CN112569227B - 一种具有神经保护功能的3d立体移植材料体系及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种具有神经保护功能的3D立体移植材料体系及其应用，属于脑损伤药物技术领域。褪黑素在制备针对在缺血缺氧条件下的神经干细胞的神经保护的药物中的应用。本发明还提供了一种具有神经保护功能的3D立体移植体系包括褪黑素、神经干细胞和基质胶。本发明通过3D移植策略能明显促进损伤模型大鼠的神经功能恢复，其中褪黑素为神经干细胞适应损伤灶不利微环境提供了保护作用，基质胶的加入可以从立体层面给予模型损伤后形成的脑组织空腔提供结构支持，提供细胞生长的立体环境，加强细胞修复效果，从基础研究层面为以后颅脑损伤的临床治疗策略的发展提供了一个方向。

Description

一种具有神经保护功能的3D立体移植材料体系及其应用

技术领域

本发明属于脑损伤药物技术领域，具体涉及一种具有神经保护功能的3D立体移植材料体系及其应用。

背景技术

颅脑损伤作为当代战创伤中最常见的损伤形式，发生率高达20％以上，死残率为各种损伤之首，时至今日及时有效的治疗措施仍然有限。目前广泛应用的颅脑损伤急性期手术救治方案虽显著提高了病员生存率，但留下的偏瘫、认知等神经功能障碍仍是影响幸存伤员生活质量的核心问题。因此寻找促进颅脑损伤修复的策略和方法是当前该领域的研究前沿。

神经干细胞是在多种动物的脑组织中发现的一类具有自我更新能力，可分化成神经元、胶质细胞、少突胶质细胞等的多潜能干细胞。正常状态下，神经干细胞在成年动物中存量少并处于静息状态。现代研究表明病损条件下，神经干细胞可以被激活并参与病灶区的神经修复，所以在颅脑损伤中，使用神经干细胞作为一种修复治疗手段的可能性受到人们的重视。

神经干细胞治疗方法一直是人们所关注的热点。但内源性神经干细胞因其数量少，目前应用受到限制，而外源性神经干细胞的移植可能是突破这一难题的方法。使用外源性细胞进行补充基本上已经算是医学研究的常规手段。与组织移植相比，细胞移植就具有更高的相容性以及更多的来源选择。并且因为干细胞类具有的增殖分化能力使得其应用性也大幅提升。很多的研究表明，神经干细胞在修复和治疗已经取得了可观的成效。EmilyW.Baker在2017成功的在猪的脑卒中模型中进行了神经干细胞移植治疗，研究检测发现移植后组织功能有明显的恢复，病灶区小胶质细胞数量减少，神经干细胞的迁移增多，而且分化成神经元以及少突胶质细胞整合神经网络。在体外培养，定向分化多巴胺表型的神经元也应用到了帕金森疾病模型中，取得了良好的恢复效果针对复杂的颅脑损伤情况，干细胞移植治疗方案虽然早已达成共识，但仍然存在很多不同的一直方案，例如骨髓注射、脑室移植、海马移植、静脉注射，大脑假手术等不同方案。不同的移植治疗方案最终都可以验证神经干细胞移植对神经功能损伤修复的促进作用。2018年AliJahanbaziJahan-Abad将手术过程中从癫痫人大脑中分离出的人类神经干/祖细胞(hNS/PCs)移植到颅脑损伤大鼠模型中。该实验有效地可减少了病变区域大小，抑制损伤后的神经炎症，改善大鼠的神经功能恢复并减少损伤部位的胶质增生。

褪黑素是在正常的昼夜节律调控影响下在夜间由松果体分泌的一种激素，血浆，唾液，尿液中都可以检测到褪黑素或者其代谢产物。褪黑素可以通过调控细胞内的离子通道(如钙离子通道)，影响分子信号通路(如Notch、MAPK等)，通过调节线粒体呼吸等途径精准调控细胞的生理活动与生命周期。少量文献表明，褪黑素可以促进神经干细胞增殖，但对神经干细胞生物学行为及其与神经干细胞联合移植对神经***损伤的影响，目前研究较少。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供褪黑素的一种新用途，即褪黑素在制备针对在缺血缺氧条件下的神经干细胞的神经保护的药物中的应用。

本发明的目的还在于提供一种具有神经保护功能的移植材料及其应用，所述移植材料移植颅脑损伤模型中具有神经功能恢复。

本发明的目的还在于提供一种具有颅脑损伤修复功能的3D立体移植体系及其应用，3D立体移植体系明显促进损伤模型大鼠的神经功能恢复。

本发明提供了褪黑素在制备针对在缺血缺氧条件下的神经干细胞的神经保护的药物中的应用。

优选的，所述神经保护表现在褪黑素使神经干细胞在缺血缺氧条件下有存活能力。

本发明提供了一种具有神经保护功能的移植材料，所述移植材料包括褪黑素和神经干细胞。

优选的，在移植材料中，褪黑素溶液的终浓度不低于25μmol/L，所述神经干细胞的浓度为10⁵～10⁷/ml。

本发明提供了所述移植材料在制备神经功能恢复的药物中的应用。

本发明提供了所述移植材料在制备治疗颅脑损伤的药物中的应用。

本发明提供了一种具有颅脑损伤修复功能的3D立体移植体系，包括所述移植材料和基质胶。

本发明提供了所述3D立体移植体系在制备治疗颅脑损伤的药物中的应用。

本发明提供了所述3D立体移植体系在制备神经功能恢复的药物中的应用

将不同梯度浓度的褪黑素添加到培养液中，观察神经干细胞的形态变化，采用CCK8方法确定细胞增殖能力和免疫荧光染色鉴定分化能力。结果表明，通过免疫荧光鉴定神经干细胞(抗体)，明确褪黑素使神经干细胞向星形胶质细胞(GFAP)、神经元(Nestin)、少突胶质细胞(Olig2)等神经亚类细胞分化的潜能。

本发明提供了褪黑素在制备针对在缺血缺氧条件下的神经干细胞的神经保护的药物中的应用。本发明通过含氯化钴(CoCl₂)的EBSS无糖培养基模拟损伤后病灶区的缺氧缺糖条件，研究褪黑素对神经干细胞生存能力的影响，结果表明，未处理组神经干细胞存活能力大幅下降，而在褪黑素25μmol/L处理后，与未处理组，神经干细胞的存活数量显著上升，提高神经干细胞的生存能力。这表明褪黑素在缺血缺氧条件下对神经干细胞具有较好的神经保护作用。

本发明提供的具有神经保护功能的移植材料，包括褪黑素和神经干细胞。鉴于神经干细胞可以激活病灶区的神经修复作用，同时神经干细胞向神经亚类细胞分化的潜能，本发明实验证明褪黑素有利于提高神经干细胞在缺血缺氧条件下的存活能力，因此，通过向脑部病灶部位移植该材料，使神经干细胞在褪黑素作用下能够实现神经干细胞向功能性神经元和其它种类神经细胞的分化，从而达到脑部损伤中神经修复的目的。

