CN102772359A - 一种恩诺沙星注射液及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种恩诺沙星注射液，其组成成份及重量份数如下：恩诺沙星21～25份；乳酸5～15份；亚硫酸氢钠0.1～0.5份；注射用水59.5～73.9份。本发明恩诺沙星注射液为弱酸性，可以与大多数酸性药物配伍应用；恩诺沙星的浓度高，达到了21～25%，可降低单次给药剂量，减少了对动物的刺激和伤害；而且，该注射液的pH为5.0～6.9，与机体肌肉组织pH范围相同，刺激性小、临床使用安全、疗效确切、质量可控，疗效优于现有产品，整个制备工艺简单可行，适于现代化的规模生产。

Description

一种恩诺沙星注射液及其制备方法

技术领域

本发明属于化学制剂领域，尤其是一种恩诺沙星注射液及其制备方法。 

背景技术

恩诺沙星(enrofloxacin,ERFX)为第三代喹诺酮类药物，是动物专用抗菌药，广泛应用于各种动物感染性疾病的预防和治疗。恩诺沙星对大肠杆菌、沙门氏菌、克雷伯氏杆菌、巴氏杆菌、胸膜肺炎放线菌、丹毒杆菌、变形杆菌、黏质沙雷氏菌、化脓性棒状杆菌、败血波特氏杆菌、金黄色葡萄球菌、支原体、衣原体等均有良好作用。恩诺沙星可用于猪、牛、禽、犬、猫的敏感菌及支原体所致的消化***、呼吸***、泌尿***及皮肤软组织感染性疾病。 

恩诺沙星是在喹诺酮类结构的6位上引入了氟原子，增强了药物与细菌靶位的亲和力、且扩大了抗菌谱；1位上的环丙基能促进药物的组织渗透性。恩诺沙星在动物体内代谢为环丙沙星来发挥抗菌活性。与其他喹诺酮类药的抗菌机理相同，恩诺沙星以细菌的脱氧核糖核酸(DNA)酶为靶。细菌的双股DNA扭曲成为袢状或螺旋状(称为超螺旋)，使DNA形成超螺旋的酶称为DNA回旋酶。药物通过与细菌DNA回旋酶亚基A结合，抑制该酶的切割与连接功能，对染色体造成不可逆损害，阻止细菌细胞***而发挥抗菌作用。同时，它对细菌细胞壁有高度的渗透力，并破坏细菌的胞膜。因此，恩诺沙星是通过双重抗菌作用来达到溶菌、杀菌目的。大量实验证实，恩诺沙星对细菌、支原体等引起的疾病疗效一般要优于环丙沙星、诺氟沙星及抗生素类药。 

恩诺沙星在体内的药代动力学特征为：内服及肌肉注射后吸收迅速；血中药物浓度和组织药物浓度的峰值均高于大多数病原菌和支原体MIC的几倍至几十倍，消除半衰期较长、体内分布广泛、表观分布容积大。恩诺沙星可在吞噬细胞内聚集，是血药浓度2～8倍，自炎症部位迅速释放出来。很多研究表明，恩诺沙星在血清中的药物浓度往往低于在其它组织中的浓度。由于该药特殊的药物力学特征，使畜禽专用的恩诺沙星成为治疗深部组织感染、肺部感染(各种肺炎)和脓皮病的首选抗菌药物。特别是其在肺和泌尿生殖道能达到高浓度，因此被广泛应用于治疗动物的呼吸道疾病、泌尿生殖道感染和支原体病。 

恩诺沙星病原体的药效和在动物体内的药动学特征上具有诸多优越性，具有抗菌活性强、抗菌谱广、口服吸收好、生物利用度高、组织分布广、半衰期长、不易产生耐药性、对其他抗菌药的耐药菌有效且不良反应相对较少等特点，同时毒副作用较小。基于恩诺沙星的诸多优点，其在兽医临床具有很高的应用价值。 

目前临床病例多为混合感染，需配伍用药，而目前恩诺沙星注射液均为碱性制剂或中性制剂，与很多酸性药物无法联合应用，不利于临床药物配伍，制约了恩诺沙星注射液临床应用范围；目前，虽然也存在酸性恩诺沙星注射液，但由于恩诺沙星的浓度较低，增加了给药次数，提高了成本，浪费资源，而且制备方法也较为复杂。 

通过检索，发现与本发明申请相关的如下专利公开文献： 

1、一种恩诺沙星注射液及其制备方法（CN201010179923.X），本发明注射液的pH为中性，包括10～20份的恩诺沙星，还包括抗氧化剂0.1～0.5份，螯合剂0.1～0.5份。本发明制成的恩诺沙星注射液的pH值为中性，这样在动物注射使用时无刺激性，而且使注射液中恩诺沙星的含量提高到20％，大大增加了单次给药的治疗效果，同时制成的恩诺沙星注射液性状稳定，长期存放无结晶析出，是一种治疗效果好、无刺激的注射液。 

