CN110603038A - 雷帕霉素类似物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种新的雷帕霉素类似物(例如，式Ⅰ或式Ⅱ)、混合物、其产物的制备方法、以及其在癌症治疗中的用途(例如，预防和/或治疗)。

Description

雷帕霉素类似物
相关申请
本申请要求于2017年2月10日提交的、美国申请号62/457,676的优先权。
背景技术
雷帕霉素(西罗莫司)是一种聚酮化合物，用于涂覆冠状动脉支架并防止器官移植排斥。本领域还提出雷帕霉素和雷帕霉素类似物可用于治疗***平滑肌瘤病、肺部炎症(美国专利5,080,999)、胰岛素依赖性糖尿病(美国专利5,362,718，其引用FifthInt.Conf.Inflamm.Res.Assoc.121(摘要)，(1990))、某些冠状动脉疾病(Morris,(1992)Heart Lung Transplant 11:197)、白血病和淋巴瘤(欧洲专利申请0 525 960)和眼部炎症(欧洲专利申请0 532 862)。
雷帕霉素(图4)由吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)NRRL 5491产生(Sehgal et al.,1975；Vezina et al.,1975；U.S.3,929,992；U.S.3,993,749)。出于本公开的目的，雷帕霉素通过McAlpine et al.(1991)(见图3)的编号惯例描述，其优先于Findlay et al.(1980)的编号惯例或Chemical Abstracts(第11个累积指数，1982-1986p60719CS)。
U.S.美国专利5,362,718公开了雷帕霉素的酰化前药。
雷帕霉素及其市售的类似物替西罗莫司(Temsirolimus)和依维莫司(Everolimus)通过与mTOR结合来抑制T细胞和B细胞的活化，除了其它方面，mTOR还减少白细胞介素-2的产生。mTOR是两种结构不同的复合物的催化亚基(catalytic subunit)：mTORC1和mTORC2(Wang et al.(2006)Journal of Biological Chemistry,281:24293-303)。mTORC1和mTORC2位于不同的亚细胞区室，其影响着它们的活化与功能。
科学证据表明，mTORC1是细胞营养和能量状态的传感器，在蛋白质合成调节中发挥作用(Hay et al.(2004)Genes&Development 18:1926-45；Kim et al.(2002)Cell,110:163-75)。mTORC1的活性受雷帕霉素类似物、胰岛素、生长因子、磷脂酸、一些氨基酸和氨基酸衍生物、机械刺激和氧化应激的调节。
科学证据表明，通过刺激F-肌动蛋白应力纤维、桩蛋白、RhoA、Rac1、Cdc42和蛋白激酶Cα，mTORC2起着肌动蛋白细胞骨架的重要调节子的功能(Sarbassov et al.(2004)Current Biology 14:1296-302)。mTORC2也通过Akt/PKB的磷酸化显然地影响代谢和存活(Betz et al.(2013)PNAS 110:12526-34)。mTORC2的Akt磷酸化与PDK1相互作用，并且导致完全的Akt活化(Sarbassov et al.(2005)Science 307:1098-101；Stephens et al.(1998)；Science 279:710-4)。此外，mTORC2能够活化IGF-IR和InsR(Yin et al.(2016)Cell Research 26:46-65)。
虽然不打算被理论束缚，但我们认为具有更平衡(例如更低选择性)的能力来抑制mTORC1和mTORC2的mTOR的雷帕霉素样聚酮化合物抑制剂，对于某些癌症的治疗是优选的，因为mTORCl和mTORC2的抑制都会使通过耐药性产生的逃逸机制失效。
雷帕霉素类似物(包括雷帕霉素)具有显著的治疗价值(Huang et al,2003)。这些聚酮化合物是雷帕霉素(mTOR)的哺乳动物靶点的有效抑制剂，mTOR是磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/Akt(蛋白激酶B)信号传导途径下游的丝氨酸-苏氨酸激酶，其介导细胞存活和增殖。雷帕霉素与免疫亲和素FK506结合蛋白12(FKBP12)结合后获得该抑制活性(Dumont,F.J.和Q.X.Su,1995)。在T细胞中，雷帕霉素抑制来自IL-2受体的信号传导，并且随后T细胞的自动增殖导致免疫抑制。雷帕霉素作为免疫抑制剂上市，用于治疗器官移植的患者以防止移植排斥(Huang et al,2003)。除免疫抑制外，雷帕霉素还发现了在癌症中的治疗应用(Vignot et al,2005)。
雷帕霉素和许多雷帕霉素类似物具有缺点，包括诱导高脂血症、由P-糖蛋白介导的细胞外排(“P-gp”；LaPlante et al,2002，Crowe et al,1999)和其它外排机制，这些机制将化合物泵出细胞并且趋于降低所施用的药物化合物的有效性，并且对多药耐药性癌症的治疗提出了挑战。雷帕霉素首次通过肝脏的损失也很高，这进一步导致其低的口服生物利用度。雷帕霉素低的口服生物利用度造成显著的个体间差异，导致治疗结果不一致和临床管理困难(Kuhn et al,2001，Crowe et al,1999)。
使用分子的化学可用位点的各种合成雷帕霉素类似物是本领域已知的。在分子上用于衍生化或置换的化学上可用位点在本领域中是已知的，包括例如C40和C28羟基(例如U.S.5,665,772；U.S.5,362,718)；C39和C16甲氧基(例如WO 96/41807；U.S.5,728,710)；C32、C26和C9酮基(例如U.S.5,378,836；U.S.5,138,051；U.S.5,665,772)；C17、C19和/或C21的氢化反应(例如U.S.5,391,730；U.S.5,023,262)；和/或在C32、C40和/或C28上形成肟，(例如U.S.5,563,145，U.S.5,446,048)。表现出抗代谢攻击的类似物(例如，U.S.5,912,253)；生物利用度(例如U.S.5,221,670；U.S.5,955,457；WO 98/04279)；和/或前药的生产(例如U.S.6,015,815；U.S.5,432,183)也已经开发出来。因此，在本领域中应当理解雷帕霉素的药学上有用和令人感兴趣的类似物的数量非常高，并且难以定量。
与式Ⅰ和式Ⅱ的化合物具有相似性的雷帕霉素类似物是美国专利号9,382,266中公开的聚酮化合物。本公开提供了美国专利号9,382,266中所述化合物的立体异构体，但美国专利号9,382,266没有公开或启示本公开提供的新型聚酮化合物，也没有提供了一种组合物，其中组合物中的大部分聚酮化合物是图1和/或图2的化合物。
发明内容
在一些实施方案中，本公开提供了类似于雷帕霉素的聚酮化合物，其具有意想不到的和有益的药物用途。在一些实施方案中，本公开提供了组合物，其包括图1和/或图2中描述的聚酮化合物和其它聚酮化合物。在一些实施方案中，本公开提供了用于产生图1和/或图2的聚酮化合物的新方法。在一些实施方案中，提供治疗有此需要的哺乳动物的方法，包括施用图1和/或图2的聚酮化合物，和/或组合物和/或包括这些物质的混合物。如本文所述和/或本领域普通技术人员可以确定的其它实施方案也是预期的。
附图说明
图1：式Ⅰ的化学结构。
图2：式Ⅱ，其为C37-[(1R,2S,4R,5S)-5-羟基双环[2.2.1]庚烷]雷帕霉素。
图3：本文件中使用的雷帕霉素编号方案。
图4：市售的聚酮化合物的化学结构，类似于本发明的聚酮化合物，其为雷帕霉素，替西罗莫司和依维莫司。
图5：美国专利号9,382,266中公开的聚酮化合物，C37R-[(1S,2R,4S,5R)-5-羟基双环[2.2.1]庚烷]雷帕霉素。
图6.在小鼠全血中以IP定量给予2mg/kg或10mg/kg的式Ⅱ(QD×3天)。
图7.随时间的肿瘤体积。图7A：随时间的平均肿瘤体积。图7B：随时间的中位肿瘤体积；图7C：随时间的平均肿瘤体积百分比；图7D：随时间的中位肿瘤体积百分比。
具体实施方式
本公开提供式Ⅰ和式Ⅱ的聚酮化合物，其为C37-[(1R,2S,4R,5S)-5-羟基双环[2.2.1]庚烷]雷帕霉素及其前药酯。式Ⅰ的化合物是式Ⅱ的化合物的前药，如本文所述，其在治疗哺乳动物疾病方面具有令人惊讶且意想不到的有益特性。式Ⅰ如下所示：
其中：
R选自氢、或-C(O)(CR3R4)b(CR5R6)d(CR7R8 R9)；
R3和R4各自独立地为氢、C1至C6烷基、C2至C8烯基、C2至C8炔基、三卤甲基或-F；
R5和R6各自独立地为氢、C1至C6烷基、C2至C8烯基、C2至C8炔基、-(CR3R4)fOR10、-CF3、-F或CO2R11；
R7为氢、C1至C6烷基、C2至C8烯基、C2至C8炔基、-(CR3R4)fOR10、-CF3、-F或CO2R11；
R8和R9各自独立地为氢、C1至C6烷基、C2至C8烯基、C2至C8炔基、-(CR3R4)fOR10、-CF3、-F或CO2R11、或R8和R9可以一起形成X或3-8个碳原子的环烷基环，所述环烷基环任选地被-(CR3R4)fOR10单、二或三取代；
R10为氢、C1至C6烷基、C2至C8烯基、C2至C8炔基、三-(C1至C6烷基)甲硅烷基、三-(C1至C6烷基)甲硅烷基乙基、三苯基甲基、苄基、C2至C8烷氧基甲基、三-(C1至C6烷基)甲硅烷基乙氧基甲基、氯乙基或四氢吡喃基；
R11为氢、C1至C6烷基、C2至C8烯基、C2至C8炔基或C7至C10苯基烷基；
X为5-(2,2-二-(C1至C6烷基)[1,3]二恶烷基、5-(2,2-二-(C3至C8环烷基)[1,3]二恶烷基、4-(2,2-二-(C1至C6烷基)[1,3]二恶烷基、4-(2,2-二-(C3至C8环烷基)[1,3]二恶烷基、4-(2,2-二-(C1至C6)烷基)[1,3]二氧戊环基、或4-(2,2-二-(C3至C8环烷基)[1,3]二氧戊环基；
