CN110609009A - 一种适用于生物样品太赫兹特异性检测的样品前处理***及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明申请属于生物样品检测技术领域，具体公开了一种适用于生物样本太赫兹特异性检测的样品前处理***及检测方法的前处理方法，包括以下步骤：(1)一次性PDMS膜及样品反应池的制备，使用太赫兹高透膜，并将其切割；(2)PDMS膜的特异性修饰，对步骤(1)中的PDMS膜进行特异性修饰，(3)利用太赫兹对步骤(2)中的PDMS膜进行本底检测，(4)靶标的特异性捕获；(5)利用太赫兹对步骤(4)中的特异性捕获靶标的PDMS膜进行检测。本发明主要用于生物样本太赫兹特异性检测，解决了太赫兹特异性检测难度较大，缺乏标准化前处理过程，难以保证结果的重复性及准确性的问题。
Description
技术领域
本发明属于生物样品检测技术领域，具体公开了一种适用于生物样品太赫兹特异性检测的样品前处理***及应用。
背景技术
太赫兹波是频率在0.1～10THz的电磁波，基于THz可以对生物物质进行无标记、非接触和无损检测。核酸、蛋白质等生物大分子之间弱的相互作用(如：氢键、范德华力等)、骨架振动及偶极子旋转等正好位于THZ频谱范围，每种生物大分子均具有特定THz波谱指纹，因此THz波能够探测到其他电磁波段无法获得的生物大分子组成、结构和功能等信息。THz波能够以一种纯物理过程、无需标记的方式在同一时间节点揭示多种生物大分子的结构和功能信息，从而可能为生物分子的无标记检测提供一种革命性新型技术手段。然而有些生物大分子在太赫兹范围内并没有特征性的吸收峰，限制了太赫兹在生物分子传感的应用。
单克隆抗体具有高选择特异性，其可识别特异性抗原，并形成稳定的抗原抗体复合物。目前对抗原抗体反应的检测方法有酶联免疫(ELISA)、免疫荧光、放射免疫和化学发光等，其均需要利用酶、荧光素和放射元素进行标记；这样增加了检测过程中的操作步骤，使得检测更为复杂。
发明内容
本发明的目的在于提供一种#，以解决抗原抗体反应的检测过程中需利用特殊标记，操作步骤多使得检测更为复杂和太赫兹传感特异性检测较难实现的问题。
为了达到上述目的，本发明的技术方案为：一种适用于生物样品太赫兹特异性检测的样品前处理***及应用，包括以下步骤：
(1)PDMS膜的制备，使用膜塑法制备所需高透膜，并将其切割成1.5*1.5cm2的大小；
(2)前处理，对步骤(1)中的PDMS膜进行修饰；
(3)利用太赫兹对步骤(2)中的PDMS膜进行检测。
进一步，步骤(2)中对PDMS膜修饰使用聚乙烯亚胺－戊二醛交联法修饰。
进一步，步骤(2)中对PDMS膜进行修饰包括以下步骤：a.将1.5*1.5cm大小的PDMS检测膜条置于反应池上，在反应池中加入0.2％聚乙烯亚胺甲醇溶液，置于70℃恒温器中避光反应3h，冷却至室温；b.去离子水充分的冲洗3次；加入质量浓度为1％戊二醛溶液，室温下避光放置30min；c.去离子水充分的冲洗3次；加入质量浓度为0.1％的DPBS溶液中浸泡5min；d.去离子水充分的冲洗3次；取一定量抗体溶液浸泡，置于4℃冰箱中冷藏过夜待用；e.将(d)步骤中的PDMS膜条置于反应池，在反应池内加入抗原，孵育使抗体与抗原充分反应。
进一步，步骤(1)中的反应池以硅片为原料，在硅片上刻蚀出长7.2mm、宽7.2mm、高200nm的检测池；检测池内光刻出亚波长周期性SRRs超材料结构，检测池的单元结构为单开口谐振环，长宽为26μm，线宽为6μm，开口间隙为2μm；将构建的可再生样品池THz-TDS检测，记录其谐振频率、谐振峰半高宽。
进一步，步骤(4)中的抗体孵育池长9cm，宽7cm，包括四个反应区，每个反应区外长1.5cm，内长0.7cm；外宽5cm，内宽2.5cm，每个反应区可放置3个1.5*1.5cm的反应膜条。
一种适用于生物样品太赫兹特异性检测的样品前处理***的应用，经过前处理的膜条置于太赫兹通用型样品池上检测，得到浓度随频移改变量变化的曲线，即可对不同浓度的生物样品进行定量。
本技术方案的工作原理及有益效果在于：
(1)太赫兹超材料生物传感器实现生物分子的特异性检测，需结合抗体的特异性捕获，但将抗体修饰在金/硅表面存在较大难度，且修饰效率不高，限制了其检测效率；同时将抗体修饰在超材料表面，超材料只能使用一次，成本较高，不利于其普及应用；PDMS成本较低，且可通过多种化学方法进行修饰，便于其普及性应用。
