CN104404164A - 一种遗传性耳聋基因突变检测试剂盒 - Google Patents

一种遗传性耳聋基因突变检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种遗传性耳聋基因突变检测试剂盒，包括测序引物，所述测序引物包括如下序列：SEQ ID NO:1-36。本发明的遗传性耳聋基因突变检测试剂盒的具有检测位点多、覆盖范围广、阳性检出率高、临床使用价值高、灵敏度高、准确性高、检测特异性高、重复性高和检测稳定性好的优点；可以用于婚前筛查、产前诊断、孕期胎儿及耳聋人群的遗传性耳聋基因位点筛查检测，可极大地避免聋儿的出生及迟发性耳聋的发生，减轻社会家庭的经济负担，实现优生优育。

Description

一种遗传性耳聋基因突变检测试剂盒
技术领域
本发明涉及基因测序技术，特别涉及一种遗传性耳聋基因突变检测试剂盒。 
背景技术
耳聋是世界范围内最常见的感觉障碍性疾病之一，遗传性耳聋可以分为非综合征性耳聋和综合征性耳聋。据第二次全国残疾人抽样调查显示，我国听力残疾人数约2004万人，占残疾人总数的24.16％；耳聋导致的言语残疾约127万人，占残疾人总数的1.53％。先天性耳聋在新生儿中的发病率约为1/1000，其中一半以上的先天性耳聋与遗传基因有关。 
在非综合征性耳聋中，GJB2、SLC26A4和线粒体DNA是我国最常见的致病基因。GJB2基因编码连接蛋白(connexin 26)，参与细胞间信号介导和离子传递，突变的GJB2基因可能导致连接蛋白异常，进而影响细胞间隙的连接功能，引起内耳钾离子回收障碍而致耳聋。GJB2基因突变与非综合征性遗传性耳聋密切相关，包括常染色体显性遗传性聋DFNA3和常染色体隐性遗传性聋DFNB1。在中国人群中，26％～33％的语前聋患儿为GJB2基因突变所致，占常染色体隐性遗传性耳聋的28％，其突变的主要方式为c.235delC，检出率约为13.6％～21.5％。GJB2基因突变还可导致非综合性常染色体显性遗传性耳聋。SLC26A4基因突变与大前庭水管综合征/Mondin畸形和Pendred综合征(前庭水管扩大或伴Mondini畸形、神经性聋和甲状腺肿)有着密切关系。SLC26A4基因编码Pendred蛋白。Pendred蛋白主要由疏水性氨基酸组成，其功能主要参与碘/氯离子的转运。在内耳中，Pendred蛋白表达于内***和内淋巴囊上皮细胞及椭圆囊和球囊边缘的神经细胞中。Pendred蛋白发生异常即可影响细胞内外阴离子的转运，从而影响声音传递而导致听力损失。在中国大陆，大前庭水管患者SLC26A4基因突变检出率为97.9％，高于韩国(78％)、日本(92％)和欧洲(40％)。 
目前，临床上用于耳聋基因进行检测的试剂盒所用技术方法有PCR-RFLP法、微阵列芯片法、ARMS-PCR法、荧光定量PCR法，凝胶电泳法，荧光熔解 曲线法，荧光毛细管电泳法。现我国临床上主要用的是微阵列芯片法和荧光定量PCR法，它们的主要技术缺陷如下： 
微阵列芯片法检测需经过全血DNA提取(30min)、PCR扩增(2h以上)、产物杂交分析(3h以上)等步骤，检测时间长(6h以上)，操作繁琐，不能满足临床对致聋基因大量筛查的需求；由于操作流程过多，容易造成样本交叉污染；其次，对单个碱基的辨识率比较低，易出现假阴性和假阳性，使结果的准确率受到影响；此外，微阵列芯片成本过高，需要专门的芯片扫描仪器，检测成本高；普通ARMS-PCR产品的扩增效率仅为正常扩增的1-10％，因此扩增体系缺乏稳定性；四引物ARMS-PCR的一个反应只能检一个突变位点。普通PCR产品共有的缺点为：在结果判读时需要通过条带大小判断基因型，缺乏直观性。凝胶电泳检测结果容易造成PCR交叉污染、检测灵敏度低且耗时长；利用Taqman探针进行SNP突变检测，每检测一个位点需要2条探针，且对探针特异性有较高要求。探针合成成本较高，对荧光PCR仪的通道数有要求，不利于推广；荧光熔解曲线法检测一管检测位点少，且受荧光染料通道限制无法满足耳聋多基因多位点的检测；PCR-RFLP法检测技术操作繁琐，需要经过酶切反应，反应时间长，同时需要凝胶电泳检测容易出现样本交叉污染。酶切位点易受基因变异影响；多重PCR引物体系较复杂，较难设计，多对引物之间会形成相互干扰，竞争性抑制。因此检测位点越多，所需引物越多，PCR体系优化难度越高，同时受毛细管电泳仪荧光通道的限制，产品推广较难，一般检测位点最多不超过20个； 
