CN110607364B - 通过检测snp位点确定等位基因的基因型的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种通过检测SNP位点确定等位基因的基因型的方法,所述方法通过AS‑PCR法检测待测等位基因的一个或多个SNP位点,然后根据每个SNP位点的检测结果,确定每个待测等位基因的基因型。本发明方法不需要昂贵的检测仪器,可以在小型实验室和医院的检验室中进行,很符合临床检验灵敏度高、方便快捷的要求。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域,特别涉及一种通过检测SNP位点确定等位基因的基因型的方法。
背景技术
等位基因是指位于一对同源染色体相同位置上控制同一性状不同形态的基因,英文原文为"allele"。不同的等位基因产生例如发色或血型等遗传特征的变化。等位基因控制相对性状的显隐性关系及遗传效应,可将等位基因区分为不同的类别。在个体中,等位基因的某个形式(显性的)可以比其他形式(隐性的)表达得多。当一个生物体带有一对完全相同的等位基因时,则该生物体就该基因而言是纯合的(homozygous)或可称纯种(true-breeding);反之,如果一对等位基因不相同,则该生物体是杂合的(heterozygous)或可称杂种(hybrid)。等位基因各自编码蛋白质产物,决定某一性状,并可因突变而失去功能。等位基因之间存在相互作用。当一个等位基因决定生物性状的作用强于另一等位基因并使生物只表现出其自身的性状时,就出现了显隐性关系。作用强的是显性,作用被掩盖而不能表现的为隐性。
单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)是一种遗传标记,位于人类基因组上。随着人类基因组计划的完成,人们发现人类的DNA序列并非完全一致的,其中包含着某些变异。这些变异导致了多种遗传性疾病的产生。作为第三代遗传标志,SNP位点与遗传性疾病的产生息息相关。故对SNP位点进行研究及检测,将为发现遗传疾病高危群体、检测疾病的相关基因以及对生物医学的基础研究等方面提供一条新的出路。现有的SNP的检测方法大致可以分为两大类:一大类是以单链构象多态性(SSCP)、等位基因特异性PCR(allele-specific PCR,AS-PCR)等为代表的以凝胶电泳为基础的传统经典的检测方法。另一大类是以直接测序、质谱检测技术等为代表的高通量、自动化程度较高的检测方法。多种检测方法中直接测序法准确度最高,常作为SNP位点检测的金标准。但该方法所需仪器成本高,测序耗时较长,很难在一般性医院或实验室中普及。
发明内容
为了解决上述技术问题,本发明提供一种通过检测SNP位点确定等位基因的基因型的方法,所述方法通过AS-PCR法检测待测等位基因的一个或多个SNP位点,然后根据每个SNP位点的检测结果,确定每个待测等位基因的基因型。
在一种实施方式中,所述方法包括以下步骤:步骤1:针对待测等位基因的每个SNP位点设计三条扩增引物,其中一条扩增引物是上游引物或下游扩增引物,相应地另外二条扩增引物是下游扩增引物或上游扩增引物;所述二条扩增引物3’末端碱基与SNP位点碱基分别是相同和互补,所述二条扩增引物的其它各个位置碱基相同;步骤2:构建符合所述SNP位点所有可能基因型的阳性质粒对照组,根据阳性对照组QPCR结果得到各待测SNP位点基因型判读区间;和,步骤3:使用步骤1设计的特异性扩增引物对待测样本进行QPCR反应,所得结果根据步骤2确定的SNP位点不同基因型判读区间判别待测样本SNP位点的基因型。
在一种实施方式中,所述步骤2包括以下步骤:a.对所述SNP位点所有可能出现的基因型与引物组合设计至少三个不同梯度DNA阳性模板实验组,每个SNP位点有三种基因型,每种基因型依照步骤1的方法设计三条扩增引物,每个SNP位点共有六种不同的基因型和引物组合,然后以上述组合进行QPCR反应;b.引物与所对应的纯合基因型质粒模板为特异性组,引物与非对应的纯合基因型质粒模板为非特异性组,引物与混合基因型质粒模板为混合组;c.将特异性组、非特异性组和混合组的QPCR结果换算成基因拷贝数后,按纯合基因型/纯合基因型、杂合基因型/杂合基因型比较各基因拷贝数,分别得到各基因型各浓度梯度下特异性组合与非特异性组合、混合组组合比较的倍率比;d.将所得各种基因型的倍率比按对数形式表现出来,并绘制所述SNP位点基因型定量分型区域图,得到各待测SNP位点基因型判读区间。
在一种实施方式中,所述待测基因是聚集素基因。
在一种实施方式中,所述SNP位点是rs11136000、rs2279590和/或rs9331888。
在一种实施方式中,所述rs11136000位点在步骤1中三条扩增引物分别是:上游引物SEQ No.3:5’-TAAAGAATCCACTCATCCTTCAAGA-3’,下游引物SEQ No.4:5’-GCAAGGGCCCGTTAGAGAA-3’和SEQ No.5:5’-GCAAGGGCCCGTTAGAGAG-3’。
在一种实施方式中,所述rs2279590位点在步骤1中三条扩增引物分别是:上游引物SEQ No.8:5’-GGAAGTCCTCCTGCTT-3’,上游引物SEQ No.9:5’-GGAAGTCCTCCTGCTC-3’和下游引物SEQ No.10:5’-TGGAAACCACTTTTATTC-3’。