2、一种酸性恩诺沙星注射液及其制备方法（CN201010582402.9），本发明涉及酸性恩诺沙星注射液及其制备方法。该注射液的组分包括恩诺沙星、盐酸林可霉素、醋酸和苯甲醇，其中，恩诺沙星5g、醋酸适量1.25g、苯甲醇1ml、盐酸林可霉素0.5%-5%和注射用水100ml，前述各组分份量可根据上述的物质和溶液的明确比例而改变。该注射液制备方法，包括以下步骤：取5g恩诺沙星加80-90ml注射用水，搅拌，加热至50～60℃，放冷，加入1.25g醋酸和1ml苯甲醇，搅拌均匀后，加入盐酸林克霉素0.5-5g，搅拌时溶解，最后用注射用水加至100ml；灌装、高压灭菌即得。 

通过对比，本发明申请与上述专利公开文献有本质的不同。 

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足之处，提供一种弱酸性的高浓度恩诺沙星注射液及其制备方法。 

本发明的目的是通过以下技术方案实现的： 

一种恩诺沙星注射液，其组成成份及重量份数如下： 

恩诺沙星    21～25份； 

乳酸        5～15份； 

亚硫酸氢钠  0.1～0.5份； 

注射用水    59.5～73.9份。 

而且，所述的恩诺沙星注射液，其组成成份及重量份数如下： 

恩诺沙星    21份； 

乳酸        9份； 

亚硫酸氢钠  0.2份； 

注射用水    69.8份。 

而且，所述的恩诺沙星注射液，其组成成份及重量份数如下： 

恩诺沙星     25份； 

乳酸         15份； 

亚硫酸氢钠   0.5份； 

注射用水     59.5份。 

而且，所述恩诺沙星注射液的pH为5.0～6.9。 

而且，所述恩诺沙星注射液的用法及用量为：按照2.5mg/kg b.w肌肉注射，1d给药1～2次，连续用药2～3d。 

上述的恩诺沙星注射液的制备方法，步骤如下： 

⑴称取用于溶解的注射用水； 

⑵按重量份数向步骤⑴溶液中加入亚硫酸氢钠，搅拌至完全溶解； 

⑶按重量份数向步骤⑵溶液中加入恩诺沙星，搅拌均匀； 

⑷按重量份数向步骤⑶溶液中加入乳酸，搅拌至溶液澄清； 

⑸向步骤⑷溶液中加剩余的注射用水至全量，过滤、灭菌，即得恩诺沙星注射液。

本发明的优点和积极效果是： 

1、本发明恩诺沙星注射液为弱酸性，可以与大多数酸性药物配伍应用，大大地扩大了恩诺沙星注射液的临床应用范围。 

2、本发明所制备的恩诺沙星注射液中恩诺沙星的浓度高，达到了21～25%，可降低单次给药剂量，减少了对动物的刺激和伤害；而且，该注射液的pH为5.0～6.9，与机体肌肉组织pH范围相同，刺激性小、临床使用安全、疗效确切、质量可控。 