本发明提供的具有颅脑损伤修复功能的3D立体移植体系，包括所述移植材料和基质胶。本发明将含褪黑素、神经干细胞和MatrixGel基质胶的3D立体移植体系通过3D移植策略能明显促进损伤模型大鼠的神经功能恢复，其中褪黑素为神经干细胞适应损伤灶不利微环境提供了保护作用，基质胶的加入可以从立体层面给予模型损伤后形成的脑组织空腔提供结构支持，提供细胞生长的立体环境，加强细胞修复效果。本发明从基础研究层面为以后颅脑损伤的临床治疗策略的发展提供了一个方向。

附图说明

图1为神经干细胞培养状态观察图为倒置相差显微镜观察下的神经干细胞形态，图1A为从额叶皮层分离提取的神经干细胞形态图；图1B为悬浮培养三天后神经干细胞增殖聚集成球状的图片，标尺：50μm；

图2为神经干细胞特异性分子标志物Nestin、SOX2免疫荧光染色鉴定结果，标尺：50μm；

图3.神经干细胞多向分化能力的鉴定结果，其中图3A为DCX标记鉴定神经干细胞向神经母细胞(neuralblast)分化；图3B为Oligo2标记物鉴定神经干细胞向少突胶质细胞分化；图3C为GFAP标志物鉴定神经干细胞向星形胶质细胞分化，DAPI复染细胞核，标尺均为50μm；

图4为使用含CoCl₂的EBSS培养基建立OGD模型，其中图4A：正常神经干细胞培养对照；图4B：OGD模型处理2h；图4C：OGD模型处理4h；图4D：OGD模型处理6h，图4E:各时间点细胞存活率统计；

图5为在缺氧缺血条件下褪黑素处理的神经干细胞的影响，图5A：OGD模型处理2h；图5B：OGD模型处理4h；图5C：OGD模型处理6h；图5A，～图5C为神经干细胞单细胞培养条件，图5D，图5F，图5E分别为2h，4h，6h处理后细胞存活率统计，其中每一组设置0，6.25，12.5，25，50，100μmol/L六组不同浓度的褪黑素处理，标尺：100μm；

图6为大鼠脑图谱定位图图示中可观察M1、M2运动皮质结构图；

图7为大鼠脑损伤模型制作标本，图7A：颅脑损伤模型破开骨窗示意图；图7B：大鼠造模后进行组织固定全脑取材，损伤区域示例；图7C：全脑组织固定取材后脑组织的纵向切面；标尺3mm；

图8为使用改良大鼠神经功能缺损评分mNSS评分表统计的行为学评分结果；

图9损伤区脑组织切片苏木精-伊红(H&E)染色，其中图9A：大鼠脑组织取材后HE染色显微图像；图9B病灶区边缘200μm细胞计数统计；

图10为损伤区免疫荧光染色检测评估细胞修复效果及细胞比例统计，其中图10A：Nestin与GFAP共染；图10B：Nestin与Oligo2共染；图10C：Nestin与MAP2共染，每个柱状图中黑色表示nestin阳性比例，白色表示GFAP/Oligo2/MAP2阳性比例，标尺200μm；

图11为移植后7D的大鼠磁共振T2相图例；

图12为移植后大鼠模型行为学评分表使用神经功能损伤严重程度(NSS)评分表，P<0.05。

具体实施方式

本发明提供了褪黑素在制备针对在缺血缺氧条件下的神经干细胞的神经保护的药物中的应用。在本发明中，神经干细胞具有向神经亚类细胞分化的潜能，所述神经亚类细胞优选包括胶质细胞和神经元；所述胶质细胞优选包括星形胶质细胞和少突胶质细胞。所述神经保护表现优选在褪黑素使神经干细胞在缺血缺氧条件下有存活能力。本发明采用含氯化钴(CoCl₂)的EBSS无糖培养基模拟损伤后病灶区的缺氧缺糖条件，在该条件下培养的神经干细胞存活能力大幅下降，而褪黑素25μmol/L处理缺氧缺糖条件下的神经干细胞后，神经干细胞的存活数量上升，提高其生存能力。该结果表明，褪黑素在缺血缺氧条件下对神经干细胞不仅没有毒害作用，具有可靠的生物安全性，而且还具有较好的神经保护作用。

本发明提供了一种具有神经保护功能的移植材料，所述移植材料包括褪黑素和神经干细胞。在移植材料中，褪黑素溶液的终浓度优选不低于25μmol/L，更优选为27～35μmol/L，所述神经干细胞的浓度优选为10⁵～10⁷/ml，更优选为10⁶/ml。所述移植材料的制备方法优选制备神经干细胞悬浮液，制备褪黑素溶液，其中褪黑素溶液所用的溶剂优选采用神经干细胞培养基。将制备的神经干细胞悬浮液和褪黑素溶液混合，得到抑制材料。

本发明提供了一种具有颅脑损伤修复功能的3D立体移植体系，包括所述移植材料和基质胶。所述移植材料的组成和含量同上述记载的具有神经保护功能的移植材料，在此不做赘述。所述基质胶与所述移植材料中褪黑素溶液和神经干细胞悬浮液的体积比优选为0.8～1.2：0.8～1.2：0.8～1.2，最优选为1:1:1。本发明对所述基质胶的种类不做具体限定，采用本领域所熟知的基质胶即可，例如通过常规的商品购买途径得到的基质胶即可。为了举例说明本发明3D立体移植体系的组成和实施方法，本发明实施例中以Matrix Gel基质胶为例加以说明，但不能理解为对本发明的限制。Matrix Gel可以有效帮助神经细胞的附着和分化，同时基质胶还可以有效地对损伤形成的组织空腔起到3D结构支撑的作用，并且提供细胞生长的立体环境。基质胶可替换为其他具有良好生物相容性的组织材料，例如水凝胶材料、透明质酸材料，类细胞外基质材料等。将所述移植材料与基质胶MatrixGel混合填充移植到大鼠颅脑损伤模型的病灶区，观察损伤区的修复情况，免疫组化结果发现在褪黑素与干细胞共移植的实验组中，病灶区周围细胞量明显增加，病灶区边缘形态更完整。免疫荧光结果显示，褪黑素和神经干细胞共移植的损伤大鼠脑组织内，胶质细胞前体细胞明显增多，可以更好的提供结构支持保护与营养功能，促进病灶区细胞的存活以及神经功能修复。

鉴于所述移植材料或3D立体移植体系在神经功能恢复中取得的效果，所述移植材料或所述3D立体移植体系在神经功能恢复或治疗颅脑损伤中的应用。本发明还提供了所述移植材料或所述3D立体移植体系在制备神经功能恢复的药物中的应用。同时鉴于所述移植材料或3D立体移植体系具有的修复大鼠颅脑损伤的生物性能，本发明提供了所述移植材料或所述3D立体移植体系在制备治疗颅脑损伤的药物中的应用。本发明对所述药物剂型没有特殊限制，采用本领域所熟知的药物剂型即可。本发明对所述药物的制备方法，优选采用本领域所熟知的药物制备方法即可。

