CN110613704B - 右旋龙脑作为阿霉素或其衍生物增敏剂在制备抗肺癌药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了右旋龙脑作为阿霉素或其衍生物增敏剂在制备抗肺癌药物中的应用。本发明发明人发现在添加了右旋龙脑后，非小细胞肺癌细胞A549对阿霉素的敏感性显著增加，右旋龙脑的应用能显著减少阿霉素的用量的同时保证阿霉素的疗效，从而达到降低阿霉素毒副作用的效果，保护人体正常细胞。因此，右旋龙脑作为阿霉素或其衍生物增敏剂在制备抗肺癌药物中的应用具有很好的应用价值。

Description

右旋龙脑作为阿霉素或其衍生物增敏剂在制备抗肺癌药物中 的应用

技术领域

本发明属于右旋龙脑的用途，特别涉及右旋龙脑作为阿霉素或其衍生物增敏剂在制备抗肺癌药物中的应用。

背景技术

阿霉素(Doxorubicin，DOX)属于蒽环类抗代谢药物，是临床上最有效和使用最广泛的抗肿瘤药物之一。阿霉素能直接以加合的方式嵌入到DNA分子的碱基对之间，引起DNA损伤。DOX的嵌合可引起DNA和RNA的合成受阻，也可以抑制拓扑异构酶的活性，破坏DNA的高级结构，被广泛用于乳腺癌、膀胱癌、肺癌和卵巢癌等的治疗。但是阿霉素毒副作用明显，特别是具有心肌毒性，严重时可引起心脏衰竭，其原发性及获得性耐药也极大的影响了化疗的效果，高剂量化疗药物的毒副作用使得患者难以耐受或继续完成治疗，因此，限制了其临床应用和治疗效率。目前，寻找有效的化疗增敏剂增强DOX的抗肿瘤效果，减弱或逆转DOX带来的化疗耐药和毒副作用已成为研究热点。

肺癌是目前世界上导致肿瘤相关死亡的首要原因,而非小细胞肺癌(Non-smallcell lung cancer，NSCLC)约占肺癌的85％，约57％的NSCLC病人诊断时已属进展期(ⅢB或Ⅳ期)肺癌，从而失去手术治愈的机会。尽管治疗手段多样，进展期非小细胞肺癌的总生存期目前仅有4－6个月，5年生存率约为4.2％。对于进展期NSCLC患者，含铂双药化疗仍是标准一线治疗方案，但目前化疗的疗效已达瓶颈，大部分病人化疗后疾病仍会进展，而二线治疗的获益往往更为局限，总生存期只有8－12个月。因此，基于现代医学及生物学对常规抗肿瘤药物耐药机制的阐述，依据“靶点互补”原则，寻找新型化疗增敏剂用于肺癌治疗，发挥其与肺癌治疗药物的协同作用，增强临床疗效，降低药物的毒副作用，具有重要的科学意义和应用价值。

龙脑(Borneol)，俗称“冰片”，是一种从龙脑香科植物树脂和挥发油中提取出来的萜烯和二环有机化合物，属于单萜醇，用于闭证神昏、目赤肿痛，喉痹口疮、疮疡肿痛，溃后不敛、冠心病和心绞痛。目前，虽有将右旋龙脑作为抗肿瘤药物增敏剂的报道，但右旋龙脑应用于不同抗肿瘤药物和肿瘤细胞过程中的作用和效果却不尽相同，而已有的文献并未对其进行过报道，也没有实验数据证明右旋龙脑增敏阿霉素，抑制非小细胞肺癌生长的显著效果。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供右旋龙脑作为阿霉素或其衍生物增敏剂在制备抗肺癌药物中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：右旋龙脑作为阿霉素或其衍生物增敏剂在制备抗肺癌药物中的应用，是将右旋龙脑作为阿霉素或其衍生物增敏剂辅助抗肺癌药物进行应用。

