基) 乙酰胺三氟乙酸酯于DMF(200微升，0.020mmol，1当量)的溶液中的加入JQ-酸(8.0mg，0.020mmol，1当量)。加入DIPEA(10.5微升，0.060mmol，3当量)和HATU(7.6mg，0.020mmol，1当量)。 18小时后，将混合物用EtOAc稀释，并用饱和碳酸氢钠、水和盐水洗涤。将合并的有机层用硫酸钠干燥，过滤并减压下浓缩。通过柱色谱(ISCO，4g硅胶柱，0至10％MeOH/DCM，25分钟梯度)纯化，得到所需产物(10.55mg，0.00914mmol，46％)。¹H NMR(500 MHz,甲醇-d₄)δ7.82(dd,J＝8.4,7.4Hz,1H),7.55(d,J＝7.0Hz, 1H),7.49–7.41(m,5H),5.13(dd,J＝12.6,5.5Hz,1H),4.80(s, 2H),4.65(dd,J＝9.1,5.1Hz,1H),3.68–3.58(m,36H),3.53–3.44 (m,5H),2.94–2.86(m,1H),2.81–2.70(m,5H),2.46(s,3H),2.19 –2.13(m,1H),1.74–1.69(m,3H).LCMS1153.59(M+H)。

合成例53：dBET56的合成

在室温，将0.1M N-(35-氨基-3,6,9,12,15,18,21,24,27,30,33-十一碳五烯三十烷基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶)-3-甲基)-1,3-氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸酯于DMF(200微升，0.020mmol，1 当量)的溶液加入JQ-酸(8.0mg，0.020mmol，1当量)。加入 DIPEA(10.5微升，0.060mmol，3当量)和HATU(7.6mg，0.020 mmol，1当量)。20小时后，将混合物用EtOAc稀释，并用饱和碳酸氢钠，水和盐水洗涤。将合并的有机层用硫酸钠干燥，过滤并减压下浓缩。通过柱色谱法(ISCO，4g硅胶柱，0至10％MeOH/DCM， 25分钟梯度)纯化，得到所需产物，为油状残余物(9.03mg，0.00727 mmol，36％)。¹H NMR(500MHz,甲醇-d₄)δ7.81(dd,J＝8.4,7.4 Hz,1H),7.53(d,J＝7.1Hz,1H),7.50–7.40(m,5H),5.11(dd,J＝12.6,5.5Hz,1H),4.78(s,2H),4.68(dd,J＝8.6,5.0Hz,1H),3.69– 3.56(m,44H),3.52–3.43(m,5H),3.34(dd,J＝7.9,3.5Hz,1H), 2.88(ddd,J＝18.0,14.0,5.2Hz,1H),2.79–2.68(m,5H),2.46(s, 3H),2.17–2.12(m,1H),1.71(s,3H).LCMS 1241.60(M+H)。

合成例54：dBET57的合成

步骤1：2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-氟异二氢吲哚-1,3-二酮的合成

向4-氟异苯并呋喃-1,3-二酮(200mg，1.20mmol，1当量)于 AcOH(4.0mL，0.3M)的溶液加入2,6-二氧代哌啶-3-胺盐酸盐(218 mg，1.32mmol，1.1当量)和乙酸钾(366mg，3.73mmol，3.1当量)。将反应混合物加热至90℃过夜，然后将其用水稀释至20mL并在冰上冷却30分钟。过滤所得浆液，并通过快速柱色谱法(2％ MeOH的CH₂Cl₂溶液，R_f＝0.3)在硅胶上纯化黑色固体，得到标题化合物，为白色固体(288mg，86％)。¹H NMR(500MHz,DMSO- d₆)δ11.15(s,1H),7.96(ddd,J＝8.3,7.3,4.5Hz,1H),7.82–7.71 (m,2H),5.17(dd,J＝13.0,5.4Hz,1H),2.90(ddd,J＝17.1,13.9, 5.4Hz,1H),2.65–2.47(m,2H),2.10–2.04(m,1H),计算 C₁₃H₁₀FN₂O₄[M+H]⁺ 277.06的MS(ESI)，实测为277.25。

步骤2：(2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-氧代异吲哚啉-4-基)氨基) 乙基)氨基甲酸叔丁酯的合成

向搅拌的2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-氟异二氢吲哚-1,3-二酮 (174mg，0.630mmol，1当量)于DMF(6.3mL，0.1M)的溶液中加入DIPEA(220μL，1.26mmol，2当量)和1-Boc-乙二胺(110μL， 0.693mmol，1.1当量)。将反应混合物加热至90℃过夜，然后将其冷却至室温并溶于EtOAc(30mL)和水(30mL)中。用盐水(3×20mL) 洗涤有机层，用Na₂SO₄干燥并真空浓缩。通过快速柱色谱法(0→10％ MeOH的CH2Cl2溶液)在硅胶上纯化残余物，得到标题化合物，为黄色固体(205mg，79％)。¹H NMR(500MHz,CDCl₃)δ8.08(bs, 1H),7.50(dd,J＝8.5,7.1Hz,1H),7.12(d,J＝7.1Hz,1H),6.98(d, J＝8.5Hz,1H),6.39(t,J＝6.1Hz,1H),4.96–4.87(m,1H),4.83 (bs,1H),3.50–3.41(m,2H),3.41–3.35(m,2H),2.92–2.66(m,3H),2.16–2.09(m,1H),1.45(s,9H)；计算C₂₀H₂₅N₄O₆[M+H]⁺ 417.18的MS(ESI)，实测为417.58。

步骤3：合成2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基) 氨基)乙-1-铵2,2,2-三氟乙酸盐

向搅拌的(2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-氧代异吲哚啉-4-基) 氨基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(205mg，0.492mmol，1当量)于二氯甲烷(2.25mL)的溶液加入三氟乙酸(0.250mL)。将反应混合物在室温搅拌4小时，然后真空除去挥发物。得到标题化合物，为黄色固体 (226mg，>95％)，其不经进一步纯化即可使用。¹H NMR(500 MHz,MeOD)δ7.64(d,J＝1.4Hz,1H),7.27–7.05(m,2H),5.10 (dd,J＝12.5,5.5Hz,1H),3.70(t,J＝6.0Hz,2H),3.50–3.42(m, 2H),3.22(t,J＝6.0Hz,1H),2.93–2.85(m,1H),2.80–2.69(m, 2H),2.17–2.10(m,1H)；计算C₁₅H₁₇N₄O₄[M+H]⁺ 317.12的MS (ESI)，实测为317.53。

步骤2：dBET57的合成

在室温，将JQ-酸(8.0mg，0.0200mmol，1当量)和2-((2- (2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-氧代异吲哚啉-4-基)氨基)乙-1-铵2,2,2-三氟乙酸盐(8.6mg，0.0200mmol，1当量)溶解在DMF(0.200mL， 0.1M)中。然后加入DIPEA(17.4μL，0.100mmol，5当量)和 HATU(7.59mg，0.0200mmol，1当量)，将混合物在室温搅拌过夜。将反应混合物溶于EtOAc(15mL)中，并用饱和NaHCO₃(水性)(15 mL)、水(15mL)和盐水(3x15mL)洗涤。将有机层用Na₂SO₄干燥并真空浓缩。通过快速柱色谱法(0→10％MeOH的CH2Cl2溶液，R_f＝ 0.3(10％MeOH的CH₂Cl₂溶液))在硅胶上纯化残余物，得到标题化合物，为亮黄色固体(11.2mg，80％)。¹H NMR(400MHz,CDCl₃) δ8.49(bs,0.6H),8.39(bs,0.4H),7.51–7.43(m,1H),7.38(d,J＝ 7.8Hz,2H),7.29(dd,J＝8.8,1.7Hz,2H),7.07(dd,J＝7.1,4.9Hz, 1H),6.97(dd,J＝8.6,4.9Hz,1H),6.48(t,J＝5.9Hz,1H),6.40(t, J＝5.8Hz,0.6H),4.91–4.82(m,0.4H),4.65–4.60(m,1H),3.62– 3.38(m,6H),2.87–2.64(m,3H),2.63(s,3H),2.40(s,6H),2.12– 2.04(m,1H),1.67(s,3H),rotamers；计算C₃₄H₃₂ClN₈O₅S[M+H]⁺ 700.19的MS(ESI)，实测为700.34。

合成例55：dGR1的合成

合成例56：dGR2的合成：

合成例57：dGR3的合成：

合成例58：dFKBP-1的合成

(1)SLF-琥珀酸酯的合成

将SLF(25mg，2.5mL的10mg/mL MeOAc溶液，0.0477 mmol，1当量)与DMF(0.48mL，0.1M)和琥珀酸酐(7.2mg，0.0715 mmol，1.5当量)合并，并在室温搅拌24小时。观察到低转化率，将混合物置于N₂气流下以除去MeOAc。加入另外的0.48mL DMF，以及另外的7.2mg琥珀酸酐和DMAP(5.8mg，0.0477mmol，1当量)。然后将混合物再搅拌24小时，然后通过制备型HPLC纯化，得到SLF-琥珀酸酯，为黄色油状物(24.06mg，0.0385mmol，81％)。 ¹H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.62(d,J＝10.7Hz,1H),7.44(d,J ＝8.0Hz,1H),7.26(td,J＝7.9,2.7Hz,1H),7.07–6.97(m,1H), 6.80(dd,J＝8.1,2.1Hz,1H),6.74–6.66(m,2H),5.73(dd,J＝8.1, 5.5Hz,1H),5.23(d,J＝4.8Hz,1H),3.83(s,3H),3.81(s,3H),3.39 –3.29(m,4H),3.21(td,J＝13.2,3.0Hz,1H),2.68–2.50(m,5H), 2.37–2.19(m,2H),2.12–2.02(m,1H),1.79–1.61(m,4H),1.49–1.30(m,2H),1.27–1.05(m,6H),0.82(dt,J＝41.2,7.5Hz,3H)。LCMS 624.72(M+H)。

(2)dFKBP-1的合成

将N-(4-氨基丁基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸酯(9.9mg，0.0192mmol，1当量)加入SLF琥珀酸盐(11.98mg，0.0192mmol，1当量)于0.192mL DMF(0.1M)中的溶液。加入DIPEA(10.0微升，0.0575mmol，3当量)，然后加入HATU(7.3mg，0.0192mmol，1当量)。将混合物搅拌17小时，然后用MeOH稀释，并通过制备型HPLC纯化，得到dFKBP- 1(7.7mg，0.00763mmol，40％)，为黄色固体。

¹H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.81(s,1H),7.77–7.70(m,1H), 7.55–7.49(m,2H),7.26(dd,J＝8.0,5.3Hz,2H),7.05–6.99(m, 1H),6.77(d,J＝8.8Hz,1H),6.66(d,J＝6.8Hz,2H),5.77–5.72 (m,1H),5.24(d,J＝4.8Hz,1H),4.99(dd,J＝12.3,5.7Hz,1H),4.68–4.59(m,2H),3.82(s,3H),3.81(s,3H),3.32(dt,J＝3.3,1.6 Hz,4H),3.26–3.14(m,3H),2.79(dd,J＝18.9,10.2Hz,3H),2.64 –2.48(m,5H),2.34(d,J＝14.4Hz,1H),2.22(d,J＝9.2Hz,1H), 2.14–2.02(m,2H),1.78–1.49(m,9H),1.43–1.30(m,2H),1.20– 1.04(m,6H),0.90–0.76(m,3H)。13C NMR(100MHz,cd3od)δ 208.51,173.27,172.64,171.63,169.93,169.51,168.04,167.69, 167.09,166.71,154.92,149.05,147.48,140.76,138.89,137.48, 133.91,133.67,129.36,122.19,120.61,120.54,119.82,118.41,118.12,117.79,112.12,111.76,68.54,56.10,55.98,51.67,46.94, 44.57,39.32,39.01,38.23,32.64,31.55,31.43,26.68,26.64,25.08, 23.52,23.21,22.85,21.27,8.76.LCMS1009.66(M+H)。

合成例59：dFKBP-2的合成

(1)(1-氯-2-氧代-7,10,13-三氧杂-3-氮杂十六烷-16-基)氨基甲酸叔丁酯的合成

将(3-(2-(2-(3-氨基丙氧基)乙氧基)乙氧基)丙基)氨基甲酸叔丁酯 (1.0g，3.12mmol，1当量)溶于THF(31mL，0.1M)。加入 DIPEA(0.543mL，3.12mmol，1当量)，将溶液冷却至0℃。加入氯乙酰氯(0.273mL，3.43mmol，1.1当量)，将混合物缓慢温热至室温。 24小时后，将混合物用EtOAc稀释，用饱和碳酸氢钠、水和盐水洗涤。将有机层用硫酸钠干燥，过滤并浓缩，得到黄色油状物(1.416g)，其不经进一步纯化而继续使用。

¹H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.24(s,1H),5.00(s,1H),3.98–3.89 (m,2H),3.54(dddt,J＝17.0,11.2,5.9,2.2Hz,10H),3.47–3.40(m, 2H),3.37–3.31(m,2H),3.17–3.07(m,2H),1.79–1.70(m,2H), 1.67(p,J＝6.1Hz,2H),1.35(s,9H).¹³C NMR(100MHz,cdcl3)δ165.83,155.97,78.75,70.49,70.47,70.38,70.30,70.14,69.48, 42.61,38.62,38.44,29.62,28.59,28.40.LCMS 397.37(M+H)。

(2)3-((2,2-二甲基-4,20-二氧代-3,9,12,15-四氧杂-5,19-二氮杂二十二烷-21-基)氧基)邻苯二甲酸二甲酯的合成

将(1-氯-2-氧代-7,10,13-三氧杂-3-氮杂十六烷-16-基)氨基甲酸叔丁酯(1.41g，3.12mmol，1当量)溶于MeCN(32mL，0.1M)中。加入3-羟基邻苯二甲酸二甲酯(0.721g，3.43mmol，1.1当量)和碳酸铯(2.80g，8.58mmol，2.75当量)。将烧瓶配备回流冷凝器，并加热至 80℃保持19小时。将混合物冷却至室温并用水稀释，用氯仿萃取一次，用EtOAc萃取两次。将合并的有机层用硫酸钠干燥，过滤并减压下浓缩。通过柱色谱(ISCO，24g二氧化硅柱，0至15％MeOH/DCM， 22分钟梯度)纯化粗物质，得到黄色油状物(1.5892g，2.78mmol， 89％，两步骤)。

¹H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.52(d,J＝7.8Hz,1H),7.35(t,J＝ 8.1Hz,1H),7.04(d,J＝8.3Hz,1H),7.00(t,J＝5.3Hz,1H),5.06 (s,1H),4.46(s,2H),3.83(s,3H),3.78(s,3H),3.47(ddd,J＝14.9, 5.5,2.8Hz,8H),3.39(dt,J＝9.4,6.0Hz,4H),3.29(q,J＝6.5Hz,2H),3.09(d,J＝6.0Hz,2H),1.70(p,J＝6.5Hz,2H),1.63(p,J＝ 6.3Hz,2H),1.31(s,9H).¹³C NMR(100MHz,cdcl3)δ167.68, 167.36,165.45,155.93,154.41,130.87,129.60,125.01,123.20, 117.06,78.60,70.40,70.17,70.06,69.39,68.67,68.25,52.77,52.57,38.38,36.58,29.55,29.20,28.34.LCMS 571.47(M+H)。

(3)N-(3-(2-(2-(3-氨基丙氧基)乙氧基)乙氧基)丙基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸酯的合成将3-((2,2-二甲基-4,20-二氧代-3,9,12,15-四氧杂-5,19-二氮杂二十二烷-21-基)氧基)邻苯二甲酸二甲酯(1.589g，2.78mmol，1当量) 溶于EtOH(14mL，0.2M)。加入3M NaOH水溶液(2.8mL，8.34mmol，3当量)，将混合物加热至80℃，保持22小时。然后将混合物冷却至室温，用50mL DCM和20mL 0.5M HCl稀释。分离各层，有机层用25mL水洗涤。合并水层，用50mL氯仿萃取三次。将合并的有机层用硫酸钠干燥，过滤并浓缩，得到1.53g物质，其不经进一步纯化而继续使用。LCMS 553.44。

将所得物质(1.53g)和3-氨基哌啶-2,6-二酮盐酸盐(0.480g，2.92 mmol，1当量)溶于吡啶(11.7mL，0.25M)中，并加热至110℃保持17 小时。将混合物冷却至室温，并减压下浓缩，得到粗制的(1-((2-(2,6- 二氧代哌啶-3-基)-1,3-氧代异吲哚啉-4-基)氧基)-2-氧代-7,10,13-三氧杂-3-氮杂十六烷-16-基)氨基甲酸叔丁酯，为黑色污泥(3.1491g)，其不经进一步纯化而继续使用。LCMS 635.47。

将粗制的(1-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4- 基)氧基)-2-氧代-7,10,13-三氧杂-3-氮杂十六烷-16-基)氨基甲酸叔丁酯(3.15g)溶于TFA(20mL)，并加热至50℃保持2.5小时。将混合物冷却至室温，用MeOH稀释并减压下浓缩。通过制备型HPLC纯化该物质，得到N-(3-(2-(2-(3-氨基丙氧基)乙氧基)乙氧基)丙基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸酯 (1.2438g，1.9598mmol，71％，3步骤)，为深红色油状物。

¹H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ7.77(dd,J＝8.3,7.5Hz,1H),7.49 (d,J＝7.3Hz,1H),7.40(d,J＝8.5Hz,1H),5.12(dd,J＝12.8,5.5 Hz,1H),4.75(s,2H),3.68–3.51(m,12H),3.40(t,J＝6.8Hz,2H), 3.10(t,J＝6.4Hz,2H),2.94–2.68(m,3H),2.16(dtd,J＝12.6,5.4, 2.5Hz,1H),1.92(p,J＝6.1Hz,2H),1.86–1.77(m,2H).¹³C NMR (100MHz,cd3od)δ173.17,169.97,168.48,166.87,166.30,154.82, 136.89,133.41,120.29,117.67,116.58,69.96,69.68,69.60,68.87, 68.12,67.92,49.19,38.62,36.14,30.80,28.92,26.63,22.22.LCMS 536.41(M+H).

(4)dFKBP-2的合成

将N-(3-(2-(2-(3-氨基丙氧基)乙氧基)乙氧基)丙基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)乙酰胺三氟乙酸酯(12.5 mg，0.0193mmol，1当量)加入SLF-琥珀酸盐(12.08mg，0.0193 mmol，1当量)于0.193mL的DMF(0.1M)溶液。加入DIPEA(10.1微升， 0.0580mmol，3当量)和HATU(7.3mg，0.0193mmol，1当量)，将混合物搅拌19小时。然后将混合物用MeOH稀释，并通过制备型 HPLC纯化，得到dFKBP-2(9.34mg，0.00818mmol，42％)，为黄色油状物。

¹H NMR(400MHz,50％MeOD/氯仿-d)δ7.76–7.70(m,1H),7.58 –7.45(m,3H),7.26(t,J＝8.2Hz,2H),7.05–6.98(m,1H),6.77(d, J＝7.9Hz,1H),6.71–6.63(m,2H),5.73(dd,J＝8.1,5.6Hz,1H), 5.23(d,J＝5.4Hz,1H),5.03–4.95(m,1H),4.64(s,2H),3.82(s, 3H),3.80(s,3H),3.62–3.52(m,8H),3.47(t,J＝6.1Hz,2H),3.44 –3.33(m,3H),3.27–3.14(m,3H),2.84–2.70(m,3H),2.64–2.47 (m,6H),2.34(d,J＝14.1Hz,1H),2.24(dd,J＝14.3,9.3Hz,2H), 2.13–2.00(m,2H),1.83(p,J＝6.3Hz,2H),1.67(dtd,J＝38.4, 16.8,14.8,7.0Hz,7H),1.51–1.26(m,3H),1.22–1.05(m,6H), 0.80(dt,J＝39.8,7.5Hz,3H).¹³C NMR(100MHz,cdcl3)δ208.64, 173.39,173.01,171.76,170.11,169.62,168.24,167.92,167.36, 166.69,155.02,149.23,147.66,140.94,139.18,137.57,134.09, 133.91,129.49,122.32,120.75,120.52,119.93,118.42,117.75, 112.33,111.98,70.77,70.51,70.40,69.45,69.04,68.48,56.20, 56.10,51.88,47.09,44.78,38.40,37.48,36.91,32.80,32.71,31.70, 31.59,31.55,29.53,29.30,26.77,25.22,23.63,23.33,22.98,21.43. LCMS 1141.71(M+H).