b是从0到6的整数；
d是0到6的整数；和，
f是从0到6的整数。
在优选的实施方案中，R包括至少一个选自-(CR3R4)fOR10、X或-(CR3R4)fOR10取代的C3至C8环烷基的部分。还提供了这些化合物的药学上可接受的盐。
式Ⅰ的前药在给予合适的哺乳动物后可转化为式Ⅱ的化合物。在一些实施方案中，给予的式Ⅰ部分的浓度随时间的图所形成的曲线下的面积小于式Ⅱ的化合物(或多个化合物)的浓度随时间的图所形成的曲线下的面积。在一些实施方案中，式Ⅱ的前药药物活性比式Ⅱ的化合物低至少10倍，优选低至少100倍。在一些实施方案中，至少10％、优选至少50％、更优选至少85％的式Ⅰ的化合物在其给予哺乳动物后转化为式Ⅱ的化合物，这相当于给予的式Ⅰ的化合物的生物半衰期。在前述的一些实施方案中，式Ⅰ的化合物基本上是药学上惰性的，直至转化为式Ⅱ的化合物。然而，在其它实施方案中，式Ⅰ的化合物在转化为式Ⅱ的化合物之前具有显著的药学活性。
在一个优选的实施方案中，式Ⅰ的聚酮化合物是式Ⅱ的聚酮化合物：
本文公开的聚酮化合物，例如式Ⅰ或II的聚酮化合物，尽管与美国专利号9,382,266中公开的聚酮化合物、雷帕霉素和雷帕霉素的其它类似物具有结构相关性，但与其相比显示出令人惊讶且意想不到的有利的药理学特征。例如，相对于美国专利号9,382,266中公开的聚酮化合物，式Ⅱ的聚酮化合物用于治疗某些医学病症具有意想不到的优点。其它优点见表1。
表1
式Ⅰ的聚酮化合物前药，和特别地以及优选式Ⅱ的聚酮化合物，也具有意想不到的有益的药代动力学。特别地，式Ⅱ的聚酮化合物具有高的口服生物利用度，测量约为0.47(％F)。这种高口服生物利用度基本上和显著优于美国专利号9,382,266中公开的聚酮化合物，其比0.47(％F)低约一半至约四分之一。在本发明的一个方面，该比较的生物利用度可以允许以较低毒性给予药学上有效的式Ⅱ组合物(即增加的治疗窗口)。在本发明的另一个方面，相对于口服给予美国专利号9,382,266公开的聚酮化合物的能力，这种增加的生物利用度改善了口服给予式Ⅱ的化合物的能力。口服给药相对于静脉内给药和其它给药途径的益处在本领域中是很好理解的。
包括式Ⅰ的聚酮化合物或优选式Ⅱ的聚酮化合物的组合物是任选地但不必是纯的。本发明的聚酮化合物(式Ⅰ或优选式Ⅱ)可以以混合物的形式存在，其中混合物中基本上所有的聚酮化合物是式Ⅰ的聚酮化合物以及优选式Ⅱ的聚酮化合物，其中混合物中99.9％重量计的聚酮化合物是式Ⅰ的聚酮化合物或优选式Ⅱ的聚酮化合物，其中混合物中99.5％的聚酮化合物是式Ⅰ的聚酮化合物或优选式Ⅱ的聚酮化合物，其中混合物中至少99％的聚酮化合物是式Ⅰ的聚酮化合物或优选式Ⅱ的聚酮化合物，其中混合物中98％的聚酮化合物是式Ⅰ的聚酮化合物或优选式Ⅱ的聚酮化合物，其中混合物中至少95％的聚酮化合物是式Ⅰ的聚酮化合物或优选式Ⅱ的化合物，其中混合物中至少90％的聚酮化合物是式Ⅰ的聚酮化合物或优选式Ⅱ的聚酮化合物，其中混合物中80％的聚酮化合物是式Ⅰ的聚酮化合物或优选式Ⅱ的聚酮化合物，或其中混合物中70％的聚酮化合物是式Ⅰ的聚酮化合物或优选式Ⅱ的聚酮化合物。
此外，在本发明的每个前述方面，式Ⅰ的化合物和优选式Ⅱ的化合物，任选地以式Ⅰ的化合物和优选式Ⅱ的盐、溶剂化物或酯提供。本发明的聚酮化合物的药学上可接受的盐包括由药学上可接受的无机或有机酸或碱形成的常规盐以及季铵酸加成盐。合适的酸盐更具体的示例包括盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、硝酸、高氯酸、富马酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、甲酸、乳酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、棕榈酸、丙二酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、富马酸、甲苯磺酸、甲磺酸、萘-2-磺酸、苯磺酸羟基萘甲酸、氢碘酸、苹果酸、类固醇的(steroic)、单宁酸等。其它酸如草酸，虽然本身不是药学上可接受的，但任选地可用于制备盐，这种盐可作为获得本发明化合物及其药学上可接受的盐的中间体。合适的碱盐更具体示例包括钠、锂、钾、镁、铝、钙、锌、N，N’-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、N-甲基葡糖胺和普鲁卡因盐。在本发明的一个方面，式Ⅰ的聚酮化合物的药学上可接受的盐与一种或多种药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体组合在一起。
类似地，本发明的聚酮化合物及其药学上可接受的盐任选地可以是溶剂化物，包括醇溶剂化物和水合物。
本发明的聚酮化合物(式Ⅰ或优选式Ⅱ)可以以纯的形式提供，例如以结晶或粉末形式或在至少一种药学上可接受的缓冲剂、载体或赋形剂中稀释。在本发明的上下文中，药学上可接受的缓冲剂、载体和赋形剂优选不与本发明的聚酮化合物不利地相互作用，在适合的时间段提供稳定的制剂，并且对其大多数接受者不会过度地有害。
在一些实施方案中，本发明的聚酮化合物(式Ⅰ或优选式Ⅱ)的溶液或悬浮液还包括赋形剂，例如N，N-二甲基乙酰胺、分散剂，例如聚山梨醇酯80、表面活性剂和增溶剂，例如聚乙二醇、Phosal 50PG(由磷脂酰胆碱、大豆脂肪酸、乙醇、甘油单酯/甘油二酯、丙二醇和抗坏血酸棕榈酸酯组成)。
本发明的组合物(优选式Ⅰ或式Ⅱ的化合物，最优选式Ⅱ的化合物)可以通过任何合适的途径或方式给药，包括但不限于肠胃外、口服、局部(包括口腔、舌下、透皮)、通过医疗装置(如支架)、通过吸入、或者通过注射(例如皮下、肌肉内或者静脉内)。治疗任选地由单剂组成，但优选在许多实施方案中是随时间多次给药。技术人员将认识到，本发明化合物的各个剂量的最佳量和间隔将取决于所治疗病症的性质和程度、给药的形式、途径和部位，以及特定受治疗的受试者的年龄和状况，并且医生将最终确定要使用的适当剂量。该剂量可以适当地重复进行。如果产生副作用，则可以根据正常的临床实践改变或减少剂量的量和/或频率。
在一些实施方案中，式Ⅰ的化合物，优选式II的化合物，作为唯一的活性药剂给药。因此，在一些实施方案中，将式Ⅰ的化合物，优选式Ⅱ的化合物给予哺乳动物(例如人)以预防和/或治疗疾病，作为任选包括一种或多种药物赋形剂的药物组合物而没有其它活性剂。在一些实施方案中，将式Ⅰ的化合物，优选式Ⅱ的化合物，给予哺乳动物(例如人)以预防和/或治疗疾病，作为包括至少一种其它活性剂的药物组合物，并且任选地包括一种或多种药物赋形剂。在一些实施方案中，将式Ⅰ的化合物，优选式Ⅱ的化合物给予哺乳动物(例如人)以预防和/或治疗疾病，作为药物组合物，其任选地包括至少一种其它活性剂，以及任选地包括一种或多种药物赋形剂与至少一种其它组合物，其它组合物也包括至少一种其它活性剂，并且任选地还包括一种或多种药物赋形剂(例如两种组合物，一种包括至少式Ⅰ的化合物，优选式Ⅱ的化合物，和包括至少一种其它活性剂的其它组合物)。还可以给予多种组合物以预防和/或治疗疾病，每种组合物包括一种或多种活性剂(这些组合物之一包括式Ⅰ的化合物，优选式Ⅱ的化合物)。这些活性剂和/或组合物可以同时或依次地给药，或者其的一些组合给药，并且可以在哺乳动物的相同或不同部位给药，或者通过相同或不同的给药途径给药。
可以与式Ⅰ的化合物，优选式Ⅱ的化合物一起给予哺乳动物以预防和/或治疗疾病的活性剂包括但不限于一种或多种化学治疗剂、抗癌剂、放射疗法、免疫调节剂、例如但不限于，任何一种或多种：抗癌剂减少或最小化与某些类型的癌症治疗相关的任何不希望的副作用(例如疲劳、贫血、食欲改变、出血问题、腹泻、便秘、脱发、恶心、呕吐、疼痛、周围神经病变、肿胀、皮肤和指甲变化、尿和膀胱变化、吞咽困难等)、烷化剂(如氮芥、氮芥-N-氧化物盐酸盐、氯丁丁胺、环磷酰胺、异环磷酰胺、噻替哌、卡波醌、硫丹磺酸盐、白消安、盐酸尼莫司汀、二溴甘露醇、美法仑、达卡巴嗪、雷莫司汀、磷酸雌莫司汀、曲他胺、卡莫司汀、洛莫司汀、链脲佐菌素、哌泊溴烷、依托格鲁、卡铂、顺铂、米帕、奈达铂、奥沙利铂、六甲蜜胺、氨莫司汀、盐酸二溴螺氯铵(dibrospidium hydrochloride)、福莫司汀、泼尼莫司汀、嘌嘧替派、盐酸苯达莫司汀(ribomustin)、替莫唑胺、曲奥舒凡、氯乙环磷酰胺、净司他丁斯酯、阿多来新、半胱胺亚硝脲、比折来新等)、抗代谢物(如巯基嘌呤、6-巯基嘌呤核苷、硫代肌苷、甲氨蝶呤、依诺他滨、阿糖胞苷、阿糖胞苷烷磷酯(cytarabine ocfosfate)、盐酸安西他滨、5-FU药物(如氟尿嘧啶、替加氟、UFT、多西氟尿苷、卡莫氟、加洛他滨(gallocitabine)、乙嘧替氟等)、氨基蝶呤、亚叶酸钙、硫鸟嘌呤(tabloid)、甘氨硫嘌呤、亚叶酸钙、左亚叶酸钙、克拉屈滨、乙嘧替氟、氟达拉滨、吉西他滨、羟基尿素、喷司他丁、吡曲克辛、碘苷、米托胍腙、thiazophrine、氨莫司汀等)、抗癌抗生素(如放线菌素-D、放线菌素-C、丝裂霉素-C、色霉素-A3、盐酸博来霉素、硫酸博来霉素、硫酸培洛霉素、盐酸柔红霉素、盐酸多柔比星、盐酸阿柔比星、盐酸吡柔比星、盐酸表柔比星、新制癌菌素、光神霉素、肉瘤霉素、嗜癌菌素、米托坦、盐酸佐柔比星、盐酸米托蒽醌、盐酸伊达比星等)、植物源性抗癌药(例如依托泊苷、磷酸依托泊苷、硫酸长春碱、硫酸长春新碱、硫酸长春地辛、替尼泊苷、紫杉醇、多西紫杉醇、长春瑞滨等)、免疫治疗剂(如抗体(例如抗PD1抗体、PD-L1抗体、抗-CTLA4抗体、抗CD20抗体、抗CD25抗体、HER2抗体(例如曲妥珠单抗)、甲磺酸伊马替尼、ZD1839或EGFR抗体(例如西妥昔单抗)、VEGF抗体(例如贝伐单抗)、VEGFR抗体、VEGFR抑制剂和EGFR抑制剂(例如厄洛替尼)、毕西巴尼、云芝胞内多糖、西佐喃(Sizofuran)、香菇多糖、乌苯美司、干扰素、白细胞介素、巨噬细胞集落刺激因子、粒细胞集落刺激因子、***、淋巴毒素、BCG疫苗、小棒状杆菌、左旋咪唑、多糖K、丙考达唑等)、甲氨蝶呤、多柔比星、5-氟尿嘧啶、长春新碱、长春碱、帕米膦酸二钠、阿那曲唑、依西美坦、环磷酰胺、表柔比星、托瑞米芬、来曲唑、曲妥珠单抗、甲地孕酮、它莫西芬(tamoxifen)、紫杉醇，多西紫杉醇、卡培他滨、醋酸戈舍瑞林、糖酵解抑制剂；一种或多种激素治疗药物(磷雌酚、己烯雌酚、氯烯雌醚、醋酸甲羟孕酮、醋酸甲地孕酮、醋酸氯地孕酮、醋酸环丙孕酮、达那唑、地诺孕素、阿索立尼、烯丙雌醇、孕三烯酮、诺美孕酮、通尿灵(tadenan)、美帕曲星、雷洛昔芬、奥美昔芬、左美洛昔芬、抗***(例如，柠檬酸它莫昔芬、柠檬酸托瑞米芬等)、ER下调调节剂(例如氟维司群等)、人绝经期***、促卵泡激素、丸制剂、美雄烷、testrolactone、氨鲁米特、LH-RH激动剂(例如醋酸戈舍瑞林、布舍瑞林，亮丙瑞林等)、屈洛昔芬、环硫雄醇、乙炔基***磺酸盐、芳香酶抑制剂(例如盐酸法曲唑(fadrozole