所述的右旋龙脑为天然右旋龙脑。

所述的衍生物包括吡喃阿霉素和表阿霉素。

所述的抗肺癌药物的组分包括阿霉素及其衍生物中的至少一种，和右旋龙脑。

所述的抗肺癌药物的组分还包括其他对肺癌有治疗效果的成分和药学上可接受的载体中的一种或两种。

所述的右旋龙脑和所述的阿霉素或其衍生物优选按10～160μg:0.03125～1nmol配比；更优选按40～160μg:0.03125～1nmol配比；更优选按40～160μg:0.15625～1nmol配比；进一步优选为按40～160μg:0.182～0.479nmol配比；最优选按160μg:0.25nmol配比。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1.本发明发现右旋龙脑作为阿霉素增敏剂能够在不影响阿霉素抗癌活性的同时显著降低阿霉素的用量。

2.本发明发现右旋龙脑可增强阿霉素在A549细胞的中累积和对线粒体的损伤，还可增强阿霉素诱导A549由caspase介导的细胞凋亡，增强阿霉素诱导细胞内活性氧的产生介导DNA损伤，从而起到增强DOX的抗癌活性作用。

附图说明

图1是天然右旋龙脑配合阿霉素对细胞生长的影响结果图；其中，图A是不同浓度天然右旋龙脑下，阿霉素对A549细胞的抑制效果柱形图，图B是天然右旋龙脑联合DOX抑制A549细胞生长的照片图，图C是细胞克隆形成实验中细胞的照片图，图D是细胞克隆形成实验的细胞克隆数。

图2是荧光显微镜和流式细胞仪检测A549细胞内阿霉素的累积情况图；其中，图A是荧光显微镜检测细胞内DOX的累积照片图；图B是流式细胞仪检测细胞内DOX累积的分布直方图；图C是单独DOX和DOX与天然右旋龙脑联合处理后随时间推移细胞内DOX累积情况的柱状图。

图3是天然右旋龙脑增强DOX诱导A549细胞由caspase介导的细胞凋亡的影响结果图；其中，图A是流式细胞仪检测细胞凋亡情况图，图B是右旋龙脑联合DOX激活细胞内Caspase蛋白酶活性图，图C是Western blotting方法检测右旋龙脑增强DOX诱导A549细胞凋亡相关蛋白表达情况图。

图4是荧光显微镜观察天然右旋龙脑增强DOX诱导A549细胞线粒体结构变化的影响照片图。

图5是天然右旋龙脑协同DOX诱导细胞内ROS介导DNA损伤的影响结果图；其中，图A是不同实验组的细胞内ROS累计情况图，图B是Western blotting检测DNA损伤的标记蛋白结果图，图C是验证抗氧化剂NAC对天然右旋龙脑联合DOX抑制A549细胞活性的作用结果图，图D是验证抗氧化剂NAC逆转天然右旋龙脑联合DOX诱导A549细胞凋亡图。

图6是天然右旋龙脑协同DOX抑制小鼠A549皮下瘤生长实验的结果图；其中，图A是六个实验组小鼠的肿瘤体积大小增长对比图，图B是给药后六个实验组小鼠的肿瘤质量对比图，图C是六个实验组小鼠的体重变化对比图，图D是i.v.DOX组、p.o.NB+i.v.DOX组、i.v.NB+i.v.DOX组小鼠的脏器中DOX累积量图；p.o.表示口服灌胃；i.v.表示静脉注射。

具体实施例

下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

一、MTT法检测天然右旋龙脑配合阿霉素对细胞生长的影响

(1)对不同细胞株进行检测

将人非小细胞肺癌细胞A549(2×10⁴个细胞/mL)以100μL/孔接种于96孔板中，待细胞贴壁(约24h)后分别将100μL天然右旋龙脑(终浓度为40、80和160μg/mL，即在细胞中的浓度)预处理A549细胞12h，之后再以3个浓度的天然右旋龙脑预处理后的A549细胞中分别加入0.03125μM～1μM(在细胞中的浓度)6个浓度梯度(0.03125μM、0.0625μM、0.125μM、0.25μM、0.5μM和1μM)的阿霉素，并设置对照组。72h后每孔加入5mg/mL MTT染液，培养3h，加入DMSO溶解，酶标仪检测波长为570nm的OD值，计算细胞存活率，绘制细胞生长曲线，计算IC₅₀值。按前述步骤，分别以黑色素瘤细胞株A375、肝癌细胞株HepG-2和乳腺癌细胞株MCF-7作为检测对象，检测结果如表1所示：

