CN110607344A - 一种兽用抗菌药物头孢喹肟pk/pd模型的构建方法及应用 - Google Patents

一种兽用抗菌药物头孢喹肟pk/pd模型的构建方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种兽用抗菌药物头孢喹肟PK/PD模型的构建方法及应用，具体内容包括检测抗菌药物头孢喹肟对副猪嗜血杆菌的药物敏感性，获得MIC分布范围；利用液相色谱检测法测定健康和疾病模型动物给药后不同时间点所得血浆样本中的游离药物浓度，获得药时曲线；用药代动力学软件对药物的药代动力学参数进行拟合，获得PK参数；研究体外和半体内条件下抗菌药物对致病性细菌的抗菌作用，对体外和半体内条件下抗菌药物对致病性细菌的时效关系进行拟合，获得PD参数；根据Sigmoid Emax方程建立半体内PK‑PD模型；利用剂量计算公式和Mlxplore软件，获得不同给药目的下的给药方案；本发明为临床上头孢喹肟的防耐药用药方案提出了一种优化方法，缓解细菌耐药性产生和传播。

Description

一种兽用抗菌药物头孢喹肟PK/PD模型的构建方法及应用
技术领域
本发明属于临床医学领域，具体涉及一种兽用抗菌药物头孢喹肟PK/PD模 型的构建方法及应用。
背景技术
近几年，从患呼吸道疾病的猪体内分离得到副猪嗜血杆菌的分离率高达20％， 且通常为毒力较强血清型。副猪嗜血杆菌病的高发病率，高致死率严重威胁了养 猪业的发展，成为养殖场保育舍仔猪死亡的一个主要病因；且副猪嗜血杆菌易与 其他病毒或呼吸道致病菌混合感染，治疗难度加大，给全球范围内的养猪业带来 了巨大的经济损失。因为副猪嗜血杆菌存在着较多的血清型，疫苗交叉保护力低 是造成预防失败的主要原因，抗生素治疗是治疗副猪嗜血杆菌感染疾病的主要手 段
头孢喹肟作为***头孢菌素类动物专用的抗菌药，对革兰氏阳性菌，革兰 氏阴性菌均有较强的抗菌活性、从用药部位到达血液的吸收速度快、达峰时间短、 生物利用度高、对哺乳动物毒性低、对β-内酰胺酶稳定的特点，能有效治疗副 猪嗜血杆菌所引发的猪呼吸道类疾病，在兽医临床拥有着出色的应用前景。然而， 在临床抗生素使用过程中，滥用及不合理使用的现象频繁发生，细菌耐药性问题 逐年增加，导致动物感染耐药菌后死亡率提升，造成巨大经济损失，甚至会威胁 到人类自身的安全，细菌耐药性问题已经成为全球关注重点。
目前，头孢喹肟对副猪嗜血杆菌临床给药方案的研究甚少。通常使用PK-PD 模型制定给药方案，根据PK-PD模型所制定的给药方案比传统的给药方案更具 有优越性，也可以评估和预测药物的临床疗效和不良反应，有助于临床正确用药， 而且FDA在近些年的药物审批过程中增加了对PK-PD数据的要求通过建立 头孢喹肟在患副猪嗜血杆菌病的仔猪的PK-PD模型，能有效的反应头孢喹肟， 仔猪和副猪嗜血杆菌三者之间的关系，得到科学合理的给药方案，防止耐药性的 产生。
副猪嗜血杆菌作为临床常见致病菌，给临床带来了巨大的经济损失，头孢喹 肟能够有效的治疗由副猪嗜血杆菌病引起的猪呼吸道疾病，为保证头孢喹肟对副 猪嗜血杆菌病的治疗有效性，延缓副猪嗜血杆菌对头孢喹肟耐药现象的出现，所 以建立头孢喹肟在患副猪嗜血杆菌病的仔猪的PK-PD模型，基于此模型建立头 孢喹肟对副猪嗜血杆菌的给药方案，指导临床用药，防止耐药性的出现。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种兽用抗菌药物头孢喹肟PK/PD模型的构建 方法；目的之二在于提供一种兽用抗菌药物头孢喹肟PK/PD模型的构建方法在 临床医学上的应用；本发明通过细菌对抗菌药物的体外药物敏感性检测、抗菌药 物在实验动物体内的药代动力学研究，以及在半体内条件下的药效动力学研究， 建立半体内PK/PD结合模型，为抗菌药物防耐药给药方案的制定提供参考标准， 维持和保护抗菌药物药物临床治疗有效性。
技术方案一：
