CN109055374B - 特异性抑制OCT1基因表达的shRNA及应用 - Google Patents

特异性抑制OCT1基因表达的shRNA及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于医药分子生物学技术领域，具体涉及特异性抑制OCT1基因表达的shRNA及应用；所述shRNA分子为shOCT1‑2或shOCT1‑5，所述shRNA通过慢病毒载体包装成慢病毒后感染卵巢癌细胞，能够与OCT1基因的mRNA结合，高效地干扰其转录后翻译，从而抑制卵巢癌细胞在体外的迁移和侵润及在活体小鼠体内的转移；本发明的shRNA有望应用于制备高效、特异性强、副作用小的卵巢癌靶向药物。

Description

特异性抑制OCT1基因表达的shRNA及应用
技术领域
本发明属于医药分子生物学技术领域，具体涉及特异性抑制OCT1基因表达的shRNA及应用。
背景技术
卵巢癌为发生在女性卵巢组织的恶性肿瘤，是女性妇科肿瘤中最常见的恶性肿瘤之一，发病率仅次于子***、子宫体癌。由于卵巢的早期发病症状不明显，且目前早期诊断技术还不够成熟，大多数被诊断出患有卵巢癌的患者都处于中晚期状态，病灶脱离原发位转移并侵袭包括***、肺脏、肝脏、肠道、膀胱等身体的其他器官，导致治疗及预后效果极差，5年生存率低于20%。
卵巢癌因其不同的病理分型而需应用不同的治疗方案，标准的治疗方案包括手术治疗联合基于铂、紫杉烷的化学疗法等进行综合治疗，但常规的治疗方案效果并不尽如人意，术后的复发率高达70％，且复发后肿瘤大都对应用的化疗药物产生耐药性，故而寻求一种高效、术后复发率低且不易引起肿瘤耐药性的治疗方法与手段已成为卵巢癌治疗领域亟待解决的热点与难题之一。大量研究表明导致卵巢癌高发病率和高死亡率的主要原因是该恶性肿瘤超强的转移和侵袭特征，因此寻找一种能够有效抑制卵巢癌细胞转移和侵袭的方法，为降低卵巢癌患者术后复发率，提高患者生存率的关键。
RNA干扰技术(RNAinterference, RNAi)是物种在进化上的一种高度保守的基因防御机制，即一种依赖于双链RNA特异性短序列实现转录后的基因沉默的技术。目前实验室常用的RNAi技术主要有siRNA寡核苷酸载体与shRNA慢病毒质粒表达载体。siRNA是短的双链RNA，大小在19-29 nt左右，3´端有两个游离的碱基，可激活RNA的干扰，通过与目标mRNA互补序列结合，特异性地实现mRNA降解。但是siRNA在细胞中的表达是瞬时的，发挥作用的时间比较短。相对于siRNA，shRNA可以通过病毒介导的转染保持稳定，能够减少脱靶效应。shRNA包括两个短的反向重复序列，中间由茎环结构进行分割，组成一个类似发夹的结构。shRNA首先被***到慢病毒载体上形成重组慢病毒质粒，慢病毒质粒与其他辅助质粒借助于293FT细胞形成慢病毒，最终用慢病毒转染细胞发挥shRNA的沉默作用。
OCT1又称POU2F1，是POU家族中首个被鉴定出来的转录因子。OCT1作为重要的转录调控因子，在癌症发生发展过程中也起到了重要的作用。对OCT1与肿瘤相关的研究发现，不同类型的癌症中均伴随着OCT1在不同程度上的异常表达，OCT1已经被证实在某些癌症中存在高表达现象，并且和患者的低存活率密切相关。癌细胞转移是肿瘤恶化的标志，OCT1可通过促进肿瘤细胞的迁移和侵润从而增强癌症的转移能力。
肿瘤细胞的异常代谢是维持肿瘤细胞生长的必要条件，OCT1在肿瘤细胞中具有促进代谢活动的作用，干扰OCT1蛋白的活性使肿瘤代谢改变很有可能运用于癌症的治疗。但是目前没有关于shRNA干扰OCT1基因在卵巢癌组织中表达情况及作用研究的相关报道。
发明内容
针对上述问题，本发明的目的在于提供一种特异性抑制OCT1基因表达的shRNA及其在卵巢癌的诊断、治疗及预后评估中的应用。
本发明通过观察沉默OCT1基因对卵巢癌细胞迁移侵润作用和在小鼠体内转移能力的影响，判断沉默OCT1基因的shRNA序列的特异性，验证可沉默OCT1基因的shRNA对卵巢癌细胞迁移侵润的抑制作用和抑制卵巢癌细胞在小鼠体内转移的作用。
本发明提供特异性抑制OCT1基因表达的shRNA，所述shRNA为shOCT1-2 或shOCT1-5，所述shOCT1-2和shOCT1-5的序列如下所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
所述沉默OCT1基因表达的shRNA分子的用途，所述shRNA能够沉默卵巢癌细胞中OCT1基因的表达，从而显著抑制卵巢癌细胞的迁移侵润能力，同时抑制卵巢癌细胞在小鼠体内的转移。
