CN110582577A - 文库定量和鉴定 - Google Patents

文库定量和鉴定 Download PDF

Info

Publication number
CN110582577A
CN110582577A CN201780090352.2A CN201780090352A CN110582577A CN 110582577 A CN110582577 A CN 110582577A CN 201780090352 A CN201780090352 A CN 201780090352A CN 110582577 A CN110582577 A CN 110582577A
Authority
CN
China
Prior art keywords
dna fragments
amplified dna
primer
amplified
fluorophore
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201780090352.2A
Other languages
English (en)
Inventor
D·A·阿莫雷塞
B·李
B·G·施罗德
R·A·费克特
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nugen Technologies Inc
Original Assignee
Nugen Technologies Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nugen Technologies Inc filed Critical Nugen Technologies Inc
Publication of CN110582577A publication Critical patent/CN110582577A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B40/00—ICT specially adapted for biostatistics; ICT specially adapted for bioinformatics-related machine learning or data mining, e.g. knowledge discovery or pattern finding
    • G16B40/10—Signal processing, e.g. from mass spectrometry [MS] or from PCR
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/6851—Quantitative amplification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B25/00—ICT specially adapted for hybridisation; ICT specially adapted for gene or protein expression
    • G16B25/20—Polymerase chain reaction [PCR]; Primer or probe design; Probe optimisation

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medical Informatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Evolutionary Biology (AREA)
  • Theoretical Computer Science (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Evolutionary Computation (AREA)
  • Bioethics (AREA)
  • Computer Vision & Pattern Recognition (AREA)
  • Data Mining & Analysis (AREA)
  • Databases & Information Systems (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Artificial Intelligence (AREA)
  • Signal Processing (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Software Systems (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本文描述了用于文库定量和鉴定的方法、组合物和试剂盒。一些实施例涉及一种文库定量的方法。例如，所述方法可以包含提供DNA片段，在存在各自标记有荧光团的引物的情况下通过聚合酶链反应PCR扩增所述DNA片段。在这些情况下，仅预定数量的荧光团连接到每个DNA片段。所述方法可以进一步包含检测由所述扩增的DNA片段产生的荧光信号，并且基于检测到的荧光信号计算所述扩增的DNA片段的数量。