一种兽用抗菌药物头孢喹肟PK/PD模型的构建方法，包括如下步骤：
a.检测抗菌药物头孢喹肟对副猪嗜血杆菌的体外药物敏感性，得到MIC分 布范围：将冻干的副猪嗜血杆菌菌种复苏传代，制备工作菌液，将头孢喹 肟灭菌后制备琼脂平板，将工作菌液接种至琼脂平板上，恒温培养后观察 记录头孢喹肟对副猪嗜血杆菌的MIC分布范围；
b.筛选具有致病性的副猪嗜血杆菌菌株，对实验动物感染建立患病模型；
c.获得半体内条件下头孢喹肟对细菌的药效动力学参数：用不同时间点所得 血浆测定半体内杀菌曲线，拟合体内中的药物浓度与杀菌效应之间的关系； 通过半体内杀菌曲线类型选择相应的PK-PD参数，使用药代动力学软件 模拟Sigmoid Emax PK-PD模型方程模拟患病组和健康组血浆中药效学数 据，得到不同抗菌效果下的PK-PD靶值；
d.获得头孢喹肟在健康和疾病模型动物体内的药代动力学参数：对健康和患 病动物进行肌内注射头孢喹肟，于给药前以及给药后不同时间点采集血浆 样品，采用液相色谱法检测不同时间点血浆样品中的药物浓度，采用药代 动力学软件计算相关的药代动力学参数以及绘制半对数药时曲线；
e.通过血管外给药剂量计算公式分别计算得到抑菌作用、杀菌作用、清除作 用三个目的下的药物剂量，所述血管外给药剂量计算公式如下：
公式中MIC为头孢喹肟对副猪嗜血杆菌Hps42菌株的最低抑菌浓度， CL/F为生物利用度校正过的体清除率，fu为游离药物浓度；
利用Mlxplore软件模拟这三个剂量下副猪嗜血杆菌随着体内药物浓度变化 的生长趋势变化，确定给药间隔。
作为本发明的进一步改进，所述步骤b中致病性的菌株为由步骤a中选择具 有致病性的MIC90菌株。
作为本发明的进一步改进，c步骤与d步骤中所述药代动力学软件为 WinNonlin软件。
作为本发明的进一步改进，所述Sigmoid Emax PK-PD模型方程如下：
其中E表示细菌在各时间点血浆中培养24h后菌落减少的对数值；Emax表 示空白血浆接种培养细菌24h后与初始接种菌落对数值的差值；E0表示血浆中 接种细菌培养24h后与初始接种菌落对数值的最大差值；C表示半体内参数值； EC50表示血浆样品中达到最大杀菌数一半时的半体内参数值；N代表Hill系数； 其中Emax和E0可由半体内杀菌数据得到，EC50和N值由WinNonlin软件模拟得 到；其中E＝0，E＝-3，E＝-4，分别代表抑菌作用、杀菌作用、清除作用。
技术方案二：
兽用抗菌药物头孢喹肟PK/PD模型的构建方法在临床医学上的应用。本发明
构建的模型在临床医学指导用药方面有很好的用途。
本发明的技术效果如下：
以疾病模型为研究对象，使用WinNonlin药代动力学软件工具，拟合抗菌药 物在健康和患病动物体内的药代动力学和半体内药效动力学特征，建立半体内 PK/PD结合模型，最终得到预防疾病、治疗疾病、彻底根除目的下的三种给药方 案，以期为临床抗菌药物的使用方案进行优化，缓解细菌耐药性的产生。
附图说明
图1为实验动物肌内注射硫酸头孢喹肟(2mg/kg b.w.)血浆中半对数药时曲 线；
图2为头孢喹肟在血浆中的液相色谱图；(A：空白血浆；B：血浆样品)；
图3为头孢喹肟在血浆中的标准曲线和工作曲线；
图4为TSB肉汤中头孢喹肟对副猪嗜血杆菌Hps42菌株的体外杀菌曲线；
图5为头孢喹肟对副猪嗜血杆菌Hps42菌株的半体内杀菌曲线；
5a健康动物血清中头孢喹肟对副猪嗜血杆菌Hps42菌株的杀菌曲线；
5b患病动物血清中头孢喹肟对副猪嗜血杆菌Hps42菌株的杀菌曲线；
图6为Mlxplore软件模拟不同给药方案下的细菌生长情况。
具体实施方式
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本 发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限值 和下限值之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他 陈述值或在所述的范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这 些较小范围的上限值和下限值可独立地包括或排除在范围内。