合成例60：dFKBP-3的合成

将0.1M N-(4-氨基丁基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸酯溶液(0.233mL，0.0233 mmol，1当量)加到2-(3((R)-3-(3,4-二甲氧基苯基)-1-(((S)-1-(3,3-二甲基-2-氧代戊酰基)吡咯烷-2-羰基)氧基)丙基)苯氧基)乙酸(13.3mg， 0.0233mmol，1当量)。加入DIPEA(12.2微升，0.0700mmol，3当量)，然后加入HATU(8.9mg，0.0233mmol，1当量)。将混合物搅拌23小时，然后用MeOH稀释，并通过制备型HPLC纯化，得到白色固体(10.72mg，0.0112mmol，48％)。

¹H NMR(400MHz,甲醇-d₄)δ7.79–7.74(m,1H),7.52(d,J＝7.4 Hz,1H),7.33(d,J＝8.4Hz,1H),7.26(t,J＝8.1Hz,1H),6.97– 6.90(m,2H),6.89–6.84(m,1H),6.79(dd,J＝8.2,1.9Hz,1H), 6.73–6.64(m,2H),5.73–5.65(m,1H),5.07–4.99(m,1H),4.67 (s,2H),4.57–4.51(m,1H),4.48(dd,J＝5.7,2.5Hz,2H),3.82(d,J ＝1.9Hz,3H),3.80(s,3H),3.66–3.39(m,3H),2.88–2.48(m,6H), 2.42–1.87(m,9H),1.73–1.51(m,6H),1.19–0.92(m,6H),0.75 (dt,J＝56.7,7.5Hz,3H).LCMS 954.52(M+H)。

实施例61：dFKBP-4的合成

将0.1M N-(4-氨基丁基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚基-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸酯(0.182mL，0.0182mmol， 1当量)溶液加入2-(3-((R)-3-(3,4-二甲氧基)苯基)-1-(((S)-1-(3,3-二甲基-2-氧代戊酰基)哌啶中)2-羰基)氧基)丙基)苯氧基)乙酸(10.6mg， 0.0182mmol，1当量)。加入DIPEA(9.5微升，0.0545mmol，3当量)，然后加入HATU(6.9mg，0.0182mmol，1当量)。将混合物搅拌26小时，然后用MeOH稀释，并加入通过制备型HPLC纯化，得到白色固体(9.74mg，0.01006mmol，55％)。

¹H NMR(400MHz,甲醇-d₄)δ7.75(dd,J＝8.3,7.4Hz,1H),7.53(d, J＝2.3Hz,1H),7.33–7.25(m,2H),7.00–6.84(m,3H),6.79(dd,J ＝8.1,2.5Hz,1H),6.72–6.65(m,2H),5.75–5.70(m,1H),5.23(d, J＝4.9Hz,1H),5.05–4.96(m,1H),4.66(s,2H),4.46(s,2H),3.82 (s,3H),3.81(s,3H),3.39–3.32(m,4H),3.20–3.12(m,1H),2.82 –2.69(m,3H),2.62–2.49(m,2H),2.37–2.00(m,5H),1.78–1.30 (m,11H),1.24–1.08(m,6H),0.81(dt,J＝32.9,7.5Hz,3H).LCMS 968.55(M+H)。

合成例62：dFKBP-5的合成

将0.1M N-(4-氨基丁基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸酯(0.205mL，0.0205mmol， 1当量)溶液加入2-(3-((R)-3-(3,4-二甲氧基苯基)-1-(((S)-1-(2-苯基乙酰基)哌啶-2-羰基)氧)丙基)苯氧基)乙酸(11.8mg，0.0205mmol， 1当量)。加入DIPEA(10.7微升，0.0615mmol，3当量)，然后加入 HATU(7.8mg，0.0205mmol，1当量)。将混合物搅拌29小时，然后用MeOH稀释，并通过制备型HPLC纯化，得到白色固体(10.62 mg，0.01106mmol，54％)。

¹H NMR(400MHz,甲醇-d₄)δ7.77–7.72(m,1H),7.52(s,1H), 7.31–7.11(m,7H),6.92–6.77(m,4H),6.68–6.62(m,2H),5.70– 5.64(m,1H),5.38(d,J＝3.8Hz,1H),4.99(d,J＝4.6Hz,1H),4.65 (s,2H),4.45–4.39(m,2H),3.80(dd,J＝6.7,2.4Hz,8H),3.13–3.03(m,1H),2.83–2.68(m,3H),2.63–2.45(m,3H),2.34–1.93 (m,6H),1.71–1.52(m,7H),1.34–1.20(m,3H).LCMS 960.54 (M+H)。

合成例63：dFKBP-6的合成

将N-(4-氨基丁基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸酯(11.9mg，0.0231mmol，1当量)加入2-(3-((R)-3-(3,4-二甲氧基苯基)-1-(((S)-1-((S)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)丁酰基)哌啶-2-羰基)氧基)丙基)苯氧基)乙酸(16.0mg， 0.0231mmol，1当量)于0.231mL DMF(0.1M)中的溶液。加入 DIPEA(12.1微升，0.0692mmol，3当量)和HATU(8.8mg，0.0231 mmol，1当量)，将混合物搅拌21小时。将混合物用EtOAc稀释，并用饱和碳酸氢钠，水和盐水洗涤。将有机层用硫酸钠干燥，过滤并减压下浓缩。通过柱色谱法纯化粗物质。

通过选择起始材料，上述合成图也可用于在本文的dFKBP结构中提供类似的邻位或对位键合构型，如下所示。任何这些位置异构体均可用于本发明中以降解FKBP。例如：

将产生

类似的用途：

将产生

合成例64：dFKBP-7的合成

将N-(3-(2-(2-(3-氨基丙氧基)乙氧基)乙氧基)丙基)-2-((2-(2,6- 二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸酯 (12.3mg，0.0189mmol，1当量)加入2-(3-((R)-3-(3,4-二甲氧基苯基)-1-(((S)-1-((S)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)丁酰基)哌啶-2-羰基)氧基) 丙基)苯氧基)乙酸(13.1mg，0.0189mmol，1当量)于0.189mLDMF(0.1M)中的溶液。加入DIPEA(9.9微升，0.0566mmol，3当量)和HATU(7.2mg，0.0189mmol，1当量)，将混合物搅拌17小时。将混合物用EtOAc稀释，并用饱和碳酸氢钠、水和盐水洗涤。将有机层用硫酸钠干燥，过滤并减压下浓缩。通过柱色谱法纯化粗物质。

合成例65：dFKBP-8的合成

将N-(6-氨基己基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸酯(12.7mg，0.0233mmol，1.3当量) 加入2-(3-((R)-3-(3,4-二甲氧基苯基)-1-(((S)-1-((S)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)丁酰基)哌啶-2-羰基)氧基)丙基)苯氧基)乙酸(12.4mg， 0.0179mmol，1当量)于0.233mL DMF(0.1M)的溶液。加入 DIPEA(9.3微升，0.0537mmol，3当量)和HATU(6.8mg，0.0179 mmol，1当量)，将混合物搅拌22小时。将混合物用EtOAc稀释，并用饱和碳酸氢钠、水和盐水洗涤。将有机层用硫酸钠干燥，过滤并减压下浓缩。通过柱色谱法纯化粗物质。

合成例66：dFKBP-9的合成

将N-(8-氨基辛基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚基-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸酯(10.4mg，0.0181mmol，1当量)加入2-(3-((R)-3-(3,4-二甲氧基苯基)-1–(((S)-1-((S)-2-(3,4,5-三甲氧基苯基)丁酰基)哌啶-2-羰基)氧基)丙基)苯氧基)乙酸(12.5mg， 0.0181mmol，1当量)于0.181mL DMF(0.1M)的溶液。加入 DIPEA(9.5微升，0.0543mmol，3当量)和HATU(6.9mg，0.0181 mmol，1当量)。混合物用EtOAc稀释，并用饱和碳酸氢钠，水和盐水洗涤。将有机层用硫酸钠干燥，过滤并减压下浓缩。通过柱色谱法纯化粗物质。

合成例67：dFKBP的合成

X2

在室温，将FKBP*-酸(14.0mg，0.0202mmol，1当量)和2-((2- (2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-氧代异吲哚啉-4-基)氨基)乙-1-铵2,2,2-三氟乙酸盐(8.7mg，0.0202mmol，1当量)溶于DMF(0.202mL， 0.1M)中。然后加入DIPEA(17.6μL，0.101mmol，5当量)和 HATU(7.6mg，0.0200mmol，1当量)，将混合物在室温搅拌过夜。将反应混合物溶于EtOAc(15mL)中，并用饱和NaHCO水溶液、 NaHCO₃(水性)(15mL)，水(15mL)和盐水(3x15mL)洗涤。将有机层用Na₂SO₄干燥并真空浓缩。通过柱色谱法纯化粗物质。

合成例68：二乙基乙酰基-O-沙利度胺三氟乙酸酯的合成

(1)(2-(2-氯乙酰氨基)乙基)氨基甲酸叔丁酯的合成

在0℃，将(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯(0.40mL，2.5mmol， 1当量)溶于THF(25mL，0.1M)和DIPEA(0.44mL，2.5mmol，1 当量)中。加入氯乙酰氯(0.21mL，2.75mmol，1.1当量)，将混合物温热至室温。22小时后，将混合物用EtOAc稀释并用饱和碳酸氢钠、水和盐水洗涤。用硫酸钠干燥有机层，过滤并减压下浓缩，得到白色固体(0.66g，定量收率)，其不经进一步纯化即可用于下一步骤。 ¹H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.16(s,1H),4.83(s,1H),4.04(s,2H), 3.42(q,J＝5.4Hz,2H),3.32(q,J＝5.6Hz,2H),1.45(s,9H). LCMS 237.30(M+H)。

(2)3-(2-((2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙基)氨基)-2-氧代乙氧基)邻苯二甲酸二甲酯的合成

将(2-(2-氯乙酰氨基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(0.66g，1当量)溶于 MeCN(17mL，0.15M)中。然后加入3-羟基邻苯二甲酸二甲酯 (0.578g，2.75mmol，1.1当量)和碳酸铯(2.24g，6.88mmol，2.75 当量)。将烧瓶配备回流冷凝器，并加热至80℃保持32小时。然后将混合物冷却至室温，用EtOAc稀释并用水洗涤三次。将有机层用硫酸钠干燥，过滤并减压下浓缩。通过柱色谱(ISCO，4g二氧化硅柱，0至15％MeOH/DCM，历经15分钟梯度)纯化，得到黄色固体 (0.394g，0.960mmol，38％，2步骤)。¹H NMR(400MHz,氯仿-d) δ7.65–7.56(m,1H),7.50–7.41(m,1H),7.27(s,1H),7.11(dd,J ＝8.4,4.1Hz,2H),5.17(s,1H),4.57(d,J＝6.3Hz,2H),3.94(s, 2H),3.88(s,2H),3.40(p,J＝5.8Hz,4H),3.32–3.19(m,4H),1.39(d,J＝5.7Hz,13H).¹³C NMR(100MHz,cdcl₃)δ168.37,168.23, 165.73,156.13,154.71,131.24,130.09,124.85,123.49,117.24, 79.42,68.48,53.22,52.83,40.43,39.54,28.44.LCMS 411.45(M+H)。

(3)二乙基乙酰基-O-沙利度胺三氟乙酸酯的合成

将3-(2-((2-((叔丁氧基羰基)氨基)乙基)氨基)-2-氧代乙氧基)邻苯二甲酸二甲酯(0.39g，0.970mmol，1当量)溶于EtOH(9.7mL， 0.1M)中。加入3M NaOH水溶液(0.97mL，2.91mmol，3当量)，将混合物加热3小时至80℃。将混合物冷却至室温，用50mL DCM、 5mL1M HCl和20mL水稀释。分离各层，有机层用20mL水洗涤。然后将合并的水层用50mL氯仿萃取3次。将合并的有机层用硫酸钠干燥，过滤并减压下浓缩，得到黄色固体(0.226g)，其不经进一步纯化而继续使用。LCMS 383.36。

将得到的黄色固体(0.226g)和3-氨基哌啶-2,6-二酮盐酸盐 (0.102g，0.6197mmol，1当量)溶于吡啶(6.2mL，0.1M)中，并加热 16小时至110℃。将混合物冷却至室温并减压下浓缩，得到(2-(2- ((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰氨基)乙基)氨基甲酸叔丁酯，为难溶性黑色焦油(0.663g)，其不经纯化而继续进行(因溶解性差)。LCMS 475.42(M+H)。

将粗制的(2-(2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-氧代异吲哚啉- 4-基)氧基)乙酰氨基)乙基)氨基甲酸叔丁酯溶于TFA(10mL)，并加热3.5小时至50℃，然后减压下浓缩。通过制备型HPLC纯化，得到红色油状物(176.7mg，0.362mmol，3步骤，收率37％)。¹HNMR(400MHz,甲醇-d₄)δ7.85–7.76(m,1H),7.57–7.50(m,1H), 7.48–7.41(m,1H),5.13(dd,J＝12.6,5.5Hz,1H),4.81(s,2H), 3.62(td,J＝5.6,1.8Hz,2H),3.14(t,J＝5.8Hz,2H),2.97(s,1H), 2.80–2.66(m,2H),2.15(dddd,J＝10.1,8.0,5.8,2.8Hz,1H).¹³C NMR(100MHz,cd₃od)δ173.09,170.00,169.99,166.78,166.62, 154.93,136.88,133.46,120.71,117.93,116.77,68.29,49.17,39.37, 38.60,30.73,22.19.LCMS 375.30(游离碱的M+H)。

合成例69：二氨基丁基-乙酰基-O-沙利度胺三氟乙酸盐的合成

根据Fischer et al.Nature,2014,512,49–53中的方法制备二氨基丁基-乙酰基-O-沙利度胺三氟乙酸酯。

合成例70：二氨基己基-乙酰基-O-沙利度胺三氟乙酸酯的合成

(1)(6-(2-氯乙酰氨基)己基)氨基甲酸叔丁酯的合成

将(6-氨基己基)氨基甲酸叔丁酯(0.224mL，1.0mmol，1当量) 溶于THF(10mL，0.1M)。加入DIPEA(0.17mL，1.0mmol，1当量)，将混合物冷却至0℃。加入氯乙酰氯(88微升，1.1mmol，1.1 当量)，将混合物温热至室温并搅拌18小时。然后将混合物用 EtOAc稀释并用饱和碳酸氢钠，水和盐水洗涤。将有机层用硫酸钠干燥，过滤并减压下浓缩，得到白色固体(0.2691g，0.919mmol， 92％)。¹H NMR(400MHz,氯仿-d)δ6.60(s,1H),4.51(s,1H),4.05(s,2H),3.30(q,J＝6.9Hz,2H),3.11(d,J＝6.7Hz,2H),1.57– 1.46(m,4H),1.44(s,9H),1.38–1.32(m,4H).LCMS 293.39 (M+H)。

(2)3-(2-((6-((叔丁氧基羰基)氨基)己基)氨基)-2-氧代乙氧基)邻苯二甲酸二甲酯的合成

将(6-(2-氯乙酰氨基)己基)氨基甲酸叔丁酯(0.2691g，0.919 mmol，1当量)溶于MeCN(9.2mL，0.1M)。加入3-羟基邻苯二甲酸二甲酯(0.212g，1.01mmol，1.1当量)和碳酸铯(0.823g，2.53mmol， 2.75当量)。将烧瓶配备回流冷凝器并加热至80℃保持14小时。将混合物冷却至室温并用EtOAc稀释，用水洗涤三次并用EtOAc反萃取一次。将合并的有机层用硫酸钠干燥，过滤并减压下浓缩。通过柱色谱(ISCO，12g二氧化硅柱，至15％MeOH/DCM，15分钟梯度)纯化粗物质，得到黄色油状物(0.304g，0.651mmol，71％)。¹H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.66–7.58(m,1H),7.44(td,J＝8.2,1.6 Hz,1H),7.15–7.08(m,1H),6.96(s,1H),4.56(s,2H),3.92(t,J＝ 1.6Hz,3H),3.88(t,J＝1.6Hz,3H),3.27(q,J＝6.9Hz,2H),3.10–3.00(m,2H),1.41(s,13H),1.33–1.22(m,4H).¹³C NMR(100MHz, cdcl₃)δ167.97,167.37,165.58,155.95,154.37,130.97,129.74, 124.94,123.26,116.81,78.96,68.04,52.89,52.87,52.69,52.67, 40.41,38.96,29.88,29.13,28.39,26.33,26.30.LCMS 467.49。

(3)二氨基己基-乙酰基-O-沙利度胺三氟乙酸酯的合成

将3-(2-((6-((叔丁氧基羰基)氨基)己基)氨基)-2-氧代乙氧基)邻苯二甲酸二甲酯(0.304g，0.651mmol，1当量)溶于EtOH(6.5mL， 0.1M)。加入3M NaOH水溶液(0.65mL，1.953mmol，3当量)，将混合物加热18小时至80℃。将混合物冷却至室温并用50mL DCM 和10mL 0.5M HCl稀释。分离各层，有机层用20mL水洗涤。然后将合并的水层用氯仿萃取3次。将合并的有机层用硫酸钠干燥，过滤并减压下浓缩，得到黄色泡沫(0.290g)，其不经进一步纯化而继续使用LCMS 439.47。

将得到的黄色固体(0.290g)和3-氨基哌啶-2,6-二酮盐酸盐 (0.113g，0.69mmol，1当量)溶于吡啶(6.9mL，0.1M)，并加热17 小时至110℃。将混合物冷却至室温并减压下浓缩，得到(6-(2-((2- (2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰氨基)己基氨基甲酸叔丁酯，为黑色固体(0.4216g)，其未经纯化而继续进行(因溶解性差)。LCMS 531.41(M+H)。

将粗制的(6-(2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-氧代异吲哚啉-4- 基)氧基)乙酰氨基)己基)氨基甲酸叔丁酯(0.4216g)溶于TFA(10mL) 中，并加热2小时至50℃。减压下浓缩混合物，然后减压下浓缩。通过制备型HPLC纯化，得到棕色固体(379.2mg)。¹H NMR(400 MHz,甲醇-d₄)δ7.79(dd,J＝8.4,7.4Hz,1H),7.52(d,J＝7.2Hz, 1H),7.42(d,J＝8.4Hz,1H),5.13(dd,J＝12.6,5.5Hz,1H),4.75(s, 2H),3.32(t,J＝7.6Hz,2H),2.96–2.89(m,2H),2.89–2.65(m, 3H),2.16(ddt,J＝10.4,5.4,2.9Hz,1H),1.63(dp,J＝20.6,7.1Hz,4H),1.51–1.34(m,4H).¹³C NMR(100MHz,cd₃od)δ174.57, 171.42,169.90,168.24,167.79,156.23,138.23,134.87,121.69, 119.22,117.98,69.36,50.53,40.64,39.91,32.14,30.01,28.44, 27.23,26.96,23.63.LCMS 431.37(M+H)。

合成例71：二氨基辛基-乙酰基-O-沙利度胺三氟乙酸酯的合成

(1)(8-(2-氯乙酰氨基)辛基)氨基甲酸叔丁酯的合成

将辛烷-1,8-二胺(1.65g，11.45mmol，5当量)溶于氯仿(50mL)。在室温缓慢加入二碳酸二叔丁酯(0.54g，2.291mmol，1当量)于氯仿 (10mL)溶液，搅拌16小时，然后减压下浓缩。将固体物质重新悬浮在DCM、MeOH、EtOAc和0.5N NH₃(MeOH)的混合物中，通过硅藻土过滤并减压下浓缩。通过柱色谱(ISCO，12g NH₂-二氧化硅柱， 0至15％MeOH/DCM，15分钟梯度)纯化，得到所需产物和原料的混合物(1.75g)，其不经进一步纯化而继续使用。

将该混合物溶于THF(72mL)和DIPEA(1.25mL，7.16mmol) 中，并冷却至0℃。加入氯乙酰氯(0.63mL，7.88mmol)，将混合物温热至室温。16小时后，将混合物用EtOAc稀释，并用饱和碳酸氢钠、水和盐水洗涤。通过柱色谱(ISCO，在二氧化硅上干燥负载，24 g柱，0至100％EtOAc/己烷，经21分钟梯度)纯化得到的混合物，得到白色固体(0.56g，1.745mmol，76％，2步骤)。¹H NMR(400 MHz,氯仿-d)δ6.55(s,1H),4.48(s,1H),4.05(s,2H),3.30(q,J＝ 6.9Hz,2H),3.10(d,J＝6.2Hz,2H),1.44(s,12H),1.31(s,9H).¹³C NMR(100MHz,cdcl₃)δ165.86,156.14,77.36,42.86,40.73,40.00, 30.18,29.44,29.26,28.59,26.86,26.82.LCMS 321.34(M+H)。

(2)3-(2-((8-((叔丁氧基羰基)氨基)辛基)氨基)-2-氧代乙氧基)邻苯二甲酸二甲酯的合成

将(8-(2-氯乙酰氨基)辛基)氨基甲酸叔丁酯(0.468g，1.46mmol， 1当量)溶于MeCN(15mL，0.1M)。加入3-羟基邻苯二甲酸二甲酯 (0.337g，1.60mmol，1.1当量)和碳酸铯(1.308g，4.02mmol，2.75 当量)。将烧瓶配备回流冷凝器，并加热18小时至80℃。将混合物冷却至室温并用水稀释，用氯仿萃取一次，用EtOAc萃取两次。将合并的有机层用硫酸钠干燥，过滤并减压下浓缩。

通过柱色谱(ISCO，24g二氧化硅柱，0至15％MeOH/DCM， 20分钟梯度)纯化粗物质，得到黄色油状物(0.434g，0.878mmol， 60％)。¹H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.57(dd,J＝7.9,0.8Hz,1H), 7.40(t,J＝8.1Hz,1H),7.07(dd,J＝8.4,0.7Hz,1H),6.89(t,J＝ 5.3Hz,1H),4.63(s,1H),4.52(s,2H),3.88(s,3H),3.83(s,3H), 3.22(q,J＝6.9Hz,2H),3.01(q,J＝6.4Hz,2H),1.36(s,12H),1.20 (s,9H).¹³C NMR(100MHz,cdcl₃)δ167.89,167.29,165.54,155.97, 154.38,130.95,129.69,124.96,123.23,116.86,78.82,68.05,52.83, 52.82,52.66,52.64,40.54,39.06,29.97,29.19,29.10,29.06,28.40, 26.66,26.61.LCMS495.42(M+H).

