CN110585432B - 成纤维细胞生长因子受体1在制备防治肠道病毒71型感染药物中的应用 - Google Patents
成纤维细胞生长因子受体1在制备防治肠道病毒71型感染药物中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及生物医学技术领域,具体是一种抗肠道病毒71型感染的新靶点及应用。本发明以人结肠癌细胞(Caco‑2)作为靶细胞,采用RNA干扰技术下调靶细胞膜受体的表达,来寻找可有效抑制EV71感染人结肠癌细胞的宿主因子,达到从源头(肠道)阻断EV71感染的目的。本发明通过实验发现成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)在EV71感染Caco‑2细胞中发挥着重要的作用,下调FGFR1的表达,能明显抑制EV71的感染。本发明提供了FGFR1在制备预防或治疗肠道病毒71型感染药物中的应用,为临床预防和治疗因EV71感染所导致的手足口病、脑膜炎、脑干脑炎或脊髓灰质炎等疾患提供了新的靶点和治疗方案。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域,具体地说,是一种抗肠道病毒71型感染 的新靶点及应用。
背景技术
肠道病毒71型(enterovirus 71,EV71)属于小核糖核酸病毒科肠道病毒 属人肠道A类病毒,是导致手足口病(Hand-foot-mouth disease,HFMD)的主 要病原体之一。目前,手足口病在世界多个地区暴发并流行,尤其是亚太地区。 手足口病主要发病人群为5岁以下婴幼儿,临床表现为发热,手、足、臀部以 及口腔粘膜等部位出现疱疹等症状;少数患儿可发展为重症患者,出现中枢神 经***(central nervous system,CNS)病变,包括无菌性脑膜炎、脑干脑炎、 脑脊髓炎以及神经源性肺水肿等,严重威胁着婴幼儿的生命健康[Solomon T,et al.Virology,epidemiology,pathogenesis,and control ofenterovirus 71.Lancet Infect Dis.2010,10(11):778-90]。手足口病特别是重症病例多由肠道病毒71型 (EV71)感染所致。然而,目前关于EV71引起手足口病的治疗尚无特异高效的抗病毒药物,临床上仍以对症治疗为主,在预防方面也无有效疫苗问世。
EV71的传播以粪-口途径最广,在此传播途径中,肠道是人体抵御病原体 的第一道屏障。动物实验研究证实,EV71经口腔接种小鼠后,最先在小肠组 织表现出病原体阳性[Chen YC,et al.A murine oral enterovirus 71infection model with centralnervous system involvement.Journal of General Virology,2004, 85(1):69-77]。因此,EV71首先通过对肠道***进行感染,在小肠道细胞内大 量快速复制,随后入血导致病毒血症并引发其它器官的感染。然而,在EV71 到达人体肠道***后,病毒如何侵入肠道细胞的机制尚不清楚。小肠作为人体 消化***重要器官,主要负责营养物质的消化与吸收,其腔面最外层为小肠粘 膜上皮细胞,对于抵御病原体的起着至关重要的作用。作为人结肠癌细胞系, Caco-2在形态学和生理学功能方面与人小肠粘膜上皮细胞相似,培养成熟的Caco-2为致密的单层细胞,具有与正常的小肠粘膜上皮细胞相同的极性和紧密 连接、微绒毛结构;且作为肿瘤细胞,比小肠粘膜上皮细胞更易培养。因此, 探明EV71感染Caco-2的机制并以此寻找新的抗病毒靶点,对于防治EV71感 染至关重要。而目前关于EV71感染Caco-2的具体分子机制仍不清楚。
病毒在感染宿主时,必须利用宿主细胞的各种分子及相关信号通路才能完 成自身的生命周期。其中,细胞因子受体已经被发现在病毒对宿主细胞的感染 以及在宿主细胞内复制的过程中具有重要的作用。比如,C-C趋化因子受体5 型(C-C chemokine receptortype 5,CCR5)自从1996年被发现作为HIV进入 的辅助受体的作用后一直是深入研究的焦点,促使了针对CCR5的小分子药物 的开发。2007年,maraviroc成为第一个临床批准的趋化因子受体抑制剂用于 HIV的治疗[Brelot A,et al.CCR5Revisited:How Mechanisms ofHIV Entry Govern AIDS Pathogenesis.J Mol Biol.2018,430(17):2557-2589]。