CN110592002A

CN110592002A - 一种用于单细胞测序的膀胱尿路上皮单细胞悬液的制备方法及应用

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Publication number: CN110592002A
Application number: CN201910959271.2A
Authority: CN
Inventors: 史本康; 刘亚骁; 李岩
Original assignee: Qilu Hospital of Shandong University
Current assignee: Qilu Hospital of Shandong University
Priority date: 2019-10-10
Filing date: 2019-10-10
Publication date: 2019-12-20
Anticipated expiration: 2039-10-10
Also published as: CN110592002B

Abstract

本发明提供一种用于单细胞测序的膀胱尿路上皮单细胞悬液的制备方法，属于生物医学技术领域。本发明所述制备方法包括将处死后的动物进行全身血液灌注，将采集到的膀胱进行孵育、酶解消化即获得单细胞悬浮液。本发明制备得到膀胱尿路上皮单细胞悬液在保证细胞质量的同时，还可一次性获得大量分离的尿路上皮细胞。另外，本发明所述方法不需要高度专业化的设备、试剂或技能，便于研究人员进行操作，因此具有良好的实际应用之价值。

Description

一种用于单细胞测序的膀胱尿路上皮单细胞悬液的制备方法及应用

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种用于单细胞测序的膀胱尿路上皮单细胞悬液的制备方法及应用。

背景技术

本发明背景技术中公开的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

哺乳动物的膀胱就像一个空心球体，由尿路上皮、固有层、逼尿肌和浆膜组成(图1A)。尿路上皮是一种特殊的层状上皮，至少由伞状细胞、中间细胞和基底细胞三种细胞类型组成(图1B)。这些细胞通过产生和维持结晶体斑块而充当尿路屏障。不同的细胞类型可以用特定的标记物来区分。Krt20标志着成熟的伞细胞，也同时表达UpkⅠa、UpkⅠb、UpkⅡ、UpkⅢa和UpkⅢb。基底细胞包括krt5标记的基底细胞和krt14标记的基底细胞，不表达Krt20和Upk。中间细胞表达Upk，不表达Krt20和Krt5(图1C)。

近年来，基于微流体的单细胞测序技术已被成功地用于了解一些正常组织中的复杂亚群及癌症。这项技术允许在单个细胞水平上研究分子差异并重建谱系层次结构，使相关研究人员能够解决有关尿路上皮细胞类型和亚型生物学的基本问题。然而由于单细胞测序需要大量的分离的、活性高(存活率90％以上)的细胞，因此，目前大多数研究尿路上皮细胞的方法，无论是分离新鲜细胞还是获得原代培养细胞，都不适合用于单细胞测序。

发明内容

针对现有技术中的不足，本发明提供一种用于单细胞测序的膀胱尿路上皮单细胞悬液的制备方法及应用。本发明所述方法可以在保证细胞质量的同时，一次性获得大量分离的尿路上皮细胞。此外，这种方法不需要高度专业化的设备、试剂或技能，因此具有良好的实际应用之价值。

本发明的第一个方面，提供一种用于单细胞测序的膀胱尿路上皮单细胞悬液的制备方法，所述制备方法包括将处死后的动物进行全身血液灌注，从而有利于后续获得纯粹的膀胱上皮细胞，将采集到的膀胱进行孵育、酶解消化即获得单细胞悬浮液。

其中，所述全身血液灌注具体方法包括向动物左心室内注入D-PBS溶液，D-PBS溶液进入体循环后，肝脏颜色由深变浅；当血液从右心耳流出时，打开左心耳，继续注入D-PBS溶液，直至肺完全变白或接近完全变白；观察到膀胱褪色则全身血液灌注成功。由于来自血液细胞的蛋白质会污染尿路上皮的RNA或蛋白质，因此为了获得纯粹的膀胱上皮细胞，本发明采用动物全身血液灌注方法，而非选择红细胞裂解液来消除红细胞的干扰。