(3)二氨基辛基-乙酰基-O-沙利度胺三氟乙酸酯的合成

将3-(2-((8-((叔丁氧基羰基)氨基)辛基)氨基)-2-氧代乙氧基)邻苯二甲酸二甲酯(0.434g，0.878mmol，1当量)溶于EtOH(8.8mL， 0.1M)。加入3M NaOH水溶液(0.88mL，2.63mmol，3当量)，将混合物加热24小时至80℃。将混合物冷却至室温并用50mL DCM 和10mL 0.5M HCl稀释。分离各层，将有机层用20mL水洗涤。然后将合并的水层用氯仿萃取3次。将合并的有机层用硫酸钠干燥，过滤并减压下浓缩，得到黄色固体(0.329g)，其不经进一步纯化而继续使用。LCMS 467.41。

将得到的黄色固体(0.329g)和3-氨基哌啶-2,6-二酮盐酸盐 (0.121g，0.734mmol，1当量)溶于吡啶(7.3mL，0.1M)，并加热 20小时至110℃。将混合物冷却至室温并减压下浓缩，得到(8-(2- ((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰氨基)辛基)氨基甲酸叔丁酯，为黑色焦油状物(0.293g)，其未经纯化而继续使用(因溶解性差)。LCMS 559.45(M+H)。

将粗制的(8-(2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-氧代异吲哚啉-4- 基)氧基)乙酰氨基)辛基)氨基甲酸叔丁酯(0.293g)溶于TFA(10mL)，并加热4小时至50℃。减压下浓缩混合物，然后减压下浓缩。通过制备型HPLC纯化，得到棕色残余物(114.69mg，23％，3步骤)。 ¹H NMR(400MHz,甲醇-d₄)δ7.84–7.78(m,1H),7.54(d,J＝7.3 Hz,1H),7.43(d,J＝8.5Hz,1H),5.13(dd,J＝12.5,5.5Hz,1H), 4.76(s,2H),3.32(d,J＝4.1Hz,1H),3.30(d,J＝3.3Hz,1H),2.94 –2.84(m,3H),2.80–2.70(m,2H),2.19–2.12(m,1H),1.67–1.55 (m,4H),1.40–1.34(m,8H).¹³C NMR(100MHz,cd₃od)δ174.57, 171.37,169.85,168.26,167.78,156.26,138.22,134.91,121.70, 119.28,117.97,69.37,50.57,40.76,40.08,32.17,30.19,30.05, 30.01,28.52,27.68,27.33,23.63.LCMS 459.41(M+H)。

合成例72：N-(3-(2-(2-(3-氨基丙氧基)乙氧基)乙氧基)丙基)-2-((2- (2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸酯的合成

将(3-(2-(2-(3-氨基丙氧基)乙氧基)乙氧基)丙基)氨基甲酸叔丁酯 (1.0g，3.12mmol，1当量)溶于THF(31mL，0.1M)。加入 DIPEA(0.543mL，3.12mmol，1当量)，将溶液冷却至0℃。加入氯乙酰氯(0.273mL，3.43mmol，1.1当量)，将混合物缓慢温热至室温。24小时后，将混合物用EtOAc稀释，用饱和碳酸氢钠、水和盐水洗涤。将有机层用硫酸钠干燥，过滤并浓缩，得到黄色油状物 (1.416g)，其不经进一步纯化而继续使用。¹H NMR(400MHz,氯仿 -d)δ7.24(s,1H),5.00(s,1H),3.98–3.89(m,2H),3.54(dddt,J＝ 17.0,11.2,5.9,2.2Hz,10H),3.47–3.40(m,2H),3.37–3.31(m, 2H),3.17–3.07(m,2H),1.79–1.70(m,2H),1.67(p,J＝6.1Hz, 2H),1.35(s,9H).¹³C NMR(100MHz,cdcl₃)δ165.83,155.97, 78.75,70.49,70.47,70.38,70.30,70.14,69.48,42.61,38.62,38.44, 29.62,28.59,28.40.LCMS397.37(M+H)。

将(1-氯-2-氧代-7,10,13-三氧杂-3-氮杂十六烷-16-基)氨基甲酸叔丁酯(1.41g，3.12mmol，1当量)溶于MeCN(32mL，0.1M)。加入3-羟基邻苯二甲酸二甲酯(0.721g，3.43mmol，1.1当量)和碳酸铯 (2.80g，8.58mmol，2.75当量)。将烧瓶配备回流冷凝器，并加热 19小时至80℃。将混合物冷却至室温并用水稀释，用氯仿萃取一次，用EtOAc萃取两次。将合并的有机层用硫酸钠干燥，过滤并减压下浓缩。通过柱色谱(ISCO，24g二氧化硅柱，0至15％MeOH/DCM， 22分钟梯度)纯化粗物质，得到黄色油状物(1.5892g，2.78mmol， 89％，两步骤)。¹H NMR(400MHz,氯仿-d)δ7.52(d,J＝7.8Hz, 1H),7.35(t,J＝8.1Hz,1H),7.04(d,J＝8.3Hz,1H),7.00(t,J＝ 5.3Hz,1H),5.06(s,1H),4.46(s,2H),3.83(s,3H),3.78(s,3H), 3.47(ddd,J＝14.9,5.5,2.8Hz,8H),3.39(dt,J＝9.4,6.0Hz,4H), 3.29(q,J＝6.5Hz,2H),3.09(d,J＝6.0Hz,2H),1.70(p,J＝6.5Hz, 2H),1.63(p,J＝6.3Hz,2H),1.31(s,9H).¹³C NMR(100MHz, cdcl₃)δ167.68,167.36,165.45,155.93,154.41,130.87,129.60, 125.01,123.20,117.06,78.60,70.40,70.17,70.06,69.39,68.67, 68.25,52.77,52.57,38.38,36.58,29.55,29.20,28.34.LCMS 571.47 (M+H)。

(3)N-(3-(2-(2-(3-氨基丙氧基)乙氧基)乙氧基)丙基)-2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸盐的合成

将3-((2,2-二甲基-4,20-二氧代-3,9,12,15-四氧杂-5,19-二氮杂二十二烷-3-21-基)氧基)邻苯二甲酸二甲酯(1.589g，2.78mmol，1当量)溶于EtOH(14mL，0.2M)。加入3MNaOH水溶液(2.8mL，8.34 mmol，3当量)，将混合物加热22小时至80℃。然后将混合物冷却至室温，用50mL DCM和20mL 0.5M HCl稀释。分离各层，将有机层用25mL水洗涤。合并水层，用50mL氯仿萃取三次。将合并的有机溶剂用硫酸钠干燥，过滤并浓缩，得到1.53g物质，其不经进一步纯化而继续使用。LCMS 553.44。

将所得物质(1.53g)和3-氨基哌啶-2,6-二酮盐酸盐(0.480g， 2.92mmol，1当量)溶于吡啶(11.7mL，0.25M)，并加热17小时至 110℃。将混合物冷却至室温并减压下浓缩，得到粗制的(1-((2-(2,6- 二氧代哌啶-3-基)-1,3-氧代异吲哚啉-4-基)氧基)-2-氧代-7,10,13-三氧杂-3-氮杂十六烷-16-基)氨基甲酸叔丁酯，为黑色污泥(3.1491g)，其不经进一步纯化而继续使用。LCMS 635.47。

将粗制的(1-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-氧代异吲哚啉-4-基) 氧基)-2-氧代-7,10,13-三氧杂-3氮杂十六烷-16-基)氨基甲酸叔丁酯 (3.15g)溶于TFA(20mL)中，并加热2.5小时至50℃。将混合物冷却至室温，用MeOH稀释并减压下浓缩。通过制备型HPLC纯化该物质，得到N-(3-(2-(2-(3-氨基丙氧基)乙氧基)乙氧基)丙基)-2-((2-(2,6- 二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酰胺三氟乙酸酯 (1.2438g，1.9598mmol，71％，3步骤)，为深红色油状物。¹H NMR(400MHz,甲醇-d₄)δ7.77(dd,J＝8.3,7.5Hz,1H),7.49(d,J ＝7.3Hz,1H),7.40(d,J＝8.5Hz,1H),5.12(dd,J＝12.8,5.5Hz,1H),4.75(s,2H),3.68–3.51(m,12H),3.40(t,J＝6.8Hz,2H),3.10 (t,J＝6.4Hz,2H),2.94–2.68(m,3H),2.16(dtd,J＝12.6,5.4,2.5 Hz,1H),1.92(p,J＝6.1Hz,2H),1.86–1.77(m,2H).¹³C NMR (100MHz,cd₃od)δ173.17,169.97,168.48,166.87,166.30,154.82,136.89,133.41,120.29,117.67,116.58,69.96,69.68,69.60,68.87, 68.12,67.92,49.19,38.62,36.14,30.80,28.92,26.63,22.22.LCMS 536.41(M+H)。

合成例73：N-(6-氨基己基)-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-5-甲酰胺的合成

(1)2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-5-羧酸的合成

将1,3-二氧代-1,3-二氢异苯并呋喃-5-羧酸(0.192g，1mmol，1 当量)和3-氨基哌啶-2,6-二酮盐酸盐(0.165g，1mmol，1当量)溶于 DMF(2.5mL)和乙酸(5mL)，并加热24小时至80℃。然后将混合物减压下浓缩并用EtOH稀释，从中缓慢形成沉淀物。将沉淀物用 EtOH洗涤两次，得到白色固体(84.8mg，0.28mmol，28％)。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ13.74(s,1H),11.12(s,1H),8.39(dd, J＝7.8,1.4Hz,1H),8.26(s,1H),8.04(d,J＝7.8Hz,1H),5.18(dd, J＝12.8,5.4Hz,1H),2.93–2.88(m,1H),2.84(d,J＝4.7Hz,0H), 2.66–2.50(m,2H),2.12–1.99(m,1H).LCMS 303.19(M+H).

(2)(6-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-5-甲酰胺基)己基)氨基甲酸叔丁酯的合成

将2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-5-羧酸(22.7 mg，0.0751mmol，1当量)和HATU(31.4mg，0.0826mmol，1.1 当量)溶于DMF(0.75mL)。5分钟后，加入DIPA(39.2微升，0.225 mmol，3当量)。再过5分钟后，加入(6-氨基己基)氨基甲酸叔丁酯(19.5mg，0.0901mmol，1.2当量)于DMF(0.75mL)的溶液。将混合物搅拌20小时，然后用EtOAc稀释。将有机层用盐水洗涤三次，经硫酸钠干燥并减压下浓缩。通过柱色谱(ISCO，4g柱，0至10％ MeOH/DCM，25分钟梯度)纯化，得到黄色油状物(17.18mg， 0.03432mmol，46％)。¹H NMR(400MHz,氯仿-d)δ8.29(d,J＝ 6.2Hz,2H),8.16(s,1H),7.94(d,J＝8.4Hz,1H),6.91(s,1H),5.00 (dd,J＝12.4,5.3Hz,1H),4.58(s,1H),3.47(q,J＝6.7Hz,2H),3.14(q,J＝8.5,7.3Hz,2H),2.97–2.69(m,3H),2.17(ddd,J＝10.4, 4.8,2.6Hz,1H),1.65(p,J＝6.9Hz,2H),1.53–1.32(m,15H).¹³C NMR(100MHz,cdcl₃)δ174.69,170.77,167.86,166.67,165.27, 156.49,141.06,133.95,133.71,132.13,124.21,122.27,77.36,49.71,39.75,31.54,30.27,29.22,28.57,25.70,25.37,22.73.LCMS 501.28 (M+H)。

(3)N-(6-氨基己基)-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-5- 甲酰胺的合成

将(6-(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-5-甲酰胺基) 己基)氨基甲酸叔丁酯(17.18mg，0.343mmol，1当量)溶于TFA(1 mL)，并加热2小时至50℃。减压下浓缩混合物，得到黄色油状物 (13.29mg)，其纯度被认为足够，无需进一步纯化。¹H NMR(400MHz,甲醇-d₄)δ8.27(dd,J＝9.3,1.3Hz,2H),7.99(d,J＝7.6Hz, 1H),5.18(dd,J＝12.5,5.4Hz,1H),3.48–3.40(m,2H),2.96–2.84 (m,3H),2.76(ddd,J＝17.7,8.1,3.7Hz,2H),2.20–2.12(m,1H), 1.75–1.63(m,4H),1.53–1.43(m,4H).LCMS 401.31(M+H)。

合成例74：2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基) 氧基)乙酸的合成

(1)2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-羟基异吲哚啉-1,3-二酮的合成

将4-羟基异苯并呋喃-1,3-二酮(0.773g，4.71mmol，1当量)和 3-氨基哌啶-2,6-二酮盐酸盐(0.775g，4.71mmol，1当量)溶于吡啶 (19mL)中，并加热16小时至110℃。将混合物减压下浓缩，并通过柱色谱(ISCO，12g硅胶柱，0至10％MeOH/DCM，25分钟梯度) 纯化，得到灰白色固体(1.14g，4.16mmol，88％)。¹H NMR(400 MHz,DMSO-d₆)δ11.19(s,1H),11.07(s,1H),7.65(dd,J＝8.3,7.3 Hz,1H),7.31(d,J＝7.2Hz,1H),7.24(d,J＝8.4Hz,1H),5.07(dd, J＝12.8,5.4Hz,1H),2.88(ddd,J＝17.7,14.2,5.4Hz,1H),2.63– 2.50(m,2H),2.11–1.95(m,1H).LCMS 275.11(M+H)。

(2)2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酸叔丁酯的合成

将2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-羟基异吲哚啉-1,3-二酮(218.8mg， 0.798mmol，1当量)溶于DMF(8mL)。加入碳酸钾(165.9mg， 1.20mmol，1.5当量)，然后加入溴乙酸叔丁酯(118微升，0.798 mmol，1当量)，将混合物在室温搅拌3小时。将混合物用EtOAc稀释，用水洗涤一次，和用盐水洗涤两次。通过柱色谱(ISCO，12g硅胶柱，0至100％EtOAc/己烷，17分钟梯度)纯化，得到白色固体(0.26g，0.669mmol，84％)。¹H NMR(400MHz,氯仿-d)δ8.74(s,1H),7.61(dd,J＝8.4,7.3Hz,1H),7.46–7.41(m,1H),7.06(d,J＝ 8.3Hz,1H),4.98–4.92(m,1H),4.74(s,2H),2.83–2.69(m,3H), 2.12–2.04(m,1H),1.43(s,9H).¹³C NMR(100MHz,cdcl₃)δ 171.58,168.37,166.96,166.87,165.49,155.45,136.27,133.89, 119.78,117.55,116.83,83.05,66.52,49.20,31.37,28.03,22.55. LCMS 411.23(M+Na)。

(3)2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氧基)乙酸的合成

在室温，将2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-氧代异吲哚啉-4- 基)氧基)乙酸叔丁酯(47.5mg，0.122mmol，1当量)溶于TFA(1.3 mL)。3小时后，将混合物用DCM稀释，并在减压下浓缩，得到白色固体(42.27mg)，其纯度被认为足够，无需进一步纯化。¹H NMR(400MHz,甲醇-d₄)δ7.76(dd,J＝8.5,7.3Hz,1H),7.50(d,J＝7.3 Hz,1H),7.34(d,J＝8.5Hz,1H),5.11(dd,J＝12.5,5.5Hz,1H), 4.96(s,2H),2.87(ddd,J＝17.8,14.2,5.0Hz,1H),2.80–2.65(m, 2H),2.18–2.09(m,1H).LCMS 333.15(M+H).

异双功能化合物药物组合物

在本申请的另一个方面，提供了药物组合物，其包含本文所述的异双功能性化合物中的任一者(或前药、药学上可接受的盐或其它药学上可接受的衍生物)，并任选地包含药学上可接受的载体。根据本申请，药学上可接受的衍生物包括但不限于药学上可接受的盐、酯、这些酯的盐、或本申请化合物的前药或其它加合物或衍生物，其在向有需要的患者给药时，能够直接或间接地提供如本文中另外描述的异双功能性化合物、或其代谢物或残余物。

如本文所用，术语“药学上可接受的盐”是指彼等在合理的医学判断范围内适合用于与人类和低等动物的组织接触而没有过度毒性，刺激，过敏反应等，并与合理的利益/风险比相称的盐。胺、羧酸和其他类型化合物的药学上可接受的盐是本领域熟知的。例如，S.M.Berge等人在J Pharmaceutical Sciences 66(1977):1-19中详细描述了药学上可接受的盐，其通过引入方式并入本文。盐可以在本申请的异双功能性化合物的最终单离和纯化过程中原位制备，或者通过使游离碱或游离酸官能团与合适的试剂反应而单独制备，如下文所述。例如，游离碱官能团可以与合适的酸反应。此外，当本申请的异双功能性化合物带有酸性部分时，其合适的药学上可接受的盐可以包括金属盐，例如碱金属盐，例如碱金属盐，如钠盐或钾盐；和碱土金属盐，例如钙或镁盐。药学上可接受的无毒酸加成盐的实例是与无机酸，如盐酸，氢溴酸，磷酸，硫酸和过氯酸或与有机酸如乙酸，草酸，马来酸，酒石酸，柠檬酸，琥珀酸或丙二酸形成的氨基的盐，或通过使用本领域中使用的其他方法如离子交换形成的氨基的盐。其他药学上可接受的盐包括己二酸盐，藻酸盐，抗坏血酸盐，天冬氨酸盐，苯磺酸盐，苯甲酸盐，硫酸氢盐，硼酸盐，丁酸盐，樟脑酸盐，樟脑磺酸盐，柠檬酸盐，丙酸环戊烷，二葡糖酸盐，十二烷基硫酸盐，乙磺酸盐，甲酸盐，富马酸盐，葡庚糖酸盐，甘油磷酸盐，葡萄糖酸盐，半硫酸盐，庚酸盐，己酸盐，氢碘酸盐，2-羟基-乙磺酸盐，乳糖酸盐，乳酸盐，月桂酸盐，月桂基硫酸盐，苹果酸盐，马来酸盐，丙二酸盐，甲磺酸盐，2-萘磺酸盐，烟酸盐，硝酸盐，油酸盐，草酸盐，棕榈酸盐，双羟萘酸盐，果胶酸盐，过硫酸盐，3-苯基丙酸盐，磷酸盐，苦味酸盐，新戊酸盐，丙酸盐，硬脂酸盐，琥珀酸盐，硫酸盐，酒石酸盐，硫氰酸盐，对甲苯磺酸盐，十一酸盐，戊酸盐等。代表性的碱金属或碱土金属盐包括钠，锂，钾，钙，镁等。适当时，其它药学上可接受的盐包括使用抗衡离子如卤根，氢氧根，羧酸根，硫酸根，磷酸根，硝酸根，低级烷基磺酸根和芳基磺酸根形成的无毒铵，季铵和胺阳离子。

另外，如本文所用，术语“药学上可接受的酯”是指在体内水解的酯，包括在人体中容易分解以留下母体异双功能性化合物或其盐的酯。合适的酯基包括，例如，彼等衍生自药学上可接受的脂族羧酸，特别是链烷酸，链烯酸，环烷酸和链烷二酸者，其中每个烷基或链烯基部分有利地具有不超过6个碳原子。特定酯的实例包括甲酸酯，乙酸酯，丙酸酯，丁酸酯，丙烯酸酯和乙基丁二酸酯。

此外，如本文所用的术语“药学上可接受的前药”是指彼等本申请的异双功能性化合物的前药，其在合理的医学判断范围内，适合用于与人类和低等动物的过度毒性，刺激，过敏反应等的问题接触，与合理的益处/风险比相称，并且对其所欲用途有效，以及在可能的情况下，本申请化合物的两性离子形式仍对其所欲用途有效。术语“前药”是指在体内快速转化以产生上式的母体化合物的化合物，例如通过在血液中水解。T.HiguchiandV.Stella,Pro-drugs as Novel Delivery Systems,Vol.14 of the A.C.S.SymposiumSeries，以及 Edward B.Rocheed.,Bioreversible Carriers in Drug Design, AmericanPharmaceutical Association and Pergamon Press，(1987) 中提供透彻的讨论，两者都通过引用方式并入本文。

如上所述，本申请的药物异双功能性化合物组合物另外包含药学上可接受的载体，如本文所用，其包括适合于所需的特定剂型的任何和所有溶剂，稀释剂或其他液体载剂，分散或悬浮助剂，表面活性剂，等渗剂，增稠剂或乳化剂，防腐剂，固体粘合剂，润滑剂等， Remington's Pharmaceutical Sciences,Sixteenth Edition,E.W. Martin(MackPublishing Co.,Easton,Pa.,(1980))揭露了用于配制药物组合物的各种载体和用于其制备的已知技术。除非任何常规载体介质与本申请的化合物不相容，例如通过产生任何不希望的生物效应或以有害的方式与药物组合物的任何其他组分相互作用，否则其用途被认为是在本申请的范畴。可用作药学上可接受的载体的材料的一些实例包括但不限于糖，如乳糖，葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠，乙基纤维素和醋酸纤维素；粉末黄蓍草；麦芽；明胶；滑石；辅料，如可可脂和栓剂蜡；油脂，如花生油，棉籽油；红花油，芝麻油；橄榄油；玉米油和豆油；乙二醇；如丙二醇；酯类，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原水；渗盐水，如林格氏液；乙醇和磷酸盐缓冲溶液，以及其他无毒相容润滑剂，如十二烷基硫酸钠和硬脂酸镁，以及着色剂，脱模剂，涂层剂，甜味剂，调味剂和芳香剂，防腐剂和抗氧化剂也可以根据配方设计师的判断，而存在于组合物中。