Description

文库定量和鉴定
序列表
与本申请相关的序列表以文本格式提供以代替纸质副本，并且特此通过引用并入本说明书中。含有序列表的文本文件的名称为Sequence_listing.txt。该文本文件约为27KB，并通过EFS-Web以电子方式提交。
背景技术
下一代DNA测序仪通常使用具有已知序列末端的DNA片段。两端具有已知的序列使得DNA片段能够扩增、固定化，并提供测序的起始位置(例如，引发位点)。已知序列的末端通常称为衔接子；其根据测序仪的需要调整DNA片段。并非溶液中所有DNA片段的每一端均具有用于序列测定的衔接子。使用两种不同引物的PCR扩增步骤(每种引物对衔接子之一具有特异性)通常用于富集末端具有两个不同衔接子的片段。末端具有衔接子的DNA片段的这种集合通常被称为文库。这些文库可以固定在固相支持体上，使得文库元素(例如，其间***不同DNA片段的衔接子)之间的空间距离允许单个元素彼此之间的可视化(检测)和识别。
元素之间的距离变得更加关键，因为必须在表面上扩增个别元素以增加其数量，并允许片段测序时有效检测荧光团。这种扩增通常被称为桥式扩增，并产生通常被称为簇的结果。随着片段的扩增，具有相同序列的片段簇在支持体上产生。
对于簇中待测定的DNA的序列，所述簇是同质的并且不包含来自任何其它文库元素的DNA。如果簇之间太过紧密或在极端情况下发生重叠，则图像分析软件可能难以区分簇的边界，并且难以将其组合为单个特征以进行数据提取。由于此簇的数据来自具有两个不同序列的两个不同DNA片段，因此软件可能无法准确测定序列。如果这些簇相距更远，则可以分别分析每个簇并准确测定序列。如果这些簇相距太远，则测序变得低效。处理样品的成本是固定的，但是每个簇的成本会增加。
由于簇的间距由个别文库元素的浓度决定，因此需要准确地测定这些文库元素的浓度。
发明内容
本文描述了用于文库定量和鉴定的方法、组合物和试剂盒。一些实施例涉及一种文库定量的方法。例如，所述方法可以包含提供DNA片段，在存在各自标记有荧光团的引物的情况下通过聚合酶链反应(PCR)扩增所述DNA片段。在这些情况下，仅预定数量的荧光团连接到每个DNA片段。所述方法可以进一步包含检测由所述扩增的DNA片段产生的荧光信号，并且基于检测到的荧光信号计算所述扩增的DNA片段的数量。
在一些实施例中，在检测由扩增的DNA片段产生的信号之前，所述方法可以进一步包含去除未掺入到扩增的DNA片段中的引物或淬灭由未掺入到扩增的DNA片段中的引物产生的信号。
在一些实施例中，仅一个荧光团连接到每个DNA片段。
在一些实施例中，所述方法可以进一步包含扩增的DNA片段的基于荧光的测序的步骤。
在一些实施例中，可以通过使用荧光计检测由掺入到扩增的DNA片段中的荧光团产生的荧光信号来检测由扩增的DNA片段产生的信号。
在一些实施例中，所述方法可以进一步包含产生标准曲线，所述标准曲线指示源自标准文库的DNA片段的数量与由DNA片段产生的荧光信号之间的关系。
在一些实施例中，可以通过基于检测到的荧光信号和标准曲线计算扩增的DNA片段的数量来基于检测到的信号计算扩增的DNA片段的数量。
在一些实施例中，所述方法可以进一步包含将扩增的DNA片段稀释到适合基于荧光的测序的预定浓度。
在一些实施例中，所述方法可以进一步包含确定扩增的DNA片段的特性。
在一些实施例中，扩增的DNA片段的特性可以包含扩增的DNA片段的平均大小。
在一些实施例中，DNA片段可以包含衔接子，并且引物与衔接子互补。
一些实施例涉及一种核酸文库，其包含各自仅连接预定数量荧光团的DNA片段，使得基于由连接的DNA片段产生的荧光信号来计算DNA片段的数量。
在一些实施例中，DNA片段是使用引物产生的PCR扩增子，每种引物用荧光团标记，使得仅预定数量的荧光团连接到每个PCR扩增子片段。
在一些实施例中，DNA片段可以包含衔接子，并且引物与衔接子互补。
一些实施例涉及一种对DNA样品进行测序的方法。例如，所述方法可以包含使用DNA样品产生DNA片段，以及在存在各自标记有荧光团的引物的情况下通过聚合酶链反应(PCR)扩增所述DNA片段。在这些情况下，仅预定数量的荧光团连接到每个DNA片段。所述方法可以进一步包含检测由扩增的DNA片段产生的荧光信号，基于检测到的荧光信号计算扩增的DNA片段的数量，将扩增的DNA片段稀释到适合基于荧光的测序的预定浓度，以及使用基于荧光的测序技术对扩增的DNA片段的至少一部分进行测序。
在一些实施例中，在检测由扩增的DNA片段产生的信号之前，所述方法可以进一步包含去除未掺入到扩增的DNA片段中的引物或淬灭由未掺入到扩增的DNA片段中的引物产生的信号。
在一些实施例中，仅一个荧光团连接到每个DNA片段。
在一些实施例中，可以通过使用荧光计检测由掺入到扩增的DNA片段中的荧光团产生的荧光信号来检测由扩增的DNA片段产生的信号。