3、本发明制备方法配方科学、各组分原料易得，且成本低廉，疗效优于现有产品，整个制备工艺简单可行，适于现代化的规模生产。 

附图说明

图1为本发明恩诺沙星对照品的色谱图（0.2μg/mL）； 

图2为本发明空白血浆色谱图； 

图3为本发明空白血浆添加药物色谱图（0.5μg/mL）； 

图4为本发明实测血浆样品色谱图； 

图5为本发明猪单剂量肌注恩诺沙星注射液的药时曲线图。 

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。 

需要说明的是：本专利申请中如无特殊说明，所使用的方法均为常规方法；所使用的各个组分均为市售产品。 

一种恩诺沙星注射液，包括主药、助溶剂、抗氧化剂及注射用水，其中： 

主药的组成原料药及重量份数为： 

恩诺沙星    21～25； 

助溶剂组成原料及重量份数为： 

乳酸        5～15； 

抗氧化剂组成原料及重量份数为： 

亚硫酸氢钠  0.1～0.5； 

注射用水的重量份数为：59.5～73.9。 

上述恩诺沙星注射液的pH为5.0～6.9。 

上述恩诺沙星注射液的用法及用量为：按照2.5mg/kg b.w肌肉注射，1d给药1～2次，连续用药2～3d。 

上述恩诺沙星注射液的制备方法，步骤如下： 

⑴称取溶解用各种药剂的注射用水； 

⑵加入抗氧化剂，搅拌至完全溶解； 

⑶加入主药，搅拌均匀； 

⑷加入助溶剂，搅拌至溶液澄清； 

⑸加剩余的注射用水至全量，过滤、分装、灭菌，即得恩诺沙星注射液。 

实施例1 

一种恩诺沙星注射液，其组成成份及重量份数如下： 

恩诺沙星    21g； 

乳酸        5g； 

亚硫酸氢钠  0.1g； 

注射用水    73.9g。 

上述恩诺沙星注射液的制备方法，步骤如下： 

⑴称取50g注射水； 

⑵向步骤⑴溶液中加入亚硫酸氢钠0.1g，搅拌至完全溶解； 

⑶向步骤⑵溶液中加入恩诺沙星21g，搅拌均匀； 

⑷向步骤⑶溶液中加入乳酸5g，搅拌至溶液澄清； 

⑸向步骤⑷溶液中加剩余注射用水至100g，过滤、分装、灭菌，即得恩诺沙星注射液。 

实施例2 

一种恩诺沙星注射液，其组成成份及重量份数如下： 

恩诺沙星     22g； 

乳酸         8g； 

亚硫酸氢钠   0.2g； 

注射用水     69.8g。 

上述恩诺沙星注射液的制备方法，步骤如下： 

⑴称取50g注射水； 

⑵向步骤⑴溶液中加入亚硫酸氢钠0.2g，搅拌至完全溶解； 

⑶向步骤⑵溶液中加入恩诺沙星22g，搅拌均匀； 

⑷向步骤⑶溶液中加入乳酸8g，搅拌至溶液澄清； 

⑸向步骤⑷溶液中加剩余注射用水至100g，过滤、分装、灭菌，即得恩诺沙星注射液。 

实施例3 

一种恩诺沙星注射液，其组成成份及重量份数如下： 

恩诺沙星     23g； 

乳酸         10g； 

亚硫酸氢钠   0.2g； 

注射用水     66.8g。 

上述恩诺沙星注射液的制备方法，步骤如下： 

⑴称取50g注射水； 

⑵向步骤⑴溶液中加入亚硫酸氢钠0.2g，搅拌至完全溶解； 

⑶向步骤⑵溶液中加入恩诺沙星23g，搅拌均匀； 

⑷向步骤⑶溶液中加入乳酸10g，搅拌至溶液澄清； 

⑸向步骤⑷溶液中加剩余注射用水至100g，过滤、分装、灭菌，即得恩诺沙星注射液。 

实施例4 

一种恩诺沙星注射液，其组成成份及重量份数如下： 

恩诺沙星    24g； 

乳酸        12g； 

亚硫酸氢钠  0.4g； 

注射用水    63.6g。 

上述恩诺沙星注射液的制备方法，步骤如下： 

⑴称取50g注射水； 

⑵向步骤⑴溶液中加入亚硫酸氢钠0.4g，搅拌至完全溶解； 

⑶向步骤⑵溶液中加入恩诺沙星24g，搅拌均匀； 

⑷向步骤⑶溶液中加入乳酸12g，搅拌至溶液澄清； 

⑸向步骤⑷溶液中加剩余注射用水至100g，过滤、分装、灭菌，即得恩诺沙星注射液。 

实施例5 

一种恩诺沙星注射液，其组成成份及重量份数如下： 

恩诺沙星      25g； 

乳酸          15g； 

亚硫酸氢钠    0.5g； 

注射用水      59.5g。 

上述恩诺沙星注射液的制备方法，步骤如下： 

⑴称取50g注射用水； 

⑵向步骤⑴溶液中加入亚硫酸氢钠0.5g，搅拌至完全溶解； 

⑶向步骤⑵溶液中加入恩诺沙星25g，搅拌均匀； 

⑷向步骤⑶溶液中加入乳酸15g，搅拌至溶液澄清； 

⑸向步骤⑷溶液中加剩余注射用水至100g，过滤、分装、灭菌，即得恩诺沙星注射液。 

实施例6 

本发明恩诺沙星注射液对猪大肠杆菌病的临床疗效试验。 

（一）材料及方法 

1、实验材料 

试验药物：实施例5的恩诺沙星注射液，肌肉注射，每日1次，连用三日； 

对照药物：恩诺沙星注射液（拜有利）：批号KP06H8U，含量5%，拜耳(四川)动物保健有限公司； 

2、试验动物：山东省济宁市某养猪场，30头已经确诊为大肠杆菌病感染的猪，发病日龄80天。 

3、试验方法：将自然发病的30头猪，分成Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三组，每组10头猪，按表1分别对实验组猪进行肌肉注射给药。每次用药前测量直肠体温，观察并记录临床症状。观察期为15d，并对每头猪进行试验前后的称重及体况观察。 