用于口服给药的液体剂型包括但不限于药学上可接受的乳液，微乳液，溶液，悬浮液，糖浆和酏剂。除活性化合物外，液体剂型可含有本领域常用的惰性稀释剂，例如水或其它溶剂，增溶剂和乳化剂，如乙醇，异丙醇，碳酸乙酯，乙酸乙酯，苄醇，苯甲酸苄酯，丙二醇， 1,3-丁二醇，二甲基甲酰胺，油(特别是棉籽油，花生油，玉米油，胚芽油，橄榄油，蓖麻油和芝麻油)，甘油，四氢糠醇，聚乙二醇和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯及其混合物。除惰性稀释剂外，口服组合物还可包括佐剂，如润湿剂，乳化剂和悬浮剂，甜味剂，调味剂和芳香剂。

可以使用合适的分散剂或湿润剂和悬浮剂根据已知技术配制可注射制剂，例如无菌可注射水性或油性悬浮液。无菌可注射制剂还可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液、悬浮液或乳液，例如在1,3-丁二醇中的溶液。可以使用的可接受的载体和溶剂是水、林格氏溶液、U.S.P和等渗氯化钠溶液。另外，无菌的固定油通常用作溶剂或悬浮介质。为此目的，可以使用任何温和的固定油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。此外，脂肪酸如油酸用于制备注射剂。

可注射制剂可以灭菌，例如，通过细菌截留过滤器过滤，或通过并入无菌固体组合物形式的灭菌剂，其可以在使用前溶解或分散在无菌水或其它无菌可注射介质中。

为了延长药物的作用，通常需要减缓皮下或肌内注射的药物吸收。这可以通过使用液体悬浮液或水溶性差的结晶或无定形材料来实现。然后，药物的吸收速率取决于其溶解速率，而溶解速率又取决于晶体大小和晶形。或者，通过将药物溶解或悬浮在油性载体中来实现胃肠外给药的药物形式的延迟吸收。通过在可生物降解的聚合物如聚丙交酯-聚乙交酯中形成药物的微囊基质来制备可注射的储库形式 (depot)。取决于药物与聚合物的比率和所用特定聚合物的性质，可以控制药物释放速率。其他可生物降解的聚合物的实例包括聚(原酸酯)和聚(酸酐)。还通过将药物包埋在与身体组织相容的脂质体或微乳液中来制备储库型可注射制剂。

用于直肠或***给药的组合物优选是栓剂，其可以通过将本申请的化合物与合适的无刺激性赋形剂或载体如可可脂、聚乙二醇或栓剂蜡混合而制备，该载体在环境温度是固体，但在体温是液体，因此在直肠或***腔内融化并释放出活性化合物。

用于口服给药的固体剂型包括囊剂，片剂，丸剂，粉剂和粒剂。在这种固体剂型中，活性化合物与至少一种惰性、药学上可接受的赋形剂或载体如柠檬酸钠或磷酸二钙和/或a)填充剂或增量剂，如淀粉，乳糖，蔗糖，葡萄糖，甘露醇和硅酸，b)粘合剂，如羧甲基纤维素，藻酸盐，明胶，聚乙烯吡咯烷酮，蔗糖和***胶，c)保湿剂，如甘油，d)崩解剂，如琼脂，碳酸钙，马铃薯或木薯淀粉，海藻酸，某些硅酸盐和碳酸钠，e)溶液延迟剂，如石蜡，f)吸收促进剂，如季铵化合物，g)润湿剂，如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯，h)吸收剂，如高岭土和膨润土，和i)润滑剂，如滑石，硬脂酸钙，硬脂酸镁，固体聚乙二醇，十二烷基硫酸钠及其混合物。在囊剂，片剂和丸剂的情况下，剂型还可包含缓冲剂。

类似类型的固体组合物也可用作软和硬填充的明胶囊剂中的填充剂，其使用诸如乳糖或奶糖以及高分子量聚乙二醇等赋形剂。片剂，糖衣丸，胶囊，丸剂和粒剂的固体剂型可以用包衣和外壳制备，例如肠溶包衣和药物配制领域熟知的其它包衣。它们可以任选地含有遮光剂，并且还可以是仅在肠道的某一部分或优选地以延迟的方式在肠道的某一部分释放活性成分的组合物。

可以使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。类似类型的固体组合物也可用作软和硬填充的明胶囊剂中的填充剂，其使用诸如乳糖或奶糖以及高分子量聚乙二醇等赋形剂。

活性异双功能性化合物也可以是具有一种或多种上述赋形剂的微胶囊形式。片剂，糖衣丸，胶囊，丸剂和粒剂的固体剂型可以用包衣和外壳制备，例如肠溶包衣，释放控制包衣和药物配制领域熟知的其它包衣。在这种固体剂型中，活性异双功能性化合物可以与至少一种惰性稀释剂如蔗糖，乳糖和淀粉掺合。正常情况下，这些剂型还可包含除惰性稀释剂以外的其它物质，例如压片(tableting)润滑剂和其它压片助剂如硬脂酸镁和微晶纤维素。在胶囊，片剂和丸剂的情况下，剂型还可包含缓冲剂。它们可以任选地含有遮光剂，并且还可以是仅在肠道的某一部分或任选地以延迟的方式在肠道的某一部分释放活性成分的组合物。可以使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。

本申请包括本发明化合物的药学上可接受的局部制剂。如本文所用，术语“药学上可接受的局部制剂”是指通过将制剂施用于表皮而皮内施用本申请化合物的药学上可接受的任何制剂。在本申请的某些具体例中，局部制剂包含载体***。药学上有效的载体包括但不限于溶剂(例如，醇，多元醇，水)，乳膏，洗剂，软膏，油，膏药，脂质体，粉末，乳液，微乳液和缓冲溶液(例如，低渗或缓冲盐水)或本领域已知的用于局部施用药物的任何其他载体。本领域标准的参考文献提供了更完整的本领域已知的载体列表，例如，Remington's Pharmaceutical Sciences，第16版(1980)和第17版(1985)，其均由 MackPublishing Company,Easton出版，其公开内容通过引用方式整体并入本文。在某些其他具体例中，本申请的局部制剂可包含赋形剂。本领域已知的任何药学上可接受的赋形剂可用于制备本发明的药学上可接受的局部制剂。可包括在本申请的局部制剂中的赋形剂的实例，包括但不限于，防腐剂，抗氧化剂，保湿剂，润肤剂，缓冲剂，增溶剂，其他渗透剂，皮肤保护剂，表面活性剂和推进剂，和/或或与本发明化合物组合使用的其他治疗剂。合适的防腐剂包括，但不限于，醇，季胺，有机酸，对羟基苯甲酸酯和酚。合适的抗氧化剂包括，但不限于，抗坏血酸及其酯，亚硫酸氢钠，丁基化羟基甲苯，丁基化羟基苯甲醚，生育酚和螯合剂如EDTA和柠檬酸。合适的保湿剂包括，但不限于，甘油，山梨糖醇，聚乙二醇，尿素和丙二醇。适用于本申请的缓冲剂包括，但不限于，柠檬酸，盐酸和乳酸缓冲剂。合适的增溶剂包括，但不限于，季铵氯化物，环糊精，苯甲酸苄酯，卵磷脂和聚山梨醇酯。可用于本申请的局部制剂的合适的皮肤保护剂包括，但不限于，维生素E油，尿囊素，聚二甲基硅氧烷，甘油，凡士林和氧化锌。

在某些具体例中，本申请的药学上可接受的局部制剂包含至少一种本申请的化合物和渗透增强剂。局部制剂的选择将取决于几个因素，包括待治疗的病症，本发明化合物和存在的其它赋形剂的物理化学特性，本发明化合物和存在的其它赋形剂在制剂中的稳定性，可用的制造设备和成本限制。如本文所用，术语“渗透增强剂”是指能够将药理活性化合物通过角质层并进入表皮或真皮，优选几乎没有或没有全身吸收的剂。已经评估了广泛多种化合物在提高药物通过皮肤的渗透速率方面的有效性。参见，例如，MaibachH.I.and Smith H.E. (eds.)，Percutaneous Penetration Enhancers,CRC Press,Inc.,Boca Raton,Fla.(1995)，其调查各种皮肤渗透促进剂的使用和测试，以及 Buyuktimkinet al.,Chemical Means of Transdermal Drug Permeation Enhancement inTransdermal and Topical Drug Delivery Systems,Gosh T,K.,Pfister W.R.,Yum S.I.(eds.)，Interpharm Press Inc.,Buffalo Grove,III(1997)。在某些示例性具体例中，与本申请一起使用的渗透剂包括但不限于甘油三酯(例如大豆油)，芦荟组合物 (例如芦荟凝胶)，乙醇，异丙醇，辛基苯基聚乙二醇，油酸，聚乙二醇400，丙二醇，N-癸基甲基亚砜，脂肪酸酯(例如肉豆蔻酸异丙酯，月桂酸甲酯，单油酸甘油酯和单油酸丙二醇酯)和N-甲基吡咯烷酮。

在某些具体例中，组合物可以是软膏，糊剂，乳膏，洗剂，凝胶，粉剂，溶液，喷雾剂，吸入剂或贴剂的形式。在某些示例性具体例中，根据本申请的组合物的制剂是乳膏，其可以进一步含有饱和或不饱和脂肪酸，例如硬脂酸，棕榈酸，油酸，棕榈油酸，十六烷基或油基醇，以及特别优选是硬脂酸。本申请的乳膏还可含有非离子表面活性剂，例如聚氧-40-硬脂酸酯。在某些具体例中，活性成分在无菌条件下与药学上可接受的载体和任何所需的防腐剂或缓冲剂掺合。眼科制剂，滴耳剂和滴眼剂也设想为包括在本申请的范畴内。另外，本申请设想使用透皮贴剂，其具有提供化合物控制递送至身体的附加优点。通过将化合物溶解或分配在适当的介质中来制备这种剂型。如上述，渗透增强剂也可用于增加化合物在皮肤上的通量。可以通过提供速率控制膜或通过将化合物分散在聚合物基质或凝胶中来控制速率。

还将理解，本申请的某些异双功能性化合物可以以游离形式存在，以用于治疗，或在适当情况下，作为其药学上可接受的衍生物存在。根据本申请，药学上可接受的衍生物包括，但不限于，本申请化合物的药学上可接受的盐，酯，这些酯的盐，或化合物的前药或其它加合物或衍生物，其在向患者给药时需要能够直接或间接地提供本文另外描述的化合物或其代谢物或残余物。

在一个具体例中，将异双功能性化合物作为上述药物组合物中的任一种，向有需要的宿主给药，以通过对合成内源性蛋白-dTAG杂合蛋白的作用来停止感兴趣的蛋白的表达。或者，将异双功能性化合物作为上述药物组合物中的任一种，施用于需要其的宿主，以通过对合成内源性蛋白-dTAG杂合蛋白的作用而开始表达感兴趣的蛋白。

实施例

进一步提供了内源性蛋白质-dTAG杂合蛋白的示例性工程化的实例，该内源性蛋白质-DTAG杂合蛋白具有能够被异双功能性化合物结合或与其结合的dTAG，当暴露于异双功能性化合物时，该异双功能性化合物被泛素蛋白酶体途径(UPP)降解。这些实施例仅是示例性的而不是限制性的，而是用作通过靶向内源性蛋白质-dTAG杂合蛋白的异双功能性化合物特异性降解靶标的来调节感兴趣的蛋白质的表达的方法的说明。

实施例1：原蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/KEXIN 9型(PCSK9)- dTAG

为了进一步描述通过使用本文考虑的dTAG靶向感兴趣的内源性蛋白质以进行降解，示例了靶向示例性感兴趣的蛋白质PCSK9的基因产物，用于***编码dTAG的核酸。

原蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶/KEXIN 9型(PCSK9)是一种控制胆固醇体内平衡的酶。PCSK9调节肝脏中低密度脂蛋白(LDL)受体的表达。LDLR与血液中的游离LDL胆固醇结合并内化，有效降低胆固醇水平。当PCSK9失调时，该酶结合并降解LDLR，从而增加游离血液胆固醇，导致高胆固醇血症。PCSK9的抑制或降解会恢复LDLC表达并有效降低肝脏中的游离血胆固醇。由于游离LDL水平升高与心脏病风险增加有关，因此减少PCKS9表达或活性的努力对社区非常重要。

为了工程化内源性蛋白质-dTAG杂合蛋白，克隆了同源供体构建体，其包括左同源区(内含子1的一部分)，dTAG核酸序列(衍生自 dTAG FKBP*-SEQ.ID.NO.:2)与PCSK9的外显子1和右侧同源区域(内含子2的一部分)框内克隆。将dTAG肽与2X甘氨酸连接子一起框内克隆。为了启动同源重组，设计CRISPR sg RNA以靶向外显子 1中的编码序列PCSK9。CAS9表达诱导双股断裂，其通过使用供体构建体作为模板的同源重组修复来修复。最终结果是具有dTAG核酸的基因座与PCSK9的外显子1框内克隆。

如所得到的，包括框内dTAG核酸***物的所得核酸序列产生如下基因组核酸序列，其中小写字母表示PCSK9基因组序列的内含子序列，大写、下划线序列表示sg RNA靶标(GAGGGAGATTTGACACACACAGG)(SEQ.ID.NO.:45)，ATG表示 PCSK9蛋白或PCSK9-dTAG杂合体的转录起始位点，大写字母表示 PCSK9蛋白的外显子编码序列，而大写、斜体字母表示框内***衍生自具有2X甘氨酸接头(GGGGGG)(SEQ.ID.NO.:46)的dTAG核酸的 FKBP*。的。图2中提供了表示示例性HR策略的图式。

靶向PCSK9基因组基因座(SEQ.ID.NO.:47)

产生的PCSK9-dTAG杂合体(SEQ.ID.NO.:48)

实施例2：β-连环蛋白(CTNNB1)-dTAG

为了进一步描述通过使用本文考虑的dTAG靶向感兴趣的内源性蛋白质进行降解，说明了用于dTAG***的示例性感兴趣的蛋白质 β-连环蛋白(CTNNB1)的靶向。

β-连环蛋白是由CTNNB1基因编码。β-连环蛋白调节细胞-细胞粘附和作为WNT信号传导途径的下游效应子的基因转录。在正常条件下，β-连环蛋白功能和表达经由βTrCPE3连接酶通过磷酸化和泛素介导的破坏介导。通常，β-连环蛋白在与抑制性复合物结合时受到调节，该复制性复合物包括轴蛋白、GSK3+和APC。在WNT刺激后，轴蛋白被隔离到卷曲的受体，因此从破坏复合物释放出β-连环蛋白。然后蛋白质易位至细胞核以结合TCF/LEF以激活转录程序。释放Wnt 配体后，游离的β-连环蛋白被GSK3β磷酸化，并通过TrCRPE3连接酶的结合和泛素化而降解。

Wnt/β-连环蛋白途径经常在人类癌症中发生突变，在近25％的肝细胞癌中观察到β-连环蛋白突变。在βTrCP结合位点内发现了复发性突变，赋予致癌转录调节因子稳定性。虽然是一个真正的肿瘤学目标，历史小分子程序已经失败，因为β-连环蛋白是一种相对扁平的蛋白质，几乎没有已知的配体以高亲和力结合。这些数据暗示β-连环蛋白作为靶向条件降解的示例性基因。

为了工程化内源性蛋白质-dTAG杂合蛋白，克隆了同源供体构建体，其包含左同源区(内含子1的一部分)，框内克隆CTNNB1的短外显子1的dTAG核酸序列(衍生自dTAGFKBP*-SEQ.ID.NO.:2)，内含子2，外显子2和右侧同源区(内含子3的一部分)。将dTAG核酸序列与2X甘氨酸连接子一起框内克隆。

为了启动同源重组，设计CRISPR sgRNA以靶向外显子2中的编码序列β-连环蛋白。CAS9表达诱导双股断裂，其通过使用供体构建体作为模板的同源重组修复来修复。最终结果是具有与CTNNB1的外显子1框内克隆的dTAG核酸序列的基因座。

如所引出的，包含框内dTAG核酸***物的所得核酸序列产生如下基因组核酸序列，其中小写字母表示CTNNB1基因组序列的内含子序列，大写、下划线序列表示sgRNA靶标(TACCACAGCTCCTTCTCTGAGTGG)(SEQ.ID.NO.:49)，ATG表示CTNNB1蛋白(β-连环蛋白)或β-连环蛋白(CTNBB1)-dTAG杂合体的转录起始位点，大写字母表示β-连环蛋白的外显子编码序列，以及大写、斜体字母表示框内***衍生自具有2X甘氨酸连接子 (GGGGGG)(SEQ.ID.NO.:46)的dTAG核酸的FKBP*的。图3中提供了表示示例性HR策略的图式。

CTNNB1基因组基因座(SEQ.ID.NO.:50)

产生的CTNNB1-dTAG杂合体(SEQ.ID.NO.:51)

在任何以下实施例中，可以使用dFKBP13-o和dFKBP 13-p或 dFKBP7-o和dFKBP7-p。

实施例3：

图4显示了用dFKBP7确认FKBP*融合蛋白的选择性降解的实例。

dTAG基于FKBP*特异性配体对内源野生型FKBP的选择性预测。在表达野生型FKBP12或FKBP*的293T细胞中，dFKBP7仅在表达FKBP*的细胞中诱导靶向降解。进行用本发明中描述的异双功能性分子处理的细胞的免疫印迹。将表达加HA标签的 FKBP12WT或FKBP*的293FT细胞(CRBN-WT或CRBN-/-)用指定浓度的dFKBP7处理4小时。FKBP*而非FKBPWT的CRBN依赖性降解证实了dFKBP7对突变体FKBP*的选择性活性。

实施例4：

图5A至B说明了一组dFKBP异双功能性化合物的剖面 (profiling)，以测量差异降解活性的实例。

为了鉴定有效和选择性的dFKPB异双功能性化合物，通过荧光素酶的替代水平测量靶向FKBP*降解的高通量测量。在这里， FKBP*外源表达为具有两种类型的荧光素酶的多顺反子转录物：纳米荧光素酶(NLuc)和萤火虫荧光素酶(FLuc)，其允许FKBP*蛋白质水平的细胞标准化定量。FKBP*的降解测量为用指定浓度的 dFKBP处理4小时的野生型(图4A)或CRBN-/-(图4B)293FT细胞的信号比(Nluc/Fluc)。信号比的降低表明FKBP*(Nluc)降解，并且观察到以小脑蛋白依赖性方式有效降解FKBP*的分子(例如 dFKBP7)。

实施例5：

图6说明了用dFKBP7和dFKBP13(其为本发明中所述的异双功能性化合物)对FKBP*融合蛋白的选择性降解的实例。

在表达野生型FKBP12或FKBP*的293T细胞中，用dFKBP7 和dFKBP13处理仅在表达FKBP*的细胞中诱导靶向降解。将同基因293FT细胞(CRBN-WT或CRBN-/-)工程化以表达FKBP12WT或 FKBP*。用100nM dFKBP7或dFKBP13处理细胞4小时，然后制备裂解物以用于西方免疫印迹分析。FKBP*而非FKBP12WT或内源性FKBP12的CRBN依赖性降解证实了dFKBP7和dFKBP13对突变体FKBP*的选择性。

实施例6：

图7说明了具有双功能性化合物dFKBP13的加HA标签的 FKBP12*的剂量依赖性降解的实例。

为了定义dFKB13异双功能性化合物的最佳浓度以诱导FKBP* 的降解，在用增加浓度的dFKBP13处理时测量降解。将同基因 293FT细胞(CRBN-WT或CRBN-/-)工程化以表达加HA标签的FKBP*。用指定剂量的dFKBP13处理细胞4小时，然后制备裂解物以用于西方免疫印迹分析。这些数据证实了dFKBP13对加HA标签的FKBP*的剂量和CRBN依赖性降解。

实施例7：

图8说明了加HA标签的FKBP*的dFKBP13依赖性降解的动力学控制。

为了评估靶向降解FKBP*的动力学控制，通过增加持续时间给药dFKBP13。将293FT细胞(CRBN-WT)工程化以表达加HA标签的FKBP*。以指定的时间，用100nM dFKBP13处理细胞。收获细胞，并对蛋白质裂解物进行免疫印迹以测量由dFKBP13诱发的加 HA标签的FKBP*降解的动力学。