所述沉默OCT1基因表达的shRNA序列用途，可以基于该序列开发制备抑制卵巢癌细胞迁移侵润的基因药物。
本发明基于OCT1基因的mRNA序列，设计筛选出2条shRNA可以显著降低OCT1基因在卵巢癌细胞中的表达。通过构建慢病毒载体pLKO.1-TRC-shOCT1，用lipofectmin2000将目的质粒与辅助质粒pLP1、pLP2和pLPSVG转入293FT细胞中，制备并收集病毒，之后用含目标shOCT1序列的慢病毒感染卵巢癌细胞株SKOV3，用Puromycin筛选出具有抗性的细胞用于实验，并设立对照组（不含目标shOCT1序列的慢病毒）。用Western blotting技术检测目的蛋白OCT1验证shRNA对卵巢癌细胞中OCT1基因表达的沉默作用；通过Transwell小室实验检测shRNA对SKOV3细胞迁移和侵润能力的影响；通过体外动物实验探索shRNA对SKOV3细胞在小鼠体内转移的影响。
本发明的有益效果为：
本发明中所涉及的shOCT1-2和shOCT1-5对SKOV3细胞中OCT1基因的表达有显著的沉默作用；Transwell小室实验证实shOCT1-2和shOCT1-5都能抑制SKOV3细胞的迁移和侵润；体外动物实验证实shOCT1-2和shOCT1-5能显著抑制SKOV3细胞在小鼠体内的转移。本发明提供的一种shRNA分子在未来卵巢癌的靶向基因药物研发和治疗中具有巨大的潜在价值。
附图说明
图 1 为琼脂糖凝胶电泳验证重组质粒的成功构建，图中，M：DNA marker；1为酶切的空载质粒PLKO.1-TRC，记为pLKO.1-control；2-6为酶切成功构建的慢病毒载体pLKO.1-TRC-shRNA-OCT1制备的质粒，分别记为pLKO.1-shOCT1-1，pLKO.1-shOCT1-2，pLKO.1-shOCT1-3，pLKO.1-shOCT1-4和pLKO.1-shOCT1-5。
图2为Western blot检测shRAN对OCT1基因在SKOV3细胞中的蛋白表达水平的抑制情况，图中，Vector为对照组，用pLKO.1-TRC空载质粒感染；其他为实验组，SKOV3细胞分别感染慢病毒质粒，记为shOCT1-1，shOCT1-2，shOCT1-3，shOCT1-4和shOCT1-5。
图3为成功制备的质粒shOCT1-1，shOCT1-2，shOCT1-5对SKOV3细胞迁移和侵润的影响；其中图3A和3C为利用Transwell检测shOCT1对细胞迁移影响的电镜图及统计结果；图3B和3D为shOCT1对SKOV3细胞侵润影响的电镜图及统计结果；**表示P＜0.01，***表示P＜0.001，n=3。Vector为对照组，shOCT1-1，shOCT1-2，shOCT1-5为实验组。
图4为成功制备的质粒shOCT1-2，shOCT1-5在体内抑制SKOV3细胞的转移情况，其中图A为对照组、shOCT1-2组和shOCT1-5组小鼠的肺形态；图B为对照组、shOCT1-2组和shOCT1-5组小鼠肺结节数统计分析结果；图C为对照组、shOCT1-2组和shOCT1-5组小鼠肺重量统计分析结果。
具体实施方式
下面将结合附图和具体实施例对本发明进行详细的解释和介绍。
实施例1：沉默OCT1基因表达的慢病毒质粒的构建
首先基于OCT1基因（在GENABANK中的登录号为NM_002697）的mRNA序列设计 5个shRNA，命名为shRNA-OCT1（5个shRNA记为shOCT1-1、shOCT1-2、shOCT1-3、shOCT1-4、shOCT1-5）如表1所示。将这5对shRNA引物退火形成5条双链寡核苷酸短片段，连接到双酶切的慢病毒载体PLKO.1-TRC上，酶切位点为EcoRⅠ和AgeⅠ（生工生物工程（上海）股份有限公司）。将连接产物通过热激法转化到DH5α大肠杆菌感受态细胞（诺唯赞生物科技有限公司）中，置于含氨苄抗性的LB固体培养基上37 ℃培养16 h，挑取单个菌落于含氨苄抗性LB液体培养基中摇菌，37 ℃、220 rpm、16 h，收集菌体提质粒，酶切验证质粒，将酶切的阳性质粒送于华大基因测序验证。测序显示构建成功的慢病毒质粒将用于后续实验。
表1. shRNA序列
Figure DEST_PATH_IMAGE002