hydrochloride)、阿那曲唑、来曲唑(retrozole)、依西美坦、伏氯唑、福美司坦等)、抗雄激素(例如氟他胺、比卡鲁胺(bicartamide)、尼鲁米特等)、5α-还原酶抑制剂(例如非那雄胺、度他雄胺、依立雄胺等)、肾上腺皮质激素药物(例如***、***龙、倍他米松、曲安西龙等)；一种或多种雄激素合成抑制剂(例如阿比特龙等)；一种或多种延迟类视黄醇代谢的类视黄醇和/或药物(例如利阿唑等)等和LH-RH激动剂(例如醋酸戈舍瑞林、布舍瑞林、亮丙瑞林))；L-天冬酰胺酶、醋葡醛内酯、盐酸丙卡巴肼、原卟啉-钴络合物盐、汞血卟啉钠；拓扑异构酶I抑制剂(例如伊立替康、拓扑替康等)、拓扑异构酶II抑制剂(例如索布佐生等)、分化诱导剂(例如类视黄醇、维生素D等)、α-受体阻滞剂(例如盐酸坦索罗辛、萘哌地尔、乌拉地尔、阿夫唑嗪、特拉唑嗪、哌唑嗪、西洛多辛等)、丝氨酸/苏氨酸激酶抑制剂、内皮素受体拮抗剂(例如阿曲生坦等)、蛋白酶体抑制剂(例如硼替佐米等)、Hsp90抑制剂(例如17-AAG等)、螺内酯、米诺地尔，llα-羟基孕酮、骨吸收抑制/转移抑制剂(例如唑来膦酸、阿仑膦酸、帕米膦酸、羟乙磷酸、伊班膦酸、氯膦酸)、血管生成抑制剂(例如尼达尼布(BIBF 1120，尼达尼布)、贝伐单抗(阿瓦斯丁)、依维莫司(癌伏妥)、替西罗莫司(驮瑞塞尔)、来那度胺(雷利米得)、帕唑帕尼(福退癌)、雷莫芦单抗(雷莫芦单抗)、索拉非尼(索拉非尼)、舒尼替尼(纾癌特)、沙利度胺(反应停)、凡德他尼(凡德他尼)、西地尼布(西地尼布)、阿西替尼(英立达)、莫特塞尼、瓦他拉尼碱、多韦替尼、布立尼布、利尼伐尼、蒂沃扎尼、仑伐替尼、瑞格非尼(瑞格非尼)、福瑞替尼(foretinib)、替拉替尼、卡博替尼(卡博替尼)、尼罗替尼(泰息安)、坦度替尼、伊马替尼(格列卫)、BMS-690514、奎扎替尼(AC220)、奥兰替尼(orantinib)、奥拉单抗(olaratumab)、埃罗替尼(特罗凯)、吉非替尼(易瑞沙)、阿法替尼(吉泰瑞)、拉帕替尼(泰克博)、瓦利替尼、AEE-788、曲妥珠单抗(赫赛汀)、西妥昔单抗(爱必妥)、帕尼单抗(维克替比)、尼妥珠单抗、帕妥珠单抗(奥密塔克)、厄妥索单抗(ertumaxomab)或扎鲁木单抗(zalutumumab)。在一些实施方案中，血管生成抑制剂是尼达尼布(BIBF 1120)、依维莫司(癌伏妥)、替西罗莫司(驮瑞塞尔)、帕唑帕尼(福退癌)、阿西替尼(英立达)，贝伐单抗(阿瓦斯丁)、索拉非尼(索拉非尼)，舒尼替尼(纾癌特)、沙利度胺(反应停)、多韦替尼、瑞格非尼(瑞格非尼)或伊马替尼(格列卫))等，和/或其组合和/或混合物，任选地与本文所述的任何其它活性剂一起，或者可以以其它方式为本领域技术人员所用。式Ⅰ或式Ⅱ的化合物，最优选式Ⅱ的化合物，也可以与外科手术、放射疗法、基因疗法、热疗法、冷冻疗法、激光烧灼术等中的任何一种或多种一起和/或其任何组合进行给药，任选地与本文所述的任何活性剂一起使用，或者可以以其它方式为本领域技术人员所用。
包括本发明的聚酮化合物(优选式Ⅰ或式Ⅱ的化合物，最优选式Ⅱ的化合物)的片剂任选地包括赋形剂，例如微晶纤维素、乳糖(例如乳糖一水合物或无水乳糖)、柠檬酸钠、碳酸钙、磷酸氢钙和甘氨酸、丁基化羟基甲苯(E321)、交联聚维酮、羟丙甲纤维素、崩解剂如淀粉(优选玉米、马铃薯或木薯淀粉)、淀粉乙醇酸钠、交联羧甲基纤维素钠和某些复合硅酸盐、以及颗粒化粘合剂如聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟基-丙基纤维素(HPC)、蔗糖、明胶和***胶。另外，任选地包括润滑剂，例如硬脂酸镁、硬脂酸和滑石。
类似类型的固体组合物也可用作明胶胶囊中的填充剂。就此而言，优选的赋形剂包括乳糖、淀粉、纤维素、乳糖或高分子量聚乙二醇。对于含水悬浮液和/或酏剂，本发明化合物可以与各种甜味剂或调味剂、着色剂或染料、乳化剂和/或悬浮剂以及稀释剂如水、乙醇、丙二醇和甘油以及其组合混合。
片剂可通过压缩或模具制造，任选地具有一种或多种辅助成分。压缩的片剂可以通过在合适的机器中压制自由流动形式(如粉末或颗粒)的活性成分，任选地与粘合剂(例如聚维酮、明胶、羟丙基甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如羟基乙酸淀粉钠、交联聚维酮、交联羧甲基纤维素钠)、表面活性剂或分散剂混合来制备。模制的片剂可以在合适的机器通过模具利用惰性液体稀释剂润湿的粉末化合物的混合物来制备。片剂可以任选地进行包衣或刻痕，并且可以配制成使其中的活性成分缓慢或控制释放，例如使用不同比例的羟丙基甲基纤维素以提供所需的释放曲线。
为方便起见，制剂任选地以单位剂型提供，并且可以通过药学领域熟知的任何方法制备。这些方法包括使活性成分(本发明化合物)与构成一种或多种辅助成分的载体结合的步骤。通常，制剂通过将活性成分与液体载体或细碎的固体载体或两者均匀并且且紧密地结合在一起来制备，然后，如果需要，使产品成形。
适于局部给药的药物组合物可以配制成软膏、乳膏、悬浮液、洗剂、粉末、溶液、糊剂、凝胶、浸渍敷料、喷雾剂、气溶胶或油、透皮装置、除尘粉末等。这些组合物可通过包括活性剂的常规方法制备。因此，它们还可以包括相容的常规载体和添加剂，例如防腐剂、有助于药物渗透的溶剂、乳膏或软膏中的润肤剂和用于洗剂的乙醇或戊醇。这些载体可以占组合物的约1％至约98％。更一般地，它们将占组合物的约80％。仅作为说明，通过将足量的亲水性材料和水混合来制备乳膏或软膏，其包括约5-10％重量计的化合物，以产生具有所需稠度的乳膏或软膏。
适于透皮给药的药物组合物可以作为离散的贴剂存在，旨在与接受者的表皮保持长时间的紧密接触。例如，可通过离子电渗疗法从贴剂递送活性剂。
对于外部组织(例如口腔和皮肤)的应用，组合物优选地作为局部软膏或乳膏施用。当配制成软膏时，活性剂可以与石蜡或水混溶性软膏基质一起使用。或者，可以将活性剂配制成具有水包油乳膏基质或油包水基质的乳膏。
对于肠胃外给药，使用活性成分和无菌载体制备流体单位剂型，例如但不限于水、醇、多元醇、甘油和植物油，优选为水。取决于所使用的载体和浓度，活性成分可以在载体中悬浮或溶解。在制备溶液时，可以将活性成分溶解在注射用水中并将其过滤灭菌，然后装入合适的小瓶或安瓿中并且密封。
有利地，诸如局部麻醉剂、防腐剂和缓冲剂的药剂可以溶解在载体中。为了增强稳定性，组合物可以在填装到小瓶中之后冷冻，并且在真空下除水。然后将干燥的冻干粉末密封在小瓶中，并且可以提供附带的一小瓶注射用水以在使用前重构液体。
以与溶液基本相同的方式制备胃肠外悬浮液，不同之处在于活性成分悬浮在载体中而不是溶解，并且不能通过过滤完成灭菌。活性成分可以在悬浮于无菌载体中之前通过暴露于环氧乙烷来灭菌。有利地，组合物包括表面活性剂或润湿剂，以促进活性成分的均匀分布。
式Ⅰ和/或式Ⅱ的化合物也可以使用本领域已知的医疗装置进行给药。例如，在一个实施方案中，本文所述的药物组合物可以使用无针皮下注射装置进行给药，例如美国专利号5,399,163；美国专利号5,383,851；美国专利号5,312,335；美国专利号5,064,413；美国专利号4,941,880；美国专利号4,790,824；或美国专利号4,596,556中公开的装置。众所周知的植入物(implant)和模块(module)的有用实施例包括但不限于美国专利号No.4,487,603公开的一种用于以受控速率分配药物的可植入微输液泵；美国专利号4,486,194公开了一种通过皮肤进行给药的治疗装置；美国专利号4,447,233公开了一种用于以精确输注速率输送药物的药物输注泵；美国专利号4,447,224公开了一种用于连续药物输送的可变流量的可植入输注装置；美国专利号4,439,196公开了一种具有多腔室的隔室的渗透药物输送***；以及美国专利号4,475,196公开了一种渗透性药物递送***。在一个具体的实施方案中，聚酮化合物(例如式Ⅰ或式Ⅱ)和包括它们组合物可以使用药物洗脱支架进行给药，例如，对应于在WO01/87263和相关出版物中描述的那些，或Perin描述的那些(Perin,EC,2005)。许多其它这样的植入物、递送***和模块是本领域技术人员已知的。
可以给予本文所述的聚酮化合物和组合物，包括式Ⅰ的聚酮化合物和/或优选式Ⅱ的聚酮化合物，以治疗、预防或改善有此需要的哺乳动物的疾病或医学状况(medicalcondition)。在优选的实施方案中，哺乳动物是人。哺乳动物的任何适当的医学状况可以通过将药学上适当量的式Ⅰ的制剂，和优选式Ⅱ的制剂给予有此需要的哺乳动物来进行治疗。通常技术人员可以在常规研究、指南和程序之后容易地选择本发明的聚酮化合物(式Ⅰ或优选式Ⅱ)的给药途径以及量。待给予的本发明化合物的剂量将根据具体化合物、所涉及的疾病、受试者、疾病的性质和严重程度以及受试者的身体状况和所选择的给药途径而变化。适当的剂量可以由本领域技术人员容易地确定。例如但不限于，每日约0.1mg至100mg，和任选地每日约0.1至15mg(或较低频率给予较高剂量)的剂量是可以考虑的。
组合物可以包括本发明的聚酮化合物(式Ⅰ或优选式Ⅱ)和其它组分的任何合适的组合。在一些优选的实施方案中，本发明的组合物包括0.1重量％至70重量％的本发明的聚酮化合物(式Ⅰ或优选式Ⅱ)，优选5-60重量％，更优选10-30重量％的本发明的聚酮化合物(式Ⅰ或优选式Ⅱ)，这取决于给药方法和其它因素。