表1试验猪分组及给药方案表 

（二）疗效评价指标 

1、死亡率 

在试验期间，猪只出现大肠杆菌病的典型症状，体温升高、食欲下降、下痢等症状并死亡，尸体剖检肠系膜等处出现化脓样物质，并有散在出血点，同时可从该处分离出大量溶血性较强的大肠杆菌。根据每组动物中的死亡数计算死亡率。 

死亡率（%）=每组死亡数（头）/各组总数（头）×100%。 

2、治愈率 

在试验期间，用药的猪只临床症状消失，***干燥，无红肿，粪便及精神恢复正常，接种菌分离阴性，均属治愈。根据每组动物中的治愈数极少数治愈率。 

治愈率（%）=各组治愈数（头）/各组总数（头）×100%。 

3、有效率 

治愈的猪和给药后体温降低或恢复正常，食欲增加，下痢减轻或消失等症状的猪，均判断为有效，据此计算有效率。 

有效率（%）=各组存活数（头）/各组总数（头）×100%。 

4、平均增重 

根据试验开始时及试验结束时每头猪的体重，计算每头猪的相对增重量，计算平均增重量。 

5、数据分析和处理 

用PASS 16.0for Windows对试验结果进行生物学统计。 

（三）实验结果 

30头发病猪分别用药后，逐日观察临床效果，其结果见表2。 

表2本发明混悬液对大肠杆菌病的疗效试验结果 

从表2中可以看出： 

⑴治愈率与有效率：实施例1组无动物死亡，其有效率及治愈率显著高于药物对照组（P<0.05）； 

⑵平均增重量：实施例1组15d的平均增重高于药物对照组。 

以上结果说明本发明恩诺沙星注射液对于猪感染大肠杆菌引起的腹泻具有良好的治疗效果，其有效率及治愈率显著高于药物对照组，能有效缓解猪病增重缓慢，并显著降低了死亡率。 

实施例7 

本发明恩诺沙星注射液对鸡白痢的疗效试验。 

（一）材料及方法 

1、实验材料 

试验药品：实施例1制备的恩诺沙星注射液，每天1次，连用三天； 

对照药物：恩诺沙星注射液（拜有利）：批号KP06H8U，含量5%，拜耳(四川)动物保健有限公司； 

菌种：鸡白痢沙门氏菌强毒株C79-21，购自中国兽药监察所。 

1、试验动物及分组 

选择健康1日龄AA肉食（公母各半）216只。试验前饲养3d，自由采食和饮水，观察鸡的精神状态及饮食情况，发现有精神沉郁、食欲下降或粪便不正常的均淘汰 

2、试验方法 

⑴菌液的制备 

首先，将保存的菌种接种于麦康凯平板，培养24h后，用灭菌接种环挑选出单个典型菌落，接种于3mlMH肉汤中，在37℃环境下培养18h取出。然后，用肉汤培养物接种鸡，经复壮后，从死鸡肝脏中分离出沙门氏菌，并接种于麦康凯平板培养。最后，挑选典型菌落接种于营养肉汤培养基中，37℃下培养24h，作为功毒菌液。 

⑵最小感染量（MID）的测定 

16只鸡分成4组，每组4只，分别经胸肌注射6×107、6×108、6×109、6×1010CFU/ml的试验菌液发现鸡发病和死亡情况。定试验时细菌的接种量为6×109CFU/ml。。 

⑶试验方法 

200只鸡，随机分成4组（见表3）每组50只，除健康对照组外，各组鸡经胸肌注射试验菌液0.5ml。治疗组在接种菌液后，经口灌服给药，具体给药方案见表3。攻毒后，仔细观察和纪录各组鸡的发病情况、临床症状及死亡情况。对死亡鸡进行剖检，取肝、心、脾进行细菌学分离培养鉴定，以确定鸡只死亡是否因为接种菌感染，临床观察时间为15d。在接种细菌前后和试验结束时，分别称重各组鸡的体重，并计算相对增重率。 