下面结合实施例对本发明提供的一种具有神经保护功能的3D立体移植材料体系及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

1.材料及试剂

主要仪器

实验用仪器公司名称及产地

立体显微镜CarlZeiss公司，德国

Sartorius电子天平Thermofisher公司，美国

电子恒温水浴箱环科公司，南京

OLYMPUSIX71倒置相差显微镜OLYMPUS公司，日本

眼科手术器械金钟公司，上海

显微手术器械瑞沃德公司，深圳

SJ-CJ1FDQ单人超净工作台苏净公司，苏州

HERAcelliCO2培养箱Thermofisher公司，美国

LSM780激光共聚焦显微镜CarlZeiss公司，德国

ST40低温离心机Thermofisher公司，美国

Millipore超纯水设备Millipore公司，德国

5427R超高速低温离心机Eppendorf公司，德国

微量移液器大龙兴创公司，北京

PH仪仪迈公司，上海

1.2试剂与耗材

试剂/耗材公司名称及产地

25cm²细胞培养瓶NEST公司，无锡

75cm²细胞培养瓶NEST公司，无锡

15mm玻底培养皿NEST公司，无锡

60mm细胞培养皿NEST公司，无锡

100mm细胞培养皿NEST公司，无锡

100μm细胞筛Corning公司，美国

DMEM/F12Gibco公司，美国

B27添加剂Gibco公司，美国

小鼠重组EGFPeprotech公司，美国

小鼠重组bFGFPeprotech公司，美国

Accutase细胞消化液Gibco公司，美国

0.01MPBS缓冲液博士德公司，武汉

0.25％胰酶Gibco公司，美国

胎牛血清(FBS)Gibco公司，美国

GlutamaxGibco公司，美国

多聚鸟氨酸(PLO)Sigma公司，德国

TritonX-100Sigma公司，德国

4％多聚甲醛博士德公司，武汉

5％BSA博士德公司，武汉

免疫荧光染色一抗稀释液碧云天公司，上海

免疫荧光染色二抗稀释液碧云天公司，上海

donkeyanti-rabbitIgG-CFL488Santa公司，美国

donkeyanti-mouseIgG-CFL555Santa公司，美国

donkeyanti-rabbitIgG-CFL555Santa公司，美国

donkeyanti-mouseIgG-CFL488Santa公司，美国

AlexaFluor488conjugatedphalloidin

reagentsLife公司，英国

DAPI染色液博士德公司，武汉

抗荧光淬灭剂博士德公司，武汉

Nestin抗体SOX2抗体Santa公司，美国三鹰公司，武汉

DCX抗体三鹰公司，武汉

Oligo2抗体三鹰公司，武汉

GFAP抗体Abcam公司，美国

褪黑素Melatoninpowder,≥98％(TLC)Sigma公司，德国

DMSO碧云天公司，上海

无水乙醇重庆川东化工公司

EBSS、CoCl_2。

2.实验方法

2.1神经干细胞分离培养相关操作

2.1.1神经干细胞原代培养

(1)使用5ml移液器将已经剥除软脑膜及血管的额叶皮层组织转移至10ml无菌离心管中，小心吸除多余的DMEM-F12，加入3ml0.25％胰酶(依据分离的胎鼠脑组织量增减，一般每3只胎鼠的额叶皮层组织使用1ml)，置于37℃水浴锅中消化12min，小心放置避免离心管口污染。每间隔一段时间轻摇离心管避免组织结团沉底，使组织与胰酶充分接触；

(2)消化完成后将离心管移入超净工作台，小心地吸除胰酶，然后加入5ml10％FBS，中间小心轻吹约10次，使FBS与组织团充分接触，终止消化。静置5min后待组织沉淀除去上清液，重复2次，使组织团充分终止消化；

(3)换用5mlDMEM-F12培养基洗涤两次，洗去残余的FBS。待组织团沉淀，除去DMEM-F12培养基；

(4)在盛有组织团的离心管中加入3.5ml神经干细胞完全培养基(DMEM/F12+2％B27+20ng/mlEGF+20ng/ml bFGF)，用5ml移液器轻柔吹打组织团6次。待组织团沉淀后吸取上层悬液经由100μm滤网过滤。重复洗吹过滤3次；

(5)将过滤后的悬浮液轻吹混匀后平均转移至3个培养瓶中培养。每个培养瓶加入10ml培养基；

(6)在光学显微镜下观察可见成透亮圆形的单个细胞即为神经干细胞，放置于HERAcelli CO₂培养箱中，37℃5％CO₂条件下培养；

(7)整理收拾实验器械及耗材，处理实验废弃物，清洁超净台。

2.1.2神经干细胞传代

神经干细胞具有干细胞增值的特性，在2～3天后形成直径约100μm悬浮球状细胞团时，应进行传代。

(1)从培养瓶中吸出细胞培养悬浮液至50ml无菌离心管中，轻冲几次培养瓶壁，收集残留在瓶壁上的神经干细胞球；

(2)收集至离心管中细胞培养悬浮液，以300转每min离心5min；

(3)将离心后的上清转移至另一50ml无菌离心管中，沉淀即为收集的神经干细胞；

(4)在存有神经干细胞沉淀的无菌离心管中加入3mlAccutase细胞消化液(干细胞级)，室温消化12min，中途轻柔震荡，促使细胞球与Accutase消化液充分接触；

(5)将步骤(3)中收集的上清液以1500转每min离心5min，收集离心后的培养基上清，继续用作神经干细胞的传代培养；

(6)待Accutase消化结束后，向消化液中加入3ml回收培养基终止消化。用5ml移液器轻柔吹打20～30次，使神经干细胞充分分散，然后用300g的离心速度离心4min；

(7)离心后去除上清液，沉淀即为神经干细胞。向沉淀中加入神经干细胞完全培养基，重悬神经干细胞沉淀。随后补入一半步骤(5)中回收的培养基混匀，接种于75cm²培养瓶中继续放入37℃，含5％CO₂培养箱中悬浮培养。此次传代后的神经干细胞单细胞即为P1代细胞，经培养后长成神经干细胞球时，即为P1代细胞球。

2.2神经干细胞鉴定及迁移分化实验

2.2.1神经干细胞的贴壁生长处理

由于神经干细胞在正常状态下悬浮生长，所以进行实验是需要对其进行贴壁处理，以便于进行后续实验。

(1)使用灭菌ddH₂O配制10mg/ml的多聚鸟氨酸(PLO)溶液；

(2)将准备接种的培养皿，六孔板等放入超净台中紫外灭菌30min待用；

(3)将10mg/ml PLO溶液加入到培养皿及六孔板当中，使其均匀覆盖底部平面，置于37℃培养箱中包被15～30min。包被完成后将培养皿及孔板中剩余的PLO溶液回收至离心管中，可重复用2～3次。