实施例8：

图9说明了通过双功能性化合物dFKBP13确认FKBP*的 CRBN依赖性降解和蛋白酶体依赖性降解的实例。

将293FT细胞(CRBN-WT)工程化以表达FKBP*。在用 dFKBP13处理4小时之前，用1uM卡非佐米(蛋白酶体抑制剂)， 0.5uM MLN4924(接合作用抑制剂)和10uM来那度胺(CRBN结合配体)预处理细胞2小时。制备裂解物并进行西方免疫印迹分析。蛋白酶体抑制剂卡非佐米挽救了dFKBP13对加HA标签的FKBP*的降解，建立了蛋白酶体功能的要求。用NAE1抑制剂MLN4924预处理挽救了加HA标签的FKBP*，建立了对CRL活性的依赖性，正如所预期，基于cullin的泛素连接酶需要接合作用以进行性E3连接酶活性。用过量的来那度胺预处理消除了dFKBP13依赖性FKBP*降解，证实了CRBN参与降解的要求。

实施例9：

图10A至B证实了当与dTAG融合时目标蛋白的靶向降解。

为了测试dTAG技术在几种蛋白质类型中的一般效用，指定的蛋白质与MV4中的dTAG融合；表达了11种白血病细胞。用指定的dFKBP双功能性分子(dFKBP7和dFKBP13)处理时，通过蛋白质印迹测量观察到靶向蛋白降解。用指定浓度的FKBP*选择性异双功能性化合物处理细胞16小时，并观察到纳摩尔浓度的降解。

实施例10：

图11说明了证实N-端dTAG-KRAS降解的实例。

在N-端dTAG-KRAS中，dFKBP7处理导致有效降解以及p- AKT信号的下游降低，暗示过表达的内源性dTAG杂合体蛋白的生物学相关性。用500nM dFKBP7处理细胞指定的时间。收获细胞并进行免疫印迹以测量FKBP*-KRAS和KRAS信号传导的下游替代物(例如，pMEK和pAKT)的降解。dTAG KRAS的过表达导致相关下游信号传导途径的激活，如通过蛋白质印迹测量观察到p-AKT信号的增加。

实施例11：

图12说明了dFKBP异双功能性化合物诱导dTAG-KRAS降解的剖面。

为了鉴定表现最佳的dFKBP分子，在一系列dFKBP分子上分析了dTAG-KRAS降解。表达dTAG-KRASG12V的NIH3T3细胞的蛋白质印迹用1μM指定的dFKBP异双功能性化合物处理24小时。收获细胞，并进行免疫印迹以测量FKBP*-KRAS和KRAS信号传导的下游替代物(例如pMEK和pAKT)的降解。数据表明dFKBP9， dFKBP12和dFKBP13诱导FKBP*-KRAS的有效降解和下游信号传导的抑制。

实施例12：

图13显示了用dFKBP13证实dTAG-KRAS的靶向降解的实例。

dFKBP13异双功能性分子在纳摩尔浓度下有效降解dTAG- KRAS。对以指定浓度的dFKBP13处理24小时的与KRAS的N-端融合的表达FKBP*的NIH3T3细胞进行蛋白质印迹。收获细胞，并进行免疫印迹以测量FKBP*-KRAS和KRAS信号传导的下游替代物(例如，pMEK和pAKT)的降解。数据暗示dFKBP13诱发FKBP* -KRAS的有效降解并且有效地抑制下游信号传导，IC50>100nM。

实施例13：

图14显示了用dFKBP13靶向降解dTAG-KRAS的动力学控制的实例。

为了评估dTAG-KRAS靶向降解的动力学控制，通过增加持续时间给药dFKBP13。对用1μMdFKBP13处理指定时间的与KRAS 的N-端融合的表达FKBP*的NIH3T3细胞进行蛋白质印迹。收获细胞，并进行免疫印迹以测量FKBP*-KRAS和KRAS信号传导的下游替代物(例如，pMEK和pAKT)的降解。数据暗示dFKBP13早在治疗后1小时就诱发FKBP*-KRAS的有效降解和下游信号传导的抑制。

实施例14：

图15说明了证实异双功能性化合物dFKBP13对dTAG- KRASG12V的CRBN依赖性和蛋白酶体依赖性的降解。

NIH3T3细胞(CRBN-WT)被工程化以表达dTAG-KRASG12V。在用dFKBP13处理4小时之前，将细胞用1uM卡非佐米(蛋白酶体抑制剂)，0.5uM MLN4924(氰基化抑制剂)和10uM来那度胺(CRBN 结合配体)预处理2小时。制备裂解物并进行蛋白质免疫印迹分析。蛋白酶体抑制剂(卡非佐米)挽救了dFKBP13对dTAG-KRASG12V 的降解，确立了蛋白酶体功能的要求。用NAE1抑制剂MLN4924进行的预处理挽救了dTAG-KRASG12V表达，建立了对CRL活性的依赖性，如预期基于cullin的泛素连接酶需要接合作用以进行E3连接酶的活性。用过量来那度胺进行的预处理废除了依赖于dFKBP13 的dTAG-KRASG12V降解，从而证实了CRBN参与降解的必要性。

实施例15：

图16显示了一个实例，该实例证实了用dFKBP13靶向降解致癌的dTAG-KRAS等位基因。

dFKBP13异双功能性化合物有效降解dTAG-KRAS突变等位基因。NIH3T3细胞经过工程化，可以表达WT或突变形式的氨基酸甘氨酸12(G12C、G12D和G12V)的KRAS等位基因。用1uM的 dFKBP13处理表达融合KRAS等位基因的N-端的dTAG的NIH3T3 细胞的蛋白质印迹。收获细胞并免疫印迹以测量dTAG-KRAS的降解和KRAS信号传导的下游替代物(例如pMEK和pAKT)。数据暗示，dFKBP13诱导WT和突变KRAS等位基因的有效降解，并有效抑制下游信号传导。

实施例16：

图17显示了一个实例，该实例证实了用dFKBP13靶向降解致癌的dTAG-KRAS等位基因。

dFKBP13异双功能性化合物有效降解dTAG-KRAS突变等位基因。NIH3T3细胞经过工程化，可以表达WT或突变KRAS等位基因(G13D、Q61L和Q61R)。用1uM的dFKBP13处理表达融合 KRAS等位基因的N-端的dTAG的NIH3T3细胞的蛋白质印迹。收获细胞并免疫印迹以测量dTAG-KRAS的降解和KRAS信号传导的下游替代物(例如pMEK和pAKT)。数据暗示，dFKBP13诱导WT 和突变KRAS等位基因的有效降解，并有效抑制下游信号传导。

实施例17：

图18A至D说明了进行的实验，以确认在dTAG-KRAS降解时诱发的表型变化。

如相差对比成像显示，在过表达dTAG-KRAS时在NIH3T3细胞中观察到形态学变化。用dFKBP13处理24小时时，细胞在形态上恢复到野生型(DMSO对照)状态。

实施例18：

图19A至D说明了dTAG-KRAS降解对NIH3T3细胞活力的表型后果。

ATPlite 1步发光测定法基于由ATP与添加的荧光素酶和D-荧光素的反应引起的光的产生来测量细胞中的细胞增殖和细胞毒性。信号的减少表明细胞数量减少。为了评估dFKBP13对表达dTAG- KRAS的NIH3T3细胞中增殖的影响，通过ATP水平的替代测量来评估生存力。用指定浓度的dFKBP处理细胞72小时，并使用 ATPlite测定法测量细胞活力。

实施例19：

图20显示了dTAG-KRAS降解对NIH3T3细胞的细胞周期谱的表型结果。

NIH3T3细胞经过工程化以表达dTAG-KRASG12V。将表达 dTAG-KRASG12V的NIH3T3细胞用dFKBP7和dFKBP13处理48 小时，以诱导靶向性dTAG-KRASG12V降解。固定的细胞用碘化丙啶染色并进行细胞周期分析。dFKBP7和dFKBP13的治疗导致S期进入减少，这与内源性KRASG12V在驱动S期进入中的生物学作用一致。这些数据与观察到的对dTAG-KRASG12V降解对细胞生存力的影响一致。

实施例20：将CRISPR-CAS9和同源供体载体递送至肝脏

可以使用病毒和非病毒方法(如腺相关病毒或慢病毒)或基于脂质的制剂来完成靶向基因治疗。例如，单个双顺反子载体***用于递送靶向PCKS9或CTNNB1的sgRNA，其中CAS9从相邻启动子表达。CRISPR载体和供体同源质粒都封装在聚(β-氨基酯)(PBAE)阳离子聚合物中，与常规肝细胞相比，它们提供了靶向癌细胞的额外特异性。PBAE纳米颗粒也是可生物降解的，或通过水解降解的，从而在内化后在肿瘤细胞的细胞质中释放质粒DNA。PBAE封装的质粒DNA将通过肝内动脉给药局部递送，并通过静脉内注射全身递送。成功重组时，在给药异双功能性化合物后，会进行局部核心活检以确认PCKS9基因产物或CTNNB1基因产物的降解。

已经参考本发明的具体例描述了本说明书。然而，本领域的普通技术人员将理解，在不脱离如所附权利要求书所阐述的本发明的范畴的情况下，可以进行各种修改和改变。因此，本说明书应被认为是说明性的而不是限制性的，并且所有这样的修改旨在被包括在本发明的范畴内。

序列表

<110> 达纳-法柏癌症研究所有限公司

<120> 用异双功能性化合物进行的可调节的内源性蛋白质降解

<130> 16010-025WO1

<150> 62/456,654

<151> 2017-02-08

<150> 62/457,127

<151> 2017-02-09

<160> 63

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 107

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly Arg Thr Phe Pro

1 5 10 15

Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly Met Leu Glu Asp

20 25 30

Gly Lys Lys Phe Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys Pro Phe Lys Phe

35 40 45

Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu Glu Gly Val Ala

50 55 60

Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile Ser Pro Asp Tyr

65 70 75 80

Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro Pro His Ala Thr

85 90 95

Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu

100 105

<210> 2

<211> 107

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 衍生自FKBP12的在氨基酸35位的苯丙氨酸(F)突变成缬氨酸(V)(F36V)的氨基酸序列

<400> 2

Gly Val Gln Val Glu Thr Ile Ser Pro Gly Asp Gly Arg Thr Phe Pro

1 5 10 15

Lys Arg Gly Gln Thr Cys Val Val His Tyr Thr Gly Met Leu Glu Asp

20 25 30

Gly Lys Lys Phe Asp Ser Ser Arg Asp Arg Asn Lys Pro Phe Lys Phe

35 40 45

Met Leu Gly Lys Gln Glu Val Ile Arg Gly Trp Glu Glu Gly Val Ala

50 55 60

Gln Met Ser Val Gly Gln Arg Ala Lys Leu Thr Ile Ser Pro Asp Tyr

65 70 75 80

Ala Tyr Gly Ala Thr Gly His Pro Gly Ile Ile Pro Pro His Ala Thr

85 90 95

Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Lys Leu Glu

100 105

<210> 3

<211> 1362

<212> PRT

<213> 智人

<400> 3

Met Ser Ala Glu Ser Gly Pro Gly Thr Arg Leu Arg Asn Leu Pro Val

1 5 10 15

Met Gly Asp Gly Leu Glu Thr Ser Gln Met Ser Thr Thr Gln Ala Gln

20 25 30

Ala Gln Pro Gln Pro Ala Asn Ala Ala Ser Thr Asn Pro Pro Pro Pro

35 40 45

Glu Thr Ser Asn Pro Asn Lys Pro Lys Arg Gln Thr Asn Gln Leu Gln

50 55 60

Tyr Leu Leu Arg Val Val Leu Lys Thr Leu Trp Lys His Gln Phe Ala

65 70 75 80

Trp Pro Phe Gln Gln Pro Val Asp Ala Val Lys Leu Asn Leu Pro Asp

85 90 95

Tyr Tyr Lys Ile Ile Lys Thr Pro Met Asp Met Gly Thr Ile Lys Lys

100 105 110

Arg Leu Glu Asn Asn Tyr Tyr Trp Asn Ala Gln Glu Cys Ile Gln Asp

115 120 125

Phe Asn Thr Met Phe Thr Asn Cys Tyr Ile Tyr Asn Lys Pro Gly Asp

130 135 140

Asp Ile Val Leu Met Ala Glu Ala Leu Glu Lys Leu Phe Leu Gln Lys

145 150 155 160

Ile Asn Glu Leu Pro Thr Glu Glu Thr Glu Ile Met Ile Val Gln Ala

165 170 175

Lys Gly Arg Gly Arg Gly Arg Lys Glu Thr Gly Thr Ala Lys Pro Gly

180 185 190

Val Ser Thr Val Pro Asn Thr Thr Gln Ala Ser Thr Pro Pro Gln Thr

195 200 205

Gln Thr Pro Gln Pro Asn Pro Pro Pro Val Gln Ala Thr Pro His Pro

210 215 220

Phe Pro Ala Val Thr Pro Asp Leu Ile Val Gln Thr Pro Val Met Thr

225 230 235 240

Val Val Pro Pro Gln Pro Leu Gln Thr Pro Pro Pro Val Pro Pro Gln

245 250 255

Pro Gln Pro Pro Pro Ala Pro Ala Pro Gln Pro Val Gln Ser His Pro

260 265 270

Pro Ile Ile Ala Ala Thr Pro Gln Pro Val Lys Thr Lys Lys Gly Val

275 280 285

Lys Arg Lys Ala Asp Thr Thr Thr Pro Thr Thr Ile Asp Pro Ile His

290 295 300

Glu Pro Pro Ser Leu Pro Pro Glu Pro Lys Thr Thr Lys Leu Gly Gln

305 310 315 320

Arg Arg Glu Ser Ser Arg Pro Val Lys Pro Pro Lys Lys Asp Val Pro

325 330 335

Asp Ser Gln Gln His Pro Ala Pro Glu Lys Ser Ser Lys Val Ser Glu

340 345 350

Gln Leu Lys Cys Cys Ser Gly Ile Leu Lys Glu Met Phe Ala Lys Lys

355 360 365

His Ala Ala Tyr Ala Trp Pro Phe Tyr Lys Pro Val Asp Val Glu Ala

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Leu Gly Leu His Asp Tyr Cys Asp Ile Ile Lys His Pro Met Asp Met

385 390 395 400

Ser Thr Ile Lys Ser Lys Leu Glu Ala Arg Glu Tyr Arg Asp Ala Gln

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Glu Phe Gly Ala Asp Val Arg Leu Met Phe Ser Asn Cys Tyr Lys Tyr

420 425 430

Asn Pro Pro Asp His Glu Val Val Ala Met Ala Arg Lys Leu Gln Asp

435 440 445

Val Phe Glu Met Arg Phe Ala Lys Met Pro Asp Glu Pro Glu Glu Pro

450 455 460

Val Val Ala Val Ser Ser Pro Ala Val Pro Pro Pro Thr Lys Val Val

465 470 475 480

Ala Pro Pro Ser Ser Ser Asp Ser Ser Ser Asp Ser Ser Ser Asp Ser

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Asp Ser Ser Thr Asp Asp Ser Glu Glu Glu Arg Ala Gln Arg Leu Ala

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Glu Leu Gln Glu Gln Leu Lys Ala Val His Glu Gln Leu Ala Ala Leu

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Ser Gln Pro Gln Gln Asn Lys Pro Lys Lys Lys Glu Lys Asp Lys Lys

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Glu Lys Lys Lys Glu Lys His Lys Arg Lys Glu Glu Val Glu Glu Asn

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Lys Lys Ser Lys Ala Lys Glu Pro Pro Pro Lys Lys Thr Lys Lys Asn

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Asn Ser Ser Asn Ser Asn Val Ser Lys Lys Glu Pro Ala Pro Met Lys

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Ser Ser Ser Glu Ser Ser Ser Ser Asp Ser Glu Asp Ser Glu Thr Glu

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Met Ala Pro Lys Ser Lys Lys Lys Gly His Pro Gly Arg Glu Gln Lys

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Met Pro Gln Gln Ala Ala Pro Ala Met Lys Ser Ser Pro Pro Pro Phe

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Ile Ala Thr Gln Val Pro Val Leu Glu Pro Gln Leu Pro Gly Ser Val

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Pro Pro Pro Pro Gln Pro Gln Pro Pro Pro Gln Gln Gln His Gln Pro

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Pro Pro Arg Pro Val His Leu Gln Pro Met Gln Phe Ser Thr His Ile

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Ser Ser Ser Asp Ser Phe Glu Gln Phe Arg Arg Ala Ala Arg Glu

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Glu Lys Glu Lys Glu Arg Leu Arg Gln Glu Arg Met Arg Ser Arg

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Ala Arg Arg Arg Gln Glu Gln Gln Gln Gln Gln Arg Gln Glu Gln

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Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Ala Ala Ala Val Ala Ala Ala Ala

1295 1300 1305

Thr Pro Gln Ala Gln Ser Ser Gln Pro Gln Ser Met Leu Asp Gln

1310 1315 1320

Gln Arg Glu Leu Ala Arg Lys Arg Glu Gln Glu Arg Arg Arg Arg

1325 1330 1335

Glu Ala Met Ala Ala Thr Ile Asp Met Asn Phe Gln Ser Asp Leu

1340 1345 1350

Leu Ser Ile Phe Glu Glu Asn Leu Phe

1355 1360

<210> 4

<211> 595

<212> PRT

<213> 智人

<400> 4

Met Thr Met Thr Leu His Thr Lys Ala Ser Gly Met Ala Leu Leu His

1 5 10 15

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20 25 30

Ile Pro Leu Glu Arg Pro Leu Gly Glu Val Tyr Leu Asp Ser Ser Lys

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50 55 60

Ala Ala Ala Ala Asn Ala Gln Val Tyr Gly Gln Thr Gly Leu Pro Tyr

65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

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180 185 190

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195 200 205

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210 215 220

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Arg Leu Arg Lys Cys Tyr Glu Val Gly Met Met Lys Gly Gly Ile Arg

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Ser Leu Ala Leu Ser Leu Thr Ala Asp Gln Met Val Ser Ala Leu Leu

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Asp Ala Glu Pro Pro Ile Leu Tyr Ser Glu Tyr Asp Pro Thr Arg Pro

325 330 335

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Glu Leu Val His Met Ile Asn Trp Ala Lys Arg Val Pro Gly Phe Val

355 360 365

Asp Leu Thr Leu His Asp Gln Val His Leu Leu Glu Cys Ala Trp Leu

370 375 380

Glu Ile Leu Met Ile Gly Leu Val Trp Arg Ser Met Glu His Pro Gly

385 390 395 400

Lys Leu Leu Phe Ala Pro Asn Leu Leu Leu Asp Arg Asn Gln Gly Lys

405 410 415

Cys Val Glu Gly Met Val Glu Ile Phe Asp Met Leu Leu Ala Thr Ser

420 425 430

Ser Arg Phe Arg Met Met Asn Leu Gln Gly Glu Glu Phe Val Cys Leu

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Lys Ser Ile Ile Leu Leu Asn Ser Gly Val Tyr Thr Phe Leu Ser Ser

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Lys Ile Thr Asp Thr Leu Ile His Leu Met Ala Lys Ala Gly Leu Thr

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His Ile Arg His Met Ser Asn Lys Gly Met Glu His Leu Tyr Ser Met

515 520 525

Lys Cys Lys Asn Val Val Pro Leu Tyr Asp Leu Leu Leu Glu Met Leu

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<213> 人工序列

<220>

<223> ***受体配体结合域

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210 215 220

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225 230 235 240

Asp Ala His Arg Leu

245

<210> 6

<211> 920

<212> PRT

<213> 智人

<400> 6

Met Glu Val Gln Leu Gly Leu Gly Arg Val Tyr Pro Arg Pro Pro Ser

1 5 10 15

Lys Thr Tyr Arg Gly Ala Phe Gln Asn Leu Phe Gln Ser Val Arg Glu

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Val Ile Gln Asn Pro Gly Pro Arg His Pro Glu Ala Ala Ser Ala Ala

35 40 45

Pro Pro Gly Ala Ser Leu Leu Leu Leu Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln

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Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln Gln

65 70 75 80

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Glu Gln Gln Pro Ser Gln Pro Gln Ser Ala Leu Glu Cys His Pro Glu

115 120 125

Arg Gly Cys Val Pro Glu Pro Gly Ala Ala Val Ala Ala Ser Lys Gly

130 135 140

Leu Pro Gln Gln Leu Pro Ala Pro Pro Asp Glu Asp Asp Ser Ala Ala

145 150 155 160

Pro Ser Thr Leu Ser Leu Leu Gly Pro Thr Phe Pro Gly Leu Ser Ser

165 170 175

Cys Ser Ala Asp Leu Lys Asp Ile Leu Ser Glu Ala Ser Thr Met Gln

180 185 190

Leu Leu Gln Gln Gln Gln Gln Glu Ala Val Ser Glu Gly Ser Ser Ser

195 200 205

Gly Arg Ala Arg Glu Ala Ser Gly Ala Pro Thr Ser Ser Lys Asp Asn

210 215 220

Tyr Leu Gly Gly Thr Ser Thr Ile Ser Asp Asn Ala Lys Glu Leu Cys

225 230 235 240

Lys Ala Val Ser Val Ser Met Gly Leu Gly Val Glu Ala Leu Glu His

245 250 255

Leu Ser Pro Gly Glu Gln Leu Arg Gly Asp Cys Met Tyr Ala Pro Leu

260 265 270

Leu Gly Val Pro Pro Ala Val Arg Pro Thr Pro Cys Ala Pro Leu Ala

275 280 285

Glu Cys Lys Gly Ser Leu Leu Asp Asp Ser Ala Gly Lys Ser Thr Glu

290 295 300

Asp Thr Ala Glu Tyr Ser Pro Phe Lys Gly Gly Tyr Thr Lys Gly Leu

305 310 315 320

Glu Gly Glu Ser Leu Gly Cys Ser Gly Ser Ala Ala Ala Gly Ser Ser

325 330 335

Gly Thr Leu Glu Leu Pro Ser Thr Leu Ser Leu Tyr Lys Ser Gly Ala

340 345 350

Leu Asp Glu Ala Ala Ala Tyr Gln Ser Arg Asp Tyr Tyr Asn Phe Pro

355 360 365

Leu Ala Leu Ala Gly Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro Pro His Pro His

