CN101710118A

CN101710118A - 基于多孔硅三元结构微腔的光学免疫检测方法

Info

Publication number: CN101710118A
Application number: CN200910113551A
Authority: CN
Inventors: 吕小毅; 莫家庆; 贾振红; 钟福如; 李锐
Original assignee: Xinjiang University
Current assignee: Xinjiang University
Priority date: 2009-12-03
Filing date: 2009-12-03
Publication date: 2010-05-19

Abstract

一种基于多孔硅三元结构微腔的光学免疫检测方法，属于生物医药、食品安全和环境监测的技术领域。该方法所采用的多孔硅微腔内上、下的Bragg结构分别由三种电流密度交替进行电化学腐蚀而形成，探针分子首先固定在多孔硅孔洞里，然后通过生物反应前后的光谱峰位变化进行检测目标分子浓度；同时利用不同腐蚀条件制备的多孔硅微腔的反射光谱或光致发光光谱进行编码载体，实现对抗原或抗体种类的标识。这种光学免疫检测方法不仅兼具多孔硅和光子带隙结构传感器的诸多优异性能，而且结构稳定性很好，通过编码检测技术更是可以实现多元检测。此外，由于采用的制备方法较为简单，价格相对低廉，有一定的商业应用前景。

Description

基于多孔硅三元结构微腔的光学免疫检测方法

技术领域

本发明涉及一种以多孔硅三元结构微腔为固相传感器载体的免标记光学免疫检测方法，属于生物医药、食品安全和环境监测的技术领域。

背景技术

目前，免疫分析检测技术在生物医药、食品安全、环境监测、激素测定等领域的研究十分活跃。这种技术主要是基于抗原和抗体之间的特异性结合原理并与现代测试手段相结合，首先在测试基片上固定探针生物分子(抗原或抗体)，通过目标分子(抗原或抗体)与探针分子特异性反应后基片信号发生的改变进行目标分子的高灵敏度的分析检测。其中，利用光学信号进行免疫检测的技术就是光学免疫检测技术。

免疫检测技术主要包括标记和免标记两大类，免疫标记检测时通过示踪物(酶、荧光素、铁蛋白、胶体金、化学发光剂等)对目标分子进行荧光标记，然后发生抗原-抗体反应，最后利用光学显微镜等精密仪器对反应结果进行分析(参见吴雄文等主编《实用免疫学实验技术》，湖北科学技术出版社，2002，57-84)。由于免疫标记技术是通过标记分子产生的信号变化进行检测，因此它是一种间接分析方法。最近20年来，一种直接检测反应分子信号的免标记免疫检测技术迅速发展了起来。如利用固定生物分子的基片传感器材料的表面层的折射率的改变进行传感检测的表面等离子共振技术(surface plasmon resonance，SPR)和干涉测量技术(interferometry)，以及利用液晶取向变化的光学免疫检测方法，椭圆偏振光学检测，基于反蛋白石光子晶体的光学免疫检测方法等等技术和方法。此外，在基于这些优秀的传感器材料的检测技术的基础上，通过对无需标记的检测单元进行编码就可以实现多元检测的目的(参见顾忠泽等，基于反蛋白石光子晶体的非标记多元免疫检测方法，专利公开号：CN101251538A)，这样就同时可以测定生物分子的种类和浓度信息。

近些年来，随着光子晶体理论的快速发展，基于光子晶体材料和光子带隙材料的免标记免疫检测方法已经成为人们研究的热点技术。光子晶体是由介电材料的周期排列而构成的一种人工光子带隙材料，根据介电常数在空间的分布，它分为一维，二维，三维三种结构，其中一维光子晶体结构无论是理论设计，或是实际制备都最为简便，而一维光子晶体中研究最为普遍的是一维二元结构光子晶体，也就是由两种介质材料构成的各种光子带隙材料。***等人在光子晶体理论的研究中发现由三种介电材料构成的光子晶体结构，也就是一维三元结构光子晶体，其由随机误差引起的无序度改变不明显，是更趋于一种理想和稳定的光子晶体结构(参见***等，光电子·激光，2004，15(1)，104-107)。