表1

表1的结果表明，右旋龙脑对于阿霉素的增敏作用，仅仅体现在肺癌细胞中。单独DOX对非小细胞肺癌A549的IC₅₀为0.861μM，当NB预处理12小时后再与DOX共处理A549时，DOX对A549的IC₅₀分别降到0.497μM，0.273μM和0.182μM。

(2)对人非小细胞肺癌细胞A549的效果的再次验证

将人非小细胞肺癌细胞A549(2×10⁴个细胞/mL)以100μL/孔接种于96孔板中，待细胞贴壁(约24h)后分别将100μL天然右旋龙脑(终浓度为40、80和160μg/mL，即在细胞中的浓度)预处理A549细胞12h，之后再以3个浓度的天然右旋龙脑预处理后的A549细胞中分别加入0.0625μM～0.25μM(在细胞中的浓度)3个浓度梯度的阿霉素，并设置对照组，具体实验设置见表2。72h后每孔加入5mg/mL MTT染液，培养3h，加入DMSO溶解，酶标仪检测波长为570nm的OD值，计算细胞存活率(图1A)。结果显示，0.0625、0.125和0.25μM的阿霉素单独处理组的A549细胞存活率分别为93.37353％±4.47985、97.23014％±2.7504和78.88145％±6.80552。但是当天然右旋龙脑预处理细胞12h后再与DOX共处理细胞时，DOX的存活率显著的下降，并且随着天然右旋龙脑的浓度增加联合处理组中A549细胞存活率显著下降，例如，40、80和160μg/mL的右旋龙脑和0.25μM DOX联合处理组的细胞存活率分别为61.41409％±2.18213，54.86051％±5.219和44.02182％±5.31299。

将人非小细胞肺癌细胞A549(2×10⁴个细胞/mL)以2mL/孔接种于6孔板中，待细胞贴壁(约24h)后加入终浓度为160μg/mL的天然右旋龙脑预处理细胞12h，然后加入阿霉素(终浓度为0.25μM)共孵育细胞72h，最后在倒置显微镜(ECLIPSE Ti尼康)下拍照(图1B)。

表2

二、细胞克隆形成实验检测天然右旋龙脑增敏DOX，抑制A549细胞增殖的影响

将A549细胞以2000个/孔接种于6孔板中，贴壁24h后加入160μg/mL天然右旋龙脑预处理细胞12h，然后加入0.25μM阿霉素。次日弃掉培养基上清并用PBS洗涤细胞3次，补加2mL含10％(v/v)FBS的DMEM培养基，将细胞置于37℃培养箱中培养7天。7天后弃掉培养基，细胞用甲醇固定10min，然后用吉木萨染液染色，拍照计数细胞克隆数。

结果如图1C和D所示，可以看出160μg/mL天然右旋龙脑增强了0.25μM阿霉素对A549细胞克隆形成的活性，并且具有显著性差异。

实施例2荧光显微镜和流式细胞仪检测A549细胞内阿霉素的累积情况

将A549细胞以16×10⁴个细胞/孔接种于6孔板中，贴壁24h后加入160μg/mL天然右旋龙脑预处理细胞12h，然后与0.25μM DOX共孵育，并在不同时间点(0h、1h、2h、4h、8h)利用荧光显微镜检测细胞内DOX的累积情况，然后消化收集不同时间点处理的细胞，通过流式细胞仪检测A549细胞内DOX的累积。

荧光显微镜检测细胞内DOX的累积情况如图2A所示，DAPI是采用Hochest33342染料对细胞核进行染色，merge是将红色通道和蓝色通道进行叠加。随着时间的推移，DOX在A549细胞中的累积不断增强，但是当细胞经过NB的预处理后，A549细胞对DOX的摄取量要比单独DOX处理组高。

流式细胞仪检测A549细胞内DOX的累积如图2B所示，其中，曲线1为对照组，曲线2为NB处理组，曲线3为DOX处理组，曲线4为NB+DOX处理组。可见，NB有效地促进了A549细胞对DOX的积累。

对图2B的结果进行分析做图，如2C所示，其中，每对柱形图中，左边的柱为DOX处理组，右边的柱为NB+DOX处理组。可见，随着时间的推移，DOX在A549细胞中的累积不断增强，但是当细胞经过NB的预处理后，A549细胞对DOX的摄取量要比单独DOX处理组高。