(2)实现生物分子的特异性检测，需通过抗体的特异性捕获，目前通过抗体捕获检测的方法主要有酶联免疫(ELISA)、免疫荧光、放射免疫和化学发光等，其均需要利用酶、荧光素和放射元素进行标记；本发明可认为是一种超灵敏、无标记的特异检测生物分子的方法。
(3)目前，太赫兹用于生物样本的传感，对于样本的前处理缺少统一、有效的方法，难以保证结果的准确性与可比性，本发明拟通过开发特用反应池与专用反应膜条，通过对膜条的修饰，实现标准化的样本前处理。
附图说明
图1是本发明实施例中抗体孵育池的俯视图；
图2是本发明检测样品池的俯视图；
图3是图2中单开口谐振环的俯视图；
图4是本发明检测样品池的俯视图；
图5是图2中单开口谐振环的俯视图；
图6是检测样品池的实物图；
图7是pmds膜片的实物图；
图8是检测样本池的太赫兹测量结果图；
图9是检测样本池的太赫兹测跃迁频率示意图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式进一步详细说明：
结合附图1-9所示，一种适用于生物样品太赫兹特异性检测的样品前处理***及应用，包括以下步骤：
1.捕获***：PDMS膜的制备
PDMS(聚二甲基硅氧烷)是一种常见的高聚物，其在太赫兹频段下具有光学透明性、低吸收性，且其可通过一定的化学方法进行表面修饰，故其可用于太赫兹检测膜条的制作。
利用模塑法制备所需高透膜，并将其切割成1.5*1.5cm的大小。
2.前处理方法
(1)PDMS修饰：聚乙烯亚胺－戊二醛交联法修饰
a.将1.5*1.5cm大小的PDMS检测膜条置于反应池上，在反应池中加入0.2％聚乙烯亚胺甲醇溶液，置于70℃恒温器中避光反应3h，冷却至室温；b.去离子水充分的冲洗3次；加入1％戊二醛溶液，室温下避光放置30min；c.去离子水充分的冲洗3次；加入0.1％的DPBS溶液(0.001g的DDM溶于1ml的10mmol/L PH 7.4缓冲液)中浸泡5min；d.去离子水充分的冲洗3次；取一定量抗体(anti-LDL)溶液浸泡(保鲜膜包裹，防止挥发)，取出膜条置于4℃冰箱中冷藏过夜，待用；e..将(d)步骤中的PDMS膜条置于反应池，在反应池内加入抗原，孵育使抗体与抗原充分反应。
3.太赫兹检测
将经过前处理的膜条置于太赫兹通用型样品池上检测，计算频移改变量，得到浓度随频移改变量变化的曲线，即可对不同浓度的生物样品进行定量。
应用：利用此样品前处理方法及通用型样品池检测血液中的氧化低密度脂蛋白(Ox-LDL)。
(1)可再生检测样品池的构建
a.深硅刻蚀出检测池，结构参数如下：长7.2mm、宽7.2mm、高220nm；
b.在检测池内光刻出亚波长周期性SRRs超材料结构。单元结构为单开口谐振环，结合图4和图5所示，其长宽为26μm(L＝26μm)，线宽6μm(W＝6μm)，开口间隙2μm(g＝2μm)；
c.将构建的可再生样品池THz-TDS检测，记录其谐振频率(f)、谐振峰半高宽(FWHM)、谐振峰强度。
(2)抗体的筛选
E06来源于免疫缺失的ApoE基因敲除小鼠的单克隆抗体。识别Ox-PC，识别表位为磷酸卵磷脂(PhoCho)——卵磷脂中的亲水部分。
(3)E06抗体固定到PDMS表面；
a.在反应池中加入1ml质量浓度为0.2％聚乙烯亚胺甲醇溶液(质量浓度为0.2％的配置为200mg的聚乙烯亚胺溶于1ml甲醇，所得即为0.2％聚乙烯亚胺甲醇溶液)，置于70℃恒温器中避光反应3h，冷却至室温。
b.去离子水充分的冲洗3次；加入1ml质量浓度1％戊二醛溶液，室温下避光放置30min。
c.去离子水充分的冲洗3次；加入1ml质量浓度0.1％的DPBS溶液(0.001g DDM溶于1ml 10mmol/L PH 7.4缓冲液)中浸泡5min。
d.去离子水充分的冲洗3次；取500μl抗体(E06)溶液浸泡(保鲜膜包裹，防止挥发)，置于4℃冰箱中冷藏过夜，待用。
(4)将结合了抗体的膜条取出，氮气吹干，置于样品池上，THz-TDS检测，谐振峰发生频移，记录其谐振频率(f)并计算Δf(谐振率变化量)；
(5)加入50μl氧化低密度脂蛋白溶液，孵育4h，使抗原抗体充分结合；
(6)取出待测膜条，氮气吹干；置于太赫兹检测样品池上，THz-TDS检测记录其谐振频率(f)并计算Δf(谐振率变化量)；
