CN110616155B - 一种高产雪腐镰刀烯醇的野生菌株及其突变体的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高产雪腐镰刀烯醇的野生菌株及其突变体的构建方法，其包括：(1)筛选获得一株高产雪腐镰刀烯醇的野生型亚洲镰刀菌，产雪腐镰刀烯醇量为来源菌株平均产量的18.34倍；(2)通过Double‑joint PCR方法构建野生型亚洲镰刀菌雪腐镰刀烯醇生物合成负调控基因FaFlbA的敲除载体，并利用PEG介导的原生质体转化方法获得野生型亚洲镰刀菌的原位替换突变体。本发明亚洲镰刀菌RR108菌株的FaFlbA基因缺失突变体中雪腐镰刀烯醇的产量显著提高，在大米培养基中约为野生型菌株的9.42倍。所述的野生菌株和原位替换突变体可以用于雪腐镰刀烯醇标准品制备，对于保障小麦的质量安全具有重要意义。

Description

一种高产雪腐镰刀烯醇的野生菌株及其突变体的构建方法

技术领域

本发明涉及种一种高产雪腐镰刀烯醇的野生菌株及其突变体的构建方法，具体涉及通过自然筛选获得的高产雪腐镰刀烯醇的野生菌株并以其作为基础菌株通过靶向基因敲除技术构建得到雪腐镰刀烯醇高产突变菌株突变体。

背景技术

小麦是全球种植面积最大、总产量最高、也是最为重要的粮食作物，超过1/3的世界人口以小麦制品为主食。2018年我国小麦播种面积达到1664万公顷，总产量约1.34亿吨，小麦是中国半数以上人口的主粮，小麦及其制品的质量安全直接关系到我国过半人口的食品安全。禾谷镰刀菌复合种(Fusarium graminearum species complex，FGSC)侵染小麦引起赤霉病，不仅会造成巨大的粮食减产，而且其侵染过程中会产生多种镰刀菌毒素，目前已经获知的镰刀菌毒素包括单端孢霉烯A族的T-2毒素和HT-2毒素、单端孢霉烯B族的雪腐镰刀烯醇(nivalenol，NIV)和脱氧雪腐镰刀烯醇(deoxynivalenol，DON)以及玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)等。这些有毒的次生代谢产物具有细胞毒性、免疫毒性、遗传毒性、生殖毒性和致癌、致畸及致突变作用，给食品安全和人畜健康造成严重威胁。

亚洲国家的优势菌群为亚洲镰刀菌(Fusarium asiaticum)，主要产3ADON(脱氧雪腐镰 刀烯醇的乙酰化化学型)和雪腐镰刀烯醇，我国是镰刀菌毒素受害最为严重的国家之一，我国政府部门高度重视镰刀菌毒素污染，国家标准制定了较欧美国家更为严苛的小麦及面粉中脱氧雪腐镰刀烯醇限量标准(1000μg/kg)，但目前尚未制定雪腐镰刀烯醇限量的相关法规。据研究表明雪腐镰刀烯醇相比于脱氧雪腐镰刀烯醇的毒性更强，急性中毒症状表现为镇静、眼睑闭合、步态蹒跚、腹泻和肺、消化道充血、厌食等；慢性中毒症状表现为动物的体重降低，各脏器质量减轻伴随肿瘤发生。细胞毒性试验结果也显示雪腐镰刀烯醇比DON的更易致突变，存在致癌风险，国际癌症研究机构将其归类为3类致癌物。鉴于上述，从长远的观点而言，应当对雪腐镰刀烯醇发生的风险评估和污染防治应当给予高度重视。

长期监测雪腐镰刀烯醇的发生风险需要建立精准的仪器检测方法，获得高纯雪腐镰刀烯醇标准品则成为进行有效监测的先决条件。目前雪腐镰刀烯醇标准品主要依赖进口，且价格非常昂贵(1mg的雪腐镰刀烯醇标品价格约折合人民币1.8万元)。此外，近年来为研发粮食污染后处理方案，真菌毒素的生物脱毒成为研究热点。黄曲霉毒素、伏马毒素和玉米赤霉烯酮等的毒素降解微生物逐步用于污染粮食的脱毒处理，而对于雪腐镰刀烯醇而言昂贵的标准品也完全限制了其降解微生物的筛选工作的进展。因此，如能在雪腐镰刀烯醇标准品的制备上有所突破将为雪腐镰刀烯醇的暴露评估与控制提供测量校准和质量控制，对于保障小麦产品的质量安全有着重要的意义。

中国发明专利201610041250.9公开了一种禾谷镰刀菌脱氧雪腐镰刀菌烯醇合成的诱导物及方法，所述诱导物为2mM～4mM的腺苷-3′，5′-环单磷酸、2mM～4mM的腺苷-3′，5′-环单磷酸钠盐或8～12mg/ml的咖啡因。该发明采用cAMP、cAMP钠盐或咖啡因诱导禾谷镰刀菌脱氧雪腐镰刀菌烯醇合成，使得其产毒量及毒素合成周期缩短，但由于其基因未发生变化，其产量提高有限。