图 1 为琼脂糖凝胶电泳验证重组质粒的成功构建，图中，M：DNA marker；1为酶切的空载质粒pLKO.1-TRC，记为pLKO.1-control；2-6为酶切成功构建的慢病毒载体pLKO.1-TRC-shOCT1制备的质粒，分别记为pLKO.1-shOCT1-1，pLKO.1-shOCT1-2，pLKO.1-shOCT1-3，pLKO.1-shOCT1-4和pLKO.1-shOCT1-5。将已构建的pLKO.1-shOCT1质粒进行质粒转化，并挑单克隆进行培养后抽提质粒，将部分质粒进行双酶切验证。图中，pLKO.1-control和5个pLKO.1-shOCT1质粒分别进行双酶切后进行跑胶，可以看到pLKO.1-control（对照组）酶切产物出现了两条带，其中下面一条条带位于500和1000 bp之间，这和双酶切EcoRⅠ和BamHⅠ两个位点间的片段726 bp大小吻合，上面一条条带位于7000和10000 bp之间，即为酶切后的线性载体。而5个pLKO.1-shOCT1质粒均只有一条条带，大小在7000-10000 bp之间并且略大于线性载体条带。这是因为pLKO.1-shOCT1质粒构建时破坏了EcoRⅠ酶切位点，质粒双酶切验证的时候只能酶切BamHⅠ位点使质粒线性化，以上结果证明质粒构建成功。
实施例2：细胞慢病毒的制备及慢病毒转染细胞
首先制备混合液A，实验组的A液是0.75µg pLP1+0.35 µg pLP2+0.49 µg pLPSVG+0.61 µg pLKO.1-TRC-shOCT1，对照组的A液是0.75 µg pLP1+0.35 µg pLP2+0.49 µgpLPSVG+0.61 µg PLKO.1-TRC，加到0.5 mL的低血清OPTI-MEM培养基中，轻轻混匀，室温孵育5 min。
然后制备混合液B，取9 μL脂质体Lipofectmin2000（购于Invitrogen公司，美国）加到0.5 mL的OPTI-MEM，轻轻混匀，室温放置 5min。
将实验组和对照组的A液分别和B液混匀，室温孵育20 min。消化293FT细胞（购于Thermo Fisher Scientific），并在显微镜下计数，调整细胞密度为培养皿底面积的三分之一。将293FT的细胞混悬液与AB混合液轻轻充分混匀，并转移到培养皿中，轻轻摇晃，使混匀铺平底部。将培养皿放置在培养箱中孵育12 h后，给细胞换液，继续培养。培养两天后，用5mL的灭菌注射器吸取细胞上清液，再经0.45 μm微孔滤膜过滤掉细胞上清杂质即可收集到病毒。
接下来用收集到的病毒转染SKOV3细胞（购于ATCC细胞资源中心，美国）：第一天，种板，数细胞，调整细胞密度为6 cm培养皿底面积的三分之一；第二天，病毒感染，拿出6 cm培养皿，弃上清，病毒与培养基1：1混合加入，并加入8 mg/mL 聚凝胺（polybrene)（Sigma生物公司，美国）使作用浓度为8 µg/mL，放入培养箱，孵育8 h；孵育8 h后，弃上清，给细胞换液，继续放入培养箱培养两天；培养两天后，弃上清，用1000 mg/mL嘌呤霉素(puromycin;PM)（Biosharp生物科技公司，中国）按1：1000稀释，筛选2-3天；重新种板：将筛选两天后的细胞消化下来重新种回培养皿中，此时，活细胞为具有抗性的细胞，可用于实验。
实施例3：Western blotting检测对照组和试验组中OCT1基因在SKOV3细胞中的表达水平
收集嘌呤霉素(puromycin;PM )筛选后实验组和对照组存活的SKOV3细胞，分别提取细胞总蛋白，Western blot检测不同组细胞中目的蛋白OCT1的表达情况，根据灰度值计算shOCT1的沉默效率。
Western blotting实验首先测定蛋白浓度，将蛋白变性之后跑胶转膜，5%脱脂牛奶封闭膜1.5h之后，依次用一抗OCT1和能够特异性结合一抗OCT1的二抗孵育牛奶封闭之后的膜各1h，0.1%TBS-T溶液洗膜3次，每次4 min，将膜置于经过暗处理的暗匣中拿到暗室中曝光，曝光时将胶片固定在膜上，在发光液和显影液的作用下蛋白的条带会印迹在胶片上。
图2为代表性Western blot检测shOCT1对OCT1基因在SKOV3细胞中的蛋白表达水平的抑制情况，图中，Vector为对照组，用pLKO.1-TRC空载体感染；其他为实验组，SKOV3细胞分别感染慢病毒载体pLKO.1-TRC-shOCT1制备的质粒，即分别感染pLKO.1-shOCT1-1，pLKO.1-shOCT1-2，pLKO.1-shOCT1-3，pLKO.1-shOCT1-4和shOCT1-5，在图2中表示为shOCT1-1，shOCT1-2，shOCT1-3，shOCT1-4和shOCT1-5。结果表明，与对照组相比，实验组中shOCT1-1，shOCT1-2，shOCT1-5能显著沉默SKOV3细胞中OCT1基因的表达。