近年来研究也 发现血小板衍生生长因子受体α(platelet-derived growth factor receptor-alpha, PDGFR-α)作为腺相关病毒5型和人巨细胞病毒的受体介导病毒的入侵[DiPasquale G,et al.Identification of PDGFR as a receptor for AAV-5transduction.Nat Med.2003,9(10):1306-12;Wu Y,et al.Human cytomegalovirus glycoproteincomplex gH/gL/gO uses PDGFR-αas a key for entry.PLoS Pathog.2017, 13(4):e1006281]。还有研究表明乙型肝炎病毒X蛋白通过上调白细胞介素-7受 体(IL7R)的表达以促进乙型肝炎病毒相关肝癌细胞的增殖和迁移[Kong F,et al. Hepatitis B virus Xprotein promotes interleukin-7receptor expression via NF-κB and Notch1pathwayto facilitate proliferation and migration of hepatitis B virus-relatedhepatoma cells.J Exp Clin Cancer Res.2016,35(1):172]。IL7R的上 调还被报道促进HIV感染的早期过程[Zhang M,et al.HIV regulation of the IL-7R:a viral mechanismfor enhancing HIV-1replication in human macrophages in vitro.J LeukocBiol.2006,79(6):1328-38]。此外,还有研究发现敲低白细胞介 素10受体(IL10R)可以显著抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒的复制[Chen Y,et al. Knockdown expression of IL-10Rαgene inhibits PRRSV replication and elevates immune responses in PBMCs ofTibetan pig in vitro.Vet Res Commun.2018, 42(1):11-18]。因此,细胞因子受体已成为抗病毒药物筛选的重要靶标。
白细胞介素4受体(interleukin 4receptor,IL4R)是一种I型跨膜蛋白。 其广泛表达于全身各种组织器官中,在免疫器官如阑尾,脾脏,***,骨髓 和扁桃体以及肺和结肠等组织器官中高度富集 [https://www.proteinatlas.org/ENSG00000077238-IL4R/tissue]。IL4R结合白细胞 介素4和白细胞介素3等配体后可以发挥多种免疫调节效应,如调节B细胞中 IgE抗体的产生,促进Th2细胞的分化以及导致巨噬细胞替代性激活等。随着研究的深入,发现通过抑制IL4R表达或敲除IL4R可以显著抑制呼吸道合胞病 毒(RSV)导致的新生小鼠肺病变以及鼻病毒(RV)诱导的气道粘液化生[Ripple MJ,etal.Immunomodulation with IL4R alpha antisense oligonucleotide preventsrespiratory syncytial virus-mediated pulmonary disease.J Immunol.2010, 185(8):4804-11;Schneider D,et al.Neonatal rhinovirus infection induces mucousmetaplasia and airways hyperresponsiveness.J Immunol.2012,188(6):2894-904]。还有研究表明,HIV 1型tat基因可以通过促进IL4R转录上调来维持其自身的 复制[HusainSR,et al.Transcriptional up-regulation of interleukin 4receptors by humanimmunodeficiency virus type 1tat gene.AIDS Res Hum Retroviruses.1996, 12(14):1349-59]。这些结果都表明IL4R在多种病毒的致病过程中发挥重要作 用。
成纤维细胞生长因子受体1(Fibroblast growth factor receptor 1,FGFR1),也称为碱性成纤维细胞生长因子受体1,fms相关酪氨酸激酶-2或CD 331,属 于是成纤维细胞生长因子受体家族成员(除FGFR1外还包括FGFR2,FGFR3, FGFR4和FGFRL1)。FGFR1是一种具有酪氨酸激酶活性的细胞表面膜受体, 其配体是成纤维细胞生长因子家族的特异性成员。当FGFR1与合适的配体如 FGF1结合时,通过激活信号通路引发细胞应答,参与多种生物过程。研究发 现,FGFR1在多种病毒的感染与致病中具有重要作用。