在一些实施例中，所述方法可以进一步包含产生标准曲线，所述标准曲线指示源自标准文库的DNA片段的数量与由DNA片段产生的荧光信号之间的关系。
在一些实施例中，可以通过基于检测到的荧光信号和标准曲线计算扩增的DNA片段的数量来基于检测到的信号计算扩增的DNA片段的数量。
在一些实施例中，所述方法可以进一步包含确定扩增的DNA片段的特性。
在一些实施例中，扩增的DNA片段的特性可以包含扩增的DNA片段的平均大小。
在一些实施例中，DNA片段可以包含衔接子，并且引物与衔接子互补。
一些实施例可以进一步包含试剂盒，所述试剂盒包含能够连接到DNA片段的衔接子和与所述衔接子互补的引物。每种引物可以用荧光团标记，使得使用引物扩增所述DNA片段以便将每个片段仅与预定数量的荧光团连接。
在一些实施例中，试剂盒可以包含一或多种聚合酶。
在一些实施例中，试剂盒可以包含用于扩增的试剂。
在一些实施例中，试剂盒可以包含用于测序的试剂。
在一些实施例中，试剂盒可以包含使用试剂盒的书面说明。
在一些实施例中，试剂盒可以包含dATP、dCTP、dGTP、dTTP或其任何混合物。
附图说明
参照附图进行详细描述。在附图中，附图标记最左侧的一或多个数字标识附图标记首次出现的附图。不同附图中相同的附图标记表示类似或相同的项。
图1示出了文库定量的实例。
图2示出了文库定量的另一个实例。
图3示出了文库定量的又一个实例。
具体实施方式
本文描述了用于文库定量和鉴定的方法、组合物和试剂盒。本公开的实施例涉及一个惊人的发现，即将荧光染料附着到DNA片段上进行文库定量和鉴定不会干扰随后的序列测定。在一些实施例中，附着有荧光染料的引物用于文库定量和鉴定。当附着有荧光染料的引物保留在文库中时，可以使用基于荧光的测序技术对文库进行随后测序。
已经报告了用于定量NGS文库的各种方法。一些方法依赖于文库元素的电泳分离以及不同长度的片段的定量(曲线下面积评估)。生物分析仪(安捷伦科技公司(AgilentTechnologies))通常用于这种方法。在一些情况下，科学家可能会估计给定大小的片段的质量，并根据其经验应用校正因子来确定稀释文库的程度以使其在测序仪的适当范围内。一些人将此信息与通过紫外分光光度法测定的总核酸质量结合使用，同样根据实践经验得出校正因子。还有一些人使用qPCR以更准确地测定实际文库(而非总核酸)的质量，并使用此质量结合生物分析仪所测的片段大小以便更准确地测定成簇单元的数量以及如何适当稀释样品以获得应用于DNA测序仪的所需浓度。
虽然这些方法可以是有效的，但其依赖于学***均大小估计不准确。
本公开提供了用于确定能够产生簇的元素数量的技术。本公开的一些实施例涉及一种用于文库定量和鉴定的方法，所述方法不依赖于诸如紫外分光光度法、qPCR和平均片段大小估计等技术。
在一些实施例中，荧光标记的PCR引物可以用于文库富集步骤。因为富集步骤产生每个片段具有单个荧光团或预定数量荧光团的扩增子，所以可以确定分子的数量。每个扩增产物(例如，扩增子)可以具有与其长度无关的预定数量的荧光团。例如，只有那些已经扩增的元素具有荧光团结合。PCR富集后，去除未掺入的引物，并通过荧光法测定荧光引物/扩增子的量。可以产生标准曲线来确定溶液中荧光片段的数量。
除非另有说明，否则生物化学、核酸化学、分子生物学和分子遗传学的术语和符号遵循本领域的标准论文和文本的术语和符号。
如在本文中和所附权利要求书中所使用的，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”包含复数指代物，除非上下文另有明确指明。因此，例如，提及“聚合酶”可以指一种试剂或这些试剂的混合物，并且提及“所述方法”包含提及相同步骤和/或本领域技术人员已知的方法等等。
如本文使用的术语“衔接子”可以指具有已知序列的寡核苷酸，其与特定核酸序列或所关注靶多核苷酸链的连接能够产生所述特定核酸或所述所关注靶多核苷酸链的扩增就绪产物。在添加至少一种衔接子之前，特定核酸样品可以被片段化或未被片段化。
设想了各种衔接子设计，其适合于产生所关注特定序列区域/链的扩增就绪产物。例如，当使用双链衔接子时，衔接子的两条链可以是自身互补的、非互补的或部分互补的。衔接子可以含有至少一部分正向序列引发位点和随机序列。
如本文中所使用的，本文中所用的术语“扩增(amplifying)”、“扩增(amplification)”和“扩增(amplify)”特定核酸可以指产生所关注核酸样品的多个拷贝的过程，例如以DNA拷贝的形式。本领域已知用于扩增核酸的许多方法和方案，如PCR和qPCR。
如本文中所使用的，本文中所用的术语“cDNA”可以指互补DNA。DNA可以在逆转录酶和DNA聚合酶催化的反应中从信使RNA(mRNA)模板中合成。
如本文中所使用的，本文中所用的术语“互补的”可以指与序列的全部或仅与其中一部分互补。特异性寡核苷酸引物或探针的可杂交序列中核苷酸的数量可以是使得用于杂交寡核苷酸引物或探针的严格条件可以防止过度随机非特异性杂交的数量。寡核苷酸引物或探针的杂交部分中的核苷酸数量可以至少与寡核苷酸引物或探针杂交的靶多核苷酸的确定序列一样多，通常为约20到约50个核苷酸。所述靶多核苷酸/寡核苷酸可以大于寡核苷酸引物、引物或探针。