另外，为了更好地说明本发明的内容，在下文的具体实施例中给出了众多的 具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。 在另外一些实施例中，对于本领域技术人员熟知的方法、手段未作详细描述，以 便于凸显本发明的主旨。关于本发明的技术指标的测定方法均为本领域内使用标 准方法，具体可参见最新的国家标准，除非另外说明。
以下实施例中所用到的副猪嗜血杆菌冻干菌种购自中国典型培养物保藏中 心，保藏编号为CCTCC NO.M 2016636，保藏地址为：中国武汉、武汉大学，保 藏日期：2016年11月10日。
其他来源的商购的副猪嗜血杆菌冻干菌种同样能够实现本发明的以下方案。
以下实施例中采用的实验动物为二元仔猪，雌雄各半，等级SPF级，体重 18kg，购自华中农业大学精品猪场。
实施例1：
1.1头孢喹肟对副猪嗜血杆菌药物敏感性的测定
将冻干的菌种复苏传代，取单个菌落混悬于5％灭活胎牛血清和1％NAD的 TSB肉汤培养基中增菌培养，待细菌达到生长对数期后方可进行药敏试验。采用 麦氏标准比管(McFarland)将菌液用TSB肉汤稀释至0.5麦氏浊度，此时的 菌液浓度约为1×108CFU/mL，然后用TSB肉汤进行100倍稀释，使细菌浓度 达到1×106CFU/mL。
称取胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)16g，再加入400mL去离子水，摇匀后121℃ 高压灭菌15min，冷至45℃左右时，加入10mL经灭活的无支原体胎牛血清 和4mL的NAD，混匀后每一培养皿中倾入19ml，并加入1ml药物，分别配 置药物浓度为0.0015，0.003，0.0075，0.015，0.03，0.06，0.125，0.25，0.5，1， 2，4，8μg/ml的含药琼脂平板。用多位点接种仪接种1-2μL制备好的菌液至每 个平板表面，菌落数在104CFU/点左右，仔细操作，避免喷溅，另外需要准备 两个不含药物的空白板作为对照，点种结束后，需要等到平板完全吸收接种物后， 再放入37℃恒温培养箱中培养，24h后观察并记录MIC值。根据敏感性检测 结果可知(表1)，头孢喹肟对副猪嗜血杆菌的MIC范围在0.0075～8μg/mL之间， MIC90为1μg/mL。
表1 头孢喹肟对131株副猪嗜血杆菌的最小抑菌浓度
1.2头孢喹肟对副猪嗜血杆菌药效学实验
根据头孢喹肟对副猪嗜血杆菌的药敏试验结果，选择MIC90附近菌株，提取 相应菌株DNA并通过ERIC-PCR测定相应的血清型，选择血清型为5型的菌株， 进行小鼠毒力实验，选择毒力最强的菌株进行后续的药效学和药动学研究。
煮沸法提取DNA取1mL的菌液加入1.5mL离心管中，以10000r/min离 心5min，弃上清液，加入100μL无菌水使沉淀重悬，并在100℃情况下煮沸 10min，时间结束后立即转入-20℃冰箱中储存10min，再以10000r/min离心5 min，取上清则为副猪嗜血杆菌模板。
将提取的副猪嗜血杆菌模板进行ERIC-PCR，观察相对应的血清型情况，选 择Sh0165为标准血清型5型菌株，选择与阳性菌株指纹图谱相近的菌株。
表2 ERIC-PCR引物序列
副猪嗜血杆菌血清型引物的合成根据肠杆菌科基因间重复一致序列特异性 引物的核苷酸序列，引物序列见表2，本引物由天一辉远基因合成有限公司合成， 将得到的引物储存于-20℃的冰柜中，使用前需以8000r/min离心2分钟，并按 照引物含量进行稀释。引物含量：灭菌水＝10mol：1mL后方可使用。