比如,FGFR1可以作 为腺相关病毒2(AAV2)和腺相关病毒3(AAV3)的共受体,介导AAV2对 宿主细胞的感染[QingK,et al.Human fibroblast growth factor receptor 1is a co-receptor forinfection by adeno-associated virus 2.Nat Med.1999,5(1):71-7; Blackburn SD,etal.Attachment of adeno-associated virus type 3H to fibroblast growth factorreceptor 1.Arch Virol.2006,151(3):617-23]。Epstein-Barr病毒 (EBV)编码的潜伏膜蛋白1(LMP1)通过增加FGFR1表达及介导FGFR1 信号传导途径的组成型激活,促进有氧糖酵解和人鼻咽上皮细胞的转化,从而参 与非角化鼻咽癌的发病[Lo AK,et al.Activationof the FGFR1signalling pathway by the Epstein-Barr virus-encoded LMP1promotesaerobic glycolysis and transformation of human nasopharyngeal epithelialcells.J Pathol.2015, 237(2):238-48]。但是,也有研究表明,FGFR1可以作为宿主细胞抵御甲型流 感病毒复制的机制,siRNA干扰FGFR1可以促进A549细胞中甲型流感/PR8 和H5N1病毒复制,慢病毒介导的外源性FGFR1表达显着抑制甲型流感病毒 复制[Liu X,et al.AFunctional Role of Fibroblast Growth Factor Receptor 1 (FGFR1)in theSuppression of Influenza A Virus Replication.PLoS One.2015, 10(4):e0124651]。
然而,目前还没有任何关于IL4R和FGFR1分子在肠道病毒尤其是EV71 感染宿主细胞中作用的报道,对于这两个分子进行深入研究不仅能够提升对 EV71感染与致病机制的认识,也可以为预防与治疗EV71感染提供新的思路 与靶点。
发明内容
本发明的目的在于提供一种抗肠道病毒71型感染的新靶点,即成纤维细 胞生长因子受体1(Fibroblast growth factor receptor 1,FGFR1)。
本发明的另一目的在于提供成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)分子的 新用途,特别是在抗肠道病毒71型感染中的应用。
本发明的第三目的在于提供干扰成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)分 子表达的siRNA及其应用。
为了实现上述目的,本发明的主要技术方案是:
本发明,以人结肠癌细胞(Caco-2)作为靶细胞,采用RNA干扰技术下 调靶细胞细胞因子受体的表达,来寻找可有效抑制EV71感染人结肠癌细胞 (Caco-2)的宿主因子,达到从源头(肠道)阻断EV71感染的目的。本发明 选择了一组宿主细胞细胞因子受体来进行筛选,这些主要分布在细胞膜上的分 子在宿主细胞的信号转导中发挥着重要作用,它们往往也是在病毒感染过程中 易被病毒“劫持”并利用的分子。这些分子包括:骨形态发生蛋白受体2型 (BMPR2)、C-C趋化因子受体5型(CCR5)、C-C趋化因子受体7型(CCR7)、 成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)、白细胞介素17受体B(IL17RB)、白 细胞介素1受体1(IL1R1)、白细胞介素4受体(IL4R)、血小板衍生的生长 因子受体A(PDGFRA)、Toll样受体2(TLR2)和肿瘤坏死因子受体超家族 成员11B(TNFRSF11B)。通过检索NCBI GeneBank得到全序列和mRNA序列,利用现有的网络资源及常用软件对这些基因进行生物学分析,选择编码区 作为siRNA设计的靶序列,然后设计siRNA,通过下调这些分子,来观察对 EV71感染的影响。
本发明通过实验发现成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)在EV71感染 Caco-2细胞中发挥着重要的作用,下调FGFR1的表达,能显著抑制EV71的 感染。
基于此,本发明的第一方面,提供一种抗肠道病毒71型感染的新靶点, 即成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)。
本发明的第二方面,提供成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)在制备预 防或治疗肠道病毒71型感染药物中的应用。