如本文中所使用的，本文中所用的术语“变性”可以指将双链核酸分离成单链。变性可以使用本领域已知的任何方法来实现，包含但不限于物理变性、热变性和/或化学变性。
如本文中所使用的，本文中所用的短语“基因组DNA”可以指染色体DNA，缩写为gDNA以代表基因组脱氧核糖核酸。gDNA包含生物体的遗传物质。
如本文中所使用的，本文中所用的术语“基因组”可以指源于患者、组织、器官、单细胞、肿瘤、取自患者的有机液体样品、自由循环核酸、真菌、原核生物和病毒的DNA、RNA或cDNA序列。
如本文中所使用的，本文中所用的术语“转录组”可以是能够反映生物体部分或全部表达基因组的所有RNA序列。
如本文中所使用的，本文中所用的术语“试剂盒”可以指任何用于传递材料的***。在反应试验的背景下，此类传递***可以包含允许将反应组分(如寡核苷酸、缓冲组分、添加剂、反应增强剂、酶等)在合适的容器中从一个位置储存、运输或传递到另一个位置的元素，通常具有进行测定的书面说明。试剂盒可以包含一或多个含有相关反应试剂和支持材料的外壳或盒子。试剂盒可包含两个或两个以上单独的容器，其中每个容器都包含全部试剂盒组件的一部分。容器可以一起或分开传递给预期接受者。
如本文中所使用的，本文中所用的短语“核酸(NA)修饰酶”可以指DNA特异性修饰酶。对于双链DNA的特异性，可以选择NA修饰酶。所述酶可以是双链特异性核酸内切酶、钝端频繁切割限制酶或另一种限制酶。
如本文中所使用的，短语“核酸片段”和“特定核酸”可互换使用，并且如本文中使用的可指核酸样品的一部分。输入样品中的核酸可以被分割为片段化核酸分子的种群或一或多个特定大小范围的多核苷酸。
如本文中所使用的，本文中所用的短语“特定核酸序列”或“特定序列”可以是所关注多核苷酸序列，需要对其进行数字测量和/或定量，包含但不限于核酸片段。就其实际序列而言，特定序列可以是已知的或未知的。本文中所用的“模板”可以是含有特定核酸序列的多核苷酸。术语“特定序列”、“特定核酸序列”、“特定核苷酸序列”、“所关注区域”或“所关注序列”及其变体可互换使用。
如本文中所使用的，本文中所用的短语“合格的核酸”和“鉴定靶核酸片段”可以指gDNA或RNA序列的片段，即：i.)DNA聚合酶的可接受模板，即模板可以不含DNA聚合酶的交联或抑制剂，或ii.)模板具有修饰，包含但不限于在5'和/或3'端连接多核苷酸序列，即条形码、衔接子、与引物互补的序列等中的至少一种，使得片段可以被修饰，以进行定量、扩增、检测或gDNA和cDNA序列分析领域技术人员已知的其它方法。
如本文中所使用的，术语“寡核苷酸”可以指多核苷酸链，通常少于200个残基长度，例如15与100个核苷酸长度之间，但也可以包括更长的多核苷酸链。寡核苷酸可以是单链或双链的。如本公开中所使用的，术语“寡核苷酸”可以与术语“引物”、“探针”和“衔接子”互换使用。
如本文中所使用的，“PCR”是术语“聚合酶链式反应”的缩写，是一种常用的核酸扩增技术。在一些实施例中，PCR对每条设计的链使用两个寡核苷酸引物，诸如一种引物的延伸为下一个PCR循环中的另一引物提供模板。为了在讨论中区分寡核苷酸引物，一对寡核苷酸引物中的任一个可以在本文中被命名为“正向”或“反向”引物。PCR可以由以下组成：重复(或循环)(i)分离双链核酸的链的变性步骤，之后是(ii)允许引物退火至所关注序列的侧面位置的退火步骤；并且然后是(iii)延伸步骤，其在5'至3'方向延伸引物，从而形成与靶序列互补的核酸片段。可以使用自动热循环仪在不同的温度下执行上述步骤中的每一个步骤。可以按需要的频率重复PCR循环，从而导致靶DNA片段的指数积累，所述靶DNA片段的端通常由所使用引物的5'端定义。
本文中所使用的短语“定量PCR”或“qPCR”可以指设计用于测量样品中的一或多个特定靶序列的丰度的PCR。可以使用一或多个参考核酸序列进行定量测量，所述参考核酸序列可以单独或与靶核酸一起测定。
本文中所使用的术语“部分”可以指小于核酸序列、核酸序列片段、特定核酸序列、特定核酸片段、探针、引物等的总长度。
本文中所使用的术语“引物”可以指通常具有游离3'羟基的寡核苷酸，其能够与模板(如特定多核苷酸、靶DNA、靶RNA、引物延伸产物或探针延伸产物)杂交或退火，并且还能够促进与模板互补的多核苷酸的聚合。引物可以含有构成引物尾部的非杂交序列。即使引物序列与靶不完全互补，所述引物仍可以与靶杂交。
本文中所使用的引物可以是沿着多核苷酸模板通过聚合酶进行的延伸反应中使用的寡核苷酸，所述反应如PCR、qPCR、延伸反应等。寡核苷酸引物可以是可能为单链的合成多核苷酸，在其3'端含有能够与靶多核苷酸的序列杂交的序列。