反应条件为：95℃预变性2min；94℃变性30s，50℃退火1min，72℃延伸 3min，35个循环；最后72℃延伸6min。PCR结束后进行琼脂糖凝胶电泳试验 以确定副猪嗜血杆菌的指纹图谱ERIC-PCR反应体系如表3所示。
表3 ERIC-PCR反应体系
选取MIC值在MIC90附近的血清型为5型的菌株进行小鼠的毒力实验，将 菌株分别浓缩稀释至109CFU/mL、108CFU/mL、107CFU/mL，通过腹腔注射 0.5ml相应浓度的菌液，攻毒感染BALB/c小鼠。选择毒力最强的副猪嗜血杆菌 Hps42为实验菌株。
最小抑菌浓度(MIC)96孔板中按顺序加入不同浓度的头孢喹肟，每个 孔中加入100μL，再依次加入100μL副猪嗜血杆菌Hps42浓度为1×106CFU/ml， 使最终的副猪嗜血杆菌Hps42浓度为5×105CFU/ml；此时药物浓度分别为0.06， 0.125，0.25，0.5，1，2，4，8，16，32，64μg/ml。接种完成后放入37℃,5％CO2培养箱中，培养24h。
最小杀菌浓度(MBC)可与MIC实验同时进行，将培养24h测定MIC 值的96孔板从37℃、5％CO2培养箱中取出，移入无菌操作台，从最低抑菌浓 度以上无细菌生长的清亮管中各取100μL，直接转入或作十倍稀释后，于TSA琼 脂平板涂布，37℃培养,5％CO2培养24h后进行菌落计数，以能刚好杀死99.9％ 的初始接种量的药物浓度为该药物的MBC。将TSB替换为血清测定半体内 MIC,MBC。
最小防突变浓度(MPC)配制含头孢喹肟药物浓度分别为1×MIC、2×MIC、4×MIC、8×MIC、16×MIC、32×MIC、64×MIC琼脂平板，分别接种 100μl浓度为1010CFU/mL的副猪嗜血杆菌，涂布后置于37℃，5％CO2培养箱 中培养，以72h时没有菌落生长的最低药物浓度为初测MPC(MPCpr)。MPCpr确定后，再以MPCpr为基准，线性递减20％抗菌药物浓度，配制含药琼脂，重 复培养，不出现菌落生长的最低药物浓度即为精确的MPC。头孢喹肟对副猪嗜 血杆菌的药效学实验结果如表4所示。
表4 头孢喹肟对Hps42菌株药效学实验结果
杀菌曲线的测定将1.5ml的头孢喹肟和1×10 6CFU/mL的菌悬液1.5mL 加入到细菌瓶中，混合后药物的终浓度为0MIC、1/4MIC、1/2MIC、1MIC、 2MIC、4MIC、8MIC、32MIC。将细菌瓶放置在培养箱中培养，分别在0h、 1h、2h、4h、8h、12h和24h各取0.1mL涂板计数，绘制体外杀菌曲线， 体外杀菌曲线结果见图4。使用0.083h,0.167h,0.25h,0.5h,0.75h,1h,2h,3h,4 h,6h,8h,10h,12h和24h，给药后的不同时间点血清样品为培养基质，取各时 间点的血浆0.5mL，添加10μL备好的菌液，混合均匀后，将细菌瓶放于37℃ 恒温培养箱中培养，分别在0、3、6、9、12、24h后取0.1mL混合悬液经过适 当稀释后进行涂板计数。将平板置于37℃恒温培养箱中培养24h后进行计数， 最低检测限为10CFU，以所有时间点为横坐标，得到的细菌总数对数值为纵坐 标，绘制Hps42菌株在血浆中的半体内杀菌曲线。
将平板置于37℃恒温培养箱中培养24h后进行计数，最低检测限为10 CFU。由结果(图5)可知血浆中头孢喹肟对副猪嗜血杆菌Hps42的杀菌效果随 着时间的延长，表现出的杀菌能力也随之增强，当在4MIC-8MIC在4-8h时其杀 菌效果已经达到最大。因此在半体内条件下，头孢喹肟对副猪嗜血杆菌的杀菌效 应呈现出时间依赖型。
1.3头孢喹肟在健康和疾病模型猪体内的药代动力学研究
给药试验实验动物分为健康组和患病组，每6头。正常饲养一周以适应环 境，减少环境对猪产生的应激反应。正式试验前12h禁食，称重编号。按照临 床推荐剂量2mg/kg·b.w单次颈部肌内注射硫酸头孢喹肟。