370 375 380

Ala Arg Ile Lys Leu Glu Asn Pro Leu Asp Tyr Gly Ser Ala Trp Ala

385 390 395 400

Ala Ala Ala Ala Gln Cys Arg Tyr Gly Asp Leu Ala Ser Leu His Gly

405 410 415

Ala Gly Ala Ala Gly Pro Gly Ser Gly Ser Pro Ser Ala Ala Ala Ser

420 425 430

Ser Ser Trp His Thr Leu Phe Thr Ala Glu Glu Gly Gln Leu Tyr Gly

435 440 445

Pro Cys Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly

450 455 460

Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Glu Ala Gly Ala Val Ala Pro

465 470 475 480

Tyr Gly Tyr Thr Arg Pro Pro Gln Gly Leu Ala Gly Gln Glu Ser Asp

485 490 495

Phe Thr Ala Pro Asp Val Trp Tyr Pro Gly Gly Met Val Ser Arg Val

500 505 510

Pro Tyr Pro Ser Pro Thr Cys Val Lys Ser Glu Met Gly Pro Trp Met

515 520 525

Asp Ser Tyr Ser Gly Pro Tyr Gly Asp Met Arg Leu Glu Thr Ala Arg

530 535 540

Asp His Val Leu Pro Ile Asp Tyr Tyr Phe Pro Pro Gln Lys Thr Cys

545 550 555 560

Leu Ile Cys Gly Asp Glu Ala Ser Gly Cys His Tyr Gly Ala Leu Thr

565 570 575

Cys Gly Ser Cys Lys Val Phe Phe Lys Arg Ala Ala Glu Gly Lys Gln

580 585 590

Lys Tyr Leu Cys Ala Ser Arg Asn Asp Cys Thr Ile Asp Lys Phe Arg

595 600 605

Arg Lys Asn Cys Pro Ser Cys Arg Leu Arg Lys Cys Tyr Glu Ala Gly

610 615 620

Met Thr Leu Gly Ala Arg Lys Leu Lys Lys Leu Gly Asn Leu Lys Leu

625 630 635 640

Gln Glu Glu Gly Glu Ala Ser Ser Thr Thr Ser Pro Thr Glu Glu Thr

645 650 655

Thr Gln Lys Leu Thr Val Ser His Ile Glu Gly Tyr Glu Cys Gln Pro

660 665 670

Ile Phe Leu Asn Val Leu Glu Ala Ile Glu Pro Gly Val Val Cys Ala

675 680 685

Gly His Asp Asn Asn Gln Pro Asp Ser Phe Ala Ala Leu Leu Ser Ser

690 695 700

Leu Asn Glu Leu Gly Glu Arg Gln Leu Val His Val Val Lys Trp Ala

705 710 715 720

Lys Ala Leu Pro Gly Phe Arg Asn Leu His Val Asp Asp Gln Met Ala

725 730 735

Val Ile Gln Tyr Ser Trp Met Gly Leu Met Val Phe Ala Met Gly Trp

740 745 750

Arg Ser Phe Thr Asn Val Asn Ser Arg Met Leu Tyr Phe Ala Pro Asp

755 760 765

Leu Val Phe Asn Glu Tyr Arg Met His Lys Ser Arg Met Tyr Ser Gln

770 775 780

Cys Val Arg Met Arg His Leu Ser Gln Glu Phe Gly Trp Leu Gln Ile

785 790 795 800

Thr Pro Gln Glu Phe Leu Cys Met Lys Ala Leu Leu Leu Phe Ser Ile

805 810 815

Ile Pro Val Asp Gly Leu Lys Asn Gln Lys Phe Phe Asp Glu Leu Arg

820 825 830

Met Asn Tyr Ile Lys Glu Leu Asp Arg Ile Ile Ala Cys Lys Arg Lys

835 840 845

Asn Pro Thr Ser Cys Ser Arg Arg Phe Tyr Gln Leu Thr Lys Leu Leu

850 855 860

Asp Ser Val Gln Pro Ile Ala Arg Glu Leu His Gln Phe Thr Phe Asp

865 870 875 880

Leu Leu Ile Lys Ser His Met Val Ser Val Asp Phe Pro Glu Met Met

885 890 895

Ala Glu Ile Ile Ser Val Gln Val Pro Lys Ile Leu Ser Gly Lys Val

900 905 910

Lys Pro Ile Tyr Phe His Thr Gln

915 920

<210> 7

<211> 462

<212> PRT

<213> 智人

<400> 7

Met Asp Thr Lys His Phe Leu Pro Leu Asp Phe Ser Thr Gln Val Asn

1 5 10 15

Ser Ser Leu Thr Ser Pro Thr Gly Arg Gly Ser Met Ala Ala Pro Ser

20 25 30

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35 40 45

Ser Pro Ile Ser Thr Leu Ser Ser Pro Ile Asn Gly Met Gly Pro Pro

50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

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Arg Gln Arg Gly Lys Asp Arg Asn Glu Asn Glu Val Glu Ser Thr Ser

210 215 220

Ser Ala Asn Glu Asp Met Pro Val Glu Arg Ile Leu Glu Ala Glu Leu

225 230 235 240

Ala Val Glu Pro Lys Thr Glu Thr Tyr Val Glu Ala Asn Met Gly Leu

245 250 255

Asn Pro Ser Ser Pro Asn Asp Pro Val Thr Asn Ile Cys Gln Ala Ala

260 265 270

Asp Lys Gln Leu Phe Thr Leu Val Glu Trp Ala Lys Arg Ile Pro His

275 280 285

Phe Ser Glu Leu Pro Leu Asp Asp Gln Val Ile Leu Leu Arg Ala Gly

290 295 300

Trp Asn Glu Leu Leu Ile Ala Ser Phe Ser His Arg Ser Ile Ala Val

305 310 315 320

Lys Asp Gly Ile Leu Leu Ala Thr Gly Leu His Val His Arg Asn Ser

325 330 335

Ala His Ser Ala Gly Val Gly Ala Ile Phe Asp Arg Val Leu Thr Glu

340 345 350

Leu Val Ser Lys Met Arg Asp Met Gln Met Asp Lys Thr Glu Leu Gly

355 360 365

Cys Leu Arg Ala Ile Val Leu Phe Asn Pro Asp Ser Lys Gly Leu Ser

370 375 380

Asn Pro Ala Glu Val Glu Ala Leu Arg Glu Lys Val Tyr Ala Ser Leu

385 390 395 400

Glu Ala Tyr Cys Lys His Lys Tyr Pro Glu Gln Pro Gly Arg Phe Ala

405 410 415

Lys Leu Leu Leu Arg Leu Pro Ala Leu Arg Ser Ile Gly Leu Lys Cys

420 425 430

Leu Glu His Leu Phe Phe Phe Lys Leu Ile Gly Asp Thr Pro Ile Asp

435 440 445

Thr Phe Leu Met Glu Met Leu Glu Ala Pro His Gln Met Thr

450 455 460

<210> 8

<211> 165

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 8

Met Asn Ser Glu Ser Val Arg Ile Tyr Leu Val Ala Ala Met Gly Ala

1 5 10 15

Asn Arg Val Ile Gly Asn Gly Pro Asn Ile Pro Trp Lys Ile Pro Gly

20 25 30

Glu Gln Lys Ile Phe Arg Arg Leu Thr Glu Gly Lys Val Val Val Met

35 40 45

Gly Arg Lys Thr Phe Glu Ser Ile Gly Lys Pro Leu Pro Asn Arg His

50 55 60

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65 70 75 80

Val Val Ser Thr Leu Ser His Ala Ile Ala Leu Ala Ser Glu Leu Gly

85 90 95

Asn Glu Leu Tyr Val Ala Gly Gly Ala Glu Ile Tyr Thr Leu Ala Leu

100 105 110

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115 120 125

Gly Asp Ala Phe Phe Pro Met Leu Asn Glu Thr Glu Phe Glu Leu Val

130 135 140

Ser Thr Glu Thr Ile Gln Ala Val Ile Pro Tyr Thr His Ser Val Tyr

145 150 155 160

Ala Arg Arg Asn Gly

165

<210> 9

<211> 297

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 细菌脱卤素酶

<400> 9

Met Ala Glu Ile Gly Thr Gly Phe Pro Phe Asp Pro His Tyr Val Glu

1 5 10 15

Val Leu Gly Glu Arg Met His Tyr Val Asp Val Gly Pro Arg Asp Gly

20 25 30

Thr Pro Val Leu Phe Leu His Gly Asn Pro Thr Ser Ser Tyr Val Trp

35 40 45

Arg Asn Ile Ile Pro His Val Ala Pro Thr His Arg Cys Ile Ala Pro

50 55 60

Asp Leu Ile Gly Met Gly Lys Ser Asp Lys Pro Asp Leu Gly Tyr Phe

65 70 75 80

Phe Asp Asp His Val Arg Phe Met Asp Ala Phe Ile Glu Ala Leu Gly

85 90 95

Leu Glu Glu Val Val Leu Val Ile His Asp Trp Gly Ser Ala Leu Gly

100 105 110

Phe His Trp Ala Lys Arg Asn Pro Glu Arg Val Lys Gly Ile Ala Phe

115 120 125

Met Glu Phe Ile Arg Pro Ile Pro Thr Trp Asp Glu Trp Pro Glu Phe

130 135 140

Ala Arg Glu Thr Phe Gln Ala Phe Arg Thr Thr Asp Val Gly Arg Lys

145 150 155 160

Leu Ile Ile Asp Gln Asn Val Phe Ile Glu Gly Thr Leu Pro Met Gly

165 170 175

Val Val Arg Pro Leu Thr Glu Val Glu Met Asp His Tyr Arg Glu Pro

180 185 190

Phe Leu Asn Pro Val Asp Arg Glu Pro Leu Trp Arg Phe Pro Asn Glu

195 200 205

Leu Pro Ile Ala Gly Glu Pro Ala Asn Ile Val Ala Leu Val Glu Glu

210 215 220

Tyr Met Asp Trp Leu His Gln Ser Pro Val Pro Lys Leu Leu Phe Trp

225 230 235 240

Gly Thr Pro Gly Val Leu Ile Pro Pro Ala Glu Ala Ala Arg Leu Ala

245 250 255

Lys Ser Leu Pro Asn Cys Lys Ala Val Asp Ile Gly Pro Gly Leu Asn

260 265 270

Leu Leu Gln Glu Asp Asn Pro Asp Leu Ile Gly Ser Glu Ile Ala Arg

275 280 285

Trp Leu Ser Thr Leu Glu Ile Ser Gly

290 295

<210> 10

<211> 229

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 雄激素受体配体结合域

<400> 10

Asp Asn Asn Gln Pro Asp Ser Phe Ala Ala Leu Leu Ser Ser Leu Asn

1 5 10 15

Glu Leu Gly Glu Arg Gln Leu Val His Val Val Lys Trp Ala Lys Ala

20 25 30

Leu Pro Gly Phe Arg Asn Leu His Val Asp Asp Gln Met Ala Val Ile

35 40 45

Gln Tyr Ser Trp Met Gly Leu Met Val Phe Ala Met Gly Trp Arg Ser

50 55 60

Phe Thr Asn Val Asn Ser Arg Met Leu Tyr Phe Ala Pro Asp Leu Val

65 70 75 80

Phe Asn Glu Tyr Arg Met His Lys Ser Arg Met Tyr Ser Gln Cys Val

85 90 95

Arg Met Arg His Leu Ser Gln Glu Phe Gly Trp Leu Gln Ile Thr Pro

100 105 110

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115 120 125

Val Asp Gly Leu Lys Asn Gln Lys Phe Phe Asp Glu Leu Arg Met Asn

130 135 140

Tyr Ile Lys Glu Leu Asp Arg Ile Ile Ala Cys Lys Arg Lys Asn Pro

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Thr Ser Cys Ser Arg Arg Phe Tyr Gln Leu Thr Lys Leu Leu Asp Ser

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Val Gln Pro Ile Ala Arg Glu Leu His Gln Phe Thr Phe Asp Leu Leu

180 185 190

Ile Lys Ser His Met Val Ser Val Asp Phe Pro Glu Met Met Ala Glu

195 200 205

Ile Ile Ser Val Gln Val Pro Lys Ile Leu Ser Gly Lys Val Lys Pro

210 215 220

Ile Tyr Phe His Thr

225

<210> 11

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 视黄酸受体配体结合域

<400> 11

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Leu Val Ser Lys Met Arg Asp Met Gln Met Asp Lys Thr Glu Leu Gly

130 135 140

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145 150 155 160

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Thr Phe Leu Met Glu Met Leu Glu Ala Pro His Gln Met Thr

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<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> MDM2的N-端

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<212> PRT

<213> 智人

<400> 13

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20 25 30

Ile Arg Lys Pro Ser Leu Leu Tyr Glu Gly Phe Glu Ser Pro Thr Met

35 40 45

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50 55 60

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65 70 75 80

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85 90 95

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Tyr His Lys Ile Ile Lys Gln Pro Met Asp Met Gly Thr Ile Lys Arg

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Gly

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<212> PRT

<213> 智人

<400> 14

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145 150 155 160

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675 680 685

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<400> 16

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<210> 17

<211> 404

<212> PRT

<213> 智人

<400> 17

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Lys Ser Lys Gln Gln Glu Ile Tyr Gln Glu Leu Thr Arg Leu Lys Ala

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275 280 285

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290 295 300

Leu Gln Ser Ser Arg Ser Asn Arg Phe Thr Trp Met Gly Leu Ser Asp

305 310 315 320

Leu Asn Gln Glu Gly Thr Trp Gln Trp Val Asp Gly Ser Pro Leu Leu

325 330 335

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Pro Pro Pro Ala

<210> 18

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<212> PRT

<213> 智人

<400> 18

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Ile Asn Lys Glu Glu Glu Phe Val Glu Glu Phe Asn Arg Leu Lys Thr

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Phe Ala Asn Phe Pro Ser Gly Ser Pro Val Ser Ala Ser Thr Leu Ala

35 40 45

Arg Ala Gly Phe Leu Tyr Thr Gly Glu Gly Asp Thr Val Arg Cys Phe

50 55 60

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Gly Gln Tyr Lys Val Glu Asn Tyr Leu Gly Ser Arg Asp His Phe Ala

115 120 125

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130 135 140

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145 150 155 160

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165 170 175

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180 185 190

Gly Ile Gly Asp Gln Val Gln Cys Phe Cys Cys Gly Gly Lys Leu Lys

195 200 205

Asn Trp Glu Pro Cys Asp Arg Ala Trp Ser Glu His Arg Arg His Phe

210 215 220

Pro Asn Cys Phe Phe Val Leu Gly Arg Asn Leu Asn Ile Arg Ser Glu

225 230 235 240

Ser Asp Ala Val Ser Ser Asp Arg Asn Phe Pro Asn Ser Thr Asn Leu

245 250 255

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Gly Gly Gly Glu Ala Gly Ala Val Ile Gly Gly Ser Ala Gly Ala Ser

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835 840 845

Ser Glu Leu Ser Ser Val Val Ser Ser Ser Gly Thr Glu Gly Ala Ser

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Glu Gly Tyr Tyr Ser Arg Leu Glu Ala Glu Arg Arg Arg Gln His

1655 1660 1665

Asp Glu Ala Ala Arg Arg Leu Leu Glu Pro Glu Ala Pro Gly Leu

1670 1675 1680

Cys Arg Pro Pro Leu Pro Arg Asp Tyr Glu Pro Pro Ser Pro Ser

1685 1690 1695

Pro Ala Pro Gly Ala Pro Pro Pro Pro Pro Gln Arg Asn Ala Ser

1700 1705 1710

Tyr Leu Lys Thr Gln Val Leu Ser Pro Asp Ser Leu Phe Thr Ala

1715 1720 1725

Lys Phe Val Ala Tyr Asn Glu Glu Glu Glu Glu Glu Asp Cys Ser

1730 1735 1740

Leu Ala Gly Pro Asn Ser Tyr Pro Gly Ser Thr Gly Ala Ala Val

1745 1750 1755

Gly Ala His Asp Ala Cys Arg Asp Ala Lys Glu Lys Arg Ser Lys

1760 1765 1770

Ser Gln Asp Ala Asp Ser Pro Gly Ser Ser Gly Ala Pro Glu Asn

1775 1780 1785

Leu Thr Phe Lys Glu Arg Gln Arg Leu Phe Ser Gln Gly Gln Asp

1790 1795 1800

Val Ser Asn Lys Val Lys Ala Ser Arg Lys Leu Thr Glu Leu Glu

1805 1810 1815

Asn Glu Leu Asn Thr Lys

1820

<210> 45

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCSK9 sgRNA target

<400> 45

gagggagatt tgacacacac agg 23

<210> 46

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 2X glycine linker

<400> 46

Gly Gly Gly Gly Gly Gly

1 5

<210> 47

<211> 3564

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> targeted PCSK9 genomic locus