在一种实施方式中,所述rs9331888位点在步骤1中三条扩增引物分别是:上游引物SEQ No.13:5’-GGAAGTCCTCCTGCTT-3’,上游引物SEQ No.14:5’-GGAAGTCCTCCTGCTC-3’和下游引物SEQ No.15:5’-TGGAAACCACTTTTATTC-3’。
单核苷酸多态性(SNP)指基因组水平上由单个核苷酸的变异引起的DNA序列多态性,包括转换、颠换、缺失和***。因每个SNP位点通常仅含两个等位基因,在检测时能通过一个简单的“+/-”分析进行基因型分型,无需分析片段长度。现有的SNP的检测方法大致可以分为两大类:一大类是以单链构象多态性(SSCP)、等位基因特异性PCR(allele-specificPCR,AS-PCR)等为代表的以凝胶电泳为基础的传统经典的检测方法。另一大类是以直接测序、质谱检测技术等为代表的高通量、自动化程度较高的检测方法。多种检测方法中直接测序法准确度最高,常作为SNP位点检测的金标准。但该方法所需仪器成本高,测序耗时较长,很难在一般性医院或实验室中普及。本发明所采用的AS-PCR法既不需要昂贵的检测仪器,也没有冗杂的实验过程,仅需设计特异性的引物,结合QPCR技术,即可实现对待测基因的SNP位点的高通量测序。
本发明方法检测结果与直接测序法结果进行对比,结果显示二者完全相符,这说明该方法对SNP位点基因型的检测灵敏度和金标准相同。因其不需要昂贵的检测仪器,可以在小型实验室和医院的检验室中进行,很符合临床检验灵敏度高、方便快捷的要求。故该方法可用于临床医院检验室对CLU基因与AD相关SNP位点基因型的检测,为临床探寻AD的易感基因提供一种简单、便捷的检测方法。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案,下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例,对于本领域普通技术人员来说,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其它的附图。
图1是rs11136000(A)位点,rs2279590(B)位点和rs9331888(C)位点基因型判读示意图;
图2是基因测序法和本发明的QPCR定量分型法检测rs11136000基因型结果图,①,②是基因测序法检测结果,基因型分别为CC,CT;③是QPCR定量分型法结果;
图3是基因测序法和QPCR定量分型法检测rs2279590基因型结果图,①,②是基因测序法检测结果,基因型分别为CC,CT;③是QPCR定量分型法结果;和
图4是基因测序法和本发明的QPCR定量分型法检测rs9331888基因型结果图,①,②,③是基因测序法检测结果,基因型分别为CC,CG,GG;④是QPCR定量分型法结果。
具体实施方式
为了使本领域技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案,下面将结合实施例对本发明作进一步说明,显然,所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例,都应当属于本申请保护的范围。
实施例
1.材料
1.1.实验样本13例血液样本均来自2019年北京中医药大学东直门医院的门诊或住院患者。其中男性8人,女性5人,所有研究对象签署书面知情同意书同意后,采集外周血2ml,并保存在-20℃冰箱。正常组3例,为健康且无AD家族遗传史者,其余10例血液样本均来自AD患者。
1.2.试剂与仪器全血基因组DNA提取试剂盒(QIAamp DNA Blood Mini Kit)(北京兰博利德商贸有限公司);TaKaRa TaqTM HotStar DNA聚合酶及其他PCR反应试剂(北京兰博利德商贸有限公司);TaKaRa DL2000DNA marker(北京兰博利德商贸有限公司);QuantiNovaTMGreen PCR Kit(北京兰博利德商贸有限公司);超微量分光光度仪(美谷分子仪器(上海)有限公司);T100TM型PCR仪(Bio RAD);DYY-6C电泳仪(北京六一生物科技有限公司);QuantStudioTM6Flex荧光定量PCR仪(Thermo Fisher);引物由深圳华大基因公司合成;测序由上海生物工程公司完成。
2.方法
2.1.基因组DNA的提取基因组的提取参考QIAamp DNA Blood Mini Kit说明书进行。提取的核酸利用超微量分光光度仪测定DNA的含量,利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA完整性,-20℃保存备用。
2.2.特异性引物的设计从Genbank中下载CLU全基因序列及待测SNP位点的信息,使用primer Premier 5.0软件对三个SNP位点设计特异性引物。针对SNP位点rs11136000设计3对特异性引物,外侧引物用于常规PCR扩增及测序,2对内侧引物用来鉴别rs11136000基因的3种基因型(CC型、CT型、TT型)。针对SNP位点rs2279590设计3对特异性引物,外侧引物用于常规PCR扩增及测序,2对内侧引物用来鉴别rs2279590基因的3种基因型(CC型、CT型、TT型)。针对SNP位点rs9331888设计3对特异性引物外侧引物用于常规PCR扩增及测序,2对内侧引物,用来鉴别rs9331888基因的3种基因型(CC型、CG型、GG型)。引物序列见下表1。