现有产品共有的缺点是检测位点少，只能检测遗传性耳聋基因热点突变，无法检测众多的稀有位点，然而耳聋致病基因多，突变位点多，以上方法均无法满足临床上快速，简便，检测范围广的要求。在临床应用时存在漏检的可能，无法对患者的病因作出进一步的解释，降低了临床使用的价值。 
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种检测范围广、速度快、灵敏度高的遗传性耳聋基因突变检测试剂盒。 
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为： 
一种遗传性耳聋基因突变检测试剂盒，包括测序引物，所述测序引物包括如下序列：根据GJB2基因设计的上游引物F1和下游引物R1，所述F1的序列如SEQ ID NO:1，所述R1的序列如SEQ ID NO:2；根据GJB3基因设计的上游引物F2和下游引物R2，所述F1的序列如SEQ ID NO:3，所述R1的序列如SEQ ID NO:4；根据SLC26A4基因设计的上游引物F3-F16和下游引物R3-R16，所述F3-F16的序列如SEQ ID NO:5-18，所述R3-R16的序列如SEQ ID NO:19-32；根据12S rRNA基因设计的上游引物F17-18和下游引物R17-18，所述F17-F18的序列如SEQ ID NO:33-34，所述R17-R18的序列如SEQ ID NO:35-36。 
本发明的有益效果在于： 
(1)本发明的遗传性耳聋基因突变检测试剂盒的测序引物针对GJB2基因、SLC26A4基因、12S rRNA基因和GJB3基因进行设计，可检测出位于GJB2基因的37个位点突变，位于GJB3基因的2个位点突变，位于SLC26A4基因的59个位点突变，位于12S rRNA基因的7个位点突变，总共105个位点，具有检测位点多、范围广，可以检测遗传性耳聋多个基因的热点突变及稀有突变。现有市面上产品均无法检测稀有位点或只能检测少数稀有位点，存在漏检的可能。本试剂盒可以弥补现有产品的缺陷，一次检测众多的稀有位点突变，从而实现检测位点多、覆盖范围广、阳性检出率高、临床使用价值高的目的； 
(2)可以用于婚前筛查、产前诊断、孕期胎儿及耳聋人群的遗传性耳聋基因位点筛查检测，为全面开展遗传性耳聋基因筛查创造了条件，可极大地避免聋儿的出生及迟发性耳聋的发生，减轻社会家庭的经济负担，实现优生优育； 
(3)本发明的遗传性耳聋基因突变检测试剂盒具有灵敏度高(最低检出限为5ng)、准确性高(达99％以上)、检测特异性高(达99％以上)、重复性高(99％以上)和检测稳定性好的优点。 
附图说明
图1为本发明实施例的线粒体1555A>G纯合子测序图谱； 
图2为本发明实施例的线粒体1494C>T纯合子测序图谱； 
图3为本发明实施例的GJB2176del 16杂合子测序图谱； 
图4为本发明实施例的GJB2235del C杂合子测序图谱； 
图5为本发明实施例的GJB2299del AT纯合子测序图谱； 
图6为本发明实施例的GJB3538C>T纯合子测序图谱； 
图7为本发明实施例的SLC26A4IVS7-2A>G杂合子测序图谱； 
图8为本发明实施例的SLC26A42168A>G杂合子测序图谱； 
图9为本发明实施例的SLC26A41174A>T纯合子测序图谱； 
图10为本发明实施例的SLC26A41226G>A纯合子测序图谱； 
图11为本发明实施例的SLC26A41229C>T纯合子测序图谱； 
图12为本发明实施例的SLC26A42027T>A纯合子测序图谱； 