其中，所述动物包括哺乳动物，进一步包括啮齿动物，所述啮齿动物包括但不限于小鼠、大鼠、地鼠和豚鼠，进一步优选为小鼠。

所述膀胱孵育、酶解消化具体方法为：

S1、将采集并处理后的膀胱使用dispase II溶液进行孵育处理；然后使用PBS-EDTA溶液冲洗2～3次；

S2、使用PBS-EDTA溶液孵育经步骤S1处理后的膀胱；

S3、收集步骤S2中的孵育处理后的PBS-EDTA溶液，离心，取上清液加入胰蛋白酶消化细胞。

本发明的第二个方面，提供上述制备方法制备得到的膀胱尿路上皮单细胞悬液。采用本发明制备方法得到的膀胱尿路上皮单细胞悬液，其中膀胱尿路上皮单细胞活性高，品质好，且细胞分离度较高，有利于进行单细胞测序。

本发明的第三个方面，提供上述制备方法和/或上述膀胱尿路上皮单细胞悬液在单细胞测序中的应用。

本发明的有益技术效果：

本发明首次提供一种用于单细胞测序的膀胱尿路上皮单细胞悬液制备方法。本发明所述方法制备得到膀胱尿路上皮单细胞悬液在保证细胞质量的同时，还可一次性获得大量分离的尿路上皮细胞。另外，本发明所述方法不需要高度专业化的设备、试剂或技能，便于研究人员进行操作，因此具有良好的实际应用之价值。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为膀胱层次结构及膀胱上皮代表性标志相关图；其中，图1A为H&E染色小鼠膀胱横断面图；100x图中粘膜由尿路上皮和固有层组成(边界用虚线表示)；200x图中虚线表示逼尿肌-粘膜边界；图1B为尿路上皮的细胞分层示意图；图1C表示小鼠尿路上皮包含两个基底层细胞亚群(Krt5和Krt14基底层细胞)、单层中间细胞和伞状细胞；其中，较小数量的Krt14基底细胞可以共表达Krt5。Krt20标志着成熟的伞细胞，同时也表达UpkⅠa、UpkⅠb、UpkⅡ、UpkⅢa和UpkⅢb；中间细胞表达UpkⅠa、UpkⅠb、UpkⅡ、UpkⅢa和UpkⅢb，同时显示检测不到Krt5、Krt20的表达。

图2为本发明实施例中膀胱尿路上皮单细胞悬液的制备方法相关步骤演示图，其中，图2A为Sylgard胶板演示图；图2B为膀胱褪色(右)标志着血液灌注成功图；图2C为膀胱内腔暴露的演示图；图2D为膀胱固定在胶板上的演示图；图2E为拉伸膀胱演示图；图2F为膀胱置于摇床晃动演示图。

图3为本发明实施例1制备得到的膀胱尿路上皮单细胞悬液细胞形态及活性相关图，其中，图3A为用血细胞计数板计数细胞数量图；图3B为台盼蓝染色图；

图3C为Calcein-am/PI染色图。

图4为使用为本发明实施例1制备得到的膀胱尿路上皮单细胞悬液细胞进行单细胞测序分析膀胱上皮特异性标志物的表达情况图，其中图4A为使用SingleR提供的参考数据集方法对细胞进行识别，t-sne分析显示上皮细胞为测序细胞的主要细胞类型图；图4B为Krt20的表达图；图4C为Krt5和Krt14的表达图；图4D为UpkⅠa、UpkⅠb、UpkⅡ、UpkⅢa和UpkⅢb的表达图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

现结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

如前所述，由于单细胞测序需要大量的分离的、活性高(存活率90％以上)的细胞，因此，目前大多数研究尿路上皮细胞的方法，无论是分离新鲜细胞还是获得原代培养细胞，都不适合用于单细胞测序。

有鉴于此，本发明的一个具体实施方式中，提供一种用于单细胞测序的膀胱尿路上皮单细胞悬液的制备方法，所述制备方法包括将处死后的动物进行全身血液灌注，从而有利于后续获得纯粹的膀胱上皮细胞，将采集到的膀胱进行孵育、酶解消化即获得单细胞悬浮液。