光子带隙结构传感器由于其折射率变化发生在电场最强的区域等特点(参见Huimin Ouyang，et al，Analytical Chemistry，2007，79，1502-1506)使得其具有灵敏度高、响应快、实时性好、免标记、可遥控、结构紧凑、无电磁干扰和安全性高等特点。电化学腐蚀制备的多孔硅就是一种制备光子带隙结构的优秀基底材料。多孔硅，具有独特的多孔结构和非常大的内表面积，并且具有能在室温下发光，造价低廉、能和现有集成电路完全兼容等特点，本身就是一种理想的免疫传感器基底材料(参见Victor S.-Y.Linet al，Science，1997，278，840-843)，澳洲弗林德斯大学Andrew Jane等人在***总结多孔硅生物传感器技术后指出成本问题是影响多孔硅生物传感器从实验室走向商业的主要问题之一(参见Andrew Jane，et al，Trends inBiotechnology，2009，27(4)，230-239)，因此选择制备方法比较廉价的电化学方法是比较有利的一种方法。此外，目前主要使用的通过高、低两种电流的交替进行的电化学腐蚀而成的多孔硅多孔硅Bragg反射镜、多孔硅微腔结构或者基于多孔硅光致发光特性的各种多孔硅多层结构，由于受许多外界随机因素作用会引起多孔硅光子带隙结构的实际尺度的偏离，会产生一定的无序性，很难大批次重复制备出理想的多孔硅光子晶体。因此，基于多孔硅的一维三元光子带隙结构生物传感器不但同时兼具多孔硅和光子带隙结构传感器的优异性能，而且会对多孔硅光子带隙结构的稳定性起到很好的保持作用，同时针对不同条件制备的多孔硅一维三元光子带隙结构生物传感器进行编码，还可以实现多元检测的目的。

发明内容

技术问题：本发明的目的是提供一种基于多孔硅三元结构微腔的免标记光学免疫检测方法，该检测方法不仅具有更为稳定的基底结构，而且兼具多孔硅和光子带隙结构传感器的检测时间短，灵敏度高等诸多优异性能，同时通过对不通条件制备的多孔硅微腔进行编码可以实现多元检测，确定待测分子的种类和浓度。

技术方案：本发明的目的可以通过以下方案实现：

采用计算机精确控制电流和时间的电化学腐蚀方法制备多孔硅微腔，多孔硅微腔内上、下的Bragg结构由三种不同大小电流的交替腐蚀而形成。这种通过氢氟酸和酒精混合溶液进行电化学腐蚀而成的多孔硅三元结构微腔是一种一维方向排列的光子带隙材料，与光子晶体材料类似，它是一种特殊的光学微腔，微腔中的缺陷会导致光子禁带中出现极窄的缺陷峰。目前在光子晶体理论的研究中有很多理论计算方法，如转移矩阵方法等，因此可以根据每层材料的折射率和物理厚度，即光学厚度精确计算光子禁带的频段位置。这种多层多孔硅中每层多孔硅的折射率与该多孔层的孔隙率有关，因此通过改变电流密度大小就可以得到较大范围内折射率的多孔硅层；而腐蚀时间的精确控制可以得到不同厚度的多孔层，所以不同电流，不同时间制备出的多孔硅微腔的反射谱中缺陷峰峰位或发光中心峰位是不一样的，这样不同的反射谱中缺陷峰峰位或发光中心峰位就可以作为多孔硅微腔的编码。如果是多元检测可以对不同条件制备的多孔硅微腔进行编码，一元检测则不需要编码，然后使抗体或抗原在多孔硅三元结构微腔的孔洞里结合，多元检测中抗原或抗体的种类利用多孔硅微腔的编码进行标识，而通过生物反应前后的光谱峰位变化进行检测样品中相应的抗原或抗体浓度，所述检测方法包括以下步骤：

1.抗原或抗体固定在多孔硅微腔的孔洞里，如果是需要编码的多元检测，那么一种编码的多孔硅微腔对应固定一种待测生物分子的特异性抗原或抗体，冲洗未结合的分子并封闭多孔硅微腔里的未结合生物分子的空白键位，记录测定固定有抗原或抗体的多孔硅微腔光谱；