尽管不希望受理论束缚，但人们相信与雷帕霉素相关的聚酮化合物的施用相关的不良副作用更多地是由mTORC2抑制而不是mTORC1抑制而引起的。因此，技术人员可能优选对于mTORC1的病症具有选择性的聚酮化合物，因为在这种情况下，细胞的逃逸机制并不特别受关注。另一方面，众所周知，癌细胞表现出快速的基因组可塑性，这可以导致在所治疗的哺乳动物中耐药性癌症的发展。对于这些疾病，通常需要给予mTOR抑制性聚酮化合物，其以更平衡的方式抑制mTORC1和mTORC2。式Ⅰ的聚酮化合物，特别是包括式Ⅱ的聚酮化合物，与美国专利号9,382,266中公开的聚酮化合物相比，意想不到地并且有利地以更平衡的方式抑制mTORC1和mTORC2。虽然不希望受理论的束缚，本发明提供了治疗有此需要的哺乳动物的方法，其包括将本文公开的聚酮化合物(例如式Ⅰ和/或式Ⅱ)给予哺乳动物，其中治疗病症是选自癌症和其它增生性发育异常、真菌感染和***性红斑狼疮。在本发明的一个方面，癌性病症是***平滑肌瘤病、白血病、肾细胞癌、卵巢癌、胰腺癌或淋巴瘤。本文还描述了其它方面。
本文所述的式Ⅰ和/或式Ⅱ的聚酮化合物可以通过加料式(Ⅲ)的起始酸(starteracid)而作为直接发酵产物而生产。
在WO 2004/007709(US 2005/0272132A1)和WO 2006/016167(US 2009/0253732A1)中描述了这种方法的合适条件，其内容通过引用整体并入。具体地，产生了生产雷帕霉素的生物体的突变菌株，吸水链霉菌，其缺乏rapK基因并且被称为吸水链霉菌△rapK(BIOT-4010；参见美国专利号9,382,266的实施例1，其方法和材料在本文中通过引用并入)。其它合适生产菌株包括吸水链霉菌MG2-10(pLL178)、吸水链霉菌NRRL5491的衍生物。在WO 2004/007709(US 2005/0272132 A1)的实施例2中描述了吸水链霉菌MG2-10的产生，并且为了产生合适的生产菌株，这应该利用rapIJMNOQL进行补充，使用表达质粒如pLL178(如在WO 2006/016167(US 2009/0253732 A1)的实例7中描述)。BIOT-4010或类似菌株，例如吸水链霉菌MG2-10(pLL178)(WO 2004/007709(US 2005/0272132 A1)、WO 2006/016167(US 2009/0253732 A1))在适当的培养基(例如(但不限于)MD6)中的发酵，在合适的温度下，例如26℃，加入外-(1R,2S,4R,5S)-5-羟基双环[2.2.1]庚烷-2-羧化物，通常24小时，这足以产生本发明化合物。在孵育后3至8天观察到峰值滴度。式(Ⅱ)化合物的酸形式是外-(1R,2S,4R,5S)-5-羟基双环[2.2.1]庚烷-2-羧酸。
生产雷帕霉素的菌株包括吸水链霉菌、放线菌属(Actinoplates sp.)N902-109(参见Nishida et al(1995))和链霉菌属(Streptomyces sp.)A 91-261402(参见WO 94/18207)。其它生产雷帕霉素的菌株在WO 95/06649中提及。WO 94/18207和WO 95/06649的内容通过引用整体并入本专利文件中。
本发明化合物可以被纯化，例如从其它发酵产物中(包括但不限于其它聚酮化合物)，通过任何合适的常规分离技术，例如但不限于快速色谱法(flash chromatography)、制备型高效液相色谱法(preparative HPLC)和/或结晶法。
因此，在一个方面，本发明提供了制备基本上纯的本发明化合物的方法，包括步骤(ⅰ)加料式(Ⅲ)的起始酸：
给生产雷帕霉素的菌株，所述菌株已经进行过基因改造以去除或灭活rapK基因，或在其它实施方案中，去除或灭活编码具有与rapK基因产物RapK相当功能的分支酸酶(chorismatase)的基因(参见Andexer et al.,2011)；(ⅱ)分离和纯化本发明化合物。
通过使用受保护的羟基和活化的聚丙烯酸、烷氧基或聚烷氧基羧酸来酰化式Ⅱ的化合物，如果需要然后去除醇保护基团，可以制备式Ⅰ的化合物。羧化物(carboxylate)活化的几种方法是本领域已知的，但优选的方法是使用碳二亚胺、混合酸酐或酰氯。例如，适当取代的羧酸可以作为混合酸酐与酰化基团(如2,4,6-三氯苯甲酸酐)一起活化。在温和碱性条件下，利用混合酸酐处理式Ⅱ，提供了所需的化合物。或者，酰化反应可以利用1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和二甲基氨基吡啶完成。
在式Ⅰ的合成过程中，通过常规加入合适的保护基团如叔丁基二甲基甲硅烷基保护基团，可以保护式Ⅱ的弱羟基，其在稍后的阶段可以在温和的酸性条件下(如在乙酸/水/THF溶液中)去除。脱保护在美国专利号5,118,678中进一步描述，该专利在此引入作为参考。通过类似于美国专利号5,120,842中的方法提供了可替代的合成方法，该专利在此引入作为参考。
可以通过任何合适的分离技术纯化式Ⅰ和式Ⅱ的化合物，包括但不限于制备级色谱法。
因此，在一些实施方案中，本公开提供了如上所述的式Ⅰ的化合物，和/或其药学上可接受的盐、溶剂化物、酯或混合物。在一些实施方案中，本公开提供了组合物，该组合物包括这些的化合物、药学上可接受的盐、溶剂化物、酯或混合物和任选的至少一种药学上可接受的载体。在一些实施方案中，本公开提供式Ⅱ的前药，其中前药是式Ⅰ的聚酮化合物，以及式Ⅰ的化合物的药学上可接受的盐、溶剂化物和水合物。在一些实施方案中，本公开提供式Ⅱ的化合物以及其药学上可接受的盐、溶剂化物、酯或混合物，和/或包括它们的组合物(例如包括药学上可接受的载体的药物组合物)。在一些实施方案中，本公开提供组合物，该组合物包括约70％或更多、约80％或更多、约90％或更多(即“基本上纯的”)、约95％或更多、或约99％或更多的化合物，该化合物选自由以下项组成的组：式Ⅱ的化合物、式Ⅰ的化合物其药学上可接受的盐、其溶剂化物、其酯和/或前述的混合物。在一些实施方案中，组合物包括基本上纯的混合物，其中基本上纯的混合物可以包括痕量或药学上不显著量的其它聚酮化合物的化合物，该化合物选自由以下项组成的组：式Ⅰ的化合物和优选式Ⅱ的化合物、式Ⅰ的化合物和优选式(Ⅱ)的药学上可接受的盐、溶剂化物和酯以及前述的混合物。在一些实施方案中，本公开提供药物组合物，该药物组合物包括药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂和式Ⅰ和优选式Ⅱ的聚酮化合物，其中式Ⅰ和优选式Ⅱ的化合物的药学上可接受的盐、溶剂化物和/或水合物包括至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、或至少约98％的药物组合物的聚酮化合物组分。在此类组合物的一些实施方案中，该聚酮化合物基本上是药物组合物中唯一的聚酮化合物。在此类组合物的一些实施方案中，式Ⅰ的前药可以代替式Ⅱ的聚酮化合物。在一些实施方案中，如果存在溶剂化物的话，其是水合物。
在一些实施方案中，抑制细胞增殖的方法，该方法包括使所述细胞与抗增殖量的式Ⅱ的化合物、其药学上可接受的盐、其溶剂化物、其酯或其混合物和/或包括式Ⅱ；和/或包括式Ⅱ的组合物接触。在一些实施方案中，细胞是人细胞，例如优选为人癌细胞(例如但不限于，例如腺癌、膀胱癌、血癌、骨癌、脑癌、实体瘤、胶质母细胞瘤、乳腺癌、骨髓癌、红白血病、骨肉瘤、结直肠癌、表皮样癌、上皮癌、子宫癌、纤维肉瘤、胃腺癌、肾癌、白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性粒细胞白血病、平滑肌母细胞瘤、肺癌、小细胞肺癌、淋巴瘤，B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、黑色素瘤、恶性黑色素瘤、神经母细胞瘤、白血病卵巢癌、卵巢腺癌、胰腺癌、***腺癌、横纹肌肉瘤、肾细胞癌、肉瘤、子宫肉瘤、鳞状细胞癌、膀胱鳞状细胞癌、头颈癌、和/或移行细胞癌)。在一些实施方案中，该方法是体外方法或体内方法。在一些实施方案中，使用细胞计数EC50、IC50和/或GI50确定式Ⅱ的化合物的抗增殖作用。在一些示例性的实施方案中，EC50为约1E-03(0.001)微摩尔或更低，或介于1E-03(0.001)和7.17E-05(0.0000717)微摩尔之间，和或至少约10％的雷帕霉素的量。在一些示例性的实施方案中，细胞计数IC50为约1E-01(0.1)微摩尔或更低，或约1E-01(0.1)至约2.97E-04(0.000297)微摩尔，和/或至少约10％的雷帕霉素的量。在一些示例性的实施方案中，细胞计数GI50为1E-02(0.01)微摩尔，介于1E-02(0.01)和约8.72E-04微摩尔之间，和/或至少约10％的雷帕霉素的量。