与特定核酸杂交的引物的3'区域可以包括与序列或引物结合位点的至少80％，优选地90％，更优选地95％，最优选的100％互补性。
本文中所使用的术语“样品”可以指含有或假定含有所关注核酸的任何物质，并且因此包含核酸、细胞、生物体、组织、体液(例如，脊髓液或淋巴液)、取自患者的有机液体的样品，以及包含但不限于以下的样品：血液、血浆、血清、尿液、眼泪、粪便、呼吸道和泌尿生殖道、唾液、不同器官的片段、组织、血细胞、循环肿瘤细胞(CTC)或散布的肿瘤细胞(CTD)、骨骼、体外细胞培养物样品或怀疑含有核酸分子的样本。
本文中所使用的术语“PCR重复”可以指任何测序读数，所述测序读数与另一测序读数源自同一原始核酸分子并且因此源自同一引物/探针延伸产物序列，并且因此不代表独特的核酸分子。
与定义、过程、方法结构和其它实施例相关的附加信息在转让给核时代公司(Nugen Corp.)的美国专利公开号US20160203259中给出，所述美国专利通过引用以其全文并入。
本公开的实施例涉及用于文库定量和鉴定的方法、组分和试剂盒。
一些实施例涉及一种文库定量的方法。在一些实施例中，所述方法可以包含提供DNA片段，以及在存在各自标记有荧光团的引物的情况下通过聚合酶链反应(PCR)扩增所述DNA片段。在这些情况下，仅预定数量的荧光团连接到每个DNA片段。所述方法可以进一步包含检测由所述扩增的DNA片段产生的荧光信号，并且基于检测到的荧光信号计算所述扩增的DNA片段的数量。
一些实施例涉及使用两种或两种以上类型的引物的文库定量的方法。每种引物类型可以具有相关的单个荧光团、多个荧光团或完全没有荧光团。对于具有两种类型的引物的那些实施例，第一种类型将具有相关的单个荧光团，并且第二种类型的引物将没有荧光团。DNA片段可以在存在至少一种引物的情况下通过聚合酶链反应(PCR)扩增，其中至少一种引物用荧光团标记，导致预定数量的荧光团连接到每个DNA片段。检测从扩增的DNA片段产生的荧光信号，并基于检测到的荧光信号计算扩增DNA片段的数量。在一些实施例中，可以通过将扩增的DNA片段稀释到预定浓度来进一步制备用于荧光测序的DNA片段。
在一些实施例中，在检测由扩增的DNA片段产生的信号之前，所述方法可以进一步包含去除未掺入到扩增的DNA片段中的引物或淬灭由未掺入到扩增的DNA片段中的引物产生的信号。
在一些实施例中，可以在进行定量测量之前去除未掺入的荧光PCR引物。例如，可以淬灭引物的荧光。在PCR反应之后，可以通过使短寡核苷酸退火来实现未掺入染料的淬灭，所述短寡核苷酸与荧光寡核苷酸互补并且附着有能够淬灭荧光团的化合物。当计划在测序之前将多个样品汇集在一起时，本公开的一些实施例可以使粗制样品能够被准确定量，以合适的比例混合，并且然后作为整体而不是单独纯化。
在一些实施例中，可以使用带有淬灭剂的单个寡核苷酸来测量粗制混合物中的功能元素，将使用具有发夹结构以及同时具有荧光团和淬灭剂的寡核苷酸进行富集。当寡核苷酸处于发夹结构中时，荧光团和淬灭剂非常接近以干扰荧光检测。当寡核苷酸结构松弛，并且寡核苷酸退火到PCR模板时，荧光团与淬灭剂之间的间距增加，使得可以检测荧光团。在PCR之后，当溶液冷却时，发夹结构在未掺入的寡核苷酸中重新形成。当进行测量时，检测掺入扩增子的寡核苷酸，但未掺入的寡核苷酸是暗的。
在一些实施例中，仅一个荧光团连接到每个DNA片段。
在一些实施例中，所述方法可以进一步包含扩增的DNA片段的基于荧光的测序的步骤。
在一些实施例中，可以通过使用荧光计(可替代地拼写为“fluorimeter”)检测由掺入到扩增的DNA片段中的荧光团产生的荧光信号来检测由扩增的DNA片段产生的信号。
在一些实施例中，所述方法可以进一步包含产生标准曲线，所述标准曲线指示源自标准文库的DNA片段与由DNA片段产生的荧光信号之间的关系。
在一些实施例中，可以通过基于检测到的荧光信号和标准曲线计算扩增的DNA片段的数量来基于检测到的信号计算扩增的DNA片段的数量。
在一些实施例中，所述方法可以进一步包含将扩增的DNA片段稀释到适合基于荧光的测序的预定浓度。
在一些实施例中，所述方法可以进一步包含确定扩增的DNA片段的特性。例如，在测量荧光引物之后，可以将荧光嵌入染料添加到样品中。荧光嵌入染料可以与双链DNA的总质量成比例地结合。然后可以通过将此荧光读数与标准曲线进行比较来确定绝对质量。通过准确的元素数量和总质量，可以确定文库片段的平均大小。所述测量可以提供与文库的质量以及文库是否正确地形成相关联的数据。
在一些实施例中，扩增的DNA片段的特性可以包含扩增的DNA片段的平均大小。
在一些实施例中，DNA片段可以包含衔接子，并且引物与衔接子互补。
一些实施例涉及一种核酸文库，其包含各自仅连接预定数量荧光团的DNA片段，使得基于由连接的DNA片段产生的荧光信号来计算DNA片段的数量。
在一些实施例中，DNA片段是使用引物产生的PCR扩增子，每种引物用荧光团标记，使得仅预定数量的荧光团连接到每个PCR扩增子片段。
