CN110582510B - 用于纯化重组抗体片段的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及从在微生物细胞中表达的包涵体中纯化重组抗体片段的方法。更具体地，本发明涉及用于从微生物细胞中表达的包涵体中纯化重组人源化(rHu)抗体片段雷珠单抗的方法。

Description

用于纯化重组抗体片段的方法
技术领域
本发明涉及用于从在微生物细胞中表达的包涵体中纯化重组抗体片段的方法。更具体地，本发明涉及用于从微生物细胞中表达的包涵体中纯化重组人源化(rHu)抗体片段雷珠单抗(Ranibizumab)的方法。
背景技术
生物制药研究和开发的近期趋势更集中于抗体片段的开发。尽管相比以前正在开发大量的生物相似性治疗蛋白质，但生物相似性产品开发中的关键挑战是更高的下游处理成本、非选择性清除工艺和产品相关杂质、产品的蛋白水解降解等。抗体片段提供了超过完整大小的单克隆抗体(mAb)治疗剂的某些优点(诸如改善的和深度的肿瘤穿透，结合到不能接近完整大小mAb的特定表位等)。Fab占已经进入临床开发的抗体片段候选物的大多数，并且三种已被美国FDA批准。上游工艺(例如高滴度克隆和连续生物制造)的进步已经将生物制药工业的焦点移向提高整个下游工艺经济。下游处理组成用于单克隆抗体治疗剂总制造成本的约60-70％。下游处理的捕获、中间和精制步骤涉及各种层析操作的广泛使用。
雷珠单抗是一种VEGF-A(血管内皮生长因子-A)拮抗剂，其结合并抑制人VEGF-A的活性形式的生物功能。VEGF-A的过度上调使其在新血管的生长中起关键作用，导致血管生成和血管的通透性过高。血管的通透性可能导致黄斑水肿和脉络膜新血管生成，从而引起湿型年龄相关性黄斑变性(AMD)。因此，为了控制和治疗血管的通透性过高的疾病状态，必须通过VEGF-A拮抗剂抑制VEGF-A。雷珠单抗在药物制剂中是商业上可获得的，如并且通过玻璃体内注射施用。其被特别设计和制造用于眼内使用。雷珠单抗是重组人源化IgG1κ同种型单克隆抗体片段，其在年龄相关性黄斑变性(ARMD)的治疗中被设计用于眼内使用。
雷珠单抗的分子量约为48.37kDa，即对于轻链和重链分别为23.43kDa和24.95kDa。所述人源化单克隆抗体片段通过重组DNA技术在大肠杆菌细胞中表达，并靶向人血管内皮生长因子A(VEGF-A)。雷珠单抗是轻链的C末端通过二硫键与重链的231个残基的N末端部分连接的214个残基的轻链。现有技术文献提供了关注抗体片段的表达及其纯化的证据。然而，使用大肠杆菌细胞产生的重组人源化(rHu)雷珠单抗以不溶解的蛋白质聚集体的形式形成包涵体。
US20160289314公开了用于制备雷珠单抗的克隆、表达和纯化方法。纯化方法仅涉及溶解的包涵体的还原、氧化和体外重折叠，接着超滤和渗滤-I、阴离子交换层析