<400> 47

gtgtggggct gcctccccga gcttccatct gccgctgggg ccacacccca ggcccaggga 60

tgggacccca cagtggtcac atcatcttgc agcagaaccc aggtacagct cctggagcag 120

atggtggtcc caagcacggg tgggaccaga aaggactctc acctgggcta actcagctgc 180

agcctcagtt ccctcctcac acacgacgag gaacatggac tggaagcctg cccagcaggc 240

cttctgctcg atgtgcgttg tgtggcttac gtccagggag ggaagcagcc tctgtgctgt 300

cttctagata agcctgtatt ccccgggctg tctgccaatg tatccagttg tcccgtcagc 360

ctggaagctc tgagggaaaa ccttgggctg cttcctgagc acctgtatcc cctgcagcca 420

gcccggggcc tctgctagga gcagactgag catggcttat gggcctggca ccatctggcc 480

tctgcccacc ttgctggcct tgtcttgtgt ctgccccttc gacattccat agcccagctc 540

aatatctagt ggttcctcta gggtggcgag cactgtttgg tctccagatg tcttcaggtc 600

ggagctcaca gcgctctcag ccaccccttc ccagtgtagc accgggcaca tggtagatgc 660

ctattgatga gtgaaagctc ctaacacact cagagagcaa ggactccgcc tcatcccaca 720

gcctgggagg agaggcagac tgccaaggac ctgctcagca tgctacagaa gaaaccaaag 780

tgcccacggg actgatcagt ggagcttcct gccgagactg gaggccttag ggcagggtag 840

acagtgtgtg tgcaggctgg ggactcacag ttcggactgt gcccagacct actagcatag 900

tgggtgggtg ggaggatgcg ggactggggg ccgaccttgc ctgaaattca tgtgggatct 960

cagagcagcc actgaattgc tctgtagggg gctaaatagt ggcccccaca gatacacaca 1020

cccagacaga gcctgtgagc cagaccttat ttggagaaaa ggtctttgta gatgtaatta 1080

agcatctcaa gatggcatca tctggattat gcggtgggct gtaagtcctg tgatgtgtct 1140

ttatgagaga aaggcagagg gagatttgac acacacagga ggggccacgt ggagacagag 1200

gtggagattg gagaaatgtg gccacaagcc agggaacacc agcagccacc agaagccgga 1260

agacgtgagg cagggttctt cccagagcct tcgctgctga gtctgggaat ttgtgaccga 1320

agccataaga agtgggtaca cgccctgagc ctcccacact tgctcacctg tcctgagatg 1380

agaatctcta ctctgcagca tatttggagg atcactgcgg gggccacaga ggtgctgttc 1440

agatggcact tcagaagact caggagaccc tggggcagga gcagtttgac tgacagccca 1500

gagggctgcc ctctgattcc acctgaggcc ctgcttttcc tggctgcagg ggttccaggg 1560

ccaggccatt tccgctggcg caggactctg ctagcagcaa cctgcctgaa gtcttccttt 1620

ggcctggctg agagtttctg agacctgcgc tggagcggag gtgcttcctt ccttgcttcc 1680

tttcttcctc tctcccttct ccatccagca ggctggacct gcctggcatc tgtgagctct 1740

ccctactttc tcctataccc taacctttgt cctgcatggg cgactccccc agtgagtctc 1800

ttgcagcttt taccccagtg cctgcttctt ggagaatcca aactgatcca gttagggatg 1860

ataaagtgta gggtaggcgc tcggtgactg ttttctctga ggttgtgact cgtgtgaggc 1920

agaagcagtc cccgtgagcc ctcctggtat cttgtggagt ggagaacgct tggacctgga 1980

gccaggaggc ccagacatac atcctgtccg agctgcagct tcctgtctct aaaatgagcc 2040

ggccagcgca ggtggccaga catcactgtt attctccttt gagtctttaa atcttgttgt 2100

ctttcttgca gactcggtga gctgtgaaag gctataatag gggctttatt ttacactttg 2160

atactatttt ttgaacattc atattattgt tagatattga tattcatatg aaggagcagg 2220

atgacttggg tccttcttgg cagtagcatt gccagctgat ggccttggac agttacctgc 2280

cctctctagg cctccctttc cttgtctatg aaatacatta tagaatagga tgtagtgtgt 2340

gaggattttt tggaggttaa acgagtgaat atatttaagg cgctttcacc agtgcctggg 2400

atgtgctctg tagtttctgt gtgttaacta taaggttgac tttatgctca ttccctcctc 2460

tcccacaaat gtcgccttgg aaagacggag gcagcctggt ggaggtgtat ctcctagaca 2520

ccagcataca gagtgaccac cgggaaatcg agggcagggt catggtcacc gacttcgaga 2580

atgtgcccga ggaggacggg acccgcttcc acagacaggt aagcacggcc gtctgatggg 2640

agggctgcct ctgcccatat ccccatcctg gaggtgggtg gggactgcca ccccagagcg 2700

ttgcagctgt actcctgggt tgcacccccc ccagctgtca ctgtcccctc cctgccatca 2760

gttgtgggaa gggcgttcat ccatccagcc acctgctgat ttgttatagg gtggaggggg 2820

ggtctttctc atgtggtcct tgtgttcgtc gagcaggcca gcaagtgtga cagtcatggc 2880

acccacctgg caggggtggt cagcggccgg gatgccggcg tggccaaggg tgccagcatg 2940

cgcagcctgc gcgtgctcaa ctgccaaggg aagggcacgg ttagcggcac cctcataggt 3000

aagtgatggc cccagacgct ggtctctctc catctggacc tggcctggga ggtggcttgg 3060

gctgggccca gggagagcta atgtctccta accaagaatg ctgtggcagc ctctgccgca 3120

gagccagaga accagagtgc caaggctggc agggttccca gtggccacga gtgcagatga 3180

agaaacccag gccccaagag ggtcatgcag gtagcccagg gagttcagcc ttgaccctgg 3240

gtcaatgacc tttccacagt tccacactgc tcccctttta aaatccggtg atgtctttat 3300

gtcttttgtt atgttatctt caatgtggag ggactcgagg tgatctaagc aaactttttc 3360

tatcttctgc ttgcatacct ctgagaccag gggactcact cacttgcatg actgggccct 3420

gcaggtcaca ctggccaggc agatgtggtg gaggaactgg cagaggactt tttctagact 3480

gtgactacat ttagtccacc cagcggcccc cctatgaagt ccagttgaga actaggactc 3540

tgggggccgg tggacagaga agag 3564

<210> 48

<211> 3888

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> PCSK9-dTAG杂合体

<400> 48

gtgtggggct gcctccccga gcttccatct gccgctgggg ccacacccca ggcccaggga 60

tgggacccca cagtggtcac atcatcttgc agcagaaccc aggtacagct cctggagcag 120

atggtggtcc caagcacggg tgggaccaga aaggactctc acctgggcta actcagctgc 180

agcctcagtt ccctcctcac acacgacgag gaacatggac tggaagcctg cccagcaggc 240

cttctgctcg atgtgcgttg tgtggcttac gtccagggag ggaagcagcc tctgtgctgt 300

cttctagata agcctgtatt ccccgggctg tctgccaatg tatccagttg tcccgtcagc 360

ctggaagctc tgagggaaaa ccttgggctg cttcctgagc acctgtatcc cctgcagcca 420

gcccggggcc tctgctagga gcagactgag catggcttat gggcctggca ccatctggcc 480

tctgcccacc ttgctggcct tgtcttgtgt ctgccccttc gacattccat agcccagctc 540

aatatctagt ggttcctcta gggtggcgag cactgtttgg tctccagatg tcttcaggtc 600

ggagctcaca gcgctctcag ccaccccttc ccagtgtagc accgggcaca tggtagatgc 660

ctattgatga gtgaaagctc ctaacacact cagagagcaa ggactccgcc tcatcccaca 720

gcctgggagg agaggcagac tgccaaggac ctgctcagca tgctacagaa gaaaccaaag 780

tgcccacggg actgatcagt ggagcttcct gccgagactg gaggccttag ggcagggtag 840

acagtgtgtg tgcaggctgg ggactcacag ttcggactgt gcccagacct actagcatag 900

tgggtgggtg ggaggatgcg ggactggggg ccgaccttgc ctgaaattca tgtgggatct 960

cagagcagcc actgaattgc tctgtagggg gctaaatagt ggcccccaca gatacacaca 1020

cccagacaga gcctgtgagc cagaccttat ttggagaaaa ggtctttgta gatgtaatta 1080

agcatctcaa gatggcatca tctggattat gcggtgggct gtaagtcctg tgatgtgtct 1140

ttatgggagt gcaggtggaa accatctccc caggagacgg gcgcaccttc cccaagcgcg 1200

gccagacctg cgtggtgcac tacaccggga tgcttgaaga tggaaagaaa gttgattcct 1260

cccgggacag aaacaagccc tttaagttta tgctaggcaa gcaggaggtg atccgaggct 1320

gggaagaagg ggttgcccag atgagtgtgg gtcagagagc caaactgact atatctccag 1380

attatgccta tggtgccact gggcacccag gcatcatccc accacatgcc actctcgtct 1440

tcgatgtgga gcttctaaaa ctggggggga gagaaaggca gagggagatt tgacacacac 1500

aggaggggcc acgtggagac agaggtggag attggagaaa tgtggccaca agccagggaa 1560

caccagcagc caccagaagc cggaagacgt gaggcagggt tcttcccaga gccttcgctg 1620

ctgagtctgg gaatttgtga ccgaagccat aagaagtggg tacacgccct gagcctccca 1680

cacttgctca cctgtcctga gatgagaatc tctactctgc agcatatttg gaggatcact 1740

gcgggggcca cagaggtgct gttcagatgg cacttcagaa gactcaggag accctggggc 1800

aggagcagtt tgactgacag cccagagggc tgccctctga ttccacctga ggccctgctt 1860

ttcctggctg caggggttcc agggccaggc catttccgct ggcgcaggac tctgctagca 1920

gcaacctgcc tgaagtcttc ctttggcctg gctgagagtt tctgagacct gcgctggagc 1980

ggaggtgctt ccttccttgc ttcctttctt cctctctccc ttctccatcc agcaggctgg 2040

acctgcctgg catctgtgag ctctccctac tttctcctat accctaacct ttgtcctgca 2100

tgggcgactc ccccagtgag tctcttgcag cttttacccc agtgcctgct tcttggagaa 2160

tccaaactga tccagttagg gatgataaag tgtagggtag gcgctcggtg actgttttct 2220

ctgaggttgt gactcgtgtg aggcagaagc agtccccgtg agccctcctg gtatcttgtg 2280

gagtggagaa cgcttggacc tggagccagg aggcccagac atacatcctg tccgagctgc 2340

agcttcctgt ctctaaaatg agccggccag cgcaggtggc cagacatcac tgttattctc 2400

ctttgagtct ttaaatcttg ttgtctttct tgcagactcg gtgagctgtg aaaggctata 2460

ataggggctt tattttacac tttgatacta ttttttgaac attcatatta ttgttagata 2520

ttgatattca tatgaaggag caggatgact tgggtccttc ttggcagtag cattgccagc 2580

tgatggcctt ggacagttac ctgccctctc taggcctccc tttccttgtc tatgaaatac 2640

attatagaat aggatgtagt gtgtgaggat tttttggagg ttaaacgagt gaatatattt 2700

aaggcgcttt caccagtgcc tgggatgtgc tctgtagttt ctgtgtgtta actataaggt 2760

tgactttatg ctcattccct cctctcccac aaatgtcgcc ttggaaagac ggaggcagcc 2820

tggtggaggt gtatctccta gacaccagca tacagagtga ccaccgggaa atcgagggca 2880

gggtcatggt caccgacttc gagaatgtgc ccgaggagga cgggacccgc ttccacagac 2940

aggtaagcac ggccgtctga tgggagggct gcctctgccc atatccccat cctggaggtg 3000

ggtggggact gccaccccag agcgttgcag ctgtactcct gggttgcacc ccccccagct 3060

gtcactgtcc cctccctgcc atcagttgtg ggaagggcgt tcatccatcc agccacctgc 3120

tgatttgtta tagggtggag ggggggtctt tctcatgtgg tccttgtgtt cgtcgagcag 3180

gccagcaagt gtgacagtca tggcacccac ctggcagggg tggtcagcgg ccgggatgcc 3240

ggcgtggcca agggtgccag catgcgcagc ctgcgcgtgc tcaactgcca agggaagggc 3300

acggttagcg gcaccctcat aggtaagtga tggccccaga cgctggtctc tctccatctg 3360

gacctggcct gggaggtggc ttgggctggg cccagggaga gctaatgtct cctaaccaag 3420

aatgctgtgg cagcctctgc cgcagagcca gagaaccaga gtgccaaggc tggcagggtt 3480

cccagtggcc acgagtgcag atgaagaaac ccaggcccca agagggtcat gcaggtagcc 3540

cagggagttc agccttgacc ctgggtcaat gacctttcca cagttccaca ctgctcccct 3600

tttaaaatcc ggtgatgtct ttatgtcttt tgttatgtta tcttcaatgt ggagggactc 3660

gaggtgatct aagcaaactt tttctatctt ctgcttgcat acctctgaga ccaggggact 3720

cactcacttg catgactggg ccctgcaggt cacactggcc aggcagatgt ggtggaggaa 3780

ctggcagagg actttttcta gactgtgact acatttagtc cacccagcgg cccccctatg 3840

aagtccagtt gagaactagg actctggggg ccggtggaca gagaagag 3888

<210> 49

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CTNNB1 sgRNA靶标

<400> 49

taccacagct ccttctctga gtgg 24

<210> 50

<211> 1650

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CTNNB1基因组基因座

<400> 50

aaataatttt tgatggcact atatcagaaa acaacttgtt aaagaaaatg tggagttttt 60

aaaatcccac tgtacctctg ttatccaaag gggatctgtg aatttttctg tgaaaggtta 120

aaaaaggaga gacctttagg aattcagaga gcagctgatt tttgaatagt gttttcccct 180

ccctggcttt tattattaca actctgtgct ttttcatcac catcctgaat atctataatt 240

aatatttata ctattaataa aaagacattt ttggtaagga ggagttttca ctgaagttca 300

gcagtgatgg agctgtggtt gaggtgtctg gaggagacca tgaggtctgc gtttcactaa 360

cctggtaaaa gaggatatgg gttttttttg tgggtgtaat agtgacattt aacaggtatc 420

ccagtgactt aggagtatta atcaagctaa atttaaatcc taatgacttt tgattaactt 480

tttttagggt atttgaagta taccatacaa ctgttttgaa aatccagcgt ggacaatggc 540

tactcaaggt ttgtgtcatt aaatctttag ttactgaatt ggggctctgc ttcgttgcca 600

ttaagccagt ctggctgaga tccccctgct ttcctctctc cctgcttact tgtcaggcta 660

ccttttgctc cattttctgc tcactcctcc taatggcttg gtgaaatagc aaacaagcca 720

ccagcaggaa tctagtctgg atgactgctt ctggagcctg gatgcagtac cattcttcca 780

ctgattcagt gagtaactgt taggtggttc cctaagggat taggtatttc atcactgagc 840

taaccctggc tatcattctg cttttcttgg ctgtctttca gatttgactt tatttctaaa 900

aatatttcaa tgggtcatat cacagattct ttttttttaa attaaagtaa catttccaat 960

ctactaatgc taatactgtt tcgtatttat agctgatttg atggagttgg acatggccat 1020

ggaaccagac agaaaagcgg ctgttagtca ctggcagcaa cagtcttacc tggactctgg 1080

aatccattct ggtgccacta ccacagctcc ttctctgagt ggtaaaggca atcctgagga 1140

agaggatgtg gatacctccc aagtcctgta tgagtgggaa cagggatttt ctcagtcctt 1200

cactcaagaa caagtagctg gtaagagtat tatttttcat tgccttactg aaagtcagaa 1260

tgcagttttg agaactaaaa agttagtgta taatagttta aataaaatgt tgtggtgaag 1320

aaaagagagt aatagcaatg tcacttttac catttaggat agcaaatact taggtaaatg 1380

ctgaactgtg gatagtgagt gttgaattaa ccttttccag atattgatgg acagtatgca 1440

atgactcgag ctcagagggt acgagctgct atgttccctg agacattaga tgagggcatg 1500

cagatcccat ctacacagtt tgatgctgct catcccacta atgtccagcg tttggctgaa 1560

ccatcacaga tgctgaaaca tgcagttgta aacttgatta actatcaaga tgatgcagaa 1620

cttgccacac gtgcaatccc tgaactgaca 1650

<210> 51

<211> 1977

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> CTNNB1-dTAG杂合体

<400> 51

aaataatttt tgatggcact atatcagaaa acaacttgtt aaagaaaatg tggagttttt 60

aaaatcccac tgtacctctg ttatccaaag gggatctgtg aatttttctg tgaaaggtta 120

aaaaaggaga gacctttagg aattcagaga gcagctgatt tttgaatagt gttttcccct 180

ccctggcttt tattattaca actctgtgct ttttcatcac catcctgaat atctataatt 240

aatatttata ctattaataa aaagacattt ttggtaagga ggagttttca ctgaagttca 300

gcagtgatgg agctgtggtt gaggtgtctg gaggagacca tgaggtctgc gtttcactaa 360

cctggtaaaa gaggatatgg gttttttttg tgggtgtaat agtgacattt aacaggtatc 420

ccagtgactt aggagtatta atcaagctaa atttaaatcc taatgacttt tgattaactt 480

tttttagggt atttgaagta taccatacaa ctgttttgaa aatccagcgt ggacaatggg 540

agtgcaggtg gaaaccatct ccccaggaga cgggcgcacc ttccccaagc gcggccagac 600

ctgcgtggtg cactacaccg ggatgcttga agatggaaag aaagttgatt cctcccggga 660

cagaaacaag ccctttaagt ttatgctagg caagcaggag gtgatccgag gctgggaaga 720

aggggttgcc cagatgagtg tgggtcagag agccaaactg actatatctc cagattatgc 780

ctatggtgcc actgggcacc caggcatcat cccaccacat gccactctcg tcttcgatgt 840

ggagcttcta aaactggggg ggatggctac tcaaggtttg tgtcattaaa tctttagtta 900

ctgaattggg gctctgcttc gttgccatta agccagtctg gctgagatcc ccctgctttc 960

ctctctccct gcttacttgt caggctacct tttgctccat tttctgctca ctcctcctaa 1020

tggcttggtg aaatagcaaa caagccacca gcaggaatct agtctggatg actgcttctg 1080

gagcctggat gcagtaccat tcttccactg attcagtgag taactgttag gtggttccct 1140

aagggattag gtatttcatc actgagctaa ccctggctat cattctgctt ttcttggctg 1200

tctttcagat ttgactttat ttctaaaaat atttcaatgg gtcatatcac agattctttt 1260

tttttaaatt aaagtaacat ttcaatctac taatgctaat actgtttcgt atttatagcc 1320

tgatttgatg gagttggaca tggccatgga accagacaga aaagcggctg ttagtcactg 1380

gcagcaacag tcttacctgg actctggaat ccattctggt gccactacca cagctccttc 1440

tctgagtggt aaaggcaatc ctgaggaaga ggatgtggat acctcccaag tcctgtatga 1500

gtgggaacag ggattttctc agtccttcac tcaagaacaa gtagctggta agagtattat 1560

ttttcattgc cttactgaaa gtcagaatgc agttttgaga actaaaaagt tagtgtataa 1620

tagtttaaat aaaatgttgt ggtgaagaaa agagagtaat agcaatgtca cttttaccat 1680

ttaggatagc aaatacttag gtaaatgctg aactgtggat agtgagtgtt gaattaacct 1740

tttccagata ttgatggaca gtatgcaatg actcgagctc agagggtacg agctgctatg 1800

ttccctgaga cattagatga gggcatgcag atcccatcta cacagtttga tgctgctcat 1860

cccactaatg tccagcgttt ggctgaacca tcacagatgc tgaaacatgc agttgtaaac 1920

ttgattaact atcaagatga tgcagaactt gccacacgtg caatccctga actgaca 1977

<210> 52

<211> 1368

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Cas-9核酸酶

<400> 52

Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val

1 5 10 15

Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe

20 25 30

Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile

35 40 45

Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu

50 55 60

Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys

65 70 75 80

Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser

85 90 95

Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys

100 105 110

His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr

115 120 125

His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp

130 135 140

Ser Thr Asp Lys Ala Asp Leu Arg Leu Ile Tyr Leu Ala Leu Ala His

145 150 155 160

Met Ile Lys Phe Arg Gly His Phe Leu Ile Glu Gly Asp Leu Asn Pro

165 170 175

Asp Asn Ser Asp Val Asp Lys Leu Phe Ile Gln Leu Val Gln Thr Tyr

180 185 190

Asn Gln Leu Phe Glu Glu Asn Pro Ile Asn Ala Ser Gly Val Asp Ala

195 200 205

Lys Ala Ile Leu Ser Ala Arg Leu Ser Lys Ser Arg Arg Leu Glu Asn

210 215 220

Leu Ile Ala Gln Leu Pro Gly Glu Lys Lys Asn Gly Leu Phe Gly Asn

225 230 235 240

Leu Ile Ala Leu Ser Leu Gly Leu Thr Pro Asn Phe Lys Ser Asn Phe

245 250 255

Asp Leu Ala Glu Asp Ala Lys Leu Gln Leu Ser Lys Asp Thr Tyr Asp

260 265 270

Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp

275 280 285

Leu Phe Leu Ala Ala Lys Asn Leu Ser Asp Ala Ile Leu Leu Ser Asp

290 295 300

Ile Leu Arg Val Asn Thr Glu Ile Thr Lys Ala Pro Leu Ser Ala Ser

305 310 315 320

Met Ile Lys Arg Tyr Asp Glu His His Gln Asp Leu Thr Leu Leu Lys

325 330 335

Ala Leu Val Arg Gln Gln Leu Pro Glu Lys Tyr Lys Glu Ile Phe Phe

340 345 350

Asp Gln Ser Lys Asn Gly Tyr Ala Gly Tyr Ile Asp Gly Gly Ala Ser

355 360 365

Gln Glu Glu Phe Tyr Lys Phe Ile Lys Pro Ile Leu Glu Lys Met Asp

370 375 380

Gly Thr Glu Glu Leu Leu Val Lys Leu Asn Arg Glu Asp Leu Leu Arg

385 390 395 400

Lys Gln Arg Thr Phe Asp Asn Gly Ser Ile Pro His Gln Ile His Leu

405 410 415

Gly Glu Leu His Ala Ile Leu Arg Arg Gln Glu Asp Phe Tyr Pro Phe

420 425 430

Leu Lys Asp Asn Arg Glu Lys Ile Glu Lys Ile Leu Thr Phe Arg Ile

435 440 445

Pro Tyr Tyr Val Gly Pro Leu Ala Arg Gly Asn Ser Arg Phe Ala Trp

450 455 460

Met Thr Arg Lys Ser Glu Glu Thr Ile Thr Pro Trp Asn Phe Glu Glu

465 470 475 480

Val Val Asp Lys Gly Ala Ser Ala Gln Ser Phe Ile Glu Arg Met Thr

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Tyr Val Thr Glu Gly Met Arg Lys Pro Ala Phe Leu Ser Gly Glu Gln

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Lys Lys Ala Ile Val Asp Leu Leu Phe Lys Thr Asn Arg Lys Val Thr

545 550 555 560

Val Lys Gln Leu Lys Glu Asp Tyr Phe Lys Lys Ile Glu Cys Phe Asp

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Ser Val Glu Ile Ser Gly Val Glu Asp Arg Phe Asn Ala Ser Leu Gly

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Thr Tyr His Asp Leu Leu Lys Ile Ile Lys Asp Lys Asp Phe Leu Asp

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Lys Ala Gly Phe Ile Lys Arg Gln Leu Val Glu Thr Arg Gln Ile Thr

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Lys Leu Val Ser Asp Phe Arg Lys Asp Phe Gln Phe Tyr Lys Val Arg

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Phe Lys Tyr Phe Asp Thr Thr Ile Asp Arg Lys Arg Tyr Thr Ser

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<210> 53

<211> 327

<212> PRT

<213> 智人

<400> 53

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325

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<211> 327

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<220>

<223> 表皮生长因子受体 T790M dTAG

<400> 54

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Ile Lys Glu Leu Arg Glu Ala Thr Ser Pro Lys Ala Asn Lys Glu Ile

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65 70 75 80

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325

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<220>

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Tyr Leu Ile Pro Gln Gln Gly

325

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<211> 327

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<220>

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Tyr Leu Ile Pro Gln Gln Gly

325

<210> 57

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 表皮生长因子受体(BCR-ABL)

<400> 57

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<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> BCR-ABL

<400> 58

Ser Pro Asn Tyr Asp Lys Trp Glu Met Glu Arg Thr Asp Ile Thr Met

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Lys His Lys Leu Gly Gly Gly Gln Tyr Gly Glu Val Tyr Glu Gly Val

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Trp Lys Lys Tyr Ser Leu Thr Val Ala Val Lys Thr Leu Lys Glu Asp