表3试验鸡分组及给药方案 

（二）疗效评价指标 

1、死亡率：凡在试验期间出现排稀粪等发病症状，死亡后剖检又有典型病变特征，并分离出相应病原菌者认为感染死亡，依据死亡数算出死亡率。 

计算公式：死亡率（%）=各组死亡数（只）/各组总数（只）×100% 

2、治愈率：凡在试验期间，服药后精神、食欲恢复正常，不再出现排稀粪等临床症状属治愈，依据治愈数算出治愈率。 

计算公式：治愈率（%）=各组治愈数（只）/各组总数（只）×100% 

3、有效率：凡在试验期间，经用药后完全治愈的，以及有临床症状但未死者，认为给药对其有效，据此计算有效率。 

计算公式：有效率（%）=各组存活数（只）/各组总数（只）×100% 

4、相对增重率：给药前及试验结束时对各组鸡逐一称重，计算每只鸡的增重量。相对增重率是各用药治疗组的增重之比，其中健康对照组设为100%。 

计算公式：相对增重率（%）=各组平均增重/对照组平均增重×100% 

（三）试验结果 

恩诺沙星注射液肌注给药对鸡白痢的治疗效果见表4。 

表4本发明恩诺沙星注射液对鸡白痢的对比试验结果 

由表4可知，恩诺沙星能有效降低鸡感染沙门氏菌的死亡率。实施例1组、对照药物组对鸡白痢的有效率、治愈率均在70%以上，相对增重率在90%以上，且实施例1组显著高于对照药物组（P<0.05）。说明本发明恩诺沙星注射液能有效治疗鸡白痢，且与恩诺沙星注射液相比，显著降低了死亡率。 

实施例8 

本发明恩诺沙星注射液与5%恩诺沙星注射液在猪体内的比较药动学研究。 

以下实验依据国家申报新兽药的有关要求，研究探讨了本发明恩诺沙星注射液与5%恩诺沙星注射液在健康猪体内的比较药动学研究和相对生物利用度考察，旨在为科学、合理地评价本发明恩诺沙星注射液，为新兽药审批提供必要的材料，也为该注射液在兽医临床上使用提供科学依据，具有重要的临床意义。 

一、材料与方法 

1、药品和试剂 

恩诺沙星注射液：批号20110829，含量25%，挑战（天津）动物药业有限公司提供，pH为5.3； 

恩诺沙星注射液（拜有利）：批号KP06H8U，含量5%，拜耳(四川)动物保健有限公司； 

恩诺沙星标准品：批号H010102，含量99.9%，中国兽医药品监察所； 

三乙胺：批号20100721，含量>99%，天津市富宇精细化工有限公司提供； 

磷酸：批号20101102，含量>85.0%，天津市福晨化学试剂厂。 

2、主要仪器 

高效液相色谱***：Agilent1200型，配备四元梯度泵、自动进样器、柱恒温***、FLD检测器、色谱工作站，美国安捷伦公司； 

电子分析天平：BP121S型，感量0.0001g，德国Sartorius公司； 

可调微量移液器：EppendorfResearch型，10~100μL、20~200μL，100~1000μL、500~5000μL，德国Eppendorf公司； 

冷冻离心机：TDL-5000B型，上海安亭科学仪器厂； 

漩涡混匀器：VXH-3型，上海跃医疗器械厂； 

针筒式微孔滤膜过滤器：孔径为0.45μm，天津市腾达过滤器件厂。 

3、药液的配置 

恩诺沙星储备液：准确称取恩诺沙星对照品50.05mg，置于50mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度，即制成1.0mg/mL的恩诺沙星储备液，4℃保存备用。临用前用流动相配成系列标准液。 

0.05mol/L磷酸溶液：取85%磷酸3.4mL，用水稀释至1000mL，搅拌下滴加三乙胺，调pH至2.4。 

4、动物与分组 

健康长白×大白二元猪16头，60日龄，体重22.53±0.40 

千克，广东省种猪场提供。随机分为2组，每组8头。试验前按常规饲养，自由饮水和采食，饲料为全价日粮（不含抗菌药物），观察两周，临床观察健康。 

5、试验设计 

两组猪给药方法分别为颈部肌肉注射5%恩诺沙星注射液、颈部肌肉注射25%恩诺沙星注射液（酸性）。在实验前对供试药物进行含量测定，按照实际药物含量进行临床给药。试验前16h起及给药后4h期间禁食，仅自由饮水。 

6、给药和血样采集 

给药：按2.5mg/kg体重单次给药。 

采样时间：在预试的基础上确定采样时间，给药前采空白血浆，给药后0.1、0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5、2、3、4、6、8、12、24、36、48h分别采集血液样品。 

采血途径：猪只仰卧保定，前腔静脉采血，每次采血5mL左右。 

样品保存：采集静脉血置于含肝素的离心管中，混匀，4000r/min离心10min，分离血浆，置-20℃冰箱保存，待测。 

7、血药浓度的测定方法 

⑴血浆样品前处理方法 

待血浆解冻后，摇匀，准确吸取0.5mL于2mL离心管中，加入1mL的甲醇，漩涡混匀，高速离心机12000r/min离心10min，吸取上清液作HPLC分析。 

⑵液相色谱条件 

高效液相色谱***：Agilent 1200高效液相色谱***。 

色谱柱：phenomenex luna-C18(2)（4.6mm×250mm，5μm）。 

流动相：0.05mol/L磷酸溶液:乙睛=82:18（V:V）。 

流速：0.8mL/min。 

检测波长：激发波长280nm，发射波长450nm。 

进样量：20μL。 

⑶检测限与定量限的确定 

取空白猪血浆，添加恩诺沙星标准液制备成0.005、0.01、0.02、0.05μg/mL的样品（n=20），按““一中7⑴血浆样品前处理方法”处理样品，再按““一中7⑵液相色 谱条件”下进行HPLC测定，测得基线噪音值，求其平均值，按信噪比S/N=3为检测限（LOD），S/N=10为定量限（LOQ）。 