本发明的又一具体实施方式中，所述动物包括哺乳动物，进一步包括啮齿动物，所述啮齿动物包括但不限于小鼠、大鼠、地鼠和豚鼠，进一步优选为小鼠。

本发明的又一具体实施方式中，所述全身血液灌注具体方法包括向动物左心室内注入D-PBS溶液，D-PBS溶液进入体循环后，肝脏颜色由深变浅；当血液从右心耳流出时，打开左心耳，继续注入D-PBS溶液，直至肺完全变白或接近完全变白；观察到膀胱褪色则全身血液灌注成功。由于来自血液细胞的蛋白质会污染尿路上皮的RNA或蛋白质，因此为了获得纯粹的膀胱上皮细胞，本发明采用动物全身血液灌注方法，而非选择红细胞裂解液来消除红细胞的干扰。

本发明的又一具体实施方式中，所述膀胱孵育、酶解消化具体方法为：

S2、使用PBS-EDTA溶液孵育经步骤S1处理后的膀胱；

本发明的又一具体实施方式中，所述步骤S1中dispase II溶液浓度为1～3mg/ml(优选为2mg/ml)，溶剂采用DMEM培养基，所述孵育处理条件为：在30～40℃(优选为37℃)条件下孵育1～3h(优选为1.5h)；

本发明的又一具体实施方式中，所述步骤S2中，孵育处理条件为在冰浴条件下孵育1～2h(优选为1.5h)，发明人经过研究发现，通过控制步骤S2孵育处理时间，既有利于获得活性较高的膀胱尿路上皮单细胞，便于后续单细胞测序处理；同时，也有利于提高细胞回收率。

本发明的又一具体实施方式中，所述步骤S3中，离心转速控制为300～400g，离心处理时间为3～8min(优选为5min)同样有利于细胞回收率的提高。

本发明的又一具体实施方式中，所述胰蛋白酶优选使用TrypLE^TM Express酶，其作为柔和的高纯度细胞解离酶，为动物胰蛋白酶替代品，用于哺乳动物细胞的解离，效果更佳；酶解处理时间控制为1～3min，有助于尿路上皮细胞的分离，减少细胞成团现象的发生。

本发明的又一具体实施方式中，所述制备方法还包括将孵育、酶解消化后的细胞悬液进行酶解消化中和、过滤、离心、重悬，获得适宜细胞浓度的可用于单细胞测序的膀胱尿路上皮单细胞悬液。

本发明的又一具体实施方式中，用于酶解消化中和的缓冲溶液为D-PBS(0.04％BSA)缓冲溶液或D-PBS(10％胎牛血清)缓冲溶液，其中，通过向细胞悬液中加入D-PBS(10％胎牛血清)缓冲溶液，不仅能够中和酶解消化作用，终止酶解反应，同时还有利于膀胱尿路上皮细胞的分散。

本发明的又一具体实施方式中，所述过滤优选采用细胞过滤器进行过滤，进一步的，所述过滤方法具体为依次使用70μm细胞过滤器和40μm细胞过滤器进行过滤。

本发明的又一具体实施方式中，离心转速控制为300～400g，离心处理时间为3～8min(优选为5min)。

本发明的又一具体实施方式中，上述制备方法各步骤在无菌条件下进行，从而避免因细菌污染造成对后续单细胞测序的影响。

本发明的又一具体实施方式中，上述制备方法至步骤S2开始，所有步骤均在冰上操作完成，有利于提高细胞活性。

本发明的又一具体实施方式中，制备过程中减少对细胞的震荡，同样有利于细胞活性的提高。

本发明的又一具体实施方式中，提供上述制备方法制备得到的膀胱尿路上皮单细胞悬液。采用本发明制备方法得到的膀胱尿路上皮单细胞悬液，其中膀胱尿路上皮单细胞活性高，品质好，且细胞分离度较高，有利于进行单细胞测序。

本发明的又一具体实施方式中，提供上述制备方法和/或上述膀胱尿路上皮单细胞悬液在单细胞测序中的应用。

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中为注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件进行。