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。 
本发明最关键的构思在于:针对GJB2基因、SLC26A4基因、12S rRNA基因和GJB3基因设计测序引物，从而具有检测位点多、覆盖范围广的优点。 
本发明根据遗传性耳聋基因突变的位点，设计特异的引物进行扩增，通过测序反应从而可以对遗传性耳聋基因检测位点进行快速、高通量检测。本发明可以检测位于遗传性耳聋四个基因GJB2、GJB3、SLC26A4、12SrRNA上的105个突变位点的108种突变，包括热点突变及稀有突变，共有引物18对，对应特异的PCR产物18组。 
1、测序引物设计：测序引物在设计上对引物的特异性要求高，以确保所扩增的PCR产物片断单一、特异并包含检测位点，同时不存在非特异扩增。引物的Tm过高，虽可提高引物特异性，但影响引物与模板序列的结合效率，导致产物量低。Tm值过低，虽可提高结合效率，但影响其特异性，容易出现非特异扩增。引物的特异性与效率之间的平衡是本发明测序引物设计中的难点。本发明的测序引物为经过大量筛选优化后获得，可确保PCR扩增特异性的同时保证其扩增效率。为了使本发明的遗传性耳聋基因突变检测试剂盒在使用上的方便， 将引物退火温度统一设计为58℃左右(±3-5℃)。从NCBI数据库获取GJB2、GJB3、SLC26A4、12SrRNA基因的DNA序列，并根据各突变位点的位置设计引物，对应扩增18组PCR产物。优化后的最优引物与检测位点的对应关系如表1所示。表1为测序引物与检测位点的对应关系表。 
表1 
2、PCR反应液配方的确定：引物储存液的浓度范围在0.1～0.5μmol/L，MgCl2终浓度选择1.5mM-6mM，等浓度的四种脱氧三磷酸腺苷(dATP、dGTP、dCTP、dTTP)的混合液dNTP终浓度选择100nM-300nM，DNA聚合酶终浓度选择0.5－5IU/反应，利用正交试验方法，通过大量实验对比，最终确定最优的PCR反应体系见表2。表2为PCR反应液配方表。 
表2 
3、PCR反应程序的确定：本发明对PCR反应程序的优化是在常规PCR程序的基础上进行。常规PCR反应程序如表3所示。选取温度梯度、时间梯度、循环数做正交实验，经大量实验，确定出最优反应程序如表4。在ABI9700仪器上先95℃预变性5min，然后95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，循环35次，最后72℃再延伸10min。表3为常规PCR反应程序表。表4为优选PCR反应程序表。 
表3  
表4 
4、测序PCR：18组特异扩增产物用2％琼脂糖凝胶电泳检测，并切取PCR产物，使用Axygen公司的DNA凝胶回收试剂盒纯化PCR产物。取1μL经纯化后的各组PCR产物作为模板分别用对应的上下游引物(测序引物)在ABI9700上进行测序PCR。测序PCR体系及反应程序如表5、表6所示。表5为测序PCR体系表。表6为测序PCR反应程序表。 
表5 
表6 
5、测序：采用醋酸钠/乙醇法对测序反应产物进行纯化，上样到3500DX/3500xL DX测序仪，进行测序。测序序列用生物信息学软件拼接后在NCBI核酸数据库序列进行比对，以分析各检测位点是否突变。 
本发明的遗传性耳聋基因突变检测试剂盒的检测方法的主要操作步骤如下：(1)PCR扩增：分别在每管PCR反应液里加入50－200ng的人遗传组DNA模板进行PCR扩增，反应程序先95℃5min，然后95℃30s，58℃30s，72℃30s，循环35次，最后72℃10min；(2)PCR产物电泳检测与纯化：PCR产物用2％浓度的琼脂糖凝胶进行电泳检测，并用Axygen公司的DNA凝胶回收试剂盒回收纯化；(3)测序PCR：按表6在测序PCR反应液里加入纯化后PCR产物1μL,上游引物/下游引物1μL进行PCR扩增，反应程序先96℃1min，然后96℃10s，50℃5s，60℃4min，循环25次，最后4℃保温；(4)测序产物纯化：采用醋酸钠/乙醇法纯化测序PCR产物；(5)基因分析仪测序：按3500DX/3500xL DX测序仪操作说明进行上样测序操作；(6)数据收集处理和分析：将所测得序列在NCBI核酸数据库中进行比对分析，分析检测位点是否存在突变。 