在一些实施方案中，本公开还提供了预防和/或治疗癌症的方法，该方法包括向所述哺乳动物(例如人)给予有效量(例如治疗有效量)的式Ⅰ或式Ⅱ的化合物，优选式Ⅱ的化合物、其药学上可接受的盐、其溶剂化物，其酯和/或组合物和/或包括这些物质的混合物。在一些实施方案中，治疗有此需要的哺乳动物的方法包括向所述哺乳动物给予有效量的式Ⅱ的化合物、其药学上可接受的盐、其溶剂化物，其酯或其混合物和/或包括式Ⅱ的化合物；和/或包括式Ⅱ的组合物(例如治疗有效量)。在一些实施方案中，哺乳动物患有的疾病选自由以下项组成的癌症：(例如但不限于例如血癌、骨癌、实体瘤、腺癌、脑癌、胶质母细胞瘤、乳腺癌、骨髓癌、红白血病、骨肉瘤、结直肠癌、表皮样癌、上皮癌、子宫癌、纤维肉瘤、胃腺癌、肾癌、白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性粒细胞白血病、平滑肌母细胞瘤、肺癌、小细胞肺癌、淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、黑色素瘤、恶性黑色素瘤、神经母细胞瘤、白血病卵巢癌、卵巢腺癌、胰腺癌、***腺癌、横纹肌肉瘤、肾细胞癌、肉瘤、子宫肉瘤、鳞状细胞癌、膀胱鳞状细胞癌、头颈癌、和/或移行细胞癌)、***性红斑狼疮、肺部炎症、和/或是需要预防器官移植排斥或宿主与移植物疾病。在一些实施方案中，式Ⅰ和/或式Ⅱ的化合物作为唯一的活性药剂给药；或者，式Ⅰ和/或式Ⅱ的化合物与一种或多种化学治疗剂、抗癌剂或免疫调节剂和/或放射疗法和/或手术联合给药。在一些实施方案中，给药的途径选自由以下项组成的组：肠胃外、口服、局部、口腔、舌下、透皮、医疗装置、支架、吸入、注射、皮下、肌肉内或静脉内；其中给药包括以单剂或同种剂量或不同剂量的多剂；和/或组合的成员在物理上和/或时间上同时或分开给予。在一些实施方案中，式Ⅰ和/或式Ⅱ的化合物以微珠、片剂、胶囊、溶液或悬浮液的形式提供。在一些实施方案中，本公开提供了式Ⅰ和/或式Ⅰ的化合物在制备预防和/或治疗癌症的药物的用途。在一些实施方案中，该方法包括将约2mg/kg式Ⅱ的化合物给予哺乳动物，以在给药后长达6小时提供在哺乳动物全血中大约350-700ng/mL(例如383-651ng/mL)的平均浓度。在一些实施方案中，该方法包括将约2mg/kg式Ⅱ的化合物给予哺乳动物，以在给药后24小时提供在哺乳动物全血中大约15-50ng/mL(例如15-43.7ng/mL)的平均浓度。在一些实施方案中，该方法包括将约10mg/kg式Ⅱ的化合物给予哺乳动物，以在给药后长达6小时提供在哺乳动物全血中大约600-3500ng/mL(例如657-3323ng/mL)的平均浓度。在一些实施方案中，该方法包括将约10mg/kg式Ⅱ的化合物给予哺乳动物，以在给药后约24小时提供在哺乳动物全血中大约20-150ng/mL(例如21-138ng/mL)的平均浓度。在一些实施方案中，该方法包括将式Ⅱ的化合物给予患有实体瘤的哺乳动物并对哺乳动物进行多次给药，并导致实体瘤体积减少(例如至少约为20％、25％、30％、40％、50％或60％中任何一种)。在一些这样的实施方案中，肿瘤体积的显著减少是由于给予式Ⅱ的化合物连续约8天。在一些实施方案中，将式Ⅱ的化合物给予哺乳动物连续约4天后，肿瘤百分比测量显示出显著降低。在一些实施方案中，例如使用动物模型(例如小鼠)的那些，将式Ⅱ的化合物给予哺乳动物30天，与未治疗的哺乳动物相比，结果表示差异肿瘤百分比为约0.7291，其中95％置信区间约为0.3481至约1.11，由Dunnett的多重比较检验确定调整的P值为0.0001。在一些实施方案中，本公开提供用于预防和/或治疗癌症的试剂盒，其包括至少一种治疗有效量的式Ⅰ和/或式Ⅱ的化合物，以及使用其预防和/或治疗癌症的说明书。
可以使用任何给药方式。在一些实施方案中，化合物、组合物和/或混合物通过施用可植入的医疗装置(例如支架)来进行给药。
在一些实施方案中，本公开还提供制备式Ⅰ的化合物或其药学上可接受的盐的方法，所述方法包括加料起始剂，式(Ⅲ)的外-(1R,2S,4R,5S)-5-羟基双环[2.2.1]庚烷-2-羧化物：
其中X＝H、烷基、钠或钾，给生产雷帕霉素的菌株，该菌株经遗传改变以去除或灭活rapK基因或其同源物。
术语“大约”“近似地”等等，当在数值的列表或范围之前时，独立地参考列表或范围中的每个单独值，就像列表或范围中的每个单独值被该术语紧接在前。该术语意味着该值与其参考的值一样、接近或类似。如本文所用，受试者或宿主或哺乳动物是指个体。受试者可以包括哺乳动物，例如家养动物，例如猫和狗、家畜(例如牛、马、猪、绵羊和山羊)、实验动物(例如小鼠、兔子、大鼠、豚鼠)和鸟类。哺乳动物也可以是灵长类动物或人类。可选的或任选地是指随后描述的事件或情况可以发生或不发生，并且该描述包括发生该事件或情况的实例和不发生的实例。例如，短语任选地组合物可以包括组合是指组合物可以包括不同化合物或分子的组合，或者可以不包括组合，使得该描述包括组合和组合不存在(即组合的个体成员)。术语“组合”或“结合”或“联合”可以指一起进行给药的药剂的物理组合或者在方案中使用两种或更多种药剂(例如，分开地、物理地和/或及时地给药)，用于治疗、预防和/或改善特定疾病。范围在本文中可以表示为从大约一个特定值，和/或到大约另一个特定值。当表达这样的范围时，在另一方面包括从一个特定值和/或到另一个特定值。类似地，当将值表示为近似值时，通过使用大约或近似地的先行词，将理解该特定值形成另一方面。将进一步理解，每个范围的端点相对于另一个端点都是重要的，并且独立于另一个端点。范围(例如90-100％)是指包括范围本身以及范围内的每个独立值，就像每个值被单独列出一样。在整个说明书和随后的权利要求中，除非上下文另有要求，否则“包括”和诸如“包含”和“含有”的变体将被理解为暗示包括所述整体、步骤、整体组或步骤组。但不排除任何其它整体、步骤、整体组或步骤组。本申请中提及的所有参考文献，包括专利和专利申请，均通过引用整体并入本公开。
在以下实施例中进一步描述某些实施方案。这些实施方案仅作为实施例提供，并不旨在以任何方式限制权利要求的范围。
实施例
实施例1
该实施例证明，与美国专利号9,382,266公开的聚酮化合物相比，本发明的聚酮化合物更少选择性地抑制mTORC1和mTORC2。表1中公开了来自该实施例的数据。
A.细胞培养
将PC3细胞维持在F12K培养基中，补充有10％FBS、1％青霉素/链霉素、2mM L-谷氨酰胺，并在37℃、95％空气和5％CO2的气氛下培养。用100nM实施例(Ⅰ)处理细胞24小时，并且在RIPA缓冲液中收获(300nM NaCl、1.0％NP-40、0.5％脱氧胆酸钠、0.1％SDS、50mM Tris(pH8.0)、蛋白酶抑制剂混合物(罗氏)、磷酸酶抑制剂2、3(西格玛)。使用洗涤剂相容的、双缩脲法的(lowry-like)蛋白质测定法(DC蛋白质测定法，伯乐)测定蛋白质浓度。
B.蛋白质印迹分析
通过SDS-PAGE分离等量的蛋白质，并使用英杰公司的Nu-Page***转移至硝酸纤维素膜上。将膜在5％牛奶中封闭1小时，并在以下适当的抗体中孵育过夜：抗rpS6(细胞信号传导#2217)、抗磷酸化rpS6(细胞信号传导#2211)、抗磷酸化Akt(S473)(细胞信号传导#4691)。第二天，将印迹在TBST中洗涤3次，与第二抗体(驴抗兔hrp缀合)孵育2小时，最后在TBST中再洗涤3次。ECL Prime(安马西亚)用于检测感兴趣的蛋白质，ImageJ用于定量印迹。数据在本文表1中报告。该实施例证明了式Ⅱ的聚酮化合物比美国专利号9,382,266中公开的聚酮化合物更少选择性地抑制mTORC1和mTORC2。
实施例2
与为了观察星形孢菌素和雷帕霉素相比，该实施例使用OncoPanelTM细胞增殖试验比较所示的细胞系的增殖的抑制作用，该试验通过高含量荧光成像或生物发光测量癌细胞系对药物治疗的增殖反应。
细胞在RPMI 1640、10％FBS、2mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠或特殊培养基中生长。将细胞接种到384孔板中，并在37℃、5％CO2的潮湿气氛中孵育。在细胞接种后第二天加入化合物。同时，未处理的细胞板在时间零点产生。孵育3天后，固定细胞并且染色以允许细胞核的荧光成像。将化合物(1mM储备溶液)从最高测试浓度(1微摩尔)以半对数步骤连续稀释，并且在10个浓度下测定，最大测定浓度为0.1％DMSO。使用美谷分子仪器公司的ImageXpress Micro XL高含量成像仪进行自动荧光显微术，并且用4X物镜收集图像。使用MetaXpress 5.1.0.41软件获取并且分析16位TIFF图像。
通过掺入的细胞核染料的荧光强度测量细胞增殖。输出指的是相对细胞计数，其中使用以下公式将测量的细胞核强度转换为对照的百分比(POC)：
其中Ix是浓度x处的细胞核强度，并且I0是未处理的载体孔的平均核强度。
使用S形单点剂量反应模型的非线性回归计算细胞反应参数：
其中y是在浓度x下测量的响应，A和B是响应的下限和上限，C是响应中点处的浓度(EC50)，D是Hill Slope(参考文献1)。
通过以下公式，使用时间零点未处理的板来确定试验期间的倍增数：
其中N是测定终点处未处理孔中的细胞数，NT0是化合物添加时的细胞数。
细胞计数IC50是在最大可能响应50％时的测试化合物浓度。EC50是曲线拐点处或有效响应的一半(拟合曲线溶液的参数C)的测试化合物浓度。GI50是将观察到的生长减少一半所需的浓度(曲线最大值和时间零点值之间的中间值)。“细胞计数活性区域”是对曲线上方的积分区域的估算(Barretina,et al.The Cancer Cell Line Encyclopedia enablespredictive modelling of anticancer drug sensitivity.Nature 483:603-607)。细胞计数活性面积值范围为0-10，其中值为0表示在所有浓度下均未抑制增殖，值为10表示在所有浓度下完全抑制增殖。在极少数情况下，可以观察到值<0或>10。在这些情况下，值<0应视为等效于0，而值>10应视为等效于10。使用自定义数据缩减引擎(custom data reductionengine)和基于MathIQ的软件(AIM)执行曲线拟合、计算以及报告生成。表2总结了对测试细胞系的载体背景效应：
表2
使用星形孢菌素、雷帕霉素和式Ⅱ的化合物进行的这些试验的结果显示在表3中表3
下面表4提供了式Ⅱ的化合物对每种细胞系增殖影响的进一步详细分析：
表4
表5提供了关于可用于异种移植物模型的细胞系的数据的总结：
表5
实施例3
该实施例证明，与美国专利号9,382,266中公开的聚酮化合物相比，本发明的聚酮化合物具有意想不到的有利的药代动力学。表6提供了单次灌注静脉内2mg/kg的剂量后雄性斯泼累格·多雷(Sprague Dawley)大鼠中实施例(Ⅰ)的药代动力学参数。
表6
表7提供了单次灌注口服10mg/kg剂量后雄性斯泼累格·多雷大鼠中实施例Ⅰ的药代动力学参数。
表7
该实施例证明式Ⅱ的聚酮化合物除了具有更平衡的TORC1/TORC2选择性外，还具有意想不到的理想药代动力学，包括但不限于高的生物利用度。
实例4
该实施例说明了一种测定本发明化合物的药代动力学和生物利用度的方法。