2.2.2神经干细胞的鉴定及分化潜能

为了证实分离培养的细胞为神经干细胞，取P2代神经干细胞球接种到已经由PLO包被后的15mm玻底培养皿中，培养三天后进行神经干细胞特征标志物免疫荧光染色。为了进一步验证神经干细胞的多向分化潜能，在玻底培养皿中已经培养三天的神经干细胞球中神经干细胞完全培养基更换为神经干细胞分化培养基(DMEM/F12+2％B27+1％glutamax)，继续培养三天诱导其分化后进行免疫荧光染色，对分化标志物进行检测。

2.2.3免疫荧光染色

免疫荧光检测主要针对不同类型细胞所带有的特殊的蛋白分子标志物，利用抗体反应使蛋白分子与设计的荧光标记相结合，借由荧光成像技术观察分析。在前述实验的细胞培养过程后，通过对神经干细胞特异性标志物Nestin和SOX2的免疫荧光表达检测来鉴定神经干细胞的干性，证实分离培养的为神经干细胞。在更换分化培养基诱导分化潜能后，通过检测星形胶质细胞标志物GFAP、少突胶质细胞标志物Oligo2、神经母细胞标志物DCX等特定分子标志物的表达来说明神经干细胞是否具有多向分化潜能。

表1标志物抗体选择

标志物名称	细胞定位	特征染色
			Nestin	细胞质	神经干细胞
SOX2	细胞核	神经干细胞
			GFAP	细胞质	星形胶质细胞
Oligo2	细胞核	少突胶质细胞
			DCX	胞质和突起	神经母细胞
DAPI	细胞核	所有细胞核

免疫荧光具体流程如下：

(1)在既定的检测时间点取出预先接种于PLO包被的15mm玻底培养基的神经干细胞(球)，吸除培养皿中的培养基，视培养皿大小加入适量0.01MPBS缓冲液清洗，重复2次；

(2)清洗后吸净培养皿中0.01MPBS缓冲液，加入适量4％多聚甲醛固定细胞，室温下放置30min；

(3)固定结束，吸净4％多聚甲醛，并加入适量0.01MPBS轻摇洗涤3次，每次约5min；

(4)加入使用0.01MPBS配制的0.3％TritonX-100于室温下放置30min，增加细胞膜的通透性；

(5)吸除0.3％TritonX-100透膜液，加入0.01MPBS轻摇洗涤3次，每次约5min；

(6)吸取清洗残留的0.01MPBS缓冲液，加入200μl5％BSA室温放置，封闭2h；

(7)封闭结束，去除5％BSA，依据实验分组和需求，分别加入200μl不同浓度的一抗，分别为Nestin抗体(1：100)、Olig2抗体(1：200)、DCX抗体(1：200)、GFAP抗体(1：1000)。设置阴性对照组，加入200μl稀释抗体所使用的免疫荧光一抗稀释液。将培养皿置于4℃冰箱中的免疫组化湿盒孵育过夜。

(8)取出培养皿，吸去孵育一抗，加入适量0.01MPBS缓冲液清洗3次，每次5min；

(9)吸去0.01MPBS缓冲液，根据一抗来源在不同的培养皿中分别加入200μl相对应的IgG荧光二抗(1：400)，放置在室温下避光孵育2h；

(10)吸除荧光二抗，加入0.01MPBS清洗3次，每次5min。

(11)如需要对细胞进行双抗体共标或三抗体共标染色时，例如SOX2与Nestin双标染色，需要在上述Nestin荧光二抗孵育完成后，经过0.01MPBS清洗，再加入200μl与Nestin一抗不同来源的SOX2抗体(1：200)，然后同样放置于4℃冰箱中的免疫组化湿盒孵育过夜；

(12)再次将孵育的一抗吸除，加入0.01MPBS缓冲液清洗3次，每次5min；

(13)吸除0.01MPBS缓冲液后，加入200μl与先前加入的荧光二抗不同激发波长的IgG荧光二抗(1：400)在室温下避光孵育2h；

(14)将孵育后的荧光二抗吸去，用0.01MPBS缓冲液清洗3次，每次5min；

(15)弃去清洗使用的0.01M PBS，加入200μl DAPI染色液，放置在室温环境避光孵育10min；

(16)吸去DAPI染色液，加入0.01MPBS缓冲液清洗3次，每次5min；

(17)清洗完毕后，向培养皿中加入适量0.01M PBS缓冲液，并滴加抗免疫荧光淬灭封片剂防止荧光淬灭，在激光共聚焦显微镜下观察拍照并保留图片；如不能及时进行观察检测，则应该将培养皿置于4℃冰箱中避光保存。

(18)观察检测后使用Zen2011软件对图片进行数据分析和处理。

2.4褪黑素在OGD模型中处理神经干细胞

为了探究褪黑素对神经干细胞的功能作用，在体外选CoCl₂+EBSS的化学OGD模型制作方法，设置褪黑素浓度梯度，检验其对神经干细胞的保护作用。预先将神经干细胞种植于PLO包被过的六孔板当中。约2h后观察神经干细胞已经贴壁生长，将神经干细胞完全培养基按照实验分组设置替换为含有褪黑素的CoCl₂+EBSS混合培养基，褪黑素浓度分别为0、6.25、12.5、25、50、100μmol/L，放置于37℃，含5％CO₂的细胞培养箱中培养8h。8h后取出细胞培养板，在倒置相差显微镜下观察细胞形态。

3结果与分析

3.1神经干细胞球的分离培养

依据实验方法中的操作，分离出神经干细胞，并且在体外悬浮培养于神经干细胞完全培养基中。在倒置相差显微镜下进行光学形态观察，可以观察到刚提取出来的神经干细胞呈高亮状折光好的小圆细胞(图1A)。提取后得细胞置于37℃，5％CO₂浓度的细胞培养箱中静置培养三天后，可以明显观察到多细胞聚集形成的神经干细胞球，边界清晰，细胞聚集状态好(图1B)。

3.2神经干细胞鉴定

在体外成功分离培养细胞后，为了进一步明确验证其确为神经干细胞，使用神经干细胞特异性的分子标志物Nestin与SOX2对细胞进行免疫荧光染色鉴定。通过对免疫荧光染色的结果分析，发现在所培养的细胞中，Nestin与SOX2分子标志物的阳性比率在90％以上，充分证明了所分离培养的细胞为神经干细胞。

3.3神经干细胞的分化潜能

在明确分离培养的细胞确为神经干细胞后，需要进一步验证神经干细胞具有分化为神经元、少突胶质细胞、星形胶质细胞的多向分化潜能。为此，将P2代神经干细胞球种植于PLO包被的共聚焦培养皿当中，将神经干细胞完全培养基更换为神经干细胞分化培养基，培养三天后使用免疫荧光染色方法对分化的细胞进行鉴定。对鉴定结果分析后可以发现，分化培养三天后的神经干细胞可以表达神经元前体细胞(neuralblast)特异标志物DCX，星形胶质细胞特异标志物GFAP，少突胶质细胞标志物Oligo2。明确了所分离的神经干细胞具有多向分化潜能。