中国专利申请201810505233.5公开了一种脱氧雪腐镰刀菌烯醇定量快速检测卡，包括依次设置于底板上的样品垫、硝酸纤维素膜和吸水垫，所述硝酸纤维素膜上具有包被有DON半抗原-载体蛋白偶联剂的检测线和包被有羊抗鼠抗体的质控线，待检样本溶液在滴加到所述样品垫前与偶联有DON抗体的乳胶微球进行混合、孵育处理；其检测方法包括预热、加液、孵育、反应和读取结果；其检测准确度和精密度高；批次间差异性小成本低；所述检测卡的检测方法操作简易，适于批量化生产和应用。这表明脱氧雪腐镰刀菌烯醇定量测定已经引起行业内的重大关注。

发明内容

为了提供一种高质量的雪腐镰刀烯醇标准品，并进而提升本领域人员对雪腐镰刀烯醇研究水平，本发明公开一种高产雪腐镰刀烯醇的野生菌株及其突变体的构建方法，其包括：(1)筛选获得一株高产雪腐镰刀烯醇的野生型亚洲镰刀菌，产雪腐镰刀烯醇量为来源菌株平均产量的18.34倍；(2)通过Double-jointPCR方法构建野生型亚洲镰刀菌雪腐镰刀烯醇生物合成负调控基因FaFlbA的敲除载体，并利用PEG介导的原生质体转化方法获得野生型亚洲镰刀菌的原位替换突变体。本发明亚洲镰刀菌RR108菌株的FaFlbA基因缺失突变体中雪腐镰刀烯醇的产量显著提高，在大米培养基中约为野生型菌株的9.42倍。所述的野生菌株和原位替换突变体可以用于雪腐镰刀烯醇标准品制备。

本发明通过下述技术方案实现上述技术效果：

本发明首先请求保护一种高产雪腐镰刀烯醇的亚洲镰刀菌野生菌株，其是通过培养基自然筛选的方法获得，命名为Fusarium asiaticum RR108。本发明比较了在产毒诱导培养液和大米培养基中野生型亚洲镰刀菌Fusarium asiaticum RR108与其他菌株产雪腐镰刀烯醇的量。实验证明，筛选获得Fusarium asiaticum RR108的产毒量约为其他同类菌株平均产毒量的18.34倍，具有显著性的提高。

其筛选方法为：将待筛选亚洲镰刀菌野生型菌株在PDA培养基上活化培养，25℃培养3天后在菌落边缘打取直径为5mm的菌块，接种到大米培养基中，25℃培养21天后提取雪腐镰刀烯醇毒素并测定其含量。

本发明还请求保护一种上述高产雪腐镰刀烯醇的亚洲镰刀菌突变菌株，该菌株已经在中国典型培养物保藏中心进行菌种保藏，保藏编号为CCTCC M 2019686(保存单位代码：CCTCC-中国典型培养物保藏中心；保藏地址：中国.武汉.武汉大学；分类命名：亚洲镰刀菌RR108-F1bA Fusarium asiaticum RR108-F1bA；保藏编号:CCTCC NO:M 2019686；保藏日期：2019-9-5；是否存活：是)，其以Fusarium asiaticum RR108菌株为基础菌株，通过构建雪腐镰刀烯醇生物合成负调控基因FaFlbA的敲除载体，然后利用PEG介导的原生质体转化将基因敲除载体转化到野生型菌株RR108中并筛选其潮霉素抗性转化子，提取转化子的基因组 DNA，利用鉴定引物筛选获得的原位替换突变体。

本发明还请求保护上述所述的高产雪腐镰刀烯醇的亚洲镰刀菌突变菌株的构建方法，该构建方法具体包括如下步骤：

(1)构建目的基因敲除片段：以pBluescript质粒为载体通过Double-joint PCR方法构建FaFlbA基因的敲除载体；

具体地，以Fusarium asiaticum RR108菌株的基因组DNA为模板，分别利用引物对FlbA-3F+FlbA-3R扩增FlbA基因3’片段，利用FlbA-5F+FlbA-5R扩增FlbA基因5’片段，以质粒pBluescript为模板利用引物HPH1349-F+HPH1349-R扩增潮霉素抗性基因HPH片段，扩增片段回收纯化后进行连接反应得到FlbA基因敲除载体，利用巢式引物FlbA-nest-F+FlbA-nest-R扩增FlbA基因敲除载体；扩增反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳进行纯化回收，即得纯化后的FaFlbA基因敲除载体；

(2)转化子获得、筛选与鉴定：利用PEG介导的原生质体转化方法将FaFlbA基因敲除载体转化到Fusarium asiaticum RR108中，添加潮霉素筛选抗性转化子，提取转化子基因组DNA，利用鉴定引物FlbA-id-F+FlbA-id-R筛选其原位替换的缺失突变体，即得。

作为本发明所优选的一种实施方式，Fusarium asiaticum RR108基因组DNA的提取方法为CTAB法。

优选地，所述步骤1)中连接反应前的PCR反应体系的组成为：50μl的反应体系中含有50ng模板DNA，25μl的2×Ex，浓度为10μM的引物各1μl，PCR反应程序：94℃5分钟；94℃ 30秒，53℃30秒，72℃60秒，共32个循环；72℃5分钟。

所述步骤1)中连接反应的反应体系的组成为：25μl反应体系中：含有100ngFaFlbA基因5’片段，100ng FaFlbA基因3’片段，200ng HPH片段，2×Prime STAR GXL DNAPolymerase Mix，PCR反应程序：94℃3分钟；94℃30秒，58℃100秒，72℃180秒，共15个循环；72℃10分钟；