6、效果分析 
6.1本发明的遗传性耳聋基因突变检测试剂盒用于临床检测的情况：选取10例先天性耳聋患者的样本，10例大前庭水管综合征患者的样本，10例药物性耳聋患者的样本及10例听力正常人群的样本，用本发明的遗传性耳聋基因突变检测试剂盒(本试剂盒)进行检测。检测结果如表7所示。表7为本试剂盒对临床样本检测的情况表。表8为本试剂盒检测结果与患者听力学检测结果对比表。 
表7 
表8 
由表7、表8可知，使用本试剂盒对临床40例样本进行检测，结果10例为线粒体1555A>G纯合突变，4例为SLC26A42168A>G纯合突变，5例为SLC26A4IVS7-2 A>G纯合突变，1例SLC26A41229C>T纯合突变，5例为GJB2235del C纯合突变，1例GJB2235del G和299del AT双重杂合突变，4例GJB2299del AT纯合突变共30例阳性样本，10例阴性样本。与临床听力学检测结果相比，其阳性符合率和阴性符合率均为100％。对上述阳性样本进行重复性检测实验，选取10例样本，不同批号产品，不同人(2人)操作，一天做2次，共做2天，每次试验每个样本重复3次检测，评价重复性，每次重复性检测实验的检测结果都如表10所示。表10为本试剂盒的重复稳定性实验表。 
表9 
6.2本试剂盒的性能指标：本试剂盒能稳定检出人血液基因组DNA的浓度最低检出限为5ng；本试剂盒检测遗传性耳聋基因的准确性达99％以上(在进行的40例样本中，30例耳聋患者样本均检测为阳性结果，10例正常样本均检测为阴性结果)；本试剂盒检测遗传性耳聋基因突变位点特异性达99％以上(40例样本中，10例听力正常患者的样本，检测结果均为阴性)；本试剂盒的重复性为99％以上(选取10例样本，不同批号产品，不同人(2人)操作，一天做2次，共做2天，每次试验每个样本重复3次检测，结果一致)；本品在有效期内使用完全可满足以上各指标。 
本发明的实施例一为：本实施例的遗传性耳聋基因突变检测试剂盒通过测序法对人临床基因组DNA样本与遗传性耳聋相关的四个热点基因上105个突变位点共108种突变进行定性检测，其中GJB235，176，187三个位点均存在两种突变。可检测位点的详细信息见表1。本试剂盒针对耳聋四个热点基因，分别在保守区设计特异引物，采用PCR法结合测序技术，检测各基因的突变情况。本实施例的试剂盒的组成成分见表11。表11为本实施例的试剂盒的组成成分表。 
表10 
于-18℃以下储存。避免反复冻融。试剂盒开瓶之后置于2～8℃或-18℃以下储存。有效期为6个月。定性PCR仪使用ABI Veriti DX Thermal Cycler，Applied Biosystems，Inc.；黑马9600；基因分析仪使用ABI 3500DX/3500xL Dx Genetic Analyzer。 
3、检验方法 
3.1DNA获取：本试剂盒所用的人基因组DNA推荐使用亚能生物技术(深圳)有限公司的《微量样本基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)》提取，也可用实验室常规方法(酚-氯仿抽提法)或其它试剂盒提取，试剂盒推荐使用QIAGEN公司的全血DNA提取试剂盒。提取所得DNA，应采用紫外分光光度计进行DNA浓度和纯度测定，OD260/OD280应达到1.7～2.1，必要时进行浓缩或稀释，将DNA浓度调整至1～100ng/μL后才能进行检测实验。 
3.2PCR扩增 
(1)反应液配制：从试剂盒中取出反应液、引物于室温融化并振荡混匀，低速离心数秒。取N个(N＝待测样本例数×18+HL质控品×18+空白管对照×1)反应管，按照表12所示体系配制单人份PCR反应液，表12为单人份PCR反应液成分表。注：每例样本分别用H1～H18的正反向引物扩增，共扩18管。 