实施例4：Transwell小室实验检测shPARD6对SKOV3细胞细胞迁移侵润的影响。
Transwell迁移：将实施例2中嘌呤霉素(puromycin;PM )筛选后实验组和对照组存活的SKOV3细胞消化下来，用无血清培养基调成细胞密度为20×104 个/mL的细胞悬液；将24孔板中的Transwell小室用无菌镊子移开，在24孔板底部加入500 μL含10%血清的完全培养基后，再将小室轻轻放回，并且保证与培养基接触的小室底部无气泡，取300 μL细胞悬液加入每个小室，放回培养箱孵育10 h；培养箱孵育10 h后，停止Transwell小孔实验；取一干净的24孔板，每孔加入1 mL PBS和500 μL的0.1%的结晶紫溶液；从培养箱中取出Transwell24孔板，用镊子移出小室，用脱脂棉签轻轻擦去上小室内的细胞，将小室底部膜于风口风干，便于染色，将小室放入孔中染色15-20 min。若染色过深，可用PBS清洗；在洁净的载玻片上，滴加一滴清水或PBS溶液，将Transwell小室底部膜正置放在液滴上，用显微镜观察就可清楚看到小室底膜上附着的细胞，随机选5到10个视野进行拍照，进行统计。
Transwell侵润：第一天，将Extracellular Matrix（ECM）基质胶（Sigma，美国）从-20℃转移到4℃过夜融化；第二天，将待用的Transwell（8 μm）小孔、24孔板、EP管、枪头等置于4℃冰箱预冷，用无血清培养基按1:12稀释基质胶，每个小室加45 μL ECM稀释液，迅速铺匀，要无气泡，放入5 % CO2、37℃细胞培养箱中培养；后面的步骤跟Transwell迁移的步骤相同，只是培养箱孵育时间为24 h。
图3为shOCT1-1，shOCT1-2，shOCT1-5对SKOV3细胞迁移和侵润的影响结果。图3A和3C为利用Transwell检测shOCT1对细胞迁移的影响及统计结果，图3B和3D为shOCT1对SKOV3细胞侵润的影响及统计结果；**表示P＜0.01，***表示P＜0.001，n=3。Vector为对照组，shOCT1-1，shOCT1-2，shOCT1-5为实验组。实验结果显示，shOCT1确实可以抑制SKOV3细胞株的迁移和侵润能力（图3 A和3B），其中shOCT-1、shOCT-2和shOCT-5的迁移能力分别为对照组的63±4.3%、21±5.6%和31±4.3%（图3C），侵润能力分别为对照组组的100±8.6%、59±5.1%和58±1.9%（图3D）。结果表明：利用shOCT1-2，shOCT1-5沉默OCT1基因表达对卵巢癌细胞SKOV3的迁移和侵润具有明显的抑制作用。
实施例5：对小鼠进行尾静脉注射实验组和对照组的SKOV3细胞，观察shOCT1对SKOV3细胞在小鼠体内转移的作用。
基于成功构建的稳定的卵巢癌细胞株SKOV3肺转移模型（PARD6A在卵巢癌中的作用机制研究，阮玲玲），将实验组和对照组的SKOV3细胞分别通过尾静脉方式注入小鼠体内，定期观察小鼠的生长状态，在60天时，处死对照组和试验组小鼠，对小鼠肺器官进行拍照、测量肺器官体积及统计肺结节数量。
图4为shOCT1-2，shOCT1-5在体内抑制SKOV3细胞的转移情况。将小鼠的肺取出，可以看到对照组小鼠的肺表面凹凸不平，形成一个个半透明状的不规则形或圆形小结节，并且肺的形态和正常小鼠有明显差异，shOCT1-2组和shOCT1-5组小鼠的肺形态较为正常（图4A）。对小鼠肺结节数进行统计分析，可以观察到虽然shOC1-2组和shOCT1-5组部分小鼠的肺部也存在肺结节，但是相较于对照组，肺结节数明显减少（图4B）并且具有统计学意义。这些结果显示，shOC1-2和shOCT1-5可以显著抑制卵巢癌细胞株SKOV3在小鼠体内向肺迁移和侵润的能力。对各组小鼠的肺重量进行统计分析发现，虽然shOCT1实验组相对于对照组的肺湿重略轻，但并不具有统计学意义，这可能是因为个体差异较大并且肺结节增多的重量还不足以使肺重量出现显著性差异（图4 C）。结果表明：利用shOC1-2和shOCT1-5沉默SKOV3细胞中OCT1基因的表达，可以显著地降低SKOV3细胞在小鼠活体内的转移。
序列表
<110> 江苏大学
<120> 特异性抑制OCT1基因表达的shRNA及应用
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccgggaccag cagctcacct attaactcga gttaataggt gagctgctgg tcttttt 57