所述步骤1)中连接反应后PCR是以连接反应液作为模板，PCR反应体系的组成为：50μl的反应体系中含有50ng模板DNA，25μl的2×Premix Ex Taq Mix，巢式反应引物10μMFlbA-nest-F和10μM FlbA-nest-R各1μl，PCR反应程序为94℃5分钟；94℃30秒，53℃30秒，72℃180秒，共32个循环；72℃5分钟；PCR反应结束后，产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，凝胶在成像***的紫外灯下进行拍照和切割回收，进行纯化回收。

优选地，所述步骤2)中原生质体转化方法包括如下步骤：

(1)原生质体制备：Fusarium asiaticumRR108菌株在产孢诱导培养液CMC中25℃，摇床转速180rpm，光照条件下培养4天，灭菌纱布过滤后8000rpm离心10min收集孢子，挑去外形饱满的10⁵个孢子接种至50mlYEPD培养液中，在25℃，摇床转速180rpm下培养6- 8h产生幼殖体；灭菌纱布过滤收集幼殖体，使用0.7M的NaCl溶液清洗后进行酶解；配置 10ml的0.7M的NaCl溶液加入0.2g Drislase(崩溃酶)和0.1g Yatalase(真菌破壁酶)，充分溶解后，过0.4μm的细菌滤器，加入幼殖体，在30℃，100rpm摇床中裂解2h即形成原生质体；

(2)原生质体清洗与转化：10ml酶解液加入30ml 0.7M的NaCl溶液，混匀，4000rpm，4℃离心10min，弃上清，加入20ml STC溶液清洗一次，再次在4000rpm，4℃条件下离心10min，弃上清。加入1ml STC溶液，250μl SPTC溶液，混匀待用；每管加入10μl肝素钠(10mg/ml)和50μl待转化DNA纯化片段，混匀，冰上放置30min，缓慢加入150μl SPTC，室温避光放置20min，转移至20ml三角瓶，加入10ml高渗恢复培养液RM，在25℃，100rpm摇床黑暗条件培养过夜；

(3)转化子筛选培养：原生质体复原后，混入温度适宜的PDA培养基，加入潮霉素，最终浓度为100μg/mL，混匀，倒板，培养36h左右，挑选转化子至含潮霉素的PDA平板上纯化培养。

优选地，所述步骤2)中转化子鉴定中PCR体系为：在25μl的反应体系中，含有50ng模板DNA，25μl的2×Ex，各1μl引物(F和R，10μM)，PCR反应程序：94℃5分钟；94℃30秒，53℃30秒，72℃90秒，共32个循环；72℃5分钟；

优选地，步骤(1)中高产雪腐镰刀烯醇负调控基因FaFlbA的序列如SEQ ID:1所示，高产雪腐镰刀烯醇负调控基因FaFlbA编码区序列如SEQ ID:2所示。所述步骤(1)中引物序列FlbA-5F和FlbA-5R的序列分别如SEQ ID:3和SEQ ID:4所示，引物序列FlbA-3F和FlbA-3R分别如SEQ ID:5和SEQ ID:6所示，引物序列HPH1349-F和HPH1349-R分别如SEQ ID:7和SEQ ID:8所示、引物序列FlbA-nest-F和FlbA-nest-R分别如SEQ ID:9和SEQ ID:10所示。所述步骤(2)中高产雪腐镰刀烯醇缺失突变体的筛选鉴定方法中鉴定转化子是否为原位缺失突变体的引物序列FlbA-id-F和FlbA-id-R如SEQ ID:11和SEQ ID:12所示。上述引物均委托上海生工合成。

本发明通过筛选自然界高产雪腐镰刀烯醇的野生型菌株，并以此为受体菌，通过基因改造构建高产雪腐镰刀烯醇突变体。靶标基因为编码发育调控因子的FaFlbA基因，通过Double-joint PCR方法，构建FlbA的敲除载体；利用PEG介导的原生质体转化方法将FlbA基因敲除载体大片段转化到野生型菌株RR108中，添加潮霉素筛选抗性转化子，提取转化子基因组DNA，利用鉴定引物FlbA-id-F+FlbA-id-R筛选原位替换的缺失突变体。

本发明比较了产毒诱导培养液和大米培养基上野生型亚洲镰刀菌RR108及其FlbA缺失突变体产雪腐镰刀烯醇的量。实验证明，筛选获得自然界高产雪腐镰刀烯醇菌株RR108的产毒量约为其他菌株平均产毒量的18.34倍。以此为受体菌株构建的FlbA缺失突变体雪腐镰刀烯醇的产量，在产毒诱导培养液(Trichothecenes biosynthesis inducingmedium,TBI)中，相比于野生型亚洲镰刀菌RR108，增加了3.72倍；在大米培养基中，相比于野生型亚洲镰刀菌RR108，FlbA缺失突变体雪腐镰刀烯醇的产量增加了9.42倍。

本发明还提供上述野生菌株Fusarium asiaticum RR108和高产雪腐镰刀烯醇的亚洲镰刀菌突变菌株的应用，具体为野生菌株Fusarium asiaticum RR108和高产雪腐镰刀烯醇的亚洲镰刀菌突变菌株在雪腐镰刀烯醇标准品制备中的应用。本发明所述的野生菌株和突变体可以在实验室条件下大幅度提高雪腐镰刀烯醇的产生量。