表11 
(2)加样：取待测DNA样品各4μL，分别加到相应的PCR反应液管中，盖紧管盖，做好标记，低速离心数秒后置于PCR仪中并记录样本摆放顺序。空白对照管和质控品管同步进行。 
(3)扩增条件：PCR扩增参数如下为先95℃5min，然后95℃15s，58℃30s， 72℃30s，循环35次，最后72℃5min。 
PCR产物电泳检测与纯化：取3～5μL扩增，用1.5％琼脂糖凝胶(内加适量核酸染料)在5V/cm电压下电泳约30min，观察是否有目的条带(各条带大小见下表)，如观察到明显的单一目的条带，则对PCR产物进行纯化。获得纯化后的PCR产物进行电泳或测OD浓度定值(浓度范围为10～50ng)，即可进行测序。表13为各测序引物与目的片段的对应关系表，表14为各扩增片断与检测位点对应关系表。 
表12 
表13 
3.3测序PCR：各测序引物先分别跟水以1:2的比例稀释，再使用。定值后 的PCR产物，按表5配制测序PCR体系。用定性PCR仪按表6参数进行扩增。 
3.4测序产物纯化：取测序PCR反应结束的PCR管，各PCR反应管加入2μL 125mmol/L EDTA和2μL 3mol/L醋酸钠(pH5.2)。再加入50μL 100％无水乙醇，盖紧管盖，混匀，室温避光放置15min。于4℃12，000g离心30min，立即小心去上清(若不能立即操作，则在去上清前重新离心3min)。每管加入150μL预冷70％乙醇，4℃12，000g离心10min，立即小心去上清(尽量将残液吸干净，若不能立即操作，则在去上清前重新离心3min)，此步骤可重复操作一次(可选)。室温避光放置15～30min(让70％乙醇挥发干净)。加入10μL Hi-Di Formamide，振荡溶解DNA，低速离心数秒。样本置于定性PCR仪上，95℃变性5min，迅速置冰中冷却4min后，准备上样电泳。若采用试剂盒纯化，推荐BigDyeR Terminator v3.1Cycle Sequencing Kit。 
3.5基因分析仪测序：变性后的测序产物加入与基因分析仪配套的96孔板，盖好，编辑样本列表。根据测序仪型号选用具有IVD标志的Seq_std_BDTV3.1_ASSYXL_P0P7或Seq_std_BDTV3.1_ASSY_P0P7进行测序。使用3500Dx时，应用Data CollectionR与Sequencing Analysis软件进行数据收集和分析。测序结果自动保存在预设位置，反应结束后打开测序结果进行分析，得到.abl、.phd.1格式的文件。 
3.6质控标准：表15为质控标准表。各项必须达到标准，否则全部实验应重新进行。 
表14 
3.7结果判断：所有样本均会出现H1～H18各片段，如其中一管无扩增条带，则该管实验无效；当出现杂合突变基因型时，某一个碱基出现双峰或从某一个碱基开始会出现套峰；根据基因型的不同，各峰图有差异，部分基因型测序结 果图详细见附图1-12。 
图1为线粒体1555A>G纯合子测序图谱；图1中圆圈中的碱基对应的图谱显示为G，该碱基为基因突变位点，则由图1可知，线粒体1555A>G纯合子出现基因突变；图2为线粒体1494C>T纯合子测序图谱；图2中圆圈中的碱基对应的图谱显示为T，该碱基为基因突变位点,则由图2可知，线粒体1494C>T纯合子出现基因突变；图3为GJB2176del 16杂合子测序图谱；图3中圆圈中的碱基对应的图谱出现套峰情况，该碱基为基因突变位点，则由图3可知GJB2176del 16杂合子出现基因突变；图4为GJB2235del C杂合子测序图谱；图4中圆圈中的碱基对应的图谱出现套峰情况，该碱基为基因突变位点，则由图4可知GJB2235del C杂合子出现基因突变；图5为GJB2299del AT纯合子测序图谱；图5中圆圈中的碱基对应的图谱为碱基C，该碱基为基因突变位点AT后一位，则由图5可知GJB2299del