3.4氧糖剥夺模(OGD)模型的建立

在一般的颅脑损伤中，创伤所导致的脑实质受损经常会引发出血、氧化应激、神经炎症反应等一系列病理学特征，影响病灶区周围局部微环境的变化。在多种致病致损的病理环境中，选择模拟损伤后呈现出局部供血供氧不足而导致的神经功能受损条件，在细胞水平建立氧糖剥夺(OGD)模型。在本实验中，将神经干细胞完全培养基更换为含100μmol/LCoCl₂的EBSS培养基。在OGD模型中，神经干细胞的生存能力大幅下降。

3.5褪黑素在OGD模型中对神经干细胞存活的影响

褪黑素在神经***中更多的作为一种节律性信息激素，调控机体与环境光周期的一致。在多项研究在也发现，褪黑素可以通过调节线粒体功能，细胞离子通道等方式调控神经干细胞的生命过程。为此，将褪黑素作为一种干预条件加入到神经干细胞的OGD模型中，尝试研究在OGD模型对神经干细胞的损伤条件下褪黑素是否具有一定的保护功能。在同样的OGD模型处理条件下，设置了0，6.25，12.5，25，50，100μmol/L不同浓度的褪黑素处理，各个时间点观察检测细胞存活状态(图3)。经过研究观察发现，在OGD模型处理后，神经干细胞均发生明显的细胞凋亡，在OGD模型处理6h后细胞存活极少，大部分细胞已经死亡，形成漂浮无序状。(图5C)经过对比分析可以发现，在设置的六组褪黑素剂量处理中，神经干细胞在25μmol/L的褪黑素处理条件下存活数目最多，说明在OGD模型处理条件下，褪黑素对神经干细胞凋亡具有较好的保护水平。

实施例2

1.材料与试剂

1.1主要材料

陆军军医大学实验动物中心购买的220～250g雄性SD大鼠。

1.2主要仪器

实验用仪器公司名称及产地

OPMIpico桌面型手术显微镜Zeiss公司，德国

显微手术器械医漫医疗器械，深圳

冰箱海尔公司，青岛

双极微手术电凝器春光医疗美容仪器有限公司，武汉

眼科手术器械金钟公司，上海

小动物立体定位仪瑞沃德公司，深圳

牙科钻

1.3试剂与耗材

试剂/耗材公司名称及产地

5％的水合氯醛溶液科隆化学品有限公司，成都市

4％的多聚甲醛溶液科隆化学品有限公司，成都市

医用碘伏施尔泰化学试剂公司，济南

3％的过氧化氢(H2O2)溶液施尔泰化学试剂公司，济南

生理盐水西南药业股份有限公司，重庆

2实验方法

2.1大鼠颅脑损伤模型制作

在过去传统的撞击创伤模型制作方法基础上，我们具体定位于大鼠M1，M2运动皮层区域，定位方法基于第三版大鼠脑立体定位图谱(原著GeorgePaxin，CharlesWatson)，进一步破除大鼠骨窗，去除皮层组织，模拟颅脑损伤后形成的组织残缺及其病理环境，具体操作步骤如下：

(1)将购买回的大鼠实验台，对其称重后按照50mg/kg的比例腹腔注射5％的水合氯醛溶液对大鼠进行麻醉；

(2)大鼠麻醉后，将头颅顶部被毛剔除，并将其固定于大鼠离体定位仪上；

(3)用碘伏对擦拭大鼠头部表皮进行消毒，然后从后脑沿冠状位中线将颅顶皮肤向前剪至两眼之间，暴露颅骨，然后使用3％的过氧化氢(H₂O₂)溶液去除骨膜；

(4)在前囟部位按照预先确定的大鼠M1、M2运动功能皮层区域，使用显微剪在前囟前1～4mm，右1～4mm区域刻画出边界线，圈出骨窗范围；

(5)根据预先设定的骨窗范围，使用牙科钻沿着边界线小心磨穿颅骨，取出骨片。开骨窗时应注意及时向钻头周围注射生理盐水，避免钻头局部高温造成脑组织热损伤，并且注意切勿将硬脑膜磨破；

(6)在骨窗范围内，使用显微器械将硬脑膜小心剪开，避免损伤内部血管；

(7)剪开硬脑膜后，对于较为明显的血管使用双极电凝进行夹闭烧结，然后沿骨窗边缘切割3mm深，使中间暴露组织与周围脑组织相分离，然后使用镊子将中间损伤区的脑组织夹离，形成损伤空腔；

(8)夹取预计损伤脑组织后，使用双极电凝对损伤区组织进行止血，然后将依次将皮肤缝合；

(9)将大鼠放置于温箱上复苏，苏醒后放回饲养箱中，饲养七天。

2.2行为学评分

在造模后第七天对模型大鼠进行行为学评分，评估其神经功能。我们采用改良大鼠神经功能缺损评分mNSS，具体如下表2：

表2改良大鼠神经功能缺损评分mNSS表

运动试验	6
		提尾试验	3
前肢屈曲	1
		后肢屈曲	1
头部在30s内偏离垂直轴>10°	1
		将大鼠放置于地板上(正常值＝0；最大值＝3)	3
正常行走	0
		不能直线行走	1
向轻瘫侧转圈	2
		向轻瘫侧倾倒	3
感觉试验	2
		放置试验(视觉和触觉测试)	1
本体感觉试验(深感觉，向桌子边缘压鼠爪刺激肢体肌肉)	1
		平衡木试验(正常值＝0；最大值＝6)	6
稳定平衡姿势	0
		紧抓平衡木边缘	1
紧抱平衡木，一肢体从平衡木垂落	2
		紧抱平衡木，二肢体从平衡木垂落或在平衡木上旋转(>60秒)	3
试图在平衡木上平衡但跌落(>40秒)	4
		试图在平衡木上平衡但跌落(>20秒)	5
跌落；未尝试在平衡木上平衡(<20秒)	6
		反射丧失和不正常运动	4
耳廓反射(接触外耳道时摇头)	1
		角膜反射(用棉丝轻触角膜时眨眼)	1
惊恐反射(对快弹硬纸板的噪音有运动反应)	1
		癫痫、肌阵挛、肌张力障碍	1
最高分数18