(7)弃去检测膜条，检测样品池可继续用于下一样本的测量；
(8)重复5、6步骤，加入不同浓度的氧化低密度脂蛋白溶液，Δf(谐振率变化量)不同，可检测不同浓度的氧化低密度脂蛋白溶液。
本实施例中，SRRs超材料制作包括以下步骤：
(1)a.衬底基片清洗：将裁剪好的硅片放入超声波清洗仪中清洗，取出后先用无水乙醇清洗再用去离子水漂洗干净，再用高压氮气把硅片表面吹干，再放入烘干箱；b.镀膜：在槽道表面镀厚度为120nm的金膜；c.涂胶：光刻胶(SU-8)均匀旋涂在金膜的表面，放入烘干箱烘干，在暗室中自然冷却；d.曝光：使用曝光机在均匀涂的表面进行周期性结构单元曝光(结构见图1)；单元结构为单开口谐振环，长宽为26μm(L＝26μm)，线宽6μm(W＝6μm)，开口间隙2μm(g＝2μm)；e.显影：选取显影液行显影；f.后烘：对显影后的基片进行烘焙，去除残留水分和显影液，提高光刻胶与衬底基片之间粘附力；g.湿法刻蚀：采用湿法刻蚀刻蚀完成后，未被光刻胶保护的金膜被腐蚀掉，然后用去离子水冲洗，直至表面刻蚀混合液被清洗干净。
(2)PDMS膜条制作(模塑法)
a.制作阳模：利用光刻和化学腐蚀的办法，在硅板上做出阳模(长1.5cm，宽1.5cm，高50μm)；b.浇筑：以PDMS预聚物(PDMS：固化剂＝10：1)浇筑阳模；c.固化：放置数小时等待PDMS固化；d.拔膜：将固化的PDMS与阳模剥离，即得到PDMS膜条；
以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体结构及特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。
Claims (6)
1.一种适用于生物样品太赫兹特异性检测的样品前处理***，其特征在于，包括以下步骤：
(1)PDMS膜的制备，使用膜塑法制备所需高透膜，并将其切割成1.5*1.5cm2的大小；
(2)前处理，对步骤(1)中的PDMS膜进行修饰；
(3)利用太赫兹对步骤(2)中的PDMS膜进行检测。
2.根据权利要求1所述的一种适用于生物样品太赫兹特异性检测的样品前处理***，其特征在于，步骤(2)中对PDMS膜修饰使用聚乙烯亚胺－戊二醛交联法修饰。
3.根据权利要求1所述的一种适用于生物样品太赫兹特异性检测的样品前处理***，其特征在于，步骤(2)中对PDMS膜进行修饰包括以下步骤：a.在反应池中加入质量浓度为0.2％聚乙烯亚胺甲醇溶液，置于70℃恒温器中避光反应3h，冷却至室温；b.去离子水充分的冲洗3次；加入质量浓度为1％戊二醛溶液，室温下避光放置30min；c.去离子水充分的冲洗3次；加入质量浓度为0.1％的DPBS溶液中浸泡5min；d.去离子水充分的冲洗3次；取一定量抗体溶液浸泡，置于4℃冰箱中冷藏过夜待用；e.将(d)步骤中的抗体加入到抗体孵育池，在抗体孵育池内加入抗原，使抗体与抗原充分反应。
4.根据权利要求3所述的一种适用于生物样品太赫兹特异性检测的样品前处理***，其特征在于，步骤(1)中的反应池以硅片为原料，在硅片上刻蚀出长7.2mm、宽7.2mm、高220nm的检测池；检测池内光刻出亚波长周期性SRRs超材料结构，检测池的单元结构为单开口谐振环，长宽为26μm，线宽为6μm，开口间隙为2μm；将构建的可再生样品池THz-TDS检测，记录其谐振频率、谐振峰半高宽。
5.根据权利要求3所述的一种适用于生物样品太赫兹特异性检测的样品前处理***，其特征在于，步骤(4)中的反应池长9cm，宽7cm，包括四个反应区，每个反应区外长1.5cm，内长0.7cm；外宽5cm，内宽2.5cm，每个反应区可放置3个1.5*1.5cm的反应膜条，整个反应池一次可实现对12片检测膜条进行修饰。
6.根据权利要求1-5任一项所述的一种适用于生物样品太赫兹特异性检测的样品前处理***的应用，其特征在于，经过前处理的膜条置于太赫兹通用型样品池上检测，记录其谐振峰频率，在反应池中加入不同浓度的生物样本，与膜条充分孵育后，将膜条置于太赫兹通用型样品池上检测，记录谐振峰频率，计算频移改变量，得到浓度随频移改变量变化的曲线，能对不同浓度的生物样品进行定量。
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