本发明相对于现有技术取得了如下有益的技术效果：

筛选获得自然界高产雪腐镰刀烯醇菌株RR108的产毒量约为其他菌株平均产毒量的18.34倍。以此为受体菌株构建的FlbA缺失突变体雪腐镰刀烯醇的产量，在产毒诱导培养液(Trichothecenes biosynthesis inducing medium,TBI)中，相比于野生型亚洲镰刀菌RR108，增加了3.72倍；在大米培养基中，相比于野生型亚洲镰刀菌RR108，FlbA缺失突变体雪腐镰刀烯醇的产量增加了9.42倍。

附图说明

图1为本发明中196株不同地域、不同寄主上野生型亚洲镰刀菌Fusariumasiaticum野生型菌株雪腐镰刀烯醇产量的分布情况表。

图2为构建RR108菌株FaFlbA基因缺失突变体的PCR鉴定凝胶电泳结果。

图3为构建RR108菌株FaFlbA基因缺失突变体示意图。

图4为RR108菌株FaFlbA基因缺失突变体与野生型菌株在产毒诱导培养液TBI和大米培养基中雪腐镰刀烯醇产量对比结果。

具体实施方式

以下结合附图及具体实施例进一步描述本发明，但本领域人员应能知晓，所述实施例并不限制本发明范围。

将196株亚洲镰刀菌野生型菌株活化到PDA培养基上，25℃培养3天后，在菌落边缘打取直径为5mm的菌块，接种到大米培养基中，25℃培养21天后提取雪腐镰刀烯醇并测定其含量。

以禾谷镰刀菌中以报道的负调控单端孢霉烯B族毒素产生的编码发育调控因子的FgFlbA基因编码的氨基酸序列(FungiDB基因登陆号为：FGSG_16620)，在本实验室前期测定的高产雪腐镰刀烯醇的亚洲镰刀菌RR108菌株的基因组中比对到同源基因FaFlbA。 FaFlbA的基因序列及FaFlbA的基因的编码区序列如SEQ ID:1和SEQ ID:2所示。

设计用于扩增FaFlbA基因5’、3’片段和抗性筛选标记基因HPH的引物，序列如SEQID:3-10所示；获得转化子后，设计用于筛选鉴定原位替换的缺失突变体(基因改造菌株)的引物，序列如SEQ ID:11-12所示。

实施例1：高产雪腐镰刀烯醇亚洲镰刀菌野生型菌株的筛选

将196株亚洲镰刀菌野生型菌株活化到PDA培养基上，25℃培养3天后，在菌落边缘打取直径为5mm的菌块，接种5个菌丝块到大米培养基中，25℃培养21天后提取雪腐镰刀烯醇并测定其含量。培养前7天，每天混匀让菌株更好定殖。雪腐镰刀烯醇的提取方法为：将大米培养物吹干，粉碎，称取5g至50ml离心管内，做好编号；加入20ml提取液(50％乙腈含0.1％甲酸，体积比)，2500rpm振荡5min，3400rpm常温下离心5min；吸取2ml上清液加至装由盐包的4ml离心管内，2500rpm充分震荡1min；3500rpm离心5min，得到上清、悬浊中层以及沉淀底层，吸取全部上清至新的4ml离心管内，氮吹；吹干后，用0.5ml的50％乙腈(色谱纯)含0.1％甲酸(色谱纯)，振荡1min复溶；过0.22μm滤膜至液相瓶中，保存在4℃冰箱待上样。检测方法参照文献Fei Dong et al.,International Journal of Food Microbiology 230(2016)58–63。

如图1所示，196个野生型亚洲镰刀菌菌株在产雪腐镰刀烯醇能力上差别较大，在大米培养基上雪腐镰刀烯醇产量小于1mg/kg的菌株为135株，占68.88％；雪腐镰刀烯醇产量在1-10mg/kg的菌株为8株，占4.08％；雪腐镰刀烯醇产量在10-100mg/kg的菌株为49株，占25％；雪腐镰刀烯醇产量大于100mg/kg的菌株为4株，占2.04％。其中雪腐镰刀烯醇产量最高的菌株为RR108，产量为218.2mg/kg，为这196株亚洲镰刀菌雪腐镰刀烯醇产量平均值(11.9±2.2)的18.34倍。下一步利用RR108作为受体菌株进行基因改造。

实施例2：高产雪腐镰刀烯醇的基因缺失突变体的构建

根据禾谷镰刀菌Fusarium graminearum中以报道的负调控单端孢霉烯B族毒素产生的编码发育调控因子的FgFlbA基因编码的氨基酸序列(FungiDB基因登陆号为：FGSG_16620)参考文献Ae Ran Park et al.,Fungal Genetics and Biology 49(2012)511–520。在本实验室前期测定的高产雪腐镰刀烯醇的亚洲镰刀菌RR108菌株的基因组数据中比对到同源基因FaFlba，FaFlbA与FgFlbA的DNA序列同源性为99.67％。FaFlbA的基因序列及FaFlbA的基因的编码区序列如SEQ ID:1和SEQ ID:2所示。