2.3大鼠脑组织固定取材

将饲养七天后的大鼠使用4％的多聚甲醛溶液进行组织固定，随后解剖取出大鼠脑组织，进行损伤区域的评估比较。

(1)大鼠称重后按照50mg/kg的比例腹腔注射5％的水合氯醛溶液进行麻醉，放入托盘中，准备20ml注射器，生理盐水以及事先遇冷的4％多聚甲醛备用；

(2)大鼠麻醉后剪开胸腔，并且用夹子向上固定胸部肋骨，将大鼠心脏暴露于视野中；

(3)将装有生理盐水的灌注针刺入左心尖，随后将右心耳上部剪破，缓慢的注入生理盐水，经由体内循环***排出血液，直至右心耳流出澄清液体及血液排空；

(4)换用装有预冷的4％多聚甲醛溶液的注射器，同样缓慢的推入大鼠体内，使4％多聚甲醛溶液经由循环***将组织固定，过程中可见大鼠四肢及尾巴抽搐抖动。待大鼠身体僵硬后即为固定完成；

(5)固定后，沿脖颈处断头，从后脑部沿冠状中线剪开头部皮肤，剥除颅骨，取出脑组织，随后放入4％多聚甲醛溶液中避光保存；

(6)脑组织于4％多聚甲醛溶液中固定一天后，取出放入30％多聚甲醛蔗糖溶液(每100ml4％的多聚甲醛中加入30g蔗糖配制)，脱水三天更换30％的多聚甲醛蔗糖溶液，直至大鼠脑组织漂浮在溶液上层。

3结果与分析

3.1大鼠颅脑损伤模型

为了更好的模拟反应颅脑损伤后的功能受损情况，我们根据第三版大鼠脑立体定位图谱针对M1，M2运动皮质进行损伤(如图6)，评估其运动功能受损状况及之后的修复恢复效果。

根据图谱定位后，准确的将颅脑损伤的病灶区定位于M1、M2运动皮层区域，然后经过开颅手术损伤皮层区域的方式将该区域的脑组织切除，形成了3×3×3mm³大小的损伤空腔。为了验证造模过程中对于损伤范围控制的一致性，在造模后七天对大鼠进行了组织固定取材，完整的将颅脑损伤模型致伤后的全脑组织取出，借此观察并测量损伤病灶空腔的大小。如图7中可以看到，经过测量，每一只大鼠经造模取材后损伤区域均与预先设想规划的M1、M2运动皮质损伤相一致。对每一只颅脑损伤大鼠模型的病灶空腔进行测量对比后可以得出，每一只模型大鼠之间的所造成的空腔大小基本一致，无显著差异，偏差在允许误差范围之内。结合大鼠脑图谱的分析也可以认为损伤区域的功能分区无不可证差异。所以，颅脑损伤模型在形态学以及功能学分区中均具有组间一致性，证实了本次研究所开发的新型脑损伤模型的可行性。

3.2颅脑损伤模型的评估

在验证了颅脑损伤模型组间一致性后，制定了关于该模型流程化的制作方法，解决了模型制作的问题。在模型制作的基础上，为了验证颅脑损伤后的模型在神经功能行为上具有明确的功能损伤，在造模后七天将每一只实验大鼠单独进行行为学评分。评分方式选取神经损伤严重程度评分(NSS)表，根据每一只实验大鼠的评分，统计分析颅脑损伤后的神经功能损伤情况，统计数据如图8(Sham组为对照假手术组，TBI为颅脑损伤组)。统计数据显示，颅脑损伤模型大鼠与对照组相比较具有明显的神经功能损伤。