患病模型将副猪嗜血杆菌Hps42复苏，将培养后的副猪嗜血杆菌接在含 NAD以及胎牛血清的TSA平板上，在适宜环境下培养，挑取3-5个单菌落接种 于50mL的TSB中，放入37℃培养12h后，4000r/min离心15min，弃上清用 无菌生理盐水稀释相应的倍数，涂布计算细菌数量。接种前每隔一段时间测定直 肠温度，并观察临床症状包括：精神状况，食欲，呼吸情况，站立坐姿等。吸取 培养至109CFU/mL的副猪嗜血杆菌2ml，通过滴鼻感染实验动物，每个鼻孔滴 入1ml，连续攻毒两天，每天两次。接种后每8h测定直肠温度，并观察临床症 状包括：精神状况，食欲，呼吸情况，站立坐姿等。
血浆采样健康组和患病组给药前均需采集空白血浆，给药后在0.083 h,0.167h,0.25h,0.5h,0.75h,1h,2h,3h,4h,6h,8h,10h,12h和24h，通过前 腔静脉取血，EP管中加入肝素钠，经抗凝处理，4000r/min离心10min后取上 清，标记后放入-20℃中备用。
采集的血浆样品经前处理方法处理后，进行HPLC检测分析，测得健康组和 患病组不同时间点血浆中头孢喹肟药物浓度见表5，半对数药时曲线见图1。利 用WinNonlin数据处理软件中的房室模型对药时数据进行拟合，得到相应的药动 学参数表6。
表5 猪肌内注射头孢喹肟(2mg/kg)血浆中药物浓度(n＝6)
表6 猪肌内注射(2mg/kg b.w)头孢喹肟血浆药动学参数(n＝6)
注：AUC：药时曲线下面积；Cmax：药物达峰浓度；Tmax：药物达峰时间；T1/2：消除半衰期；CL/F：清 除率；MRT：平均驻留时间；Vz/F：表观分布容积
使用高效液相色谱法测定血浆中头孢喹肟的浓度：
色谱条件：色谱柱：Agilent SB-aq：250×4.6mm(i.d.),粒径5μm；柱温：30℃； 流动相：乙腈—磷酸水(v:v＝1.12:1000)；进样量：30μl；流速：1ml/min；检测 波长：265nm。
样品前处理方法：取0.5ml血浆样品，加入1ml乙腈沉淀蛋白，涡旋2min， 10000g离心10min，取上清液加入到另一离心管中，加入1.5ml的二氯甲烷， 涡旋15s，10000g离心力向下离心10min，取上清液过0.22μm滤膜后上样检 测。
特异性：取空白血浆0.5mL和添加药物的血浆0.5mL按照样品前处理方 法处理后上样检测，设定5个平行。如果头孢喹肟在出峰位置无杂质峰干扰， 则证明方法特异性和专一性良好，实验结果如图2所示。
灵敏度：取空白血浆，添加药物使血浆中药物浓度为0.02μg/mL、0.04μg/mL 和0.05μg/mL。按照样品前处理方法处理样品上样检测，每个浓度设置5个重 复。当信噪比大于等于3时对应浓度为最低检测限，当信噪比大于等于10时 对应浓度为最低定量限。
准确度和精密度：以1倍、2倍和4倍定量限的药物浓度作为添加后浓度， 按照样品前处理方法进行处理上样，每个浓度设置5个重复，重复测定5d。 计算回收率和日间变异系数如表示所示。
表7 猪血浆中头孢喹肟的准确度和精密度
标准曲线：用流动相将头孢喹肟标准储备液依次稀释为0.05μg/mL、0.1 μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL，工作曲线：取空 白血浆添加标准药物储备液后使浓度为0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.5μg/mL、1 μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL，按照样品前处理方法处理后0.22um过 膜上样。以药物浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，以测定结果平均值绘制工作曲 线按照样品前处理方法处理后过膜上样，每个浓度测定5次，重复测定5d。 以药物浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，以测定结果平均值绘制标准曲线，见附图。