本领域技术人员将能够使用本领域技术人员已知的体内和体外方法确定本发明的化合物的药代动力学和生物利用度，包括但不限于下文和Gallant-Haidner et al,2000和Trepanier et al,1998及其中的参考文献中描述的那些。化合物的生物利用度由许多因素决定(例如水溶性、细胞膜渗透性、蛋白质结合程度和代谢和稳定性)，每种因素可以通过本文实施例中所述的体外试验确定。本领域技术人员将理解，这些因素中的一种或多种的改善将导致化合物的生物利用度的改善。或者，本发明化合物的生物利用度可以使用如下文更详细描述的体内方法或本文实施例中的方法测量。
为了测量体内的生物利用度，化合物可以以腹膜内(i.p.)或静脉内(i.v.)和口服(p.o.)给予试验动物(例如小鼠或大鼠)，并且定期取血样以检查药物的血浆浓度如何随着时间的推移变化。血浆浓度随时间变化的时间过程使用标准模型可以用于计算化合物的绝对生物利用度百分比。下面描述典型协议的实施例。
例如，给小鼠或大鼠静脉内注射1或3mg/kg的本发明化合物。或者，口服1、5或10mg/kg的本发明化合物。以5分钟、15分钟、1小时、4小时和24小时间隔取血样，并通过LCMS-MS测定样品中本发明化合物的浓度。然后可以使用血浆或全血浓度的时间过程来得出关键参数，例如血浆或血液浓度-时间曲线下的面积(AUC-其与达到全身循环的未改变的药物总量成正比)、最大(峰值)血浆或血药浓度、最大血浆或血药浓度发生的时间(峰值时间)、用于准确测定生物利用度的其它因素包括：化合物的终末半衰期、总体清除率、稳态分布量和F％。然后通过非分隔(non-compartmental)或分隔(compartmental)方法分析这些参数，得到计算的百分比生物利用度，对于这种类型的方法的实施例，参见Gallant-Haidner et al,2000和Trepanier et al,1998及其参考文献。
下面显示的是给予式Ⅱ的化合物后小鼠的全血浓度。将式Ⅱ的化合物以2mg/kg或10mg/kg给予小鼠，并且测定全血中化合物的浓度。使用蛋白质沉淀、液相色谱法(LC)和质谱法(MS/MS)进行这些测定。10μL等份的全血和基质校准标准品分布在96孔板中；包括10μL等分的空白基质作为对照，用于基质空白和对照空白。向每个样品加入10μL水，然后涡旋。除基质空白外，向每个样品加入160ml内标物；160μL70：30的水：乙腈(ACN)加入到基质空白中。然后在>3500rpm下进行5分钟的涡旋。然后将150μL所得上清液转移至新的96孔板中，并且样品在35℃下吹干。然后用90μL的ACN重构所得产物。使用设备进行LC，条件和校准标准显示在表8和9中。
表8
表9
小鼠全血中式Ⅱ的校准标准反算浓度总结
N/A＝不适用 //NR＝未报告
这些分析的结果总结在表10和11中。
表10
表11
AQL：高于定量限的原始值(1000ng/mL)。在重新分析之前稀释样品，但是由于序列错误，将重新注入样品。
如上所示，以2mg/kg或10mg/kg、通过腹膜内途径(IP)、每天一次(QD)给药3天后，式II在全血中表现出足够的浓度。
实施例5
异种移植研究
进行研究以确定式Ⅱ的化合物对雌性裸鼠中U-118MG(HTB-15，人脑胶质母细胞瘤)实体瘤的抗肿瘤功效。在该研究中，建立了晚期皮下异种移植物以评估测试试剂的抗肿瘤活性，从而可以确定活性的临床相关参数。用于评估药物功效的终点是相对肿瘤生长(比较治疗小鼠与对照小鼠的肿瘤)。在这些模型中，监测肿瘤生长，并且一旦肿瘤达到100-300mg的重量范围，通常开始测试试剂的治疗。每周获得两次肿瘤大小和体重以确定毒性和功效。本研究中使用的U-118MG(HTB-15)细胞系是从取自50岁男性高加索人的恶性胶质母细胞瘤中分离的。使用以下参数确定研究终点：肿瘤生长抑制百分比(％TGI)＝100(Wc-Wt)/Wc＝100(1-Wt/Wc)，其中Wc是对照组的中位肿瘤重量，Wt是治疗组的中位肿瘤重量；肿瘤缓解和消退(％REG＝100(W0-Wi)W0，其中W0是治疗开始时治疗组的中位肿瘤重量，Wi是在任何给定时间该组的中位肿瘤重量；log10细胞杀伤＝[T-C值以天/(3.32)(Td)]，其中T-C是肿瘤生长延迟；T＝治疗组肿瘤达到预定大小所需的中位时间(以天计)(即1000mg)和C是对照组达到相同大小的中位时间(以天计)；并且，从这些计算中排除无肿瘤幸存者，其中Td＝对照组的中位肿瘤倍增时间(以天计)。
在研究开始时(第1天)(Envigo，印第安纳波利斯，IN)，雌性无胸腺裸的Foxn1nu小鼠(5-6周龄，体重约19-23克(平均约21g))通过尾部纹身鉴定并且在力特光电(Optimax)的聚碳酸酯笼中分开饲养(每个笼5只)，该笼具有聚碳酸酯顶部、辐照过的玉米芯垫、悬浮食物和水瓶。在驯化和研究期间，将动物饲养在实验室环境中，温度范围为67-76℉，相对湿度为30％-70％。自动定时器提供12小时光照和12小时黑暗。允许动物随意接近无菌的HarlanTeklad Rodent Chow和pH 3.0的无菌水。U-118MG(HTB-15)肿瘤细胞在组织培养物中生长并扩增，以在小鼠侧腹皮下地(SC)在无血清生长培养基中植入3×106个细胞。每天监测肿瘤生长。当计算的肿瘤体积达到约100-300mm3(或100-300mg)时，将荷瘤小鼠称重并且随机分成治疗组。随机化(研究第1天)后开始治疗，并按指示继续治疗(每组10只小鼠，QD，10ml/kg，载体对照或式Ⅱ以10mg/kg(以2％乙醇、40％聚乙二醇400(PEG 400)和58％盐水作为悬浮液(通过首先将化合物溶解在2％乙醇中，然后加入PEG和盐水制备)；每两周制备一次悬浮液，并在使用期间-20℃冷冻)。每周测量两次肿瘤生长和体重，每天观察动物的毒性和肿瘤溃疡的迹象。使用游标卡尺沿长度和宽度进行肿瘤的测量，并且使用以下公式计算肿瘤体积：(L×W2)/2。使用单因素方差分析(ANOVA)和Dunnett多重比较事后分析，将肿瘤体积(绝对值和基线百分比)和体重测量值与载体对照进行比较。显著性设定为p≤0.05。在第16天和第30天从第2-4组的动物1-5中收集血样。在第16天给药前和第30天给药24小时后，在(低谷水平)通过眼眶后抽血收集全血(K2EDTA，50μl/小鼠)，并且在-80℃冷冻保存。在预定的研究终止日期(治疗开始后30天)后，动物保持存活，继续称重和肿瘤测量，以评估可能的载体对肿瘤生长的影响。
皮下(SC)植入肿瘤的小鼠在第1-29天通过腹膜内(IP)途径以载体(2％乙醇(EtOH(西格玛)/40％PEG 400(西格玛)/58％盐水(VetPath))或式Ⅱ的化合物(10mg/kg)每日(QD)给药。如上所述每周测量两次肿瘤生长和体重，并且每天观察动物的毒性和肿瘤溃疡的迹象。功效评估基于治疗后的疾病进展(持久性治愈)、肿瘤体积和体重测量。
如表12中总结，给予载体对照或式Ⅱ的化合物30天后体重没有显著差异。一个观察到的差异是利用式Ⅱ的化合物治疗的动物获得了平均3.13％的体重，而载体对照仅为2.26％。
表12
表13-19和图7A-D中示出的数据显示了式Ⅱ的化合物的给药有效减少U118肿瘤的生长，对肿瘤体积的影响表示为早在治疗第4天观察到的基线百分比以及早在第8天观察到的对平均肿瘤体积的影响。数据在表13-19和图7A-D中示出。
表13
表14
表15
表16
表17
表18
统计分析总结(肿瘤体积)
表19
统计分析总结(肿瘤百分比)
如表13-19和图7A-7D所示，与给予载体对照相比，式Ⅱ的化合物在30天试验期内显著减少U188异种移植模型中的肿瘤生长，并且早在给予式Ⅱ后4天显示出效果(每天一次(QD)腹膜内(IP)给药)。载体对照小鼠的肿瘤大小在第11天增加，然后一般地在第30天保持181-205mm3的平均范围(从基线增加139-157％)。与载体对照相比，式Ⅱ的化合物处理的小鼠中肿瘤体积的基线百分比(第1天)在4-30天内显著减少。因此，通过评估随时间的肿瘤大小确定了利用式Ⅱ的化合物的治疗对雌性裸鼠中的U-118MG实体瘤生长显示出显著的抑制作用。利用载体对照或式Ⅱ处理的动物在30天的存活率为100％。
实施例6
该实施例说明了制备式Ⅱ的聚酮化合物的一种方法。
投料的起始剂外-(1R,2S,4R,5S)-5-羟基双环[2.2.1]庚烷-2-羧化物为
在28℃下，将吸水链霉菌BIOT-4010或MG2-10培养在培养基1琼脂平板(见下文)上。孢子储备溶液在培养基1上生长后制备，保存在20％w/v甘油：10％w/v乳糖的蒸馏水中，并储存在-80℃。在250mL烧瓶中，将0.1mL冷冻储备溶液接种至50mL培养基2(见下文)中，制备营养培养物。将培养物在28℃、300rpm下孵育36-48小时。
A.生产方法
将营养培养物以2.5-5％v/v接种至培养基3中。在26℃、300rpm下培养6-7天。
B.投料步骤
在孵育后24-48小时进行式Ⅲ的投料/添加，除非另有说明，否则以1-2mM的终浓度投料。
培养基1
然后对该培养基进行121℃高压灭菌20分钟。
MD6培养基(小型发酵培养基)
用1M的NaOH将pH校正至6.0
在灭菌之前，将0.4mL的西格玛的α-淀粉酶(BAN 250)加入1L培养基中。将培养基在121℃下灭菌20分钟。灭菌后，每7mL加入0.35mL无菌的40％果糖和0.10mL L-赖氨酸(140mg/mL水溶液，过滤除菌)。
RapV7种子培养基
用1M的NaOH调整pH至7.5。
然后培养基在121℃高压灭菌20分钟。高压灭菌后加入d-葡萄糖(至10g/L)。
MD6培养基(小型发酵培养基)
调节培养基至pH6.0，加入0.4mL/Lα-淀粉酶(西格玛的A7595-液体，>250单位/g)并且培养基在121℃灭菌30分钟。高压灭菌后加入d-果糖(至20g/L)和l-赖氨酸(盐酸盐)(至2g/L)。
MD6/5-1培养基(中型发酵培养基)
培养基在121℃灭菌30分钟。灭菌后，每升加入15g果糖。48小时后，加入0.5g/L的L-赖氨酸。
实施例7
分析方法
分析方法A
注射量：0.005-0.1mL(根据灵敏度的要求)。HPLC在安捷伦的“液相色谱柱”“快速分离”盒SB C8上进行，3微米、30mm×2.1mm，运行流动相：
流动相A：纯水中0.01％的甲酸