AT纯合子出现基因突变；图6为GJB3538C>T纯合子测序图谱；图6中圆圈中的碱基对应的图谱为碱基T，该碱基为基因突变位点，则由图6可知GJB3538C>T纯合子出现基因突变；图7为SLC26A4IVS7-2A>G杂合子测序图谱；图7中圆圈中的碱基对应的图谱出现双峰，该碱基为基因突变位点，则由图7可知SLC26A4IVS7-2A>G杂合子出现基因突变；图8为SLC26A42168A>G杂合子测序图谱；图8中圆圈中的碱基对应的图谱出现双峰，该碱基为基因突变位点，则由图8可知SLC26A42168A>G杂合子出现基因突变；图9为SLC26A41174A>T纯合子测序图谱；图9中圆圈中的碱基对应的图谱为碱基T，该碱基为基因突变位点，则由图9可知SLC26A41174A>T纯合子出现基因突变；图10为SLC26A41226G>A纯合子测序图谱；图10中圆圈中的碱基对应的图谱为碱基A，该碱基为基因突变位点，则由图10可知SLC26A41226G>A纯合子出现基因突变。 
图11为SLC26A41229C>T纯合子测序图谱；图11中圆圈中的碱基对应的图谱为碱基T，该碱基为基因突变位点，则由图11可知SLC26A41229C>T纯合子出现基因突变。 
图12为SLC26A42027T>A纯合子测序图谱；图12中圆圈中的碱基对应的图谱为碱基A，该碱基为基因突变位点，则由图12可知SLC26A42027T>A纯 合子出现基因突变。 
根据临床样本的检测结果，本试剂盒测序峰图raw data的rfu值应不少于100rfu。每次实验均要设置质控品，质控品达到质控标准方可进行检测结果的判读；通过对不同基因型的模板浓度研究，确定基因组DNA最低检出浓度为10ng；试剂盒与人类基因组其它基因无交叉反应。 
结果判定：采用SeqScanner软件进行分析，若各片段序列与HL质控品对应的序列匹配，则判定为未检测出该位点的野生型。其他则为突变型。当发生缺失突变时，野生型和突变型的测序峰会混在一起，造成从突变位置开始，测序峰会混乱。每个样本的测序结果为包含目的位点的18片段，各序列内的其他突变位点也可以同时检出。 
综上所述，本发明提供的遗传性耳聋基因突变检测试剂盒的具有检测位点多、覆盖范围广、阳性检出率高、临床使用价值高、灵敏度高、准确性高、检测特异性高、重复性高和检测稳定性好的优点。 
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。 

Claims (4)

1.一种遗传性耳聋基因突变检测试剂盒，其特征在于，包括测序引物，所述测序引物包括如下序列：
根据GJB2基因设计的上游引物F1和下游引物R1，所述F1的序列如SEQID NO:1，所述R1的序列如SEQ ID NO:2；
根据GJB3基因设计的上游引物F2和下游引物R2，所述F1的序列如SEQID NO:3，所述R1的序列如SEQ ID NO:4；
根据SLC26A4基因设计的上游引物F3-F16和下游引物R3-R16，所述F3-F16的序列如SEQ ID NO:5-18，所述R3-R16的序列如SEQ ID NO:19-32；
根据12S rRNA基因设计的上游引物F17-18和下游引物R17-18，所述F17-F18的序列如SEQ ID NO:33-34，所述R17-R18的序列如SEQ ID NO:35-36。
2.根据权利要求1所述的遗传性耳聋基因突变检测试剂盒，其特征在于，还包括PCR反应液，所述PCR反应液包括MgCl2、PCR Buffer、dNTP混合液和DNA聚合酶。
3.根据权利要求1所述的遗传性耳聋基因突变检测试剂盒，其特征在于，还包括PCR测序试剂，所述PCR测序试剂包括BigDye和5×Sequencing buffer。
4.根据权利要求1所述的遗传性耳聋基因突变检测试剂盒，其特征在于，还包括质控品，所述质控品为正常人基因组DNA。
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