在一些实施例中，DNA片段可以包含衔接子，并且引物与衔接子互补。
一些实施例涉及一种对DNA样品进行测序的方法。例如，所述方法可以包含使用DNA样品产生DNA片段，以及在存在各自标记有荧光团的引物的情况下通过聚合酶链反应(PCR)扩增所述DNA片段。在这些情况下，仅预定数量的荧光团连接到每个DNA片段。所述方法可以进一步包含检测由扩增的DNA片段产生的荧光信号，基于检测到的荧光信号计算扩增的DNA片段的数量，将扩增的DNA片段稀释到适合基于荧光的测序的预定浓度，以及使用基于荧光的测序技术对扩增的DNA片段的至少一部分进行测序。
在一些实施例中，在检测由扩增的DNA片段产生的信号之前，所述方法可以进一步包含去除未掺入到扩增的DNA片段中的引物或淬灭由未掺入到扩增的DNA片段中的引物产生的信号。
在一些实施例中，仅一个荧光团连接到每个DNA片段。
在一些实施例中，可以通过使用荧光计检测由掺入到扩增的DNA片段中的荧光团产生的荧光信号来检测由扩增的DNA片段产生的信号。
在一些实施例中，所述方法可以进一步包含产生标准曲线，所述标准曲线指示源自标准文库的DNA片段与由DNA片段产生的荧光信号之间的关系。
在一些实施例中，可以通过基于检测到的荧光信号和标准曲线计算扩增的DNA片段的数量来基于检测到的信号计算扩增的DNA片段的数量。
在一些实施例中，所述方法可以进一步包含确定扩增的DNA片段的特性。
在一些实施例中，扩增的DNA片段的特性可以包含扩增的DNA片段的平均大小。
在一些实施例中，DNA片段可以包含衔接子，并且引物与衔接子互补。
一些实施例可以进一步包含试剂盒，所述试剂盒包含能够连接到DNA片段的衔接子和与所述衔接子互补的引物。每种引物可以用荧光团标记，使得使用引物扩增所述DNA片段以便将每个片段仅与预定数量的荧光团连接。
在一些实施例中，试剂盒可以包含一或多种聚合酶。
在一些实施例中，试剂盒可以包含用于扩增的试剂。
在一些实施例中，试剂盒可以包含用于测序的试剂。
在一些实施例中，试剂盒可以包含使用试剂盒的书面说明。
在一些实施例中，试剂盒可以包含dATP、dCTP、dGTP、dTTP或其任何混合物。
参考以下实例对本公开进行进一步的描述。提供这些实例仅仅是为了说明的目的，并不旨在进行限定，除非另作说明。因此，本公开决不应解释为限于以下实例，而是应解释为涵盖由于本文所提供的教导而变得明显的任何和所有变化。
实例1
使用荧光标记的PCR引物(/56-FAM/CAA GCA GAA GAC GGC ATA CG(SEQ ID:1))对两个lllumina TruSeq DNA文库(BC11和BC13)进行PCR扩增。在安捷伦生物分析仪上对纯化的文库进行分析，以确定文库的平均大小，并且结果在图1(A)中。还通过NanoDrop紫外-可见分光光度计和KAPA文库定量试剂盒对文库进行定量。使用由KAPA文库定量试剂盒确定的量和由生物分析仪确定的文库平均大小来计算摩尔浓度。将2至8微升的文库与200μL的TE缓冲液混合，并在量子位2.0荧光计上读取荧光。量子位荧光读数与摩尔量的线性相关性在图1(B)中示出。
使用荧光标记的PCR引物(/56-FAM/CAA GCA GAA GAC GGC ATA CG(SEQ ID:1))对两个lllumina TruSeq DNA文库(BC12和BC14)进行PCR扩增。将5微升的文库与200μL的TE缓冲液混合，并在量子位2.0荧光计上读取荧光。文库BC13被用作计算文库BC12和BC14的摩尔浓度的标准，如图2(A-C)所示。在lllumina MiSeq测序仪上对四个文库的等摩尔库进行测序。测序结果在图2(D)中。
实例2
通过在最终PCR扩增中使用荧光标记的PCR引物(/56-FAM/CAA GCA GAA GAC GGCATA CG(SEQ ID:1))形成六个DNA文库。通过准确的元素数量和总质量，可以确定文库片段的平均大小。相应地，使用在安捷伦生物分析仪上对纯化的文库进行分析，以确定文库的平均大小，其结果在图3(A)中示出。将2微升的文库与198μL的量子位dsDNA HS试剂或198μL的TE缓冲液混合，并在量子位2.0荧光计上读取荧光。结果在表1中示出。文库大小和量子位读数之比(DNA染料/Fam)的相关性在图3(B)中示出。
表1
尽管已经用特异于结构特征和/或方法动作的语言描述了主题，但是应该理解，所附权利要求书中定义的主题不必限于上述特定特征或动作。相反，特定特征和动作作为权利要求的实例形式被公开。
序列表
<110> 纽亘技术公司(NuGEN Technologies, Inc.)
<120> 文库定量和鉴定
<130> NUGEN 00101
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成
<400> 1
caagcagaag acggcatacg 20