流动相B：乙腈中0.01％的甲酸
流速：1mL/分钟。
使用线性梯度，从0分钟5％B至2.5分钟95％B，保持95％B直至4分钟，回到5％B直至下一个循环。使用液相色谱质谱联用仪(Micromass Quattro-Micro instrument)，通过254nm处的UV吸光度和/或通过质谱法电喷雾电离(正或负)进行检测。
分析方法B
注射量：0.02mL。HPLC在3微米的BDS C18 Hypersil(ThermoHypersil-KeystoneLtd)柱上进行，150×4.6mm，保持在50℃，运行流动相：
流动相A：用去离子水将乙腈(100mL)、三氟乙酸(1mL)、1M乙酸铵(10mL)配制成1L。
流动相B：用乙腈将去离子水(100mL)、三氟乙酸(1mL)、1M乙酸铵(10mL)配制成1L。
流速：1mL/分钟。
在10分钟内使用55％B-95％B的线性梯度，随后2分钟的95％B，0.5分钟达到55％B，再2.5分钟的55％B。化合物的检测通过280nm的UV吸光度测定。
分析方法C
HPLC***包括安捷伦HP1100，并在3微米的BDS C18 Hypersil(ThermoHypersil-Keystone Ltd)柱上进行，150×4.6mm，保持在40℃，运行流动相：
流动相A：去离子水。
流动相B：乙腈。
流速：1mL/分钟。
该***与布鲁克·道尔顿公司(Bruker Daltonics)的Esquire3000电喷雾质谱仪耦合。在500至1000道尔顿的扫描范围内使用正负切换。
在10分钟内使用55％B-95％B的线性梯度，随后2分钟的95％B，0.5分钟达到55％B，再2.5分钟的55％B。
分析方法D
注射量：0.025mL。HPLC在3微米Gemini NX C18(菲罗门(Phenomenex))柱上进行，150×4.6mm，保持在50℃，运行流动相：
流动相A：去离子水与甲酸(0.1％)
流动相B：乙腈与甲酸(0.1％)
流速：1mL/分钟。
在10分钟内使用55％B-95％B的线性梯度，随后2分钟的95％B，0.5分钟达到55％B，再2.5分钟的55％B。化合物的检测通过280nm的UV吸光度测定。
分析方法E
流动相A 10mM乙酸铵/水
流动相B ACN
柱FluoroSep-RP Phenyl HS，50×2.1mm，5□m
柱温温度环境
自动进样器针头洗涤溶液0.5％甲酸、10％ACN/水
注射量0.012ml
自动进样器温度10℃
WYE-126657保留时间3.8分钟。
IS(WAY-130779)保留时间3.8分钟。
总运行时间6.7分钟。
梯度程序
质谱条件
Sciex API 4000(序列号：V09300509)Batman
实验：MRM(多反应监测)
*(M+NH4)+是母离子。
实施例8
吸水链霉菌BIOT-4010或MG2-10的产生
对于产生吸水链霉菌MG2-10的方法，参见WO 2004/007709(US 2005/0272132A1)中的实施例2。该菌株可以用于代替BIOT-4010，以在转化后产生式Ⅱ的化合物，该转化使用标准方案，利用表达rapIJMNOL的载体，例如pLL158(WO2006/016167(US 2009/0253732A1)，Gregory et al.,2012)。
BIOT-3410是生产雷帕霉素的吸水链霉菌NRRL5491菌株的高产衍生物，通过诱变和选择高产变体产生，并且BIOT-4010是BIOT-3410的突变体，其中，使用与吸水链霉菌MG2-10描述的类似方法，BIOT-3410的rapK已被特异性删除。因此，BIOT-4010是基于所选菌株、更高产量的吸水链霉菌MG2-10的变体。然而，吸水链霉菌NRRL5491自身或衍生物可用于产生能够生产本发明化合物的菌株。
天然存在的Mfel/位点在rapK的5’末端附近存在。产生上游和下游同源区域以进行集成，来自pR19的7.3kbp NcoI片段(Schwecke et al.,1995)已被克隆到已经利用Nco I消化并且去磷酸化的plitmus28，并且来自粘粒-2的4.2kbp Nhei/Pst I片段(Schwecke etal.,1995)克隆到利用Pstl-SpeI消化的plitmus28中。这分别得到中间质粒plitmus28-7.3和plitmus28-4.2。为了将所需的缺失从Mfel位点引入rapK的内部位点，使用两个寡核苷酸扩增所需区域，BioSG159：5’-CCCCAATTGGTGTCGCTCGAGAACATCGCCCGGGTGA-3’/(序列号：1)和使用质粒pR19作为模板的BioSG 158：5’-CGCCGCAAGTAGCACCGCTCGGCGAAGATCTCCTGG-3’(序列号：2)(Schwecke 1995)。将得到的1.5kbp PCR产物用T4多核苷酸激酶处理，并且克隆到已经利用EcoRV消化并且去磷酸化的plitmus28中，并且对克隆的PCR产物进行测序。切离该质粒的1.5kbp Mfei-Bg/11片段，用于替换plitmus28-4.2的2.3kbp Mfei-Bg/11片段。为了完成构建体，将该质粒的3.3kbp Mfei-HindIII片段连接到同样经过消化的plitmus28-7.3中。最后，将缺失构建体作为HindIII/XbaI片段转移到缀合的链霉菌载体pKC 1132(Bierman et al.,1992)中。最终的构建体命名为pSG3998。
通过电穿孔将质粒pSG3998转化到大肠杆菌ET12567：pUZ8002中，并在含有阿泊拉霉素(0.050mg/mL)、卡那霉素(0.025mg/mL)和氯霉素(0.0125mg/mL)的2TY平板上进行选择，平板在30℃孵育过夜。菌落接种到含有相同抗生素的液体2TY培养基(4mL)中，并且在30℃和250rpm孵育过夜。大约0.8mL过夜培养物接种到含有相同抗生素的2TY(10mL)，并且在30℃和250rpm孵育直至它们达到OD-O.5(595nm)。将培养物以4000rpm离心，用2TY洗涤两次，并且将得到的细胞沉淀重悬于2TY(0.25mL)中。将BIOT-3401的孢子解冻，并且通过离心(4000rpm)沉淀，并且用2TY(1mL)洗涤，然后悬浮于2TY(1mL)中。然后将孢子在50℃下暴露以热休克10分钟，然后立即置于冰上。每次缀合使用大约100μL孢子储备溶液，并且加入2TY(0.150mL)以将体积调整至0.25mL。通过将0.25mL经过洗涤的大肠杆菌细胞与调整过的BIOT-3401孢子储备溶液混合，并且立即涂布在干燥的R6平板上进行缀合。将板短暂干燥，用保鲜膜包裹并在37℃下孵育2-3小时。然后将每个板用含有萘啶酸(0.015mL 50mg/L溶液)的无菌水(1mL)覆盖，干燥并且在37℃下孵育过夜。然后将板用含有阿泊拉霉素(0.015mL的100mg/L溶液)的无菌水(1mL)覆盖，并且在37℃下孵育。在4-7天后出现前缀合物菌落(ex-conjugate colonie)，并且将其挑选至含有阿泊拉霉素(0.050mg/mL)和萘啶酸(0.025mg/mL)的培养基1平板上，37℃下孵育3-4天，然后重新修补至含有阿泊拉霉素(0.050mg/mL)和萘啶酸(0.025mg/mL)的培养基1平板中。然后在没有抗生素的培养基1平板上重复该修补过程三轮，在37℃孵育直至可见良好生长。然后将斑块转移至培养基1平板中，并且在28℃孵育以促进孢子形成(～7-10天)。收获孢子，通过棉绒过滤并且制备稀释系列。将等分(100μL)的稀释系列接种到培养基1平板上，并且在28℃孵育直至菌落上可见孢子。将菌落平行修补至含有和不含有阿泊拉霉素(0.050mg/mL)的平板中。然后培养代表候选二次重组体的阿泊拉霉素敏感菌落，以评估雷帕霉素的生产。在24小时后，通过往生产培养基中添加外源的反式-4-羟基CHCA进一步测试非生产者，以确认雷帕霉素类似物诱变合成(rapalog mutasynthetic)的生产并且验证所需的rapK破坏。
实施例9
式Ⅱ的发酵和分离
液体培养(小型)
使用BIOT-4010的塞子将RapV7种子培养基(7mL)接种至塞有泡沫塞的Falcon管(50mL)中，并且在28℃和300rpm(2.5cm投掷)下培养48小时。使用宽口吸头将该种子培养物(0.5mL)接种至MD6生产培养基(7mL)中，并且在26℃和300rpm(2.5cm投掷)下发酵6天。在生产培养基中生长24小时后加入式Ⅲ。饲料可以制备为在甲醇中的0.32M储备溶液，并且向每个管加入0.050mL以使最终浓度为2mM。
发酵(制备)
种子条件
发酵条件
提取和纯化
离心澄清发酵液(3000rpm，30min)，如果总物质含量低于5％则弃去上清液。将细胞糊悬浮于乙腈(2体积)并且在室温下搅拌1小时。将所得浆液离心分离并且将上清液倾析。重复该过程，合并上清液，并且在40℃减压下去除乙腈。将所得含水浆液用等体积的乙酸乙酯萃取两次，合并有机部分并且在40℃减压下去除溶剂。分析所得粗提取物的37R-羟基降冰片基雷帕霉素含量，并且在色谱分离之前于4℃储存。
将粗提物溶解于甲醇：水(80：20；200-300mL)中，用等体积的己烷萃取两次。保留甲醇：水相，并且在40℃减压下去除溶剂，得到粘性液体残余物。该物质经快速硅胶(25×5cm柱)色谱分离，先用氯仿(1L)洗脱，然后用1L的1％、2％和3％甲醇的氯仿溶液洗脱。取出～250mL的级分并通过HPLC分析。从含有BC319的级分中去除溶剂，得到固体残余物。将其用快速硅胶(20×2.5cm柱)进一步色谱分离，利用乙酸乙酯：己烷(1：1)洗脱。取～200mL的级分并且通过HPLC分析。合并含有相当于投料原料的峰的级分，去除溶剂得到固体残余物。将其在反相硅胶(Waters XTerra C18-ODS2、10微米粒径、19×250mm)上进行色谱分离，利用水(A)和乙腈(B)的梯度洗脱，流速为21mL/分钟：T＝0分钟，50％B；T＝25分钟，100％B。合并含有相当于投料原料的峰的级分，真空去除溶剂，得到式Ⅰ的化合物。
虽然已经根据优选实施方式描述了某些实施方式，但是应该理解，本领域技术人员将想到变化和修改。因此，所附权利要求旨在覆盖落入所附权利要求范围内的所有这些等同变化。