如图1所示，设计用于构建FaFlbA基因缺失突变体的引物，序列如SEQ ID：3-10所示。第一轮PCR：利用CTAB法提取RR108基因组DNA，以此为模板，利用引物对FlbA-3F+ FlbA-3R、FlbA-5F+FlbA-5R扩增FaFlbA基因5’、3’的片段；提取质粒pBluescript，以此为模板，利用引物HPH1349-F+HPH1349-R以为模板，扩增潮霉素抗性基因HPH片段，其中，PCR反应体系：在50μl的反应体系中，含有50ng模板DNA，25μl的2×Ex，各1μl引物(F和R，10μM)， PCR反应程序：94℃5分钟；94℃30秒，53℃30秒，72℃60秒，共32个循环；72℃5分钟；PCR反应结束后，产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，凝胶在成像***的紫外灯下进行拍照和切割回收，进行纯化回收；二轮PCR：将一轮PCR纯化的DNA片段进行连接，25μl按照如下体系： 100ng FaFlbA基因5’片段、100ng FaFlbA基因3’片段、200ng HPH片段、2×PrimeSTA RGXL DN APolymeraseMix，PCR反应程序：94℃3分钟；94℃30秒，58℃100秒，72℃180秒，共15个循环；72℃10分钟；三轮PCR：以2轮PCR的连接反应液作模板，利用引物对FlbA-nest-F+ FlbA-nest-R进行敲除载体大片段扩增，其中，PCR反应体系：在50μl的反应体系中，含有 50ng模板DNA，25μl的2×Premix Ex Taq Mix，各1μl引物(F和R，10μM)，PCR反应程序：94℃ 5分钟；94℃30秒，53℃30秒，72℃180秒，共32个循环；72℃5分钟；PCR反应结束后，产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，凝胶在成像***的紫外灯下进行拍照和切割回收，进行纯化回收。

利用PEG介导的原生质体转化方法将FaFlbA基因敲除载体大片段转化至高产雪腐镰刀烯醇野生型菌株RR108中，其中，转化方法为：分生孢子收集：RR108菌株在产孢诱导培养液CMC中25℃，180rpm，光照，培养4天，用灭菌纱布过滤，8000rpm离心10min收集孢子，10⁵个孢子接种至50ml YEPD培养液中，25℃，180rpm，培养6-8h产生幼殖体；灭菌纱布过滤收集幼殖体，0.7M的NaCl溶液清洗后进行酶解；配置10ml的0.7M的NaCl溶液加入0.2gDrislase(崩溃酶)和0.1g Yatalase(真菌破壁酶)，充分溶解后，过0.4μm的细菌滤器，加入幼殖体，在30℃，100rpm摇床中裂解2h形成原生质体；10ml酶解液加入30ml 0.7M的NaCl 溶液，混匀，4000rpm，4℃离心10min，弃上清，加入20ml STC溶液清洗一次，再次在 4000rpm，4℃条件下离心10min，弃上清。加入1ml STC溶液，250μl SPTC溶液，混匀待用；每管加入10μl肝素钠(10mg/ml)和50μl待转化DNA纯化片段，混匀，冰上放置30min，缓慢加入 150μlSPTC，室温避光放置20min，转移至20ml三角瓶，加入10ml高渗恢复培养液RM，在25 ℃，100rpm摇床黑暗条件培养过夜；原生质体复原后，混入温度适宜的PDA培养基，加入潮霉素，最终浓度为100μg/mL，混匀，倒板，培养36h左右，挑选转化子至含潮霉素的PDA平板上纯化培养。

转化子的PCR鉴定：牙签挑取适量菌丝，利用CTAB法抽提基因组DNA，加入100μlCTAB溶液(使用前应放烘箱预热，使其充分溶解)，手持式电钻将菌丝磨碎，加入400μl CTAB溶液涡旋混匀，室温静置5min，再加入700μL的DNA提取液(酚：氯仿：异戊醇25:24:1)，上下颠倒10-15次，静置5min，4℃，13200rpm离心15min。将400μl上清液转移到新管中，加入2倍体积无水乙醇，混匀，4℃，13200rpm，离心10min。倒掉上清液，加入1ml的70％无水乙醇清洗沉淀，13200rpm室温离心2min，倒掉上清，再次室温稍微离心，枪头吸尽剩余液体，在超净工作台风干20min。加入40μl的10mM Tris Buffer和2μL RNase(10mg/ml)，50℃金属浴30min，提取好的基因组DNA在-20℃保存待用。以提取的转化子的基因组DNA为模板，利用鉴定引物FlbA-id-F+FlbA-id-R进行PCR扩增，序列如SEQ ID:10-11所示，筛选原位替换的缺失突变体，其中，PCR体系为：在25μl的反应体系中，含有50ng模板DNA，25μl的2×Ex，各1 μl引物(F和R，10μM)，PCR反应程序：94℃5分钟；94℃30秒，53℃30秒，72℃90秒，共32个循环；72℃5分钟；同时设置2个阳性对照(二轮PCR反应连接液为模板、野生型RR108基因组 DNA为模板)和阴性清水对照。PCR反应结束后，产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，凝胶在成像***下显色记录结果。

如图3所示，以二轮连接反应液R2做阳性模板扩增出1597-bp大小的DNA片段，以野生型菌株RR108的基因组DNA做阳性模板扩增出2759-bp大小的DNA片段，从编号为1、15、17和18的FaFlbA基因转化子基因组DNA中扩增出R2和野生型两条带，为异位***突变体；从其余编号的转化子(2-14、16)转化子基因组DNA中仅扩增出R2大小的条带，为原位替换突变体。将这些编号的转化子保存备用。