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<213> 智人

<400> 59

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20 25 30

Ser Ile Ser Asp Leu Lys Glu Val Pro Arg Lys Asn Ile Thr Leu Ile

35 40 45

Arg Gly Leu Gly His Gly Ala Phe Gly Glu Val Tyr Glu Gly Gln Val

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Gly Val Ser Leu Gln Ser Leu Pro Arg Phe Ile Met Leu Glu Leu Met

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Arg Val Ala Lys Ile Gly Asp Phe Gly Met Ala Arg Asp Ile Tyr Arg

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Met Pro Tyr Pro Ser Lys Ser Asn Gln Glu Val Leu Glu Phe Val Thr

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Ser Gly Gly Arg Met Asp Pro Pro Lys Asn Cys Pro Gly Pro Val Tyr

275 280 285

Arg Ile Met Thr Gln Cys Trp Gln His Gln Pro Glu Asp Arg Pro Asn

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Phe Ala Ile Ile Leu Glu Arg Ile Glu Tyr Cys Thr Gln Asp Pro Asp

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Val Ile Asn Thr Ala Leu Pro Ile Glu Tyr Gly Pro Leu Val Glu Glu

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Glu Glu Lys

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<212> PRT

<213> 智人

<400> 60

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<210> 61

<211> 272

<212> PRT

<213> 智人

<400> 61

Asp Trp Glu Ile Pro Asp Gly Gln Ile Thr Val Gly Gln Arg Ile Gly

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Ser Gly Ser Phe Gly Thr Val Tyr Lys Gly Lys Trp His Gly Asp Val

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65 70 75 80

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85 90 95

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Ala Arg Gly Met Asp Tyr Leu His Ala Lys Ser Ile Ile His Arg Asp

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Gln Phe Glu Gln Leu Ser Gly Ser Ile Leu Trp Met Ala Pro Glu Val

165 170 175

Ile Arg Met Gln Asp Ser Asn Pro Tyr Ser Phe Gln Ser Asp Val Tyr

180 185 190

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195 200 205

Ser Asn Ile Asn Asn Arg Asp Gln Ile Ile Glu Met Val Gly Arg Gly

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Ser Leu Ser Pro Asp Leu Ser Lys Val Arg Ser Asn Cys Pro Lys Arg

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Met Lys Arg Leu Met Ala Glu Cys Leu Lys Lys Lys Arg Asp Glu Arg

245 250 255

Pro Ser Phe Pro Arg Ile Leu Ala Glu Ile Glu Glu Leu Ala Arg Glu

260 265 270

<210> 62

<211> 254

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> dTAG序列

<400> 62

Leu Arg Leu Glu Val Lys Leu Gly Gln Gly Cys Phe Gly Glu Val Trp

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Met Gly Thr Trp Asn Gly Thr Thr Arg Val Ala Ile Lys Thr Leu Lys

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35 40 45

Lys Lys Leu Arg His Glu Lys Leu Val Gln Leu Tyr Ala Val Val Ser

50 55 60

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Leu Asp Phe Leu Lys Gly Glu Thr Gly Lys Tyr Leu Arg Leu Pro Gln

85 90 95

Leu Val Asp Met Ala Ala Gln Ile Ala Ser Gly Met Ala Tyr Val Glu

100 105 110

Arg Met Asn Tyr Val His Arg Asp Leu Arg Ala Ala Asn Ile Leu Val

115 120 125

Gly Glu Asn Leu Val Cys Lys Val Ala Asp Phe Gly Leu Ala Arg Leu

130 135 140

Ile Glu Asp Asn Glu Tyr Thr Ala Arg Gln Gly Ala Lys Phe Pro Ile

145 150 155 160

Lys Trp Thr Ala Pro Glu Ala Ala Leu Tyr Gly Arg Phe Thr Ile Lys

165 170 175

Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly Ile Leu Leu Thr Glu Leu Thr Thr Lys

180 185 190

Gly Arg Val Pro Tyr Pro Gly Met Val Asn Arg Glu Val Leu Asp Gln

195 200 205

Val Glu Arg Gly Tyr Arg Met Pro Cys Pro Pro Glu Cys Pro Glu Ser

210 215 220

Leu His Asp Leu Met Cys Gln Cys Trp Arg Lys Glu Pro Glu Glu Arg

225 230 235 240

Pro Thr Phe Glu Tyr Leu Gln Ala Phe Leu Glu Asp Tyr Phe

245 250

<210> 63

<211> 254

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> dTAG序列

<400> 63

Leu Arg Leu Glu Val Lys Leu Gly Gln Gly Cys Phe Gly Glu Val Trp

1 5 10 15

Met Gly Thr Trp Asn Gly Thr Thr Arg Val Ala Ile Lys Thr Leu Lys

20 25 30

Pro Gly Thr Met Ser Pro Glu Ala Phe Leu Gln Glu Ala Gln Val Met

35 40 45

Lys Lys Leu Arg His Glu Lys Leu Val Gln Leu Tyr Ala Val Val Ser

50 55 60

Glu Glu Pro Ile Tyr Ile Val Thr Glu Tyr Ala Ser Lys Gly Ser Leu

65 70 75 80

Leu Asp Phe Leu Lys Gly Glu Thr Gly Lys Tyr Leu Arg Leu Pro Gln

85 90 95

Leu Val Asp Met Ala Ala Gln Ile Ala Ser Gly Met Ala Tyr Val Glu

100 105 110

Arg Met Asn Tyr Val His Arg Asp Leu Arg Ala Ala Asn Ile Leu Val

115 120 125

Gly Glu Asn Leu Val Cys Lys Val Ala Asp Phe Gly Leu Ala Arg Leu

130 135 140

Ile Glu Asp Asn Glu Tyr Thr Ala Arg Gln Gly Ala Lys Phe Pro Ile

145 150 155 160

Lys Trp Thr Ala Pro Glu Ala Ala Leu Tyr Gly Arg Phe Thr Ile Lys

165 170 175

Ser Asp Val Trp Ser Phe Gly Ile Leu Leu Thr Glu Leu Thr Thr Lys

180 185 190

Gly Arg Val Pro Tyr Pro Gly Met Val Asn Arg Glu Val Leu Asp Gln

195 200 205

Val Glu Arg Gly Tyr Arg Met Pro Cys Pro Pro Glu Cys Pro Glu Ser

210 215 220

Leu His Asp Leu Met Cys Gln Cys Trp Arg Lys Glu Pro Glu Glu Arg

225 230 235 240

Pro Thr Phe Glu Tyr Leu Gln Ala Phe Leu Glu Asp Tyr Phe

245 250

Claims

1.一种转化细胞，包括：

基因组整合的核酸序列，其编码能够被异双功能性化合物结合的异双功能性化合物靶向蛋白；

其中该dTAG包括衍生自EGFR、BCR-ABL、ALK、JAK2、BRAF、Src、LRRK2、PDGFRα或RET的氨基酸序列；

其中该编码dTAG的核酸序列与编码内源性蛋白质的基因的核酸序列以5'或3'方向基因组框内整合；

其中该编码内源性蛋白质的基因的表达产生内源性蛋白质-dTAG杂合蛋白；

其中该异双功能性化合物能够a)通过该dTAG结合该内源性蛋白质-dTAG杂合蛋白和b)以使该内源性蛋白质-dTAG杂合蛋白接近泛素连接酶的方式结合该泛素连接酶；

其中该内源性蛋白质-dTAG杂合蛋白经泛素化，然后被蛋白酶体降解。

2.如权利要求1所述的转化细胞，其中该细胞是人类细胞。

3.如权利要求2所述的转化细胞，其中该人类细胞是肝细胞。

4.如权利要求1至3中任一者所述的转化细胞，其中该异双功能性化合物靶向蛋白包括来自非内源性蛋白质的氨基酸序列。

5.如权利要求1至4中任一者所述的转化细胞，其中该异双功能性化合物靶向蛋白包含选自SEQ.ID.NO.:53至63的氨基酸序列。

6.如权利要求1至4中任一项所述的转化细胞，其中该异双功能性化合物靶向蛋白是衍生自EGFR的氨基酸序列。

7.如权利要求6所述的转化细胞，其中该异双功能性化合物靶向蛋白是SEQ.ID.NO.:53的氨基酸序列。

8.如权利要求6所述的转化细胞，其中该异双功能性化合物靶向蛋白是SEQ.ID.NO.:54的氨基酸序列。

9.如权利要求6所述的转化细胞，其中该异双功能性化合物靶向蛋白是SEQ.ID.NO.:55的氨基酸序列。

10.如权利要求6所述的转化细胞，其中异双功能性化合物靶向蛋白是SEQ.ID.NO.:56的氨基酸序列。

11.如权利要求1至4中任一者所述的的转化细胞，其中该异双功能性化合物靶向蛋白是衍生自BCR-ABL的氨基酸序列。

12.如权利要求11所述的转化细胞，其中该异双功能性化合物靶向蛋白是SEQ.ID.NO.:57的氨基酸序列。

13.如权利要求11所述的转化细胞，其中该异双功能性化合物靶向蛋白是SEQ.ID.NO.:58的氨基酸序列。

14.如权利要求1至4中任一者所述的转化细胞，其中该异双功能性化合物靶向蛋白是衍生自ALK的氨基酸序列。

15.如权利要求14所述的转化细胞，其中该异双功能性化合物靶向蛋白是SEQ.ID.NO.:59的氨基酸序列。

16.如权利要求1至4中任一者所述的转化细胞，其中该异双功能性化合物靶向蛋白是衍生自JAK2的氨基酸序列。

17.如权利要求16所述的转化细胞，其中该异双功能性化合物靶向蛋白是SEQ.ID.NO.:60的氨基酸序列。

18.如权利要求1至4中任一者所述的转化细胞，其中该异双功能性化合物靶向蛋白是衍生自BRAF的氨基酸序列。

19.如权利要求18所述的转化细胞，其中该异双功能性化合物靶向蛋白是SEQ.ID.NO.:61的氨基酸序列。

20.如权利要求1至4中任一者所述的转化细胞，其中该异双功能性化合物靶向蛋白是衍生自Src的氨基酸序列。

21.如权利要求20所述的转化细胞，其中该异双功能性化合物靶向蛋白是SEQ.ID.NO.:62的氨基酸序列。

22.如权利要求20所述的转化细胞，其中该异双功能性化合物靶向蛋白是SEQ.ID.NO.:63的氨基酸序列。

23.如权利要求1至4中任一者所述的转化细胞，其中该异双功能性化合物靶向蛋白是衍生自LKKR2的氨基酸序列。

24.如权利要求1至4中任一者所述的转化细胞，其中该异双功能性化合物靶向蛋白是衍生自PDGFRα的氨基酸序列。

25.如权利要求1至4中任一者所述的转化细胞，其中该异双功能性化合物靶向蛋白是衍生自RET的氨基酸序列。

26.如权利要求1至25中任一者所述的转化细胞，其中该编码异双功能性化合物靶向蛋白的核酸序列框内***编码与疾病相关的内源性蛋白质的基因，该疾病是功能获得性突变的结果、扩增或增加的表达、单基因疾病、蛋白病或其组合。

27.如权利要求1至26中任一者所述的转化细胞，还包括编码CRISPR RNA引导的内切核酸酶的核酸序列。

28.如权利要求27所述的转化细胞，其中该CRISPR RNA引导的内切核酸酶选自Cas1、Cas IB、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4和Cpf1。

29.如权利要求28所述的转化细胞，其中该核酸编码包含SEQ.ID.NO.:52的氨基酸序列的Cas9内切核酸酶。

30.如权利要求1至29中任一者所述的转化细胞，其中该异双功能性化合物靶向蛋白基本上不干扰内源性表达蛋白质的功能。

31.一种调节受试者中基因表达的方法，包括：

向该受试者给药有效量的异双功能性化合物；

其中该受试者具有一个或多个转化细胞，该转化细胞已经用编码异双功能性化合物靶向蛋白(dTAG)的核酸序列转化；

其中该编码dTAG的核酸序列与与疾病相关的内源性蛋白质的核酸序列以5'或3'方向基因组框内整合；

其中该编码dTAG的核酸序列***基因组序列中，造成在表达时产生内源性蛋白质-dTAG杂合蛋白；

其中该异双功能性化合物能够a)通过该dTAG结合该内源性蛋白质-dTAG杂合蛋白和b)以使该内源性蛋白质-dTAG杂合蛋白接近泛素连接酶的方式结合该泛素连接酶，其中该内源性蛋白质-dTAG杂合蛋白经泛素化，然后被蛋白酶体降解。

32.如权利要求31所述的方法，其中该细胞是人类细胞。

33.如权利要求32所述的方法，其中该人类细胞是肝细胞。

34.如权利要求31至33中任一项所述的方法，其中该异双功能性化合物靶向蛋白包括来自非内源性蛋白质的氨基酸序列。

35.如权利要求31至34中任一者所述的方法，其中该异双功能性化合物靶向蛋白包括选自SEQ.ID.NO.:53至63的氨基酸序列。

36.如权利要求31至34中任一者所述的方法，其中该异双功能性化合物靶向蛋白是衍生自EGFR的氨基酸序列。

37.如权利要求36所述的方法，其中该异双功能性化合物靶向蛋白是SEQ.ID.NO.:53的氨基酸序列。

38.如如权利要求36所述的方法，其中该异双功能性化合物靶向蛋白是SEQ.ID.NO.:54的氨基酸序列。

39.如权利要求36所述的方法，其中该异双功能性化合物靶向蛋白是SEQ.ID.NO.:55的氨基酸序列。

40.如权利要求36所述的方法，其中该异双功能性化合物靶向蛋白是SEQ.ID.NO.:56的氨基酸序列。

41.如权利要求31-34中任一者所述的方法，其中该异双功能性化合物靶向蛋白是衍生自BCR-ABL的氨基酸序列。

42.如权利要求41所述的方法，其中该异双功能性化合物靶向蛋白是SEQ.ID.NO.:57的氨基酸序列。

43.如权利要求41所述的方法，其中该异双功能性化合物靶向蛋白是SEQ.ID.NO.:58的氨基酸序列。

44.如权利要求31至34中任一者所述的方法，其中该异双功能性化合物靶向蛋白是衍生自ALK的氨基酸序列。

45.如权利要求44所述的方法，其中该异双功能性化合物靶向蛋白是SEQ.ID.NO.:59的氨基酸序列。

46.如权利要求31至34中任一者所述的方法，其中该异双功能性化合物靶向蛋白是衍生自JAK2的氨基酸序列。

47.如权利要求46所述的方法，其中该异双功能性化合物靶向蛋白是SEQ.ID.NO.:60的氨基酸序列。

48.如权利要求31至34中任一者所述的方法，其中该异双功能性化合物靶向蛋白是衍生自BRAF的氨基酸序列。

49.如权利要求48所述的方法，其中该异双功能性化合物靶向蛋白是SEQ.ID.NO.:61的氨基酸序列。

50.如权利要求31至34中任一者所述的方法，其中该异双功能性化合物靶向蛋白是衍生自Src的氨基酸序列。

51.如权利要求50所述的方法，其中该异双功能性化合物靶向蛋白是SEQ.ID.NO.:62的氨基酸序列。

52.如权利要求50所述的方法，其中该异双功能性化合物靶向蛋白是SEQ.ID.NO.:63的氨基酸序列。

53.如权利要求31至34中任一者所述的方法，其中该异双功能性化合物靶向蛋白是衍生自LKKR2的氨基酸序列。

54.如权利要求31至34中任一者所述的方法，其中该异双功能性化合物靶向蛋白是衍生自PDGFRα的氨基酸序列。

55.如权利要求31至34中任一者所述的方法，其中该异双功能性化合物靶向蛋白是衍生自RET的氨基酸序列。

56.如权利要求31至55中任一者所述的方法，其中该编码异双功能性化合物靶向蛋白的核酸序列框内***编码与疾病相关的内源性蛋白质的基因，该疾病是功能获得性突变的结果、扩增或增加的表达、单基因疾病、蛋白病或其组合。

57.如权利要求31至56中任一者所述的方法，还包含编码CRISPR RNA引导的内切核酸酶的核酸序列。

58.如权利要求57所述的方法，其中该CRISPR RNA引导的内切核酸酶选自Cas1、CasIB、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4和Cpf1。

59.如如利要求58所述的方法，其中该核酸编码包含SEQ.ID.NO.:52的氨基酸序列的Cas9内切核酸酶。

60.如权利要求31至59中任一者所述的方法，其中该异双功能性化合物靶向蛋白基本上不干扰内源性表达蛋白质的功能。

61.一种减少受试者中基因过表达的方法，包括：

向该受试者给药有效量的异双功能性化合物；

其中该编码dTAG的核酸序列与因蛋白质的过表达而与疾病相关的内源性蛋白质的核酸序列以5'或3'方向基因组框内整合；

62.如权利要求61所述的方法，其中该细胞是人类细胞。

63.如权利要求62所述的方法，其中该人类细胞是肝细胞。

64.如权利要求61至63中任一者所述的方法，其中该异双功能性化合物靶向蛋白包括来自非内源性蛋白质的氨基酸序列。

65.如权利要求61至64中任一者所述的方法，其中该异双功能性化合物靶向蛋白包括选自SEQ.ID.NO.:53至63的氨基酸序列。

66.如权利要求61至64中任一者所述的方法，其中该异双功能性化合物靶向蛋白是衍生自EGFR的氨基酸序列。

67.如权利要求66所述的方法，其中该异双功能性化合物靶向蛋白是SEQ.ID.NO.:53的氨基酸序列。

68.如权利要求66所述的方法，其中该异双功能性化合物靶向蛋白是SEQ.ID.NO.:54的氨基酸序列。

69.如权利要求66所述的方法，其中该异双功能性化合物靶向蛋白是SEQ.ID.NO.:55的氨基酸序列。

70.如权利要求66所述的方法，其中该异双功能性化合物靶向蛋白是SEQ.ID.NO.:56的氨基酸序列。

71.如权利要求61至64中任一项的方法，其中该异双功能性化合物靶向蛋白是衍生自BCR-ABL的氨基酸序列。

72.如权利要求71所述的方法，其中该异双功能性化合物靶向蛋白是SEQ.ID.NO.:57的氨基酸序列。

73.如权利要求71所述的方法，其中该异双功能性化合物靶向蛋白是SEQ.ID.NO.:58的氨基酸序列。

74.如权利要求61至64中任一者所述的方法，其中该异双功能性化合物靶向蛋白是衍生自ALK的氨基酸序列。

75.如权利要求74所述的方法，其中该异双功能性化合物靶向蛋白是SEQ.ID.NO.:59的氨基酸序列。

76.如权利要求61至64中任一者所述的方法，其中该异双功能性化合物靶向蛋白是衍生自JAK2的氨基酸序列。

77.如权利要求76所述的方法，其中该异双功能性化合物靶向蛋白是SEQ.ID.NO.:60的氨基酸序列。

78.如权利要求61至64中任一者所述的方法，其中该异双功能性化合物靶向蛋白是衍生自BRAF的氨基酸序列。

79.如权利要求78所述的方法，其中该异双功能性化合物靶向蛋白是SEQ.ID.NO.:61的氨基酸序列。

80.如权利要求61至64中任一者所述的方法，其中该异双功能性化合物靶向蛋白是衍生自Src的氨基酸序列。

81.如权利要求80所述的方法，其中该异双功能性化合物靶向蛋白是SEQ.ID.NO.:62的氨基酸序列。

82.如权利要求80所述的方法，其中该异双功能性化合物靶向蛋白是SEQ.ID.NO.:63的氨基酸序列。

83.如权利要求61至64中任一者所述的方法，其中该异双功能性化合物靶向蛋白是衍生自LKKR2的氨基酸序列。

84.如权利要求61至64中任一者所述的方法，其中该异双功能性化合物靶向蛋白是衍生自PDGFRα的氨基酸序列。

85.如权利要求61至64中任一者所述的方法，其中该异双功能性化合物靶向蛋白是衍生自RET的氨基酸序列。

86.如权利要求61至85中任一者所述的方法，其中该编码异双功能性化合物靶向蛋白的核酸序列框内***编码与疾病相关的内源性蛋白质的基因，该疾病是功能获得性突变的结果、扩增或增加的表达、单基因疾病、蛋白病或其组合。

87.如权利要求31至56中任一者所述的方法，还包含编码CRISPR RNA引导的内切核酸酶的核酸序列。

88.如权利要求87所述的方法，其中CRISPR RNA引导的内切核酸酶选自Cas1、Cas IB、Cas2、Cas3、Cas4、Cas5、Cas6、Cas7、Cas8、Cas9、Cas10、Csy1、Csy2、Csy3、Cse1、Cse2、Csc1、Csc2、Csa5、Csn2、Csm2、Csm3、Csm4、Csm5、Csm6、Cmr1、Cmr3、Cmr4、Cmr5、Cmr6、Csb1、Csb2、Csb3、Csx17、Csx14、Csx10、Csx16、CsaX、Csx3、Csx1、Csx15、Csf1、Csf2、Csf3、Csf4和Cpf1。

89.如权利要求88所述的方法，其中该核酸编码包含SEQ.ID.NO.:52的氨基酸序列的Cas9内切核酸酶。

90.如权利要求61至89中任一者所述的方法，其中该异双功能性化合物靶向蛋白实质上不干扰内源性表达的蛋白质的功能。