进一步的,所述的应用是指将成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)作为 预防或治疗肠道病毒71型感染的干预靶点。
进一步的,所述的肠道病毒71型感染导致的疾病包括但不限于手足口病、 脑膜炎、脑干脑炎和脊髓灰质炎等。即,本发明还提供成纤维细胞生长因子受 体1(FGFR1)在制备预防或治疗由肠道病毒71型感染导致的包括但不限于手 足口病、脑膜炎、脑干脑炎或脊髓灰质炎等疾病的药物中的应用。
进一步的,所述的药物是通过抑制或下调成纤维细胞生长因子受体1 (FGFR1)的表达量抑制肠道病毒71型感染的药物。
本发明的第三方面,提供抑制或下调成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1) 的表达量的试剂在制备预防或治疗肠道病毒71型感染药物中的应用。
进一步的,所述的抑制或下调FGFR1的表达量的试剂指特异性干扰 FGFR1基因表达、加工的siRNA、shRNA、miRNA或反义核苷酸,或包含siRNA、 shRNA、miRNA或反义核苷酸的重组载体(如质粒)等。
在本发明的一个实施方式中,所述的抑制或下调FGFR1的表达量的试剂 是成纤维细胞生长因子受体1的干扰RNA(siRNA),所述的干扰RNA的序列 选自以下任一:
GUAGCAACGUGGAGUUCAU(SEQ ID NO:10)
GCAAGAUUGGCCCAGACAA(SEQ ID NO:11)
GGUCGGUCAUCGUCUACAA(SEQ ID NO:12)
其中,以如SEQ ID NO:10所示的siRNA下调FGFR1的表达量效果最佳, 且降低EV71对Caco-2细胞的感染最为明显。
本发明的第四方面,提供一种预防或治疗肠道病毒71型感染的药物,所 述的药物中包含抑制或下调FGFR1的表达量的试剂。
本发明优点在于:
本发明筛选到能够抑制EV71感染Caco-2细胞的一个新的宿主细胞分子 FGFR1。FGFR1基因下调以后,不影响细胞正常的生理功能,但明显抑制了 EV71对Caco-2细胞的感染。因此本发明为临床预防和治疗因EV71感染所导 致的手足口病、神经***和心肺***疾患提供了新的靶点和治疗方案。
附图说明
图1为转染有效siRNA后靶基因的相对表达量及细胞毒性,图中主坐标 轴(左y轴)表示采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)法检测的靶基因的相对 表达量(以RQ值表示),次坐标轴(右y轴)表示采用CCK-8试剂盒检测的 转染各siRNA对细胞的毒性(以标准化到空转对照组的细胞存活率表示);
CTRL:不转染任何siRNA的Caco-2细胞组(空转对照组);
siRNA:转染针对各目的基因的siRNA的Caco-2细胞组(实验组);
*:p<0.05。
图2为免疫荧光法检测各转运相关膜蛋白下调后对EV71感染的影响,其 中A为下调各蛋白后对病毒感染性的荧光观测图,B为下调各分子后相对于空 转对照组病毒感染率的统计图;
CTRL:不转染任何siRNA的Caco-2细胞组(空转对照组);
NT:转染non-targeting siRNA的Caco-2细胞组(阴性对照组);
siRNA:转染针对各目的基因的siRNA的Caco-2细胞组(实验组)
水平虚线:相对于空转对照组病毒感染率为50%的参考线。
图3为转染靶向FGFR1(A)和IL4R(B)的不同序列siRNA后,采用 实时荧光定量PCR(RT-PCR)法检测靶基因的mRNA水平(以FGFR1和IL4R 基因相对表达量RQ值表示);
CTRL:不转染任何siRNA的Caco-2细胞组(空转对照组);
NT:转染non-targeting siRNA的Caco-2细胞组(阴性对照组);
FGFR1-10:转染针对FGFR1基因的siRNA(SEQ ID NO:10)的Caco-2 细胞组;
FGFR1-11:转染针对FGFR1基因的siRNA(SEQ ID NO:11)的Caco-2 细胞组;
FGFR1-12:转染针对FGFR1基因的siRNA(SEQ ID NO:12)的Caco-2 细胞组;
IL4R-19:转染针对IL4R基因的siRNA(SEQ ID NO:19)的Caco-2细胞 组;
IL4R-20:转染针对IL4R基因的siRNA(SEQ ID NO:20)的Caco-2细胞 组;
IL4R-21:转染针对IL4R基因的siRNA(SEQ ID NO:21)的Caco-2细胞 组;
*:p<0.05。
图4为下调FGFR1和IL4R后对EV71感染的影响,A和B为通过RT-PCR 法检测病毒RNA载量(以EV71RNA的相对表达量RQ值表示),C和D为 通过Western Blot法检测病毒蛋白表达量;
CTRL:不转染任何siRNA的Caco-2细胞组(空细胞组);
NT:转染non-targeting siRNA的Caco-2细胞组(阴性对照组);
FGFR1-10:转染针对FGFR1基因的siRNA(SEQ ID NO:10)的Caco-2 细胞组;