实施例3天然右旋龙脑对DOX诱导A549细胞由caspase介导的细胞凋亡的影响

细胞的生长抑制主要有细胞周期阻滞和细胞凋亡两种方式，为了检测右旋龙脑协同DOX诱导A549细胞的死亡方式，首先利用流式细胞技术(具体操作参考文献J.Agric.FoodChem.2017,65,4405-4413)进行检测，用sub-G1峰来衡量细胞凋亡情况。按实施例2操作，获得单独NB(160μg/mL)处理的A549细胞、单独DOX处理(0.25μM)的A549细胞和NB+DOX处理的A549细胞，同时设置对照组。

结果如图3所示，与单独0.25μM DOX处理组相比，160μg/mL右旋龙脑与0.25μM DOX共处理组的细胞凋亡更为显著，sub-G1峰增加(图3A)。该结果也被半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶caspase3/9酶的激活(图3B，图中每对柱子中，左边的柱子为caspase3酶活性，右边的柱子为caspase9酶活性)证实。进一步的，从凋亡相关蛋白表达情况，比如DNA修复酶PARP的切割以及caspase3/8/9蛋白的切割，也证实天然右旋龙脑能够协同DOX诱导A549细胞凋亡(图3C)。

实施例4荧光显微镜观察天然右旋龙脑对DOX诱导A549细胞线粒体结构变化的影响

在细胞凋亡过程中，内源性和外源性信号通路会在线粒体内汇合，并且引起线粒体膜通透性改变。为了验证天然右旋龙脑和DOX联合用药诱导的A549细胞凋亡是否激活线粒体通路，本发明通过荧光显微镜(Life technologies

Auto，美国)对线粒体结构进行观察。具体步骤如下：将3000个A549细胞接种于2cm玻璃培养皿中，贴壁(约24小时)后加入160μg/mL NB预处理12小时，然后加入0.25μMDOX。随后通过荧光显微镜100×下在0、1、2、4、8小时对线粒体结构进行观察。

结果如图4所示，单独的天然右旋龙脑基本对线粒体无损伤作用；单独的DOX仅仅诱导轻微的线粒体的断裂；但是，当天然右旋龙脑和DOX联合处理时，细胞内的线粒体发生明显的断裂，仅仅在2h就能观察到断裂的线粒体，同时，随着时间的推移该联合处理组的线粒体结构断裂的更加显著。该结果表明，天然右旋龙脑增强了DOX诱导的A549细胞线粒体结构发生断裂，激活了线粒体通路。

实施例5天然右旋龙脑对DOX诱导细胞内ROS的产生和介导DNA损伤的作用

DOX可诱导产生活性氧(ROS)并以此来抑制肿瘤细胞的生长，线粒体是细胞内ROS的重要来源。为了验证天然右旋龙脑协同DOX诱导A549细胞凋亡是否与ROS的产生有关，本发明用DCFH-DA探针进行检测(具体操作参照参考文献Adv.Funct.Mater.2018,1805225)。结果表明，单独的DOX(0.25μM)和右旋龙脑(160μg/mL)在细胞内诱导轻微的ROS累积，但是当右旋龙脑(160μg/mL)和DOX(0.25μM)联合用药时，细胞内的ROS累积显著性增强(图5A)。

过多的ROS会导致DNA损伤，进而激活下游的信号通路。细胞具有感应DNA损伤和维护基因组稳定性的***，整个DNA损伤信号通路可以感应DNA损伤，激活信号通路，从而通过诱导周期阻滞来进行DNA损伤的修复或启动凋亡的方式清除受损的细胞。因此，本发明运用western blotting技术从蛋白水平检测了两个DNA损伤的标记蛋白(具体操作参照参考文献2014Sep；5(17):7431–7445.)。结果如图5B所示，天然右旋龙脑预处理显著增强DOX诱导的DNA损伤，表现为磷酸化p53、p-H2AX、p-ATM和p-ATR蛋白表达的上调。