1.4 Sigmoid Emax PK-PD结合模型的构建
由半体内杀菌数据可知，头孢喹肟在血浆中表现出来的杀菌效应具有时间依 赖型和一定程度的浓度依赖型特点，因此对于半体内PK-PD参数的选择可通过 参数值和细菌对数减少量之间来确定。分析结果可知，(AUC24h/MIC)ex与24h之 间的细菌减少量相关性良好。
半体内PK-PD模型的拟合是模拟健康组和患病组半体内杀菌曲线数据和对 应的PK-PD参数值之间的关系，具体见下表8和9。其中，(AUC24h/MIC)ex是通 过HPLC检测得到的健康组和患病组血浆中不同时间点头孢喹肟药物浓度的平 均值，然后乘以半体内培养时间24h再除以最低抑菌浓度。细菌对数减少值为 健康组和患病组血浆中细菌培养24h后与0h之间的细菌对数变化量。
表8 健康组血液半体内PK-PD参数值和抗菌效果对应值
注：(AUC24h/MIC)ex为半体内PK-PD参数值；E为各时间点血浆接种培养24h后菌落对数值的差值；
表9 患病组血液半体内PK-PD参数值和抗菌效果对应值
注：(AUC24h/MIC)ex为半体内PK-PD参数值；E为各时间点血浆接种培养24h后菌落对数值的差值；
然后通过Sigmoid Emax模型，即Hill方程来表明半体内PK-PD参数与抗菌 效果之间的对应关系。公式如下：
公式中E表示细菌在各时间点血浆中培养24h后菌落减少的对数值；Emax表示空白血浆接种培养细菌24h后与初始接种菌落对数值的差值；E0表示血浆 中接种细菌培养24h后与初始接种菌落对数值的最大差值；C表示半体内参数 值；EC50表示血浆样品中达到最大杀菌数一半时的半体内参数值；N代表Hill 系数。描述了半体内PK-PD参数值与效应E直线化后的斜率，决定S型曲线关 系的陡度。其中Emax和E0可由半体内杀菌数据得到，EC50和N值由WinNonlin 软件模拟而来。
利用不同E值所对应的不同治疗效应来计算得到所对应的的PK-PD参数值。 当E＝0时，表示培养前后细菌对数变化量无差异，可抑制细菌生长，起到预防 作用；当E＝-3时，表示培养适当时间后可杀灭99.9％的细菌，起到治疗作用； 当E＝-4时，表示培养适当时间后可杀灭99.99％的细菌，可根除病原菌，防止耐 药菌的产生，起到根除作用。
表10 猪肌内注射(2mg/kg b.w)头孢喹肟血浆Sigmoid Emax模型拟合结果
注：(AUC24h/MIC)ex E为各时间点血浆接种培养24h后菌落对数值的差值；Emax为空白血浆接种培养24h 后与初始接种菌落对数值的差值；E0为血浆样品接种培养24h前后与初始接种菌落对数值的最大差值；C 为半体内PK-PD参数值；EC50为血浆样品中产生50％最大杀菌作用时半体内PK-PD参数值；N为Hill系 数，描述半体内PK-PD参数值与效应E直线化后的斜率，决定S型曲线关系的陡度；
通过Sigmoid Emax模型方程可以计算出抗菌药物达到不同抗菌效果时所需的 PK-PD模型参数值(见上表10)，带入剂量计算公式即可算出抗菌药物浓度达到 不同抗菌效果(预防、治疗、根除)所需要的给药剂量。得到不同给药目的下的剂 量，具体见下表11。最终得到预防、治疗、清除给药剂量分别为3.61,6.55，10.26 mg/kg b.w。剂量计算公式如下：
公式中AUC24/MIC值为当E＝0(抑菌)时所对应的PK-PD参数值；MIC为测 定的最低抑菌浓度；CL/F为生物利用度校正过的体清除率；fu为药物游离度。
表11 不同给药目的下头孢喹肟给药剂量
通过给药方程得到患病组分别在预防，治疗和清除的给药剂量，参考FDA推荐头孢喹肟对猪的呼吸道推荐的给药剂量为2mg/kg b.w，通过Mlxplore软件模拟一天一次， 连续三天，给药剂量为6.5mg/kg·b.w发现有较好的细菌清除效果(图6)。