FGFR1-11:转染针对FGFR1基因的siRNA(SEQ ID NO:11)的Caco-2 细胞组;
FGFR1-12:转染针对FGFR1基因的siRNA(SEQ ID NO:12)的Caco-2 细胞组;
IL4R-19:转染针对IL4R基因的siRNA(SEQ ID NO:19)的Caco-2细胞 组;
IL4R-20:转染针对IL4R基因的siRNA(SEQ ID NO:20)的Caco-2细胞 组;
IL4R-21:转染针对IL4R基因的siRNA(SEQ ID NO:21)的Caco-2细胞 组;
GAPDH:内参蛋白甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase)(36kDa);
*:p<0.05。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
本发明所用试剂和原料均市售可得或可按文献方法制备。下列实施例中未 注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件如Sambrook等人《分子克隆: 实验室指南》(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述 的条件,或按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否 则百分比和份数按重量计算。
实施例1:
1设计、合成各转运相关膜蛋白的特异性siRNA序列。
1.1针对各个目的基因,检索NCBI GeneBank得到全序列和mRNA序列, 利用现有的网络资源及常用软件对AXIIR进行生物学分析,选择编码区作为 siRNA设计的靶序列。参照siRNA设计原则,并通过GeneBank数据库的blast 功能与人类基因组序列进行对比,确保无同源性;排除aitisense链的5’端连续 8个碱基与其它基因配对的潜在siRNA;排除任何一段连续14个碱基与其它 基因配对的潜在siRNA。并利用设计软件进行预评估测定,选择3个最佳的动 力学参数靶点进入后续实验流程,每一基因共合成3条干扰序列,见表1。
1.2单链siRNA的合成与纯化由Invitrogen公司完成。
表1.siRNA靶点的设计
2siRNA序列筛选与干扰效果鉴定
2.1RNA转染
转染步骤参照DharmaFECT-1(购于Horizon公司,货号T-2001-02)说明 书
1)Caco-2细胞(购自ATCC公司,货号HTB-37)以3×104/孔种于24孔 细胞培养板,37℃培养,待细胞密度为70%左右进行siRNA转染。
2)取4μL DharmaFECT-1加入46μL opti-MEM中并轻柔混匀,室温孵育5 分钟;另取5μL浓度为5μM的siRNA和46μL opti-MEM混合。孵育结束后, 将稀释的DharmaFECT-1转染试剂加入稀释的siRNA中,并轻柔吹吸混匀。室 温孵育15min后,加入Caco-2细胞中,补加400μL opti-MEM,使得RNA终 浓度为50nM。
3)6-8小时更换含10%胎牛血清(购买自Thermo Fisher scientific公司,货 号10437028)的DMEM培养基(购买自Thermo Fisher scientific公司,货号 12430062)。
2.2实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测各靶蛋白的mRNA水平
1)提取各组细胞的总RNA,具体步骤如下:
转染48小时后,去培养上清,在细胞中加入1ml RNAiso Plus(购买自 TAKARA公司,货号9109),充分混合冰上裂解细胞5-10分钟。将混合物转 移到EP管,加入1/5体积的氯仿,剧烈震荡15秒。于4℃12,000转/分钟离心 15分钟。将上层水相转移到新的EP管中,加入等体积异丙醇,充分混合,室 温静置10分钟。于4℃12,000转/分钟离心10分钟。弃上清,加入1ml冰冷 75%乙醇。于4℃12,000转/分钟离心10分钟。充分弃上清,室温晾干RNA沉 淀,加入去RNA酶水(Rnase Free dH2O)溶解沉淀,得到总RNA。
2)利用逆转录试剂盒(购买自TAKARA公司,货号RR036A)制备总 cDNA,具体步骤如下:
在PCR管中加入如下反应体系,
5×PrimeScript RT Master Mix 2μL
Total RNA 500ng
Rnase Free dH2O up to 10μL
轻柔混合混匀,置于37℃反应15分钟(逆转录反应),转移至85℃灭活5 秒(逆转录酶的失活反应)。
3)RT-PCR检测目的基因表达量
利用TB Green Premix Ex Taq试剂盒(购买自TAKARA公司,货号 RR420A)进行反应,反应体系如下,
利用Applied Biosystems 7300plus仪器进行两步法扩增:
4)采用ΔΔt法计算各靶基因相对表达量。