Claims (30)

1.一种文库定量的方法，所述方法包括：
提供DNA片段；
在存在至少一种引物的情况下，通过聚合酶链反应PCR扩增所述DNA片段，其中至少一种引物用荧光团标记，导致预定数量的荧光团连接到每个扩增的DNA片段；
检测从所述扩增的DNA片段产生的荧光信号；
基于检测到的荧光信号计算所述扩增的DNA片段的数量；以及
通过将所述扩增的DNA片段稀释到预定浓度来准备进行固相连接。
2.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括：
在检测由所述扩增的DNA片段产生的所述信号之前，
去除未掺入到所述扩增的DNA片段中的引物，以准备进行荧光测序。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种引物包括第一引物类型和第二引物类型，并且所述第一引物类型具有单个连接的荧光团。
4.根据权利要求1所述的方法，其中单个荧光团连接到每个DNA片段。
5.根据权利要求2所述的方法，其中所述检测由所述扩增的DNA片段产生的所述信号包括使用荧光计检测由掺入到所述扩增的DNA片段中的荧光团产生的所述荧光信号。
6.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括：
产生指示源自参考样品的DNA片段的数量与由所述DNA片段产生的荧光信号之间的关系的标准曲线。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述基于所述检测到的信号计算所述扩增的DNA片段的数量包括基于所述检测到的荧光信号和所述标准曲线计算所述扩增的DNA片段的数量。
8.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括：
进行第二测量以确定所述扩增的DNA片段的特性。
9.根据权利要求1所述的方法，其进一步包括：确定样品中DNA的总质量。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述扩增的DNA片段的特性包括所述扩增的DNA片段的平均大小，所述平均大小源自片段的数量与DNA质量之间的比率。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述DNA片段包括至少一个衔接子，并且所述引物与所述衔接子互补。
12.一种核酸文库，其包括各自仅连接预定数量的荧光团的DNA片段，使得基于由所连接的荧光团产生的荧光信号计算所述DNA片段的数量。
13.根据权利要求12所述的核酸文库，其中所述DNA片段是使用两种不同的引物产生的PCR扩增子，并且其中一种引物用荧光团标记，使得仅预定数量的荧光团连接到每个PCR扩增子片段。
14.根据权利要求12所述的核酸文库，其中所述DNA片段包括衔接子，并且所述引物与所述衔接子互补。
15.一种对DNA样品进行测序的方法，所述方法包括：
使用所述DNA样品产生DNA片段；
在存在两种不同的引物的情况下，通过聚合酶链反应PCR扩增所述DNA片段，其中一种引物用荧光团标记，以提供连接到每个DNA片段的预定数量的荧光团；
检测由所述扩增的DNA片段产生的荧光信号；
基于检测到的荧光信号计算所述扩增的DNA片段的数量，
将所述扩增的DNA片段稀释到适合基于荧光的测序的预定浓度；以及
使用基于荧光的测序技术对所述扩增的DNA片段的至少一部分进行测序。
16.根据权利要求15所述的方法，其进一步包括：
在检测由所述扩增的DNA片段产生的所述信号之前，
去除未掺入到所述扩增的DNA片段中的引物，以准备进行荧光测序。
17.根据权利要求15所述的方法，其中仅单个荧光团连接到每个DNA片段。
18.根据权利要求16所述的方法，其中所述检测由所述扩增的DNA片段产生的所述信号包括使用荧光计检测由掺入到所述扩增的DNA片段中的荧光团产生的所述荧光信号。
19.根据权利要求18所述的方法，其进一步包括：
产生指示源自标准文库的DNA片段的数量与由所述DNA片段产生的荧光信号之间的关系的标准曲线。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述基于所述检测到的信号计算所述扩增的DNA片段的数量包括基于所述检测到的荧光信号和所述标准曲线计算所述扩增的DNA片段的数量。
21.根据权利要求15所述的方法，其进一步包括：
确定所述扩增的DNA片段的特性。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述扩增的DNA片段的特性包括所述扩增的DNA片段的平均大小。
23.根据权利要求15所述的方法，其中所述DNA片段包括衔接子，并且所述引物与所述衔接子互补。
24.一种试剂盒，其包括：
两种不同的引物，所述两种不同的引物与文库衔接子互补，其中至少一种引物用荧光团标记，使得使用所述引物扩增的DNA片段具有预定数量的连接的荧光团。
25.根据权利要求24所述的试剂盒，其进一步包括一或多种聚合酶。
26.根据权利要求24所述的试剂盒，其进一步包括用于扩增的试剂。
27.根据权利要求24所述的试剂盒，其进一步包括用于测序的试剂。
28.根据权利要求24所述的试剂盒，其进一步包括使用所述试剂盒的书面说明。
29.根据权利要求24所述的试剂盒，其进一步包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP或其任何混合物。
30.根据权利要求24所述的试剂盒，其进一步包括能够连接到DNA片段的衔接子。
CN201780090352.2A 2017-04-11 2017-04-11 文库定量和鉴定 Pending CN110582577A (zh)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PCT/US2017/027060 WO2018190814A1 (en) 2017-04-11 2017-04-11 Library quantitation and qualification