2.不同多孔硅微腔与不同浓度待测溶液发生反应，使抗原-抗体在多孔硅微腔的孔洞里特异性结合，反应后进行冲洗，记录多孔硅微腔光谱及编码确定种类和浓度。

基于多孔硅三元结构微腔的光学免疫检测方法中，多孔硅微腔的编码可以通过反射光谱测定，也可以通过多孔硅的荧光光谱测定。通过反射光谱测定的多孔硅微腔的编码为其缺陷所对应的共振透射峰位，通过荧光光谱测定的多孔硅微腔的编码为其发光中心所对应的峰位，多孔硅微腔多孔硅微腔的编码表征可以设计在紫外可见区域，也可以在红外区域。

多孔硅三元结构微腔的孔径大小可以根据不同生物分子设计成几个纳米左右的纳米孔微腔，10～500纳米的介孔微腔或微米数量级的大孔微腔结构。抗原或者抗体可以通过物理或者化学方法结合在多孔硅三元微腔的孔洞里。待测样品可以是血清、组织液、毒品、***、各种细胞的可溶性受体分子。

有益效果：本发明具有以下优点：

1)保留了电化学制备的多孔硅微腔免疫传感器原有廉价、表面积大、能和现有集成电路完全兼容等优点的同时，兼具光子带隙结构传感器的优异性能，此外，三元结构的采用使得多孔硅微腔更加稳定，制备过程中随进因素的影响得到很大程度的降低。

2)只需调整腐蚀的电流和时间，就可以得到具有不同光谱峰位的多孔硅微腔，从而可以利用不同光谱峰位的多孔硅微腔进行编码，实现了多元检测的目的。

3)多孔硅微腔的编码可以根据多孔硅微腔反射谱中的缺陷峰位进行编码，也可以利用多孔硅结构独有的室温下光致发光光谱，即多孔硅的发光中心所对应的峰位进行编码。

3)根据实际检测的需要，应用光子晶体中的电磁场理论，可以将反射谱缺陷峰的峰位设计到位于紫外波段到红外波段的广大区域，编码量十分巨大，可以满足高通量检测的要求。

附图说明

附图为多孔硅三元结构微腔的结构示意图。

具体实施方式

通过物理吸附或共价键耦合的方式将探针抗原或抗体分子固定在制备好的多孔硅微腔的孔洞里，如果是化学键耦合模式，则利用缓冲溶液进行冲洗未结合的分子并封闭空白键位，并进行光谱测定，可以是反射光谱，也可以是发光光谱。集中不同编码的若干多孔硅微腔并加入目标分子，使得探针、目标分子在多孔硅微腔的孔洞里发生抗原-抗体反应；反应后冲洗未反应的抗原或抗体分子，再次进行光谱测定，光谱峰位的位置变化与待测分子的浓度有关，而编码的测定可以标识待测分子的种类。

其中，多孔硅三元结构微腔的孔径大小可以根据不同生物分子设计成纳米孔微腔，介孔微腔或大孔微腔结构。待测样品则可以是血清、组织液、毒品、***、各种细胞的可溶性受体分子。在多孔硅微腔编码的测定中，通过反射光谱测定的多孔硅微腔的编码为其缺陷所对应的共振透射峰位，通过荧光光谱测定的多孔硅微腔的编码为其发光中心所对应的峰位，多孔硅微腔多孔硅微腔的编码表征可以在紫外可见区域，或在红外区域。

基于多孔硅三元结构微腔的光学免疫检测方法包括以下步骤：

实施例一。使用多孔硅三元结构微腔进行目标抗原-牛血清白蛋白(BSA)的浓度检测：

1.采用化学键耦合的办法固定BSA抗体到多孔硅微腔的孔洞里，预处理步骤如下：

1)将多孔硅放置在900℃的环境中氧化15min；

2)甲苯溶液稀释的4％APTES中浸泡一小时进行硅烷化反应；

3)分别用甲苯，甲醇-甲苯，甲醇，去离子水反复冲洗，置于N2环境中干燥，然后将样品在100℃环境中烘烤10min；

4)在2％的戊二醛水溶液中30min，并用PBS(磷酸缓冲液PH＝7.4)反复冲洗去除残余的戊二醛；

处理过的多孔硅微腔分为2组，一组进行BSA阳性血清浸泡，另一组进行BSA阴性血清浸泡做为对照。之后样品37℃下放置2小时，然后用PBST(0.1％Tween-20与磷酸的混合溶液)反复冲洗，并用3％卵清白蛋白(OVA)封闭。记录多孔硅微腔的反射谱中的缺陷峰峰位。