RQ=2-ΔΔt=2-[(Ct处理样本目的基因-Ct对照样本目的基因)-(Ct处理样本内参基因-Ct对照样本内参基因)]
干扰效率=1-RQ
3细胞毒性实验
采用CCK-8方法检测转染siRNA后对细胞增值的影响,具体步骤如下:
收集对数生长期细胞,以每孔3000个的密度接种于96孔板。培养细胞至 约70%融合度,转染各siRNA,培养48小时,弃去原有培养基,每孔加入含 10μL CCK-8试剂(购自日本同仁化学研究所,货号:CK04)的新鲜培养基 100μL,培养3-4小时后用多功能酶标仪检测各孔在450nm波长吸光度值。实 验独立重复3次,计算平均值,并将结果标准化到空转对照组。
4EV71病毒感染Caco-2细胞
4.1Caco-2细胞的EV71病毒感染实验
Caco-2细胞转染siRNA后48小时,进行EV71病毒感染实验。将培养上 清吸出,用预温PBS润洗2次,以MOI=0.1的病毒量接种EV71,37℃孵育 2h后弃去病毒液,并用预温PBS润洗3次,加入新鲜培养基继续培养。
4.2免疫荧光染色检测EV71抗原表达
Caco-2细胞感染病毒后继续培养48h,采用免疫荧光法检测病毒抗原的表 达,具体步骤如下:
1)细胞固定与透膜:将96孔板中的培养液移去,加入PBS清洗细胞2 次,每孔加入100μl预冷甲醇(兼具固定与透膜功能),于-20℃条件下固定透 膜20min,用预冷的PBS清洗细胞3次。
2)封闭:每孔加入100μl 3%BSA,于室温下孵育1h。
3)一抗孵育:每孔加入EV71特异性鼠源单抗10F0(1:1000稀释)100μl, 4℃摇床孵育过夜,用预冷的PBS洗涤3次。
4)二抗孵育:每孔加入AF 488荧光标记抗鼠IgG(1:1000稀释)100μl, 室温避光孵育1h,用预冷的PBS避光洗涤3次。
5)标记细胞核:每孔加入细胞核荧光染料DAPI(1:10000,PBS稀释), 室温避光孵育15min,用预冷的PBS避光洗涤3次。
6)荧光显微镜下检测并计算绿色AF 488阳性细胞比率。
4.3蛋白免疫印迹。
(1)用蛋白裂解液分别提取各组Caco-2细胞的总蛋白。
(2)蛋白质定量后分别将20ug蛋白加到10%浓度的SDA-PAGE凝胶中 电泳,并截取相应条带用电转仪转到PVDF膜上。
(3)蛋白的非特异性位点用5%的脱脂牛奶封闭,然后用稀释的EV71特 异性鼠源单抗10F0(1:1000稀释)孵育4℃过夜,用TBST缓冲液漂洗三遍。
(4)然后用HRP标记的羊抗兔IgG(1:1000稀释)室温孵育2小时,继 而用TBST缓冲液洗三遍。
(5)最后,利用显色液显色并拍照分析。
4.4RT-PCR检测细胞中EV71病毒量
Caco-2细胞感染病毒后继续培养48h,采用TRIzol提取对照组与干扰组 细胞的总RNA,并逆转录获得cDNA,通过RT-PCR检测EV71病毒量。具体 步骤同2.2所示。
实验结果:
1设计、合成并筛选有效的siRNA
针对各个目的基因序列,本发明设计了多个RNA干扰靶点序列,并利用 设计软件进行预评估测定,选择3个最佳的动力学参数靶点进入后续实验流程, 每一基因共合成3条干扰序列,如表1所示。
采用体外转染的方法,将各个基因的干扰RNA转染到Caco-2细胞中去, 48h后通过RT-PCR法检测各靶基因的相对表达量(如表2所示),最终筛选 到干扰效果最佳的siRNA序列(表2中加粗序列)进行后续实验。
表2RT-PCR法检测转染siRNA后靶基因的相对表达量
注:CTRL:不转染任何siRNA的Caco-2细胞组(空转对照组);
NT:转染non-targeting siRNA的Caco-2细胞组(阴性对照组);
siRNA:转染针对各目的基因的siRNA的Caco-2细胞组(实验组)。
2siRNA干扰后的干扰效率以及细胞毒性检测
挑选出的针对各宿主分子的有效siRNA转染Caco-2细胞,转染后48h通 过RT-PCR法检测各靶基因的相对表达量,同时采用CCK8检测转染后对 Caco-2细胞毒性的影响。
结果如图1所示,转染有效siRNA组与CTRL组相比,转染各siRNA后 能够明显抑制相应基因的表达水平(P<0.05)。转染FGFR1siRNA(SEQ ID NO:10)和IL4R siRNA(SEQ IDNO:21)的干扰效率分别高达83.36%和70.59%。
细胞毒性实验表明,各siRNA转染后并没有产生明显的细胞毒性(P> 0.05),对细胞正常的生理功能未产生影响,可用于后续实验。
3siRNA干扰后对EV71病毒感染的影响
转染各宿主分子的有效siRNA来下调宿主细胞相关分子的表达后,感染 相同剂量的EV71病毒,感染48h后,采用免疫荧光法检测各宿主分子下调后 对EV71感染的影响,发现与对照组相比,转染FGFR1siRNA(SEQ ID NO:10) 和IL4R siRNA(SEQ ID NO:21)分别使FGFR1基因和IL4R基因下调后,明 显降低了EV71对Caco-2细胞的感染(图2A)。通过计算病毒量发现,FGFR1 和IL4R基因下调后对病毒的抑制率分别达到87.90%和90.58%,而其余分子 的下调并没有明显抑制EV71对Caco-2细胞的感染(P>0.05)(图2B)。