为了进一步评价ROS的重要性，本发明加入了硫醇诱导的抗氧化剂N-乙酰-L-半胱氨酸NAC(深圳市祥根生物科技有限公司，纯度：98％HPLC)。待细胞贴壁约24h后加入NAC(终浓度为5mM)，预处理细胞2h，然后再加入阿霉素(0.25μM)和天然右旋龙脑(160μg/mL)。利用流式细胞技术进行检测(具体操作方法参照J.Agric.Food Chem.2017,65,4405-4413)，用sub-G1峰来衡量细胞凋亡情况。结果表明，NAC的加入显著减弱了天然右旋龙脑联合DOX诱导的A549细胞生长抑制。例如，天然右旋龙脑联合DOX抑制了细胞活性，使到细胞成活率降至36.2％，而5mM NAC预处理2h就显著增加细胞成活率至71.6％(图5C)；NAC的预处理显著逆转天然右旋龙脑协同阿霉素诱导的A549细胞凋亡，subG1比例从59.91％降至21.79％(图5D)。

以上结果均表明天然右旋龙脑可通过启动ROS介导的DNA损伤来增强DOX诱导的A549细胞生长抑制作用。

实验例6天然右旋龙脑协同DOX抑制小鼠A549皮下瘤生长

为进一步验证天然右旋龙脑联合DOX在体内的抑制肿瘤生长的效果，本发明利用荷瘤裸鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)，进行了生物效应实验。将荷瘤裸鼠分为6组，每组8只。实验组设置：对照组、i.v.DOX组、p.o.NB组、i.v.NB、p.o.NB+i.v.DOX组、i.v.NB+i.v.DOX组。以天然右旋龙脑通过口服灌胃(p.o.)和静脉注射(i.v.)两种给药途径进行给药，给药剂量分别为200mg/kg和2mg/kg。DOX通过静脉注射给药，给药剂量为4mg/kg。给药周期为14天，隔天给药一次，同时记录小鼠肿瘤体积。

同时，本发明对组织中阿霉素的分布进行检测(方法参照文献BiochemicalMedicine.1973,7(3),396-404；所用仪器：荧光分光光度计(Lumina,赛默飞世尔)；试剂：异戊醇(阿拉丁M116198-500mL)、硝酸银(阿拉丁S116264-25g)。

结果如图6所示，裸鼠肿瘤的生长明显受到抑制，口服和静脉注射天然右旋龙脑+阿霉素的两个实验组的荷瘤裸鼠体内肿瘤的质量和体积减小，说明天然右旋龙脑可在体内显著增强DOX诱导裸鼠肿瘤生长抑制的作用(图6A-C)。图6D说明天然右旋龙脑能够促进阿霉素在肿瘤组织中的累积，进一步证明了右旋龙脑增敏阿霉素的抗肿瘤活性。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他任何未背离本发明的精神实质与原理下所做的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (7)

1.右旋龙脑作为阿霉素或其衍生物增敏剂在制备抗肺癌药物中的应用，其特征在于：

所述的衍生物包括吡喃阿霉素和表阿霉素；

所述的右旋龙脑和所述的阿霉素或其衍生物按40～160μg:0.03125～1nmol配比。

2.根据权利要求1所述的右旋龙脑作为阿霉素或其衍生物增敏剂在制备抗肺癌药物中的应用，其特征在于：所述的右旋龙脑为天然右旋龙脑。

3.根据权利要求1所述的右旋龙脑作为阿霉素或其衍生物增敏剂在制备抗肺癌药物中的应用，其特征在于：所述的抗肺癌药物的组分包括阿霉素及其衍生物中的至少一种，和右旋龙脑。

4.根据权利要求3所述的右旋龙脑作为阿霉素或其衍生物增敏剂在制备抗肺癌药物中的应用，其特征在于：所述的抗肺癌药物的组分还包括其他对肺癌有治疗效果的成分和药学上可接受的载体中的一种或两种。

5.根据权利要求1所述的右旋龙脑作为阿霉素或其衍生物增敏剂在制备抗肺癌药物中的应用，其特征在于：所述的右旋龙脑和所述的阿霉素或其衍生物按40～160μg:0.15625～1nmol配比。

6.根据权利要求5所述的右旋龙脑作为阿霉素或其衍生物增敏剂在制备抗肺癌药物中的应用，其特征在于：所述的右旋龙脑和所述的阿霉素按40～160μg:0.182～0.479nmol配比。

7.根据权利要求6所述的右旋龙脑作为阿霉素或其衍生物增敏剂在制备抗肺癌药物中的应用，其特征在于：所述的右旋龙脑和所述的阿霉素或其衍生物按160μg:0.25nmol配比。

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