实施例

动物

小鼠(8～10周龄)购自山东大学动物实验中心。所有小鼠均保存在本研究所特定的无致病性动物设施中。

试剂

D-PBS溶液(without calcium,magnesium,phenol red)(Solarbio,Chinacat.no.D1040)

BSA(Solarbio,China cat.no.A8850)

DMEM培养基(Thermo Fisher Scientific,USA cat.no.C11995500BT)

PBS-EDTA溶液(10mmol/L)(leagene,China cat.no.CZ0026)

Dispase II(Sigma,USA cat.no.04942078001)

TrypLE^TM Express Enzyme(1X,no phenol red)(Thermo Fisher Scientific,USAcat.no.12604-013)

Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit(Dow Corning,USA cat.no.DC184)

75％浓度乙醇

设备

用于打开胸腔的弯曲止血器(Yuyan,China cat.no.Y30373)

用于打开胸腔和腹腔的组织剪刀(Yuyan,China cat.no.Y2201)

两对解剖剪刀，用于切开和打开膀胱(Yuyan,China cat.no.Y25010)

眼科镊(Yuyan,China cat.no.Y15201)

用于切割左右心房的显微外科剪刀(Yuyan,China cat.no.Y52011)

用来制作Sylgard胶板的大培养皿(Falcon,USA cat.no.353004)

装入75％乙醇的酒精喷壶

在手术中稳定老鼠肢体的纸带

手术中收集血液和灌注液的托盘

灌注时用塑料板(10×15×0.4cm)，用于放置小鼠。塑料盘的一侧置于托盘边缘，另一侧置于托盘底部，使得灌注溶液可以排到托盘中

20号针头

20-ml无菌注射器

冰盒

0.22μm过滤装置(Millex-GP,IRL cat.no.SLGP033RB)

40μm细胞过滤器(Falcon,USA cat.no.352340)

70μm细胞过滤器(Falcon,USA cat.no.352350)

大头针

超净台(JIANGETECH,China cat.no.SW-CJ-1D)

细胞温箱(Thermo Fisher Scientific,USA cat.no.371)

摇床(DLAB Scientific,China cat.no.SK-O180-S)

离心机(YINGTAI,China cat.no.TD4N)

操作步骤

准备工作

1.Sylgard胶板制备:将体积比为10:1的试剂A和试剂B混合，倒入培养皿中(30-40ml)，水平放置24-48h(Sylgard胶板可多次使用)。(图2A)

2.使用75％乙醇浸泡手术器械、大头针、Sylgard胶板至少30min，然后用无菌水冲洗干净，在超净工作台晾干。这一步需要在取下膀胱前30分钟完成。

3.将dispase II稀释于DMEM培养基中，浓度为2mg/ml，使用0.22μm过滤装置滤过后放于37℃预热。

4.准备0.04％BSA D-PBS溶液，使用0.22μm过滤装置滤过后放于4℃预冷。

5.将PBS-EDTA和D-PBS溶液在4℃预冷。

6.将20号针安装在20ml注射器，抽取20ml 4℃D-PBS溶液备用。

7.剪下4条4厘米长的纸带，用来固定老鼠的四肢。

动物灌注及膀胱采集

8.将10ml DMEM倒入涂有Sylgard胶板中。

9.小鼠采用颈椎脱位法处死，进行灌注。

10.将鼠标仰面放在塑料板上，塑料板应放在容器内，并将鼠标的四肢绑在塑料板上使其稳定。

11.在剑突处用止血器按住皮肤。切开皮肤做一个小切口，打开皮肤，用组织剪刀露出下面的胸肌区域。

12.用止血器抓住剑突，夹住肋骨两侧，穿刺横膈膜暴露胸腔。将胸骨固定在头部一侧，露出跳动的心脏。

13.使用显微手术剪刀打开右心耳。

14.用一只手，稳定跳动的心脏。另一只手拿起准备好的20ml注射器(步骤6)轻轻刺入左心室(心尖搏动附近)，同时握住针头的位置，防止针头刺入左心房、右心室。

15.慢慢推入D-PBS溶液。D-PBS溶液进入体循环后，肝脏颜色由深变浅。

16.当血液从右心耳流出时，用另一只手打开左心耳。

17.继续推动D-PBS溶液，直到肺几乎完全变白。

18.用75％乙醇湿润腹部皮肤后，切开v形切口打开腹腔。浅色的膀胱是成功的标志。(图2B)