⑷标准曲线与线性范围 

在9个塑料离心管中各加入0.48mL空白血浆，再依次加入20μL恩诺沙星标准液系列（0.5~100μg/mL），涡旋混匀，使血浆样品中的药物浓度为0.02~4μg/mL，第1管不加药物作对照，具体见表1。按“一中7⑴血浆样品前处理方法”进行处理，上机测定。将获得的恩诺沙星色谱峰面积（S）与浓度（C）回归，求得标准曲线回归方程和相关系数，结果见表5。 

表5浆中恩诺沙星的标准曲线系列浓度 

⑸回收率和变异系数测定 

将定量的恩诺沙星标准液加入猪空白血浆中，制得低（0.02μg/mL）、中（0.2μg/mL）、高（2μg/mL）三个样品浓度，按“一中7⑴血浆样品前处理方法”处理样品，再按“一中7⑵液相色谱条件”下进行HPLC测定；同时分别取浓度为0.02μg/mL、0.2μg/mL、2μg/mL恩诺沙星标准液按“一中7(1)”方法处理后，进行HPLC分析，以峰面积比计算求其回收率。每浓度5个重复（批内），共3个批次（批间），计算批内和批间的变异系数。 

⑹给药后血浆药物浓度的测定 

给药后不同时间点采集的血浆，按“一中7⑴血浆样品前处理方法”处理样品，再按“一中7⑵液相色谱条件”下进行HPLC分析，求得恩诺沙星的峰面积，带入标准曲线回归方程，换算出血浆中恩诺沙星的浓度；同时超过4μg/mL血药浓度样品，稀释成相应倍数使之在0.02～4μg/mL范围内。 

⑺数据分析处理 

采用美国Pharsight公司药动学软件Winnonlin5.2.1的非房室模型来处理药动数 据，计算出每头试验猪的药动学参数，然后计算平均值 

及标准差（S.D.），同时以血药浓度平均值对时间作药-时曲线图。 

二、结果与分析 

1、血浆中恩诺沙星检测的方法学 

⑴色谱行为 

根据“一中7⑵液相色谱条件”进行HPLC测定，血浆中恩诺沙星与其他组分分离良好，恩诺沙星的色谱峰保留时间分别为9.8min左右。 

恩诺沙星对照品、猪空白血浆、空白血浆添加药物、给药后实测血浆样品色谱图分别见图1-4。 

⑵检测限和定量限 

根据“一中7⑶”测定，按信噪比S/N=3为检测限（LOD），S/N=10为定量限（LOQ），求得猪血浆中恩诺沙星的检测限为0.01μg/mL，定量限为0.02μg/mL，表明方法的灵敏度高，可满足药动学研究要求。 

⑶标准曲线与线性范围 

根据“一中7⑷”测定，得到恩诺沙星在血浆中的标准曲线和线性范围见表6。恩诺沙星标准曲线在0.02~4μg/mL浓度范围内，相关系数均大于0.9990，线性关系良好。 

表6恩诺沙星标准曲线回归方程与相关系数 

⑷回收率和变异系数 

根据“一中7⑸”测定，批内和批间的回收率及变异系数结果见表7。本方法在猪血浆中，恩诺沙星在低、中、高三个添加水平的回收率分别在73.50～113.23%、78.54~100.27%和83.77~99.38%，批内变异系数分别在3.02~10.34%、2.44~10.54%和1.98~7.19%，批间变异系数在5.36~12.90%。方法回收率、准确度、精密度均满足残 留检测的要求。 

表7猪血浆中恩诺沙星的回收率和变异系数 

2、血浆中恩诺沙星的浓度 

按2.5mg/kg b.w.给猪单剂量肌注两种恩诺沙星注射液后，依据“一中7⑹”的方法，对血浆中恩诺沙星浓度进行了检测，各时间点血浆中恩诺沙星浓度测定结果见表8和表9，两种注射液在猪体内的血药浓度与时间关系曲线图见图5。同时试验发现，猪肌注恩诺沙星注射液后，血药浓度出现反跳(flip-flop)现象，提示恩诺沙星在猪体内可能存在肝肠循环。 

表8健康猪单剂量(2.5mg/kg b.w)肌注5%恩诺沙星注射液的血药浓度(μg/mL) 