实施例3：基因改造菌株的雪腐镰刀烯醇产量测定

(1)在产毒诱导培养液TBI中测定雪腐镰刀烯醇产量：将野生型菌株RR108和鉴定为阳性的FaFlbA基因原位替换突变体活化到PDA平板上，25℃培养3d后，从菌落边缘打取直径为5mm的菌丝块，接种至50ml的产孢诱导培养液CMC中，25℃，180rpm，光照，培养4d，用灭菌纱布过滤，8000rpm离心10min收集孢子，10⁵个孢子接种至30mL TBI培养液中，28℃黑暗静置培养7d，收集滤液，冷冻干燥后用80％甲醇：水(v:v)溶解，过滤器后进行质谱检测雪腐镰刀烯醇含量。

实验结果如图3所示，RR108菌株FlbA基因缺失突变体与野生型菌株相比，在产毒诱导培养液TBI中雪腐镰刀烯醇产量上升3.72倍。

(2)在大米培养基中测定雪腐镰刀烯醇产量：将野生型菌株RR108和鉴定为阳性的FaFlbA基因原位替换突变体活化到PDA平板上，25℃培养3d后，从菌落边缘打取直径为5mm的菌丝块，接种至大米培养基中，参照实施案例1中描述方法测定雪腐镰刀烯醇含量。