19.用锋利的剪刀从膀胱颈处剪下膀胱，放在Sylgard胶板上。切开膀胱时，将剪刀的一只手***膀胱的小孔，露出膀胱腔。(图2C)

20.用一根大头针钉在膀胱一角，以确保膀胱腔侧向上。再使用三根大头针固定膀胱其他三角，使膀胱形成一个平行四边形。(图2D)

21.用3mL DMEM冲洗膀胱，吸除尿液或附着的毛发。重复两遍。

22.倒入配制好的dispase II溶液(步骤3)，将膀胱放在37℃细胞温箱孵育1.5小时。

单细胞悬浮液的制备

23.移动大头针，最大程度的伸展膀胱。(图2E)倒掉dispase II溶液，用3mL PBS-EDTA冲洗膀胱三遍。

24.在Sylgard胶板中加入10-15ml PBS-EDTA溶液孵育膀胱。将胶板放在冰上，轻轻摇晃1.5小时。(图2F)

25.将PBS-EDTA收集到15ml离心管中。300g离心5分钟。

26.吸入大部分上清液，确保不吸入细胞。然后加入1ml TrypLE^TM Express酶消化细胞1min，每20秒用无菌巴氏滴管轻轻吹打一次，确保滴管尖端没有压在离心管表面。

27.在15ml离心管中加入10ml 0.04％BSA D-PBS溶液，用以中和TrypLE^TM Express酶，停止消化。300g离心5分钟，吸入大部分上清液，加入3ml 0.04％BSA D-PBS溶液重悬。重复三遍。

28.使用70μm细胞过滤器过滤细胞悬液。

29.使用40μm细胞过滤器过滤细胞悬液。

30.300g离心5分钟。吸入大部分上清液，留300ul重悬。

31.使用细胞数计数来获得适当的细胞浓度。

注意：

32.所有操作应在无菌条件下进行，细菌污染可影响单细胞测序结果。

33.来自血液细胞的蛋白质会污染尿路上皮的RNA或蛋白质。为了获得纯粹的膀胱上皮细胞，小鼠全身血液灌注是不可替代的。不要选择红细胞裂解液来消除红细胞的干扰。

34.每块Sylgard胶板上不要放超过4个膀胱。多余的膀胱会影响细胞收集效率。通常，每个膀胱(雌性C57BL/6小鼠，8-10wk)可提供100000-150000个细胞。

尽管冲洗-离心-重悬的过程会损失很多的细胞，导致细胞回收率较低，但这是必要的操作。如果不彻底清除EDTA，会影响单细胞测序的结果。为解决上述问题，可以：

1.选择摆式转子离心机。

2.离心机转速增加到400g。

3.可以适当增加PBS-EDTA的处理时间，但不超过两个小时。

同时，成团是尿路上皮细胞的一种特征，不能完全避免。为减少细胞成团现象的发生，可以：

1.适当增加TrypLE^TM的处理时间，但不超过3分钟。

2.重复步骤19一到两次。

3.用10％胎牛血清D-PBS代替0.04％BSA D-PBS溶液

另外，针对细胞活性过低的问题，可以：

1.适当减少PBS-EDTA的处理时间，但不少于一个小时。

2.步骤23后的所有操作在冰上完成。

3.不要随意震荡细胞。

效果验证用血细胞计数板计数细胞数量

如图3A所示，采用血细胞计数板观察细胞形态和数量，显示本发明制备得到的大部分膀胱尿路上皮细胞相互分离。

台盼蓝染色

将0.4％台盼蓝溶液(Solarbio,China cat.no.C0040)与细胞悬液按体积比1:9混合，计算台盼蓝耐染率，即为细胞存活率。如图3B所示，台盼蓝耐染率大于90％，表明本发明制备方法得到的膀胱尿路上皮细胞活性高。