为进一步明确FGFR1和IL4R在EV71感染中的重要作用,分别转染三条 针对FGFR1和IL4R分子的siRNA后观察对病毒感染性的影响。通过RT-PCR 法检测siRNA干扰效率。分别通过RT-PCR法和免疫印迹法检测EV71病毒载 量。结果表明不同的siRNA对FGFR1和IL4R分子的干扰效率不同(图3A、 3B),其中FGFR1siRNA(SEQ ID NO:10)和IL4R siRNA(SEQ IDNO:21) 的干扰效率最高,与前面的结果相一致。检测干扰后对EV71感染性的影响发 现,三条FGFR1和三条IL4R分子的siRNA对病毒感染的抑制率均可达到50% 以上,并且随着对FGFR1和IL4R分子的干扰效率的增高,Caco-2细胞中的病 毒量也显著下降(图4A-4D),与免疫荧光法检测结果相一致。这些结果表明, FGFR1和IL4R分子在EV71感染Caco-2细胞中发挥着重要作用。
因此,FGFR1和IL4R可作为抑制EV71对Caco-2细胞感染的新的宿主靶 点。
通过以上实验结果证明:本发明筛选到能够抑制EV71感染Caco-2细胞的 两个新的宿主细胞分子FGFR1和IL4R。FGFR1和IL4R基因下调以后,不影 响细胞正常的生理功能,但明显抑制了EV71对Caco-2细胞的感染。因此本发 明为临床预防和治疗EV71感染提供了新的靶点和治疗方案。
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明,但本发明创造并不限 于所述实施例,熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可 做出种种的等同的变型或替换,这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要 求所限定的范围内。
序列表
<110> 中国人民解放军第二军医大学
<120> 成纤维细胞生长因子受体1在制备防治肠道病毒71型感染药物中的应用
<130> /
<160> 30
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 1
ccaagagugu cacuaugaa 19
<210> 2
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 2
cuacuaguuu gccuuugaa 19
<210> 3
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 3
gccuuaugcu uuggauaca 19
<210> 4
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 4
gccuuaugcu uuggauaca 19
<210> 5
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 5
cccaaagucu cucacauua 19
<210> 6
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 6
gcaagggaag gaauaugua 19
<210> 7
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 7
cuggucgugu ugaccuaua 19
<210> 8
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 8
ggacgugcgg aacuuuaaa 19
<210> 9
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 9
ucccuaucau guacuccau 19
<210> 10
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 10
guagcaacgu ggaguucau 19
<210> 11
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 11
gcaagauugg cccagacaa 19
<210> 12
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 12
ggucggucau cgucuacaa 19
<210> 13
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 13
gcagggaucu aucuaaugu 19
<210> 14