<210> 2
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
aattaaaaag accagcagct cacctattaa ctcgagttaa taggtgagct gctggtc 57
<210> 3
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccgggcaact gggaacctgg tatttctcga gaaataccag gttcccagtt gcttttt 57
<210> 4
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aattaaaaag caactgggaa cctggtattt ctcgagaaat accaggttcc cagttgc 57
<210> 5
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccggtttcac tctgcagtgt gattgctcga gcaatcacac tgcagagtga aattttt 57
<210> 6
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aattaaaaat ttcactctgc agtgtgattg ctcgagcaat cacactgcag agtgaaa 57
<210> 7
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ccgggaggac agataactgg gcttactcga gtaagcccag ttatctgtcc tcttttt 57
<210> 8
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
aattaaaaag aggacagata actgggctta ctcgagtaag cccagttatc tgtcctc 57
<210> 9
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ccggccagtc aacaccaaag cgaatctcga gattcgcttt ggtgttgact ggttttt 57
<210> 10
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
aattaaaaac cagtcaacac caaagcgaat ctcgagattc gctttggtgt tgactgg 57

Claims (7)

1.特异性抑制OCT1基因表达的shRNA，其特征在于，所述shRNA为shOCT1-2 或shOCT1-5，其中，shOCT1-2 的正义链模板序列如SEQ.ID.NO.3所示，反义链模板序列如SEQ.ID.NO.4所示，所述shOCT1-5的正义链模板序列如SEQ.ID.NO.9所示，反义链模板序列如SEQ.ID.NO.10所示；所述OCT1基因在GENABANK中的登录号为NM_002697。
2.特异性抑制OCT1基因表达的shRNA慢病毒表达载体pLKO.1-TRC-shRNA-OCT1，其特征在于，所述pLKO.1-TRC-shRNA-OCT1载体包含权利要求1所述的shRNA。
3.权利要求1所述的特异性抑制OCT1基因表达的shRNA在特异性抑制卵巢癌细胞中OCT1基因表达中非诊断治疗目的的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用为抑制卵巢癌细胞的迁移或/和侵润能力。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用为非诊断治疗目的的，用于获取抑制卵巢癌细胞转移的信息。
6.权利要求1所述的特异性抑制OCT1基因的shRNA在制备抑制卵巢癌细胞转移的药物中的应用，所述OCT1基因在GENABANK中的登录号为NM_002697。
7.一种抑制卵巢癌细胞转移的药物，其特征在于，所述药物包含权利要求1所述的特异性抑制OCT1基因的shRNA，所述OCT1基因在GENABANK中的登录号为NM_002697。
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