ND：表示未测得（Not Detectable），低于定量限0.02μg/mL。 

表9健康猪单剂量(2.5mg/kg b.w)肌注速25%恩诺沙星注射液（酸性）的血药浓度(μg/mL) 

ND：表示未测得（Not Detectable），低于定量限0.02μg/mL。 

3、恩诺沙星在猪体内的比较药动学特征 

依据“一中7⑺”的方法，采用Winnonlin5.2.1的非房室模型来处理血浆中恩诺沙星药时数据，计算出每头试验猪的药动学参数，结果见表11和表12，主要药动学参数利用Excel进行医学统计t检验分析，结果见表10，参数MRT、Cmax统计差异极显著（P<0.01），参数Vd、Kel、t1/2统计有差异（P<0.05），参数AUC统计无显著性差异（P>0.05），25%恩诺沙星注射液（酸性）的相对生物 利用度为98.83%，生物利用度相当，表明两种恩诺沙星注射液存在潜在的生物等效性。 

表10两种恩诺沙星注射液主要药动学参数比较（ n=8） 

注：**：P<0.01，说明差异有高度统计学意义；*：p<0.05，说明差异有统计学意义。 

表11健康猪单剂量(2.5mg/kg b.w)肌注5%恩诺沙星注射液的药物动力学参数 

表12健康猪单剂量(2.5mg/kg b.w)肌注速25%恩诺沙星注射液（酸性）的药物动力学参数 

三、结论 

1、两种恩诺沙星注射液在猪体内的药动学比较 

恩诺沙星在猪的药物动力学研究，国内外均有报道，涉及的剂型有注射液（曾振灵等，2001；张晓会等，2010；祝万菊，2003；肖田安等，2002；周云波等，2005）、微囊（罗雅劲等，2010）、混悬液（曾五和等，2002）等，但尚未见有酸性pH注射液的药动学报道。 

本试验按2.5mg/kg b.w.给猪单剂量肌注5%恩诺沙星注射液后，Winnonlin5.2.1的非房室模型来处理药动数据，主要药动学参数为：AUC为8.23±1.63μg·h/mL，Vd为4.78±0.92L/kg，MRT为14.24±3.63（mL/kg·h），Cmax为0.65±0.17μg/mL，tmax为1.45±1.25h，Kel为0.06±0.021/h，t1/2为11.56±3.56h，Cl为0.30±0.07（L/（kg·h））；按2.5mg/kg b.w.给猪单剂量肌注25%恩诺沙星注射液（酸性）后，Winnonlin5.2.1的非房室模型来处理药动数据，主要药动学参数为：AUC为8.14±1.91μg·h/mL，Vd为3.04±1.13L/kg，MRT为7.67±2.31（mL/kg·h），Cmax为1.11±0.23μg/mL，tmax为0.95±0.44h，Kel为0.11±0.041/h，t1/2为7.07±2.60h，Cl为0.31±0.07（L/（kg·h））。参数MRT、Cmax统计差异极显著（P<0.01），表明25%恩诺沙星注射液（酸性）在猪体内达峰浓度显著升高，平均驻留时间显著减少，参数Vd、Kel、t1/2统计有差异（P<0.05），参数AUC 统计无显著性差异（P>0.05），25%恩诺沙星注射液（酸性）的相对生物利用度为98.83%，生物利用度相当，表明两种恩诺沙星注射液存在潜在的生物等效性。 

2、本发明恩诺沙星注射液临床给药方案的建议 

随着氟喹诺酮类药物耐药性的产生，其临床应用效果减弱。氟喹诺酮类药物属浓度依赖型药物，George L Drusano等（1993）的研究表明，Cmax/MIC对氟喹诺酮类药物的药效有标志作用，与药效成正相关，具有相同Cmax/MIC值表现出药效接近，Cmax/MIC大于8有较好的临床治疗效果。敏感菌耐药性的产生主要是由于Cmax/MIC偏小。25%恩诺沙星注射液（酸性）的Cmax为1.11±0.23μg/mL，显著高于5%恩诺沙星注射液的Cmax（0.65±0.17μg/mL），对各种细菌的Cmax/MIC接近8或大于8，提示可有效防治临床各种细菌疾病。 