实施例3

1材料与试剂

1.1主要材料

陆军军医大学实验动物中心购买的220～250g雄性SD大鼠；

体外分离培养的神经干细胞。

1.2主要仪器

实验用仪器公司名称及产地

立体显微镜CarlZeiss公司，德国

Sartorius电子天平Thermofisher公司，美国

电子恒温水浴箱环科公司，南京

OLYMPUSIX71倒置相差显微镜OLYMPUS公司，日本

眼科手术器械金钟公司，上海

显微手术器械瑞沃德公司，深圳

SJ-CJ1FDQ单人超净工作台苏净公司，苏州

HERAcelli CO₂培养箱Thermofisher公司，美国

LSM780激光共聚焦显微镜CarlZeiss公司，德国

ST40低温离心机Thermofisher公司，美国

Millipore超纯水设备Millipore公司，德国

5427R超高速低温离心机Eppendorf公司，德国

微量移液器大龙兴创公司，北京

PH仪仪迈公司，上海

OPMIpico桌面型手术显微镜Zeiss公司，德国

显微手术器械医漫医疗器械，深圳

冰箱海尔公司，青岛

双极微手术电凝器春光医疗美容仪器有限公司，武汉

眼科手术器械金钟公司，上海

小动物立体定位仪瑞沃德公司，深圳

牙科钻

1.3试剂与耗材

试剂/耗材公司名称及产地

25cm²细胞培养瓶NEST公司，无锡

75cm²细胞培养瓶NEST公司，无锡

15mm玻底培养皿NEST公司，无锡

60mm细胞培养皿NEST公司，无锡

100mm细胞培养皿NEST公司，无锡

100μm细胞筛Corning公司，美国

DMEM/F12 Gibco公司，美国

B27添加剂Gibco公司，美国

小鼠重组EGFPeprotech公司，美国

小鼠重组bFGFPeprotech公司，美国

Accutase细胞消化液Gibco公司，美国

0.01MPBS缓冲液博士德公司，武汉

0.25％胰酶Gibco公司，美国

胎牛血清(FBS)Gibco公司，美国

GlutamaxGibco公司，美国

多聚鸟氨酸(PLO)Sigma公司，德国

TritonX-100Sigma公司，德国

4％多聚甲醛博士德公司，武汉

5％BSA博士德公司，武汉

免疫荧光染色一抗稀释液碧云天公司，上海

免疫荧光染色二抗稀释液碧云天公司，上海

donkeyanti-rabbitIgG-CFL488Santa公司，美国

donkeyanti-mouseIgG-CFL555Santa公司，美国

donkeyanti-rabbitIgG-CFL555Santa公司，美国

donkeyanti-mouseIgG-CFL488Santa公司，美国

AlexaFluor488conjugatedphalloidin

reagentsLife公司，英国

DAPI染色液博士德公司，武汉

抗荧光淬灭剂博士德公司，武汉

Nestin抗体SOX2抗体Santa公司，美国三鹰公司，武汉

DCX抗体三鹰公司，武汉

Oligo2抗体三鹰公司，武汉

GFAP抗体Abcam公司，美国

褪黑素Melatoninpowder,≥98％(TLC)Sigma公司，德国

DMSO碧云天公司，上海

无水乙醇重庆川东化工公司

EBSS

CoCl₂

5％的水合氯醛溶液科隆化学品有限公司，成都市

4％的多聚甲醛溶液科隆化学品有限公司，成都市

医用碘伏施尔泰化学试剂公司，济南

3％的过氧化氢(H₂O₂)溶液施尔泰化学试剂公司，济南

生理盐水西南药业股份有限公司，重庆

2实验方法

2.1移植材料混合及分组

材料移植分组具体的配法如下：

实验前准备，每组45μl体系，预估使用10μl/只，神经干细胞悬浮液细胞量约为10⁶个/ml

1、基质胶组：30μl神经干细胞完全培养基+15μl MTX基质胶

2、神经干细胞悬浮液组：30μl神经干细胞完全培养基+15μl神经干细胞悬浮液

3、神经干细胞悬浮液+MTX基质胶组：15μl神经干细胞完全培养基+15μlMTX基质胶+15μl神经干细胞悬浮液

4、神经干细胞褪黑素基质胶移植组：15μl 75μM褪黑素溶液(神经干细胞完全培养基配制)+15μlMTX基质胶+15μl神经干细胞悬浮液对于神经干细胞与褪黑素共培养移植，在普通移植的基础上，我们把MatrixGel基质胶作为3D结构支撑材料混合，并且按照单一变量原则设置了以下分组：①MatrixGel基质胶(MTX)组；②神经干细胞悬浮液(NSC)组；③神经干细胞悬浮液+MatrixGel基质胶(NSC+MTX)组；④神经干细胞+Matrix Gel基质胶+褪黑素(NSC+MTX+Mel)组。并且为了维持每组之间细胞的一致性，在混合前对每一组细胞进行计数，保证对每一只颅脑损伤模型大鼠移植时，神经干细胞数量维持在1×10⁵个细胞。此外为了避免因为基质胶浓度的差异引起移植后胶体填充的强度差异而影响细胞在病灶区的修复效果，其中第2组为液体移植，其余每组基质胶移植的含量比例均为总体积的1/3。

2.2免疫组化苏木精-伊红(H&E)染色

(1)大鼠称重后按照50mg/kg的比例腹腔注射5％的水合氯醛溶液进行麻醉，放入托盘中，准备20ml注射器，生理盐水以及事先遇冷的4％多聚甲醛备用；大鼠麻醉后剪开胸腔，并且用夹子向上固定胸部肋骨，将大鼠心脏暴露于视野中；将装有生理盐水的灌注针刺入左心尖，随后将右心耳上部剪破，缓慢的注入生理盐水，经由体内循环***排出血液，直至右心耳流出澄清液体及血液排空；换用装有预冷的4％多聚甲醛溶液的注射器，同样缓慢的推入大鼠体内，使4％多聚甲醛溶液经由循环***将组织固定，过程中可见大鼠四肢及尾巴抽搐抖动。待大鼠身体僵硬后即为固定完成；固定后，沿脖颈处断头，从后脑部沿冠状中线剪开头部皮肤，剥除颅骨，取出脑组织，随后放入4％多聚甲醛溶液中避光保存；脑组织于4％多聚甲醛溶液中固定一天后，取出放入30％多聚甲醛蔗糖溶液(每100ml4％的多聚甲醛中加入30g蔗糖配制)，脱水三天更换30％的多聚甲醛蔗糖溶液，直至大鼠脑组织漂浮在溶液上层，固定后用0.01MPBS缓冲液漂洗去除多余的固定液，将脑组织转入70％乙醇中保存备用；

(2)梯度酒精脱水法，将脑组织按照顺序依次放入以下浓度的酒精溶液中进行脱水处理，70％、80％、90％、90％、无水乙醇，每一步处理约十分钟。随后再次按照依次使用50％二甲苯乙醇溶液、二甲苯、第二次二甲苯，每个浓度梯度处理12～15分钟，50％二甲苯乙醇混合液需要现配现用；

(3)将组织置于事先具有熔融蜡的100ml的具有和组织相对应的小烧杯中，于60℃恒温条件下，软蜡烧杯透蜡1小时，转移至硬蜡烧杯透蜡1小时；

(4)进行石蜡包埋，用60℃熔融的液体蜡将组织包埋，并固定在提前标记，4℃保存备用；

(5)对组织进行切片，将组织在切片机上固定安装好后，匀速摇动切片机手轮，获得5μm切片；

(6)将切好的蜡带用镊子将朝着刀片面的蜡带迅速平铺于37℃温水中，摊1～2分钟，待其完全展平，展开后进行捞片，用多聚赖氨酸包被的载玻片，将展平的蜡带轻轻捞起，最好使蜡带位于载玻片中央，以防后期处理磨损组织；

(7)烤片，全脑石蜡切片于65℃烘箱中烤片半小时，也可以于38℃烘片机烘烤过夜，使蜡带粘牢；

(8)脱蜡，依次使用第一次二甲苯脱蜡，再次二甲苯脱蜡各15分钟；

(9)梯度水化。将载玻片浸没在100％乙醇2次，每次5分钟，再依次浸没在90％、80％、70％乙醇溶液中各5分钟。切片于双蒸水中漂洗5分钟后进行染色；

(10)苏木精染色：将组织切片于苏木精染液中染色5分钟后，再将切片在自来水冲洗适宜时间，直至切片颜色变蓝。边观察边将切片在1％盐酸乙醇分化液进行分化，看到切片变红停止分化，在自来水小心冲洗切片，使切片返蓝

(11)伊红染色：切片于伊红中染色2秒，依次过75％酒精、85％酒精、95％酒精、100％酒精Ⅱ、100％酒精Ⅰ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅰ各5秒，并洗去多余浮色。连续两次二甲苯透明，各5分钟，65℃烘箱中烤干

(12)封片，用胶头滴管在切片一侧滴一滴中性树胶，并轻轻加压盖玻片，注意用力均匀，不要使盖玻片在载玻片上滑动，并避免气泡产生；

(13)显微镜观察和拍照：待切片干燥后，进行观察及拍摄。

2.3组织切片免疫荧光染色

2.3.1冷冻切片

(1)按照2.2(1)中的实验方法将大鼠脑组织取出，并脱水；

(2)将脱水的脑组织取出，切除小脑，使脑组织平置于切片冷冻台上；

(3)用OCT包埋剂将脑组织逐层完全包埋于冷冻台上，放入冰冻切片机进行冷冻处理，使包埋剂完全凝固，与冷冻台粘连；

(4)设置切片厚度为16μm，包埋好的脑组织放到切片架上，转动把手依次进行切片；

(5)在目的区域完成切片后，使用预冷的镊子夹取切片置于防冻液(30ml乙二醇+30g蔗糖+40ml 0.1M的PBS比例配制)中，做好标记放置于-20℃保存备用。

2.3.2组织切片免疫荧光染色

(1)将保存的切片捞出置于盛有0.01M PBS的24孔板中，清洗3次，每次5分钟，清洗完毕后将孔板内PBS吸净，加入适量的0.3％的Triton-X100透膜30分钟；

(2)透膜完毕，吸除Triton-X100，使用0.01MPBS清洗标本3次，每次5分钟；

(3)清洗完毕后吸除PBS，加入适量5％BSA室温下封闭2h；

(4)封闭结束后，吸去孔板内5％BSA封闭液，在各孔内加入适量的加入Nestin免疫荧光一抗(1：100)，将孔板盖好做好标记后置于免疫组化湿盒中，在4℃冰箱中中孵育过夜；