表1 SNP位点常规PCR和QPCR引物序列
2.3.基因测序分型使用设计的常规PCR引物及TaqTM HotStar DNA聚合酶进行PCR扩增。PCR反应体系组成如下:10x PCR Buffer 2.5ul,dNTP Mixture(2.5mM)2ul,TaKaRaTaq酶(5U/ul)0.125ul,上下游引物(10uM)各1ul,DNA模板1ul,灭菌水17.375ul,反应总体系25ul。扩增反应条件:95℃ 3min,95℃ 30s,58℃ 30s,72℃ 30s,共35个循环;终延伸72℃ 5min,4℃保存。PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行检测分析,DL2000DNA marker作为参考,回收并纯化所需DNA条带,送由上海生物工程公司完成测序。
2.4.阳性对照组质粒模板的构建使用北京市东直门医院采集的3例健康者的血液作为样本,从血液中提取基因组DNA,按上述方法进行PCR扩增,回收所需DNA条带并送测,PCR产物作为模板构建质粒载体。因s11136000,rs2279590和rs9331888位点各对应2种碱基,三种基因型。故根据测序结果,以已经构建好的质粒载体为模板进行点突变实验,获得每个SNP位点相对应的另一种碱基,并构建新的质粒载体。将已经构建好的两种纯合子质粒载体等比例混合,获得杂合质粒载体,从而构建符合各SNP位点基因型的阳性对照组质粒模板。载体的构建使用PCR产物作为模板,pMDTM18-TVector(TaKaRa)作为载体,步骤参考TaKaRa pMDTM18-T Vector Cloning Kit说明书。点突变实验采用已经测序的质粒载体作为模板,点突变引物自行设计,选择QuikChangeLightning Multi Site-DirectedMutagenesis Kit中的PCR反应试剂,PCR反应体系组成如下:10x reaction Buffer 5ul,dNTP Mixture 1ul,上下游突变引物(10uM)各1ul,QuickSolutionreagent 1.5ul,质粒DNA模板1ul,灭菌水14.5ul,随后加入Quickchange lightening Enzyme1ul,反应总体系26ul。扩增反应条件:95℃ 2min,95℃ 20s,60℃ 10s,68℃ 30s,共18个循环;终延伸68℃ 5min,4℃保存。PCR产物根据说明书构建质粒载体。
2.5.QPCR定量分型采用设计的QPCR引物,选择SYBR Green qPCR Master进行QPCR检测。QPCR反应体系组成如下:2×SYBR Green Master Mix 10ul,上下游引物(10uM)1ul,DNA模板1ul,灭菌水7ul,反应总体系25ul。rs11136000、rs9331888扩增反应条件:95℃2min,95℃ 5s,64℃ 20s,共40个循环。rs2279590扩增反应条件:95℃ 2min,95℃ 5s,55℃20s,共40个循环。将实验组和阳性对照组所得结果进行比较,对各组临床样本进行SNP分型。
2.6.基因型判读QPCR实验前对每个SNP位点设计4个不同梯度的DNA模板(109拷贝数、108拷贝数、107拷贝数、106拷贝数)阳性对照组。因一个SNP位点有三种基因型,两对特异性引物,故每个SNP位点共有6种不同的基因型和引物组合。其中引物与所对应的纯合基因型质粒模板为阳性对照组,引物与非对应的纯合基因型质粒模板为非特异性组,引物与混合基因型质粒模板为混合组。反应结束后,以ct值为横坐标,特异性引物与相对应的纯合子基因型组起始拷贝数浓度的对数为纵坐标,绘制定量标准曲线(相关系数R2>0.99)。通过定量标准曲线将混合组和非特异性组ct值等比例换算成拷贝数,换算结果按纯合基因型/纯合基因型,杂合基因型/杂合基因型比较,所得结果按倍率形式体现,再将倍率按logistic对数形式转换,并对结果进行分析。根据阳性对照组QPCR结果得到所需的SNP位点基因型判读区间为:对于rs11136000,当结果落在[1,+∞]时基因型为CC;[-1,1]基因型为CT;[-1,-∞]基因型为TT。对于rs2279590,当结果落在[1,+∞]时基因型为CC;[-1,1]基因型为CT;[-1,-∞]基因型为TT。对于rs9331888,当结果落在[1,+∞]时基因型为CC;[-1,1]基因型为CG;[-1,-∞]基因型为GG。各SNP位点基因型判读区间如下图1所示。以CLU R1rs11136000作为具体例子对QPCR定量分型的判读区间构建过程进行说明。
下表为CLU R1(rs11136000)阳性质粒六种不同基因组和引物组合的QPCR结果。其中CLU-P1-FOR/P3C-REV引物与CLU R1的CC纯合质粒模板组合、CLU-P1-FOR/P3T-REV引物与CLU R1的TT纯合质粒模板组合为特异性组;CLU-P1-FOR/P3C-REV引物与CLU R1的TT纯合质粒模板组合、CLU-P1-FOR/P3T-REV引物与CLU R1的CC纯合质粒模板组合为非特异性组;剩余两组为混合组。根据上述实验方法,以特异性组作为阳性标准设置四个梯度(109拷贝数、108拷贝数、107拷贝数、106拷贝数),QPCR结果构建定量标准曲线(相关系数R2>0.99),再通过定量标准曲线将混合组和非特异性组ct值等比例换算成拷贝数,以得到下表。