目前，国内市场上兽药制剂中同类注射液较多，药效相差较大，多数注射液未进行***的动物试验，与国外制剂存在差距。国内制定给药方案时多采用血药浓度与对细菌的MIC确定该药的给药间隔时间，或参考国外制剂，对时间依赖型药物可提供较科学的依据，然而对浓度依赖型药物给药方案的制定有失客观。Cmax/MIC及AUC/MIC对氟喹诺酮类药物疗效有较好的预测作用，在制定给药方案时应予以充分考虑，加强相关方面的研究（张晓会等，2010）。已有研究证明，氟喹诺酮类药物能产生较长的抗菌药后效应(PAE)，为2~6h，以前设计抗菌药物的治疗方案时，强调血药浓度高于MIC，PAE的存在提示，当血药浓度低于MIC时，细菌生长仍持续受到抑制，故根据PAE及药动学参数，在临床设计给药方案时，可适当延长给药间期，减少给药次数与剂量，仍能维持抗菌效果（方翼等，1997；Gicquel M et al，1997；曾五和等，2002）。制剂、种属差异、年龄、不同生理状况、给药途径等各种因素都会对药动学产生影响，要根据临床实际制定合理的给药方案。 

恩诺沙星对敏感菌的最小抑菌浓度（MIC）低，如恩诺沙星对猪大肠杆菌、猪丹毒杆菌的MIC分别为0.05和0.1μg/mL，对猪胸膜肺炎放线杆菌的MIC90≤0.06μg/mL，对临床分离的猪放线杆菌、大肠杆菌、克雷菲尔德沙门氏菌、肺炎克雷伯氏菌、多杀性巴氏杆菌的MIC90均低于0.128μg/mL（Gutierrez et al.1993；曾振灵，1996）。猪按2.5mg/kg b.w单剂量肌注25%恩诺沙星注射液（酸性）后，血药浓度迅速上升，给药3分钟后血药浓度为0.33±0.22μg/mL，达到大 多数敏感菌的MIC以上血药浓度，即可以有效地抑制杀灭病原菌，1h达到0.98±0.21μg/mL，随后血药浓度开始下降，至14h血药浓度下降为0.15±0.06μg/mL，与5%恩诺沙星注射液14h的血药浓度相当（0.17±0.04μg/mL）。25%恩诺沙星注射液（酸性）在采样点9h前的血药浓度均高于对应时间5%恩诺沙星注射液的血药浓度。恩诺沙星属浓度依赖型药物，提示25%恩诺沙星注射液（酸性）可能比5%恩诺沙星注射液更能有效防治临床各种细菌疾病。对猪临床敏感菌感染，建议按照2.5mg/kg b.w.肌肉注射给药，1d给药1～2次，连续用药2～3d。 

综上： 

建立了猪血浆中恩诺沙星的HPLC检测方法。方法的检测限为0.01μg/mL，定量限为0.02μg/mL。标准曲线在0.02~4μg/mL浓度范围内，相关系数均大于0.9990，线性关系良好，恩诺沙星在低、中、高三个添加水平的回收率在73.50~113.23%，批内变异系数＜10.54%，批间变异系数＜12.90%。 

研究了健康猪肌注两种恩诺沙星注射液（2.5mg/kg b.w）的比较药动学。结果表明，25%恩诺沙星注射液（酸性）与5%恩诺沙星注射液相比，达峰浓度显著升高，平均驻留时间显著降低，生物利用度相当。 

对猪临床敏感菌感染，建议按照2.5mg/kg b.w.肌肉注射25%恩诺沙星注射液（酸性），1d给药1～2次，连续用药2～3d。 

Claims (6)

1.一种恩诺沙星注射液，其特征在于：其组成成份及重量份数如下：

恩诺沙星    21～25份；

乳酸        5～15份；

亚硫酸氢钠  0.1～0.5份；

注射用水    59.5～73.9份。

2.根据权利要求1所述的恩诺沙星注射液，其特征在于：其组成成份及重量份数如下：

恩诺沙星    21份；

乳酸        9份；

亚硫酸氢钠  0.2份；

注射用水    69.8份。

3.根据权利要求1所述的恩诺沙星注射液，其特征在于：其组成成份及重量份数如下：

恩诺沙星      25份；

乳酸          15份；

亚硫酸氢钠    0.5份；

注射用水      59.5份。

4.根据权利要求1至3任一项所述的恩诺沙星注射液，其特征在于：所述恩诺沙星注射液的pH为5.0～6.9。

5.根据权利要求1所述的恩诺沙星注射液，其特征在于：所述恩诺沙星注射液的用法及用量为：按照2.5mg/kg b.w.肌肉注射，1d给药1～2次，连续用药2～3d。

6.一种如权利要求1至5任一项所述的恩诺沙星注射液的制备方法，其特征在于：步骤如下：

⑴称取用于溶解的注射用水；

⑵按重量份数向步骤⑴溶液中加入亚硫酸氢钠，搅拌至完全溶解；

⑶按重量份数向步骤⑵溶液中加入恩诺沙星，搅拌均匀；

⑷按重量份数向步骤⑶溶液中加入乳酸，搅拌至溶液澄清；

⑸向步骤⑷溶液中加剩余的注射用水至全量，过滤、灭菌，即得恩诺沙星注射液。

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