(5)孵育完成后，取出孔板，将一抗吸出回收，然后使用0.01M PBS轻摇洗涤3次，每次5分钟；

(6)将孔板内的PBS吸净，依照抗体来源，在孔板内加入适当的对应的免疫荧光二抗，室温下避光孵育2小时；

(7)吸去免疫荧光二抗，用0.01M PBS清洗孔板3次，每次5分钟；

(8)如需要对细胞进行双抗体共标或三抗体共标染色时，例如需要将GFAP，MAP2，Oligo2与Nestin双标染色，需要在上述Nestin荧光二抗孵育完成后，经过0.01M PBS清洗，再加入200μl与Nestin一抗不同来源的GFAP抗体(1：1000)，MAP2抗体(1：200)，Oligo2抗体(1：200)，然后同样放置于4℃冰箱中的免疫组化湿盒孵育过夜；

(9)再次将孵育的一抗吸除，加入0.01M PBS缓冲液清洗3次，每次5分钟；

(10)吸除0.01M PBS缓冲液后，加入200μl与先前加入的荧光二抗不同激发波长的IgG荧光二抗(1：400)在室温下避光孵育2小时；

(11)将孵育后的荧光二抗吸去，用0.01M PBS缓冲液清洗3次，每次5分钟；

(12)弃去清洗使用的0.01M PBS，加入200μl DAPI染色液，放置在室温环境避光孵育10分钟；

(13)吸去DAPI染色液，加入0.01M PBS缓冲液清洗3次，每次5分钟；

(14)清洗完毕后，向培养皿中加入适量0.01M PBS缓冲液，并滴加抗免疫荧光淬灭封片剂防止荧光淬灭，在激光共聚焦显微镜下观察拍照并保留图片；如不能及时进行观察检测，则应该将培养皿置于4℃冰箱中避光保存。

(15)观察检测后使用Zen2011软件对图片进行数据分析和处理。

3结果与分析

3.1损伤区HE染色

为了确定褪黑素和神经干细胞共同移植于大鼠颅脑损伤模型后每一项实验分组中的模型大鼠在病灶区周围的细胞修复情况，我们对模型大鼠进行灌注取材，并将脑组织依次脱水，进行石蜡切片。石蜡切片后按照免疫组化要求进行苏木精-伊红染色，标记病灶区周围的细胞形态，并且统计病灶区边缘200μm内的细胞数目，判断修复差异。根据免疫组化切片染色显示，添加Matrix Gel基质胶的实验模型大鼠病灶区周围细胞密集，与材料有明显的连接融合现象。对病灶区周围200μm范围的细胞进行计数分析中可以明显发现，与基质胶组以及神经干细胞悬浮液组相比，神经干细胞基质胶结合组以及神经干细胞+基质胶+褪黑素组周围细胞数目明显增多。在神经干细胞，基质胶与褪黑素共同移植的实验组中，病灶区周围的细胞数量比未经褪黑素处理的神经干细胞移植组明显增加，基本可以推断褪黑素在细胞移植的治疗中可以有效地促进神经干细胞的生长，并且保护神经干细胞在大鼠颅脑损伤后的病灶空腔中存活，增加细胞在病灶区的存活率。

3.2免疫荧光检测细胞移植修复水平

为了进一步验证褪黑素与神经干细胞共同移植后的神经功能修复效果，探究神经干细胞移植到损伤病灶区后的分化命运，我们在取得全脑组织后，在损伤区范围内进行冷冻切片，并且在切片后分别使用神经元标志物MAP2，星形胶质细胞标志物GFAP，少突胶质细胞Oligo2，神经干细胞标志物Nestin进行免疫荧光染色，检测病灶区周围细胞类型，推测在病理条件下神经干细胞的功能损伤修复策略。

免疫荧光染色结果分析发现，在损伤病灶区周围，Nestin+阳性细胞明显增多，并且与免疫组化结果一致。对GFAP，Oligo2，MAP2分化标志物染色分析可以发现，四组移植组的Oligo2染色均无明显区别(图12)，很少或几乎没有神经干细胞向Oligo2标记的少突胶质细胞分化。在NSC+MTX移植组中，GFAP+阳性率要高于其他组。添加Mel处理后，MAP2阳性表达升高，神经干细胞向神经元分化增多。对此我们可以推测，在正常的损伤模型病灶区中，添加基质胶后，神经干细胞移植效果提升显著。在常规病理条件下，神经干细胞自发的分化命运是在病灶区周围向星形胶质细胞分化，通过分化成星形胶质细胞，发挥整合受损神经网络，提供营养基础，调控病损环境改善达到修复神经功能受损的作用。而在添加褪黑素后，神经干细胞的分化命运向神经元方向发展，提高病灶区周围的神经元绝对数量，构建病损后的再生神经网络，更加直接的提升神经功能恢复效果。

3.3MRI磁共振技术检测

在大鼠颅脑损伤模型制作并且进行神经干细胞移植填充后，在第七天对实验大鼠进行小动物磁共振检测。通过磁共振检测技术对损伤区病损情况进行直观判断与评估。在磁共振T2相，高亮反应区域为颅脑损伤中的病灶区域。磁共振图像中可以观察发现，NSC+MTX+Mel组磁共振T2相中高亮信号区域大小要小于MTX组、NSC组以及NSC+MTX组，说明在经过细胞移植实验后七天的模型大鼠中，NSC+MTX+Mel组实验大鼠病灶区病变区域的恢复更好，具有更好的修复效果。

3.4神经功能的行为学评分

为了评估对大鼠颅脑损伤模型进行神经干细胞移植实验各组之间的神经功能恢复效果的差异性，使用神经功能损伤严重程度(NSS)评分表对大鼠模型的行为学进行评估。数据分析显示，使用褪黑素和神经干细胞共同移植填充到大鼠颅脑损伤模型中，其行为学评分相对其他实验组明显降低，表明该组大鼠在损伤后的神经功能恢复效果要优于其他三组模型大鼠。说明基质胶在修复过程中明确起到对组织结构支撑，并且促进神经功能恢复的效果。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种具有颅脑损伤修复功能的3D立体移植体系，其特征在于，由移植材料和基质胶组成；

所述移植材料为褪黑素和神经干细胞；

所述基质胶与所述移植材料中褪黑素溶液和神经干细胞悬浮液的体积比为0.8～1.2：0.8～1.2：0.8～1.2。

2.根据权利要求1所述具有颅脑损伤修复功能的3D立体移植体系，其特征在于，在移植材料中，褪黑素溶液的终浓度不低于25μmol/L，所述神经干细胞的浓度为10⁵～10⁷/ml。

3.权利要求1或2所述3D立体移植体系在制备治疗颅脑损伤的药物中的应用。

4.权利要求1或2所述3D立体移植体系在制备神经功能恢复的药物中的应用。

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