效果例：
以山东东营某养猪场为例，该养猪场出现副猪嗜血杆菌病，患病猪16例， 采用实施例1中确定的给药剂量6.5mg/kg·b.w对这16例患病猪进行治疗，一疗 程7天，1个疗程后，痊愈猪数量为14例，两个疗程后全部痊愈。
本发明中，Mlxplore软件、WinNonlin软件的使用方法和工作原理均为本领 域的公知常识，本发明应用的也是两个软件的常规的功能模块，实现的也是常规 技术效果，且这两款软件并非发明要点，其工作过程在此不做赘述。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围 进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的 技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (5)

1.一种兽用抗菌药物头孢喹肟PK/PD模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
a.检测抗菌药物头孢喹肟对副猪嗜血杆菌的体外药物敏感性，得到MIC分布范围：将冻干的副猪嗜血杆菌菌种复苏传代，制备工作菌液，将头孢喹肟灭菌后制备琼脂平板，将工作菌液接种至琼脂平板上，恒温培养后观察记录头孢喹肟对副猪嗜血杆菌的MIC分布范围；
b.筛选具有致病性的副猪嗜血杆菌菌株，对实验动物感染建立患病模型；
c.获得半体内条件下头孢喹肟对细菌的药效动力学参数：用不同时间点所得血浆测定半体内杀菌曲线，拟合体内中的药物浓度与杀菌效应之间的关系；通过半体内杀菌曲线类型选择相应的PK-PD参数，使用药代动力学软件模拟Sigmoid Emax PK-PD模型方程模拟患病组和健康组血浆中药效学数据，得到不同抗菌效果下的PK-PD靶值；
d.获得头孢喹肟在健康和疾病模型动物体内的药代动力学参数：对健康和患病动物进行肌内注射头孢喹肟，于给药前以及给药后不同时间点采集血浆样品，采用液相色谱法检测不同时间点血浆样品中的药物浓度，采用药代动力学软件计算相关的药代动力学参数以及绘制半对数药时曲线；
e.通过血管外给药剂量计算公式分别计算得到抑菌作用、杀菌作用、清除作用三个目的下的药物剂量，所述血管外给药剂量计算公式如下：
公式中MIC为头孢喹肟对副猪嗜血杆菌Hps42菌株的最低抑菌浓度，CL/F为生物利用度校正过的体清除率，fu为游离药物浓度；
利用Mlxplore软件模拟这三个剂量下副猪嗜血杆菌随着体内药物浓度变化的生长趋势变化，确定给药间隔。
2.根据权利要求1所述的兽用抗菌药物头孢喹肟PK/PD模型的构建方法，其特征在于，所述步骤b中致病性的菌株为由步骤a中选择具有致病性的MIC90菌株。
3.根据权利要求1所述的兽用抗菌药物头孢喹肟PK/PD模型的构建方法，其特征在于，c步骤与d步骤中所述药代动力学软件为WinNonlin软件。
4.根据权利要求1所述的兽用抗菌药物头孢喹肟PK/PD模型的构建方法，其特征在于，所述Sigmoid Emax PK-PD模型方程如下：
f.其中E表示细菌在各时间点血浆中培养24h后菌落减少的对数值；Emax表示空白血浆接种培养细菌24h后与初始接种菌落对数值的差值；E0表示血浆中接种细菌培养24h后与初始接种菌落对数值的最大差值；C表示半体内参数值；EC50表示血浆样品中达到最大杀菌数一半时的半体内参数值；N代表Hill系数；其中Emax和E0可由半体内杀菌数据得到，EC50和N值由WinNonlin软件模拟得到；其中E＝0，E＝-3，E＝-4，分别代表抑菌作用、杀菌作用、清除作用。
5.如权利要求1-4所述的兽用抗菌药物头孢喹肟PK/PD模型的构建方法在临床医学上的应用。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111549156A (zh) * 2020-05-15 2020-08-18 华中农业大学 建立替米考星对猪胞内劳森菌的pk-pd同步模型的方法