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 14
ggucuacuuu agagagauu 19
<210> 15
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 15
gcagaaguga ggucauccu 19
<210> 16
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 16
gaaugagccu aacuuaugu 19
<210> 17
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 17
ggaguacccu caucacagu 19
<210> 18
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 18
gguggaggau ucaggacau 19
<210> 19
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 19
gucaacauuu ggagugaaa 19
<210> 20
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 20
cuuccaccuu cgggaagua 19
<210> 21
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 21
ccaagcucuu gcccuguuu 19
<210> 22
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 22
gcaucacaau gcuggaaga 19
<210> 23
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 23
ggcuaagaau cuccuugga 19
<210> 24
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 24
ggaacagccu auggauuaa 19
<210> 25
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 25
gaacuaucca cuggugaaa 19
<210> 26
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 26
cucccucuua cccauguua 19
<210> 27
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 27
cccucucuac aaacuuuaa 19
<210> 28
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 28
ggcuuagugu cuugguaga 19
<210> 29
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 29
guaccuucau uaugacgaa 19
<210> 30
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 30
guaccuaccu aaaacaaca 19
Claims (3)
1.抑制或下调成纤维细胞生长因子受体1的表达量的试剂在制备预防或治疗肠道病毒71型感染药物中的应用;所述的抑制或下调成纤维细胞生长因子受体1的表达量的试剂指特异性干扰成纤维细胞生长因子受体1基因表达、加工的siRNA、shRNA、miRNA或反义核苷酸,或包含siRNA、shRNA、miRNA或反义核苷酸的重组载体。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述的抑制或下调成纤维细胞生长因子受体1的表达量的试剂在制备预防或治疗由肠道病毒71型感染导致的手足口病、脑膜炎、脑干脑炎或脊髓灰质炎的药物中的应用。
3.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述的抑制或下调成纤维细胞生长因子受体1的表达量的试剂是成纤维细胞生长因子受体1的干扰RNA,所述的干扰RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12中任一所示。
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瑞戈非尼的毒性反应管理现状;高杰,等;《现代医药卫生》;20170531;第33卷(第10期);1484-1487 * |
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