Calcein-AM/PI染色

配制Calcein-AM/PI工作液，Calcein-AM浓度为2mM，PI浓度为1.5mM(Solarbio,China cat.no.CA1630)。将工作液与细胞悬液按体积比1:2混合，荧光显微镜下观察，计算细胞存活率。结果见图3C，同样证明本发明制备方法得到的膀胱尿路上皮细胞活性很高。

单细胞测序

本发明采用v3单细胞试剂试剂盒(10×Genomics)，应用Chromium***，将捕获的20000个细胞进行裂解和扩增后，获得cDNA构建Illumina测序文库。Illumina basecall文件使用CellRanger v3.0换成为FASTQs，该软件是基于条形码生成基因与细胞表达矩阵，并分配了唯一的分子标识符(UMIs)，从而能够确定单个细胞RNA分子的来源。利用CellView软件对基因表达进行归一化。细胞类型由SingleR程序鉴定。本发明通过Sing cell RNA-seq分析验证了尿路上皮细胞的类型和特异性标志物，实验结果见图4和下表，上述结果均表明本发明制备得到的细胞是高质量的，进一步证明了本实验方法的可行性。同时需要说明的是，本发明制备方法不适用于膀胱上皮原代培养。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种用于单细胞测序的膀胱尿路上皮单细胞悬液的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括将处死后的动物进行全身血液灌注，将采集到的膀胱进行孵育、酶解消化即获得单细胞悬浮液。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述动物包括哺乳动物，进一步包括啮齿动物，所述啮齿动物包括小鼠、大鼠、地鼠和豚鼠，进一步优选为小鼠。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述全身血液灌注具体方法包括：向动物左心室内注入D-PBS溶液，D-PBS溶液进入体循环后，肝脏颜色由深变浅；当血液从右心耳流出时，打开左心耳，继续注入D-PBS溶液，直至肺完全变白或接近完全变白；观察到膀胱褪色则全身血液灌注成功。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述膀胱孵育、酶解消化具体方法为：

S1、将采集并处理后的膀胱使用dispaseII溶液进行孵育处理；然后使用PBS-EDTA溶液冲洗2～3次；

S2、使用PBS-EDTA溶液孵育经步骤S1处理后的膀胱；

5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，

所述步骤S1中dispase II溶液浓度为1～3mg/ml(优选为2mg/ml)，溶剂采用DMEM培养基，所述孵育处理条件为：在30～40℃(优选为37℃)条件下孵育1～3h(优选为1.5h)；或，

所述步骤S2中，孵育处理条件为在冰浴条件下孵育1～2h(优选为1.5h)；或，

所述步骤S3中，离心转速控制为300～400g，离心处理时间为3～8min(优选为5min)；

优选的，所述胰蛋白酶优选使用TrypLE^TMExpress酶；酶解处理时间控制为1～3min。

6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括将孵育、酶解消化后的细胞悬液进行酶解消化中和、过滤、离心和重悬。

7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，用于酶解消化中和的缓冲溶液为D-PBS(0.04％BSA)缓冲溶液或D-PBS(10％胎牛血清)缓冲溶液，优选为D-PBS(10％胎牛血清)缓冲溶液；

所述过滤优选采用细胞过滤器进行过滤；进一步优选的，所述过滤方法具体为依次使用70μm细胞过滤器和40μm细胞过滤器进行过滤；

优选的，离心转速控制为300～400g，离心处理时间为3～8min(优选为5min)。

8.如权利要求1-7任一项所述制备方法，其特征在于，所述制备方法各步骤在无菌条件下进行；或，

所述制备方法至步骤S2开始，所有步骤均在冰上操作完成。

9.权利要求1-8任一项所述制备方法制备得到的膀胱尿路上皮单细胞悬液。

10.权利要求1-8任一项所述制备方法和/或权利要求9所述膀胱尿路上皮单细胞悬液在单细胞测序中的应用。