实验结果如图4所示，RR108菌株FlbA基因缺失突变体与野生型菌株相比，在大米培养基中雪腐镰刀烯醇产量上升9.42倍。

序列表

<110> 江苏省农业科学院

<120> 一种高产雪腐镰刀烯醇的野生菌株及其突变体的构建方法

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4633

<212> DNA

<213> Fusarium graminearum

<400> 1

ggcttgttct tctttgaccc caaacacagc ctctgacagt tgatatgccg agccatgcta 60

agtaagatga agacacattg attatccgat acggcgcagc cggttcaatg ctcgtgacag 120

tcccgagctg tcaccagcct gacatatcag accagcgcga atatgcgctg aaaatcctag 180

gacaaagatg ccgtattgtc cagtctcgtc tcgtagctaa ggtactatgt atggagagag 240

tatcgcttgc agtgatggat aacaaggaaa acagacagat ggatgcctgg cttgaaaggg 300

agtgagcggg ctgttatagt cctttgttag cagcatcaat agtatgaaag acggtatgga 360

tgaaaaaaat atcattacaa gttggactat ctattctgag aatccacttt agcggtagta 420

gagtagtgct gtctttctgc tttcctttct ttttcttctt cttcttcttc ttcctctctc 480

acactctctc ccctccttgt aaccactccg caatattaca tagtaagaga ccctttcttc 540

tctcttgggt tcctgagatt cttttttagc tggagaatcg ggcgtcttga ccctgatcct 600

ggcccttgcc ctggttattt agctgcttgg agaccatcca tggatctcgc ccgctgtcct 660

cagcgcccgc gtccgactgg agaacggagg ccgggtaaga tccactcgct agcagtgagt 720

ctcctcttct atctggacgc ctctgtgcaa gatgatcaag gggtcccctt ttgacacctc 780

caccctcccc cccctctcct ctcctctctg cctgtactca gtacccgtac cagtacctgt 840

acctgtacct gtaccaggac cacctcagta cctacgaccc tctctctacc tccgttacct 900

taccttacct attctcgcct ttgcctatcc tatcctatcc taattccacc cagacctgat 960

ctatcttttc tgtgtcccac ttgacttggt ttactctgct tccactcgtt cgccgcgtcc 1020

atccccaacc cacttccact tccatccttc ttatttgaac cttcccgctg ccgtcaccgt 1080

aaaactcccc tccttctgac ctttctcgtt tccgttagat ggccactctg tcgcatcacc 1140

aaaaacacac ggtaaaccag tctgcctctc cttctgatac cttcgaccag gatacgacta 1200

ctcgctctca cccaccttct caagttacca ctccacgctc ctcgcctcct cttgaaccac 1260

cgcccgcacc accggtggac gctaccatta acccttccat tgtctccgca aacacaacca 1320

ctgggtcaag atcagcatcg ggaacaggat cagggccagc accgggaacg aacacacccg 1380

tctacgtccc atacaacccg caccaaggtc atcatcgcca tacctcgtca gtctcgagat 1440

tgaacaatcg ttcctccaca ggtctcttcg ccttagccgc ctctgccttt gaccgcacgc 1500

aaaacgcaat tgctgccatc tcagagccat ccgtccgacc tcgacagtcc agcggtgctc 1560

tttcgaggct ttccttgctc accagctctt caccttcgtc cgaaccctct agtccggaca 1620

agtaccaccg ccttcgaagc tcatcaaacc aatcactttc ctcaggcgca accgtggacg 1680

gcaagattgc tccccaggca ttgcaggcga ataacccgcc gtctcagcct tacacaacca 1740

cagacccgaa tcaccctctt ccttacaagt cctccacagc cgccaagatg catcaaacat 1800

catcgcgctt attgcgcatg acggacgatg accggccatt tacaaaggta agctctttcc 1860

ctacttcaaa ttgcatggtg tgctttgcat gcgccgtttc gccgtgtgcg cagacatgca 1920

taattgttgc ctatgcacca attgcattct agcaagaaag ctatacatac tcgagtcctt 1980

gctgacagag ttgcacaaac aggactttaa agatctcttc tcaacccttg ttgttagttt 2040

gctgccgctt tcggctcatc gtgtccgatt gaccaaggtt gaatacacct ttttgtccga 2100

ggatgctatt aacaacctgg gctctctcaa attctctcaa tccaatcgca tgcctgaccc 2160

caaggacccc tcccgcattg ttaccaccac gacaaccacc actttctcca tggctaagga 2220

catggctcgt tctatctgtc aacggtttct ggaggcacgc tttatcgaat cagccgatgg 2280

taaataccag caggtttaca cgatgaaggg ctctgtctgg caactaaccc ccaagggtat 2340

caccgttttg gatagattct gttccaggaa cggtatccag caaaagcaag tttctgaact 2400

cgccaacctc gcttccaccc agctggtgct ccttgagcgc gaccctcaga cggacaagct 2460

tctccacgat cacggaacaa tcgaggttat cttccgccga tttgctgggt cagagggccg 2520

caacattaag tccactgtca acgccgccga ctcagactct ctacatgact acagggatgg 2580

actcacagga gtcaagatgg ctgctgagcg caaggtgaat ggaaagacat atcgtgatac 2640

cttcactggt aaggctacca ctgattggct catggattgt tcgactattg tggataagag 2700

agaaaccgtc gaggtggcca ccctctttgt cgagttcgag ttgatggagc ctgtagccca 2760

ggaccgagct tacatggctc agaaccctgg ctgcaacctt ttccagccca ccaagtatgc 2820

catctaccaa ctatcacaac gcggaaagga tattgttagc ggcgctgcct ctcgaggacg 2880

agcttccgag agtgaaggcg gtgccacatc tcagcgaaac ggcatcacca gagactccaa 2940

cactcagcgc cttgataaga ttcttaacga ccctgctctt cgcctgcttt tccgtgaaca 3000

gctccgggat actcactgcg aagagaactt gtccttctac caagatgttg atgagttcgt 3060

gcgcagctgc aaggctgcta cacgggctgc gcaaaaggcg cctaacacca atgctatgga 3120

cggaattaaa gagattatgg cttcagcata tggtatttac aatgccttcc ttgctcccgg 3180

atcgccttgc gagctcaaca tcgatcacca gttgcgtaac aacctggcta cacgaatgac 3240

taaggccgtt gggcaggatg tggctatgat tgacacactt caagaagtga cgtcgctgtt 3300

tgaggatgct caaaacgcag tcttcaagct gatggctagt gtaagtttgg ctaaaaaccg 3360

cccccgtccc agccccccat ggcacgttcg cggccatgcc gatccctccc aattgaggat 3420

aaagcaatgc agatgctaat ataggagaaa acaggactcg gtaccaaaat tccttcgcag 3480

ccccaagtac gagcagcaat tgcgaaacta tgaattcgac gttgttggcc gaggccccga 3540

gcgaagccaa agcaggtcca accgaaagtg atctctccct cgaaggaaat ccggccatgc 3600

gctatctaca ctagagcggg ttgactaggc tcgaaaggaa agctcaagtc taaaacagat 3660

ccagacttga ggccagaacc agaaaccagg gaaaaaaaaa cagggccatg actaggaccc 3720

tgaaccttgc tgggccagct caagcattta catcatctgc ctcatttaat cacgagtcat 3780

ttgcatagag acgtttgaca gttttggcta ccaaagcgtt ttatcacgag aacgatacca 3840

cctagagcca taccttcctg cattaccggt gttttggttt ctgagctatt ttgtttttgc 3900