表2 CLU R1(rs11136000)特异性引物与质粒模板QPCR结果
下图为六种组合(特异性组、非特异性组、混合组)QPCR结果换算拷贝数后,按纯合基因型/纯合基因型、杂合基因型/杂合基因型比较拷贝数,分别得到CC、TT、CT基因型各梯度下特异性组合与非特异性组合、混合组组合比较的倍率比。
表3 CLU R1(rs11136000)各基因型QPCR定量分型倍率比
最后将所得三种基因型的倍率比按对数形式表现出来,并绘制基因型定量分型区域图。如图1A所示。
3.结果
3.1.基因组DNA的提取10例AD患者的外周血采用DNA提取试剂盒提取基因组DNA,经超微量分光光度仪检测吸光度(A),A260nm/A280nm比值均在1.8-2.0之间,表明提取DNA纯度符合后续实验要求。
3.2.基因测序法和QPCR定量分型法结果比较对10组样本的rs11136000,rs2279590和rs9331888 3个SNP位点进行基因测序和QPCR定量分型结果如图2,图3,图4所示。两种方法检测10例样本rs11136000,rs2279590和rs9331888位点基因型的符合率为100%,结果见表4-6。
表4两种方法检测rs11136000基因型分布(n=10)
表5两种方法检测rs2279590基因型分布(n=10)
表6两种方法检测rs9331888基因型分布(n=10)
应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质,因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的,而不是意欲限制本发明的范围,本发明的范围仅受限于所附的权利要求。
本领域的技术人员还将认识到,或者能够确认使用不超过常规实验,在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。
序列表
<110> 北京中医药大学
<120> 通过检测SNP位点确定等位基因的基因型的方法
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
agaatccact catccttcaa ga 22
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atttttgtat ttttagtaga gatgg 25
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
taaagaatcc actcatcctt caaga 25
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcaagggccc gttagagaa 19
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gcaagggccc gttagagag 19
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cctggagact tctacaggga ccgt 24
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
aatgtttgga aaccactttt attctt 26
<210> 8
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ggaagtcctc ctgctt 16
<210> 9
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ggaagtcctc ctgctc 16
<210> 10
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tggaaaccac ttttattc 18
<210> 11
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ggagtctcag caccacctga acttgac 27
<210> 12
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
tcgtcctgtt ggttctgtga tggca 25
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
gagcaggctt cccagagaaa gtccg 25
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gagcaggctt cccagagaaa gtccc 25
<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
tcgtcctgtt ggttctgtga tggca 25
Claims (1)
1.通过检测SNP位点确定等位基因的基因型的方法,其特征在于,所述方法通过AS-PCR法检测待测等位基因的一个或多个SNP位点,然后根据每个SNP位点的检测结果,确定每个待测等位基因的基因型;
所述方法包括以下步骤:
步骤1:针对待测等位基因的每个SNP位点设计三条扩增引物,其中一条扩增引物是上游引物或下游扩增引物,相应地另外二条扩增引物是下游扩增引物或上游扩增引物;所述二条扩增引物3’末端碱基与SNP位点碱基分别是相同和互补,所述二条扩增引物的其它各个位置碱基相同;
步骤2:构建符合所述SNP位点所有可能基因型的阳性质粒对照组,根据阳性对照组QPCR结果得到各待测SNP位点基因型判读区间;
步骤3:使用步骤1设计的特异性扩增引物对待测样本进行QPCR实验,所得结果根据步骤2确定的SNP位点不同基因型判读区间判别待测样本SNP位点的基因型;
所述步骤2包括以下步骤:
a.对所述SNP位点所有可能出现的基因型与引物组合设计至少三个不同梯度DNA阳性模板实验组,每个SNP位点有三种基因型,每种基因型依照步骤1的方法设计三条扩增引物,每个SNP位点共有六种不同的基因型和引物组合,然后以上述组合进行QPCR实验;
b.引物与所对应的纯合基因型质粒模板为特异性组,引物与非对应的纯合基因型质粒模板为非特异性组,引物与混合基因型质粒模板为混合组;
c.QPCR反应结束后,以ct值为横坐标,特异性引物与相对应的纯合子基因型组起始拷贝数浓度的对数为纵坐标,绘制定量标准曲线;将非特异性组和混合组的QPCR结果换算成基因拷贝数后,按纯合基因型/纯合基因型、杂合基因型/杂合基因型比较各基因拷贝数,分别得到各基因型各浓度梯度下特异性组合与非特异性组合、混合组组合比较的倍率比;
d.将所得各种基因型的倍率比按对数形式表现出来,并绘制所述SNP位点基因型定量分型区域图,得到各待测SNP位点基因型判读区间;
所述待测等位基因是聚集素基因,所述SNP位点是rs11136000、rs2279590和/或rs9331888;
所述rs11136000位点在步骤1中三条扩增引物分别是:上游引物SEQ No.3:5’-TAAAGAATCCACTCATCCTTCAAGA-3’,下游引物SEQ No.4:5’-GCAAGGGCCCGTTAGAGAA-3’和SEQNo.5:5’-GCAAGGGCCCGTTAGAGAG-3’;
所述rs2279590位点在步骤1中三条扩增引物分别是:上游引物SEQ No.8:5’-GGAAGTCCTCCTGCTT-3’,上游引物SEQ No.9:5’-GGAAGTCCTCCTGCTC-3’和下游引物SEQNo.10:5’-TGGAAACCACTTTTATTC-3’;
所述rs9331888位点在步骤1中三条扩增引物分别是:上游引物SEQ No.13:5’-GGAAGTCCTCCTGCTT-3’,上游引物SEQ No.14:5’-GGAAGTCCTCCTGCTC-3’和下游引物SEQNo.15:5’-TGGAAACCACTTTTATTC-3’。
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Citations (3)
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CN101054601A (zh) * | 2006-04-13 | 2007-10-17 | 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 | 一种检测细胞色素p450酶系突变位点的寡核苷酸探针及基因芯片 |
CN102471800A (zh) * | 2009-07-03 | 2012-05-23 | 加的夫大学学院咨询有限公司 | 阿尔茨海默病的诊断和治疗 |
AU2013203473A1 (en) * | 2008-04-30 | 2013-05-02 | Integrated Dna Technologies, Inc. | RNase-H-Based Assays Utilizing Modified RNA Monomers |
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-
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---|---|---|---|---|
CN101054601A (zh) * | 2006-04-13 | 2007-10-17 | 中国人民解放军军事医学科学院放射与辐射医学研究所 | 一种检测细胞色素p450酶系突变位点的寡核苷酸探针及基因芯片 |
AU2013203473A1 (en) * | 2008-04-30 | 2013-05-02 | Integrated Dna Technologies, Inc. | RNase-H-Based Assays Utilizing Modified RNA Monomers |
CN102471800A (zh) * | 2009-07-03 | 2012-05-23 | 加的夫大学学院咨询有限公司 | 阿尔茨海默病的诊断和治疗 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
AS-PCR 方法检测中国人群 CYP2C19基因多态性;薛丽等;《海南医学院学报》;20100930;第16卷(第9期);第1101-1105,1110页 * |
薛丽等.AS-PCR 方法检测中国人群 CYP2C19基因多态性.《海南医学院学报》.2010,第16卷(第9期),第1101-1105,1110页. * |
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