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110582577A true CN110582577A (zh) 2019-12-17

Family

ID=63792657

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201780090352.2A Pending CN110582577A (zh) 2017-04-11 2017-04-11 文库定量和鉴定

Country Status (4)

Country Link
EP (1) EP3610031A4 (zh)
JP (1) JP6983906B2 (zh)
CN (1) CN110582577A (zh)
WO (1) WO2018190814A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20230069191A1 (en) * 2020-01-31 2023-03-02 Edge Biosystems, Inc. Method for quantitating nucleic acid library

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060177841A1 (en) * 2004-10-18 2006-08-10 Wangh Lawrence J Primers, probes and methods for nucleic acid amplification
CN104364392A (zh) * 2012-02-27 2015-02-18 赛卢拉研究公司 用于分子计数的组合物和试剂盒
US20160298182A1 (en) * 2013-12-11 2016-10-13 Qiagen Gmbh Nucleic acid detection and quantification

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20020197611A1 (en) * 2001-06-21 2002-12-26 Chagovetz Alexander Michael Method for real-time detection and quantification of nucleic acid sequences using fluorescent primers
WO2010021936A1 (en) * 2008-08-16 2010-02-25 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Digital pcr calibration for high throughput sequencing
US20140186827A1 (en) * 2010-05-14 2014-07-03 Fluidigm, Inc. Assays for the detection of genotype, mutations, and/or aneuploidy
US8663924B2 (en) * 2011-11-30 2014-03-04 Agilent Technologies, Inc. Quantitative PCR-based method to predict the efficiency of target enrichment for next-generation sequencing using repetitive DNA elements (lines/sines) as negative controls
CN105861487B (zh) * 2012-01-26 2020-05-05 纽亘技术公司 用于靶向核酸序列富集和高效文库产生的组合物和方法
CN105890722A (zh) * 2016-06-13 2016-08-24 常州大学 利用共振原理测量dna分子质量的方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060177841A1 (en) * 2004-10-18 2006-08-10 Wangh Lawrence J Primers, probes and methods for nucleic acid amplification
CN104364392A (zh) * 2012-02-27 2015-02-18 赛卢拉研究公司 用于分子计数的组合物和试剂盒
US20160298182A1 (en) * 2013-12-11 2016-10-13 Qiagen Gmbh Nucleic acid detection and quantification

Also Published As

Publication number Publication date
JP6983906B2 (ja) 2021-12-17
WO2018190814A1 (en) 2018-10-18
JP2020516274A (ja) 2020-06-11
EP3610031A1 (en) 2020-02-19
EP3610031A4 (en) 2020-11-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110191961B (zh) 制备经不对称标签化的测序文库的方法
CN107075581B (zh) 由靶向测序进行数字测量
US9909179B2 (en) Single-cell nucleic acid analysis
San Segundo-Val et al. Introduction to the gene expression analysis
US9938570B2 (en) Methods and compositions for universal detection of nucleic acids
US10036059B2 (en) Compositions of toehold primer duplexes and methods of use
US20160068903A1 (en) Selective Amplification of Nucleic Acid Sequences
US20130017549A1 (en) Method of amplifying target nucleic acid with reduced amplification bias and method for determining relative amount of target nucleic acid in sample
US20220364169A1 (en) Sequencing method for genomic rearrangement detection
JP2015500012A (ja) 組成物中のｒｎａを特徴づける方法およびキット
US20180291443A1 (en) Library Quantitation And Qualification
JP6983906B2 (ja) ライブラリーの定量および定性
US10927405B2 (en) Molecular tag attachment and transfer
CN110468179A (zh) 选择性扩增核酸序列的方法
WO2022094403A1 (en) Quantitative multiplex amplicon sequencing system
CN114761578A (zh) 测定亚硫酸氢盐全局转化率的方法
CN111373042A (zh) 用于选择性扩增核酸的寡核苷酸

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
CB02 Change of applicant information
CB02 Change of applicant information

Address after: California, USA

Applicant after: TECAN genomics

Address before: California, USA

Applicant before: NUGEN TECHNOLOGIES, Inc.