Claims (34)

1.式Ⅰ的化合物：
其中：
R选自氢、或-C(O)(CR3R4)b(CR5R6)d(CR7R8R9)；
R3和R4各自独立地为氢、C1至C6烷基、C2至C8烯基、C2至C8炔基、三卤甲基或-F；
R5和R6各自独立地为氢、C1至C6烷基、C2至C8烯基、C2至C8炔基、-(CR3R4)fOR10、-CF3、-F或CO2R11；
R7为氢、C1至C6烷基、C2至C8烯基、C2至C8炔基、-(CR3R4)fOR10、-CF3、-F或CO2R11；
R8和R9各自独立地为氢、C1至C6烷基、C2至C8烯基、C2至C8炔基、-(CR3R4)fOR10、-CF3、-F或CO2R11、或R8和R9可以一起形成X或3-8个碳原子的环烷基环，所述环烷基环任选地被-(CR3R4)fOR10单、二或三取代；
R10为氢、C1至C6烷基、C2至C8烯基、C2至C8炔基、三-(C1至C6烷基)甲硅烷基、三-(C1至C6烷基)甲硅烷基乙基、三苯基甲基、苄基、C2至C8烷氧基甲基、三-(C1至C6烷基)甲硅烷基乙氧基甲基、氯乙基或四氢吡喃基；
R11为氢、C1至C6烷基、C2至C8烯基、C2至C8炔基或C7至C10苯基烷基；
X为5-(2,2-二-(C1至C6烷基)[1,3]二恶烷基、5-(2,2-二-(C3至C8环烷基)[1,3]二恶烷基、4-(2,2-二-(C1至C6烷基)[1,3]二恶烷基、4-(2,2-二-(C3至C8环烷基)[1,3]二恶烷基、4-(2,2-二-(C1至C6)烷基)[1,3]二氧戊环基、或4-(2,2-二-(C3至C8环烷基)[1,3]二氧戊环基；
b是从0到6的整数；
d是0到6的整数；和，
f是从0到6的整数；和/或
其药学上可接受的盐、溶剂化物、酯或混合物。
2.根据权利要求1所述的化合物和/或药学上可接受的盐、溶剂化物、酯或混合物，其中R包括至少一个选自H、-(CR3R4)fOR10、X或-(CR3R4)fOR10取代的C3至C8环烷基的部分。
3.一种组合物，包括权利要求1或2所述的化合物、药学上可接受的盐、溶剂化物、酯或混合物。
4.根据权利要求3所述的组合物，还包括药学上可接受的载体。
5.式Ⅱ的化合物：
和/或其药学上可接受的盐、溶剂化物、酯或混合物。
6.一种组合物，包括权利要求5所述的化合物、药学上可接受的盐、溶剂化物、酯或混合物。
7.根据权利要求6所述的组合物，还包括药学上可接受的载体。
8.一种组合物，包括约70％或更多的化合物，所述化合物选自由以下化合物组成的组：式(Ⅱ)的化合物，
式(Ⅰ)的化合物其药学上可接受的盐、其溶剂化物、其酯以及前述的混合物。
9.根据权利要求8所述的组合物，其中所述组合物包括约90％或更多的化合物，所述化合物选自由以下化合物组成的组：式(Ⅰ)的化合物、式(Ⅱ)的化合物的药学上可接受的盐和溶剂化物以及前述的混合物。
10.根据权利要求8所述的组合物，其中所述组合物包括基本上纯的化合物的混合物，所述化合物选自由以下化合物组成的组：式(Ⅱ)的化合物、式(Ⅰ)的化合物的药学上可接受的盐、溶剂化物和酯以及前述的混合物。
11.一种药物组合物，包括药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂和一种或多种聚酮化合物，其中如果存在一种聚酮化合物，则其为式(Ⅱ)的聚酮化合物，并且其中如果组合物中存在多于一种的聚酮化合物，则式Ⅱ的聚酮化合物占到药物组合物中的聚酮组分的至少约70％：
其中式Ⅱ的化合物的药学上可接受的盐、溶剂化物和/或水合物占到药物组合物中的聚酮组分的至少70％。
12.根据权利要求11所述的药物组合物，其中所述式Ⅱ的化合物的量为药物组合物中的聚酮组分的至少80％。
13.根据权利要求11所述的药物组合物，其中所述式Ⅱ的化合物的量为药物组合物中的聚酮组分的至少90％。
14.根据权利要求11所述的药物组合物，其中所述式Ⅱ的化合物的量为药物组合物中的聚酮组分的至少95％。
15.根据权利要求11所述的药物组合物，其中所述式Ⅱ的化合物的量为药物组合物中的聚酮组分的至少98％。
16.根据权利要求11所述的药物组合物，其中所述式Ⅱ的化合物基本上是药物组合物中的唯一的聚酮。
17.前述权利要求中任一项所述的组合物，其中如果存在溶剂化物的话，其是水合物。
18.前述权利要求中任一项所述的组合物，其中所述组合物是或者包括微珠、片剂、胶囊、溶液或悬浮液。
19.一种抑制细胞增殖的方法，所述方法包括使所述细胞与抗增殖量的前述权利要求中任一项所述的化合物、其药学上可接受的盐、其溶剂化物、其酯或其混合物；和/或前述权利要求中任一项所述的组合物接触。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述细胞是人细胞。
21.根据权利要求19或20所述的方法，其中所述细胞是人癌细胞。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述人癌细胞选自由以下组成的组：血癌、骨癌、实体瘤、腺癌、脑癌、胶质母细胞瘤、乳腺癌、骨髓癌、红白血病、骨肉瘤、结直肠癌、表皮样癌、上皮癌、子宫癌、纤维肉瘤、胃腺癌、肾癌、白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性粒细胞白血病、平滑肌母细胞瘤、肺癌、小细胞肺癌、淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、黑色素瘤、恶性黑色素瘤、神经母细胞瘤、白血病卵巢癌、卵巢腺癌、胰腺癌、***腺癌、横纹肌肉瘤、肾细胞癌、肉瘤、子宫肉瘤、鳞状细胞癌、膀胱鳞状细胞癌、头颈癌和移行细胞癌。
23.根据权利要求19-22中任一项所述的方法，其中所述方法是体外方法。
24.根据权利要求19-22中任一项所述的方法，其中所述方法是体内方法。
25.一种治疗患有疾病的哺乳动物的方法，所述方法包括给予所述哺乳动物有效量的式Ⅱ的化合物、其药学上可接受的盐、其溶剂化物、其酯，或其混合物和/或包括式Ⅱ的化合物；和/或包括式Ⅱ的组合物。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
27.根据权利要求25或26所述的方法，其中所述疾病是癌症，并且所述癌症选自由以下组成的组：血癌、骨癌、实体瘤，腺癌、脑癌、胶质母细胞瘤、乳腺癌、骨髓癌、红白血病、骨肉瘤、结肠直肠癌、表皮样癌、上皮癌、子宫癌、纤维肉瘤、胃腺癌、肾癌、白血病、急性淋巴细胞白血病、慢性粒细胞白血病、平滑肌母细胞瘤、肺癌、小细胞肺癌、淋巴瘤、B细胞淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、T细胞淋巴瘤、黑色素瘤、恶性黑色素瘤、神经母细胞瘤、白血病卵巢癌、卵巢腺癌、胰腺癌、***腺癌、横纹肌肉瘤、肾细胞癌、肉瘤、子宫肉瘤、鳞状细胞癌、膀胱鳞状细胞癌、头颈癌和移行细胞癌。
28.根据权利要求25-27中任一项所述的方法，其中所述式Ⅰ和/或式Ⅱ的化合物作为唯一的活性药剂进行给药；或者，所述式Ⅰ和/或式Ⅱ的化合物与一种或多种化学治疗剂、抗癌剂或免疫调节剂；和/或放射疗法和/或手术进行联合给药。
29.根据权利要求25所述的方法，其中所述哺乳动物需要预防器官移植排斥或宿主与移植物疾病。
30.根据权利要求25-29中任一项所述的方法，其中所述给药是通过选自由以下组成的组的途径进行：肠胃外、口服、局部、口腔、舌下、透皮、医疗器械、支架、吸入、注射、皮下、肌肉内或静脉内；其中给药包括以单剂或同样或不同剂量的多剂；和/或组合的成员在物理上和/或时间上同时或分开进行给药。
31.根据权利要求25-30中任一项所述的方法，其中式Ⅰ和/或式Ⅱ的化合物以微珠、片剂、胶囊、溶液或悬浮液的形式提供。
32.一种制备权利要求1、2、5、或55所述的式(Ⅰ)的化合物或其药学上可接受的盐的方法，所述方法包括投料起始剂式(Ⅲ)的外-(1R,2S,4R,5S)-5-羟基双环[2.2.1]庚烷-2-羧化物：
其中X＝H、烷基、钠或钾，给生产雷帕霉素的菌株，所述菌株经遗传改变去除或灭活rapK基因或其同源物。
33.一种式Ⅱ的前药，其中所述前药是式Ⅰ的聚酮化合物，
R选自H、或-C(O)(CR3R4)b(CR5R6)d(CR7R8R9)；
R3和R4各自独立地为氢、C1至C6烷基、C2至C8烯基、C2至C8炔基、三卤甲基或-F；
R5和R6各自独立地为氢、C1至C6烷基、C2至C8烯基、C2至C8炔基、-(CR3R4)fOR10、-CF3、-F或CO2R11；
R7为氢、C1至C6烷基、C2至C8烯基、C2至C8炔基、-(CR3R4)fOR10、-CF3、-F或CO2R11；
R8和R9各自独立地为氢、C1至C6烷基、C2至C8烯基、C2至C8炔基、-(CR3R4)fOR10、-CF3、-F或CO2R11、或R8和R9可以一起形成X或3-8个碳原子的环烷基环，所述环烷基环任选地被-(CR3R4)fOR10单、二或三取代；
R10为氢、C1至C6烷基、C2至C8烯基、C2至C8炔基、三-(C1至C6烷基)甲硅烷基、三-(C1至C6烷基)甲硅烷基乙基、三苯基甲基、苄基、C2至C8烷氧基甲基、三-(C1至C6烷基)甲硅烷基乙氧基甲基、氯乙基或四氢吡喃基；
R11为氢、C1至C6烷基、C2至C8烯基、C2至C8炔基或C7至C10苯基烷基；
X为5-(2,2-二-(C1至C6烷基)[1,3]二恶烷基、5-(2,2-二-(C3至C8环烷基)[1,3]二恶烷基、4-(2,2-二-(C1至C6烷基)[1,3]二恶烷基、4-(2,2-二-(C3至C8环烷基)[1,3]二恶烷基、4-(2,2-二-(C1至C6)烷基)[1,3]二氧戊环基、或4-(2,2-二-(C3至C8环烷基)[1,3]二氧戊环基；
b是从0到6的整数；
d是0到6的整数；和，
f是从0到6的整数；和/或
其药学上可接受的盐、溶剂化物、酯或混合物。
34.前述权利要求中任一项所述的组合物或方法，其中式Ⅰ的前药由式Ⅱ的聚酮代替。
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