CN112500997A (zh) * 2020-12-18 2021-03-16 上海钧济医学检验所有限公司 一种用于抗菌药物体外pk/pd模型在线补充培养液的辅助装置及其使用方法
CN113571202A (zh) * 2021-07-13 2021-10-29 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 联合用药阻控细菌耐药性的预测方法及装置、电子设备

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102183608A (zh) * 2011-02-27 2011-09-14 浙江大学 一种中药药动学－药效学联合分析方法
CN106388966A (zh) * 2016-09-28 2017-02-15 广东联捷生物科技有限公司 药物临床前快速实验方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102183608A (zh) * 2011-02-27 2011-09-14 浙江大学 一种中药药动学－药效学联合分析方法
CN106388966A (zh) * 2016-09-28 2017-02-15 广东联捷生物科技有限公司 药物临床前快速实验方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
IJAZ AHMAD等: "Integration of PK/PD for dose optimization of Cefquinome again Staphylococcus aureus causing septicemia in cattle", 《FRONTIERS IN MICROBIOLOGY》 *
XIA XIAO等: "In vitro dynamic pharmacokinetic/pharmacodynamic(PK/PD) modeling and PK/PD cutoff of cefquinome against Haemophilus parasuis", 《BMC VETERINARY RESEARCH》 *
王芳: "喹赛多对鸡产气荚膜梭菌的药动学_药效学同步关系及临床疗效研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111549156A (zh) * 2020-05-15 2020-08-18 华中农业大学 建立替米考星对猪胞内劳森菌的pk-pd同步模型的方法
CN112500997A (zh) * 2020-12-18 2021-03-16 上海钧济医学检验所有限公司 一种用于抗菌药物体外pk/pd模型在线补充培养液的辅助装置及其使用方法
CN112500997B (zh) * 2020-12-18 2023-08-04 上海原科实业发展有限公司 一种用于抗菌药物体外pk/pd模型在线补充培养液的辅助装置及其使用方法
CN113571202A (zh) * 2021-07-13 2021-10-29 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 联合用药阻控细菌耐药性的预测方法及装置、电子设备
CN113571202B (zh) * 2021-07-13 2023-07-14 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所 联合用药阻控细菌耐药性的预测方法及装置、电子设备

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