catgttctta atttttttat tattcgcgcc tcggcccctt tctcttcggc ggctagtgcg 3960

aagttagggg ccatagccca cagccacagc tacggctacg gctttgccta ccagacccga 4020

caacagtcta ctcgcttcgg ccgcctccga agacgctcgg gtggccttta ttccgcgtca 4080

tgccctattt gctcattcat gatgaatctc ggattgaaaa ttattatttc aacaataggg 4140

tgctcggatg taccgatgag agaagctgat ggggcgtgcg gtcgacagct tcctgcttgg 4200

atacagttac actgcttggt tgtgccgagt aacgagcgcc gagcttcgaa tcaatcccga 4260

gacaaaaacg agctatacga atttcgatgt ttgggatctt cgagacatga ctatgaccgt 4320

atggatatag gacgaaacgg cctgtgagaa atggttgatc gatttgcaca gcgtgaggga 4380

tatcgacaaa cgaaatcggc agcacttctc ttgttattat ctttgtgttg tttgtactac 4440

tttggggggt ttacttcttc attatctctc tcttttcttt tcttttattt atttattatg 4500

ttgcggacgg caccccaata tcttgggacc gaaagtaaat gcattgcatt ggaaggagtc 4560

ggggtacatt acggcgggcc agcgctgaaa tacgattgta catagaaaaa agacactggg 4620

cgggcagtct cga 4633

<210> 2

<211> 2453

<212> DNA

<213> Fusarium graminearum

<400> 2

atggccactc tgtcgcatca ccaaaaacac acggtaaacc agtctgcctc tccttctgat 60

accttcgacc aggatacgac tactcgctct cacccacctt ctcaagttac cactccacgc 120

tcctcgcctc ctcttgaacc accgcccgca ccaccggtgg acgctaccat taacccttcc 180

attgtctccg caaacacaac cactgggtca agatcagcat cgggaacagg atcagggcca 240

gcaccgggaa cgaacacacc cgtctacgtc ccatacaacc cgcaccaagg tcatcatcgc 300

catacctcgt cagtctcgag attgaacaat cgttcctcca caggtctctt cgccttagcc 360

gcctctgcct ttgaccgcac gcaaaacgca attgctgcca tctcagagcc atccgtccga 420

cctcgacagt ccagcggtgc tctttcgagg ctttccttgc tcaccagctc ttcaccttcg 480

tccgaaccct ctagtccgga caagtaccac cgccttcgaa gctcatcaaa ccaatcactt 540

tcctcaggcg caaccgtgga cggcaagatt gctccccagg cattgcaggc gaataacccg 600

ccgtctcagc cttacacaac cacagacccg aatcaccctc ttccttacaa gtcctccaca 660

gccgccaaga tgcatcaaac atcatcgcgc ttattgcgca tgacggacga tgaccggcca 720

tttacaaagg taagctcttt ccctacttca aattgcatgg tgtgctttgc atgcgccgtt 780

tcgccgtgtg cgcagacatg cataattgtt gcctatgcac caattgcatt ctagcaagaa 840

agctatacat actcgagtcc ttgctgacag agttgcacaa acaggacttt aaagatctct 900

tctcaaccct tgttgttagt ttgctgccgc tttcggctca tcgtgtccga ttgaccaagg 960

ttgaatacac ctttttgtcc gaggatgcta ttaacaacct gggctctctc aaattctctc 1020

aatccaatcg catgcctgac cccaaggacc cctcccgcat tgttaccacc acgacaacca 1080

ccactttctc catggctaag gacatggctc gttctatctg tcaacggttt ctggaggcac 1140

gctttatcga atcagccgat ggtaaatacc agcaggttta cacgatgaag ggctctgtct 1200

ggcaactaac ccccaagggt atcaccgttt tggatagatt ctgttccagg aacggtatcc 1260

agcaaaagca agtttctgaa ctcgccaacc tcgcttccac ccagctggtg ctccttgagc 1320

gcgaccctca gacggacaag cttctccacg atcacggaac aatcgaggtt atcttccgcc 1380

gatttgctgg gtcagagggc cgcaacatta agtccactgt caacgccgcc gactcagact 1440

ctctacatga ctacagggat ggactcacag gagtcaagat ggctgctgag cgcaaggtga 1500

atggaaagac atatcgtgat accttcactg gtaaggctac cactgattgg ctcatggatt 1560

gttcgactat tgtggataag agagaaaccg tcgaggtggc caccctcttt gtcgagttcg 1620

agttgatgga gcctgtagcc caggaccgag cttacatggc tcagaaccct ggctgcaacc 1680

ttttccagcc caccaagtat gccatctacc aactatcaca acgcggaaag gatattgtta 1740

gcggcgctgc ctctcgagga cgagcttccg agagtgaagg cggtgccaca tctcagcgaa 1800

acggcatcac cagagactcc aacactcagc gccttgataa gattcttaac gaccctgctc 1860

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accaagatgt tgatgagttc gtgcgcagct gcaaggctgc tacacgggct gcgcaaaagg 1980

cgcctaacac caatgctatg gacggaatta aagagattat ggcttcagca tatggtattt 2040

acaatgcctt ccttgctccc ggatcgcctt gcgagctcaa catcgatcac cagttgcgta 2100

acaacctggc tacacgaatg actaaggccg ttgggcagga tgtggctatg attgacacac 2160

ttcaagaagt gacgtcgctg tttgaggatg ctcaaaacgc agtcttcaag ctgatggcta 2220

gtgtaagttt ggctaaaaac cgcccccgtc ccagcccccc atggcacgtt cgcggccatg 2280

ccgatccctc ccaattgagg ataaagcaat gcagatgcta atataggaga aaacaggact 2340

cggtaccaaa attccttcgc agccccaagt acgagcagca attgcgaaac tatgaattcg 2400

acgttgttgg ccgaggcccc gagcgaagcc aaagcaggtc caaccgaaag tga 2453

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

ggcttgttct tctttgaccc 20

<210> 4

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

caaaataggc attgatgtgt tgacctccaa ggaggggagt tttacggt 48

<210> 5

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

ctcgtccgag ggcaaaggaa tagagtagta cactagagcg ggttgact 48

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 6

ccgcccagtg tcttttttct 20

<210> 7

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 7

ggaggtcaac acatcaatgc ctatt 25

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 8

ctactctatt cctttgccct 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 9

ggttcaatgc tcgtgacagt 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 10

ccgactcctt ccaatgcaat 20

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 11

tactctgctt ccactcgttc 20

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 12

tgtaaatgct tgagctggcc 20

Claims (2)

1.一种高产雪腐镰刀烯醇的亚洲镰刀菌突变菌株，其保藏编号为CCTCC M 2019686。

2.权利要求1所述的高产雪腐镰刀烯醇的亚洲镰刀菌突变菌株在雪腐镰刀烯醇标准品制备中的应用。

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