2.将固定血清的多片多孔硅微腔分别固定不同的BSA，所有样品37℃下放置2小时，使其充分发生抗原抗体反应，反应后再用PBST冲洗，去除未反应的BSA，然后样品在N₂环境中干燥。记录下每片多孔硅微腔的反射谱并与抗原-抗体反应前的反射谱做对比，根据缺陷峰波长红移距离来判断BSA的浓度。

实施例二。使用编码的多孔硅微腔进行溶液中人***状瘤病毒(HPV)L1抗原和草原兔尾鼠卵透明带3基因(LZP3)抗原的检测：

1.采用实施例一中多孔硅微腔的预处理方法对两种结构的多孔硅微腔进行功能化预处理。两种结构的多孔硅微腔分别固定HPV L1抗体和LZP3抗体，另外一种多孔硅微腔固定BSA做为对照。用PBST(0.1％Tween-20与磷酸的混合溶液)反复冲洗，并用3％BSA封闭。测定3种多孔硅微腔的缺陷透射峰波长分别在1500nm，3500nm，5500nm，依据缺陷透射峰波长分别进行编码。

2.将3种放在一起的多孔硅微腔浸泡在混合待测溶液中，所有样品37℃下放置2小时，使其充分发生抗原抗体反应，反应后再用PBST冲洗，去除未反应的BSA，然后样品在N₂环境中干燥。测量结果首先与编码对照，缺陷透射峰波长接近1500nm的是HPV L1抗原，接近3500nm的是LZP3抗原，接近3500nm的是对照抗原。然后根据缺陷透射峰波长红移的距离来判断待测分子的浓度。

Claims

1.一种基于多孔硅三元结构微腔的光学免疫检测方法，该方法采用基于计算机精确控制的电化学腐蚀方法制备多孔硅微腔，其中多孔硅微腔内上、下的Bragg结构由三种电流密度交替进行电化学腐蚀而形成，其特征在于对于不同条件制备的多孔硅微腔进行编码可以实现多元检测，如果是一元检测则不需要编码，使抗体或抗原在多孔硅三元结构微腔的孔洞里结合，多元检测中抗原或抗体的种类利用多孔硅微腔的编码进行标识，而通过生物反应前后的光谱峰位变化进行检测样品中相应的抗原或抗体浓度，所述检测方法包括以下步骤：

1)抗原或抗体固定在多孔硅微腔的孔洞里，如果是需要编码的多元检测，那么一种编码的多孔硅微腔对应固定一种待测生物分子的特异性抗原或抗体，冲洗未结合的分子并封闭多孔硅微腔里的未结合生物分子的空白键位，记录测定固定有抗原或抗体的多孔硅微腔光谱；

2)不同多孔硅微腔与不同浓度待测溶液发生反应，使抗原-抗体在多孔硅微腔的孔洞里特异性结合，反应后进行冲洗，记录多孔硅微腔光谱及编码确定种类和浓度。

2.根据权利要求1所述的基于多孔硅三元结构微腔的光学免疫检测方法，其特征在于多孔硅微腔的编码可以通过反射光谱测定，也可以通过多孔硅的荧光光谱测定。

3.根据权利要求1或2所述的基于多孔硅三元结构微腔的光学免疫检测方法，其特征在于通过反射光谱测定的多孔硅微腔的编码为其缺陷所对应的共振透射峰位，通过荧光光谱测定的多孔硅微腔的编码为其发光中心所对应的峰位。

4.根据权利要求3所述的基于多孔硅三元结构微腔的光学免疫检测方法，其特征在于多孔硅微腔多孔硅微腔的编码表征可以设计在紫外可见区域，也可以设计在红外区域。

5.根据权利要求1所述的基于多孔硅三元结构微腔的光学免疫检测方法，其特征在于多孔硅三元结构微腔的孔径大小可以根据不同生物分子设计成纳米孔结构微腔，介孔结构微腔或大孔结构微腔结构。

6.根据权利要求1所述的基于多孔硅三元结构微腔的光学免疫检测方法，其特征在于抗原或者抗体可以通过物理或者化学方法结合在多孔硅微腔的孔洞里。

7.根据权利要求1所述的基于多孔硅三元结构微腔的光学免疫检测方法，其特征在于待测样品可以是血清、组织液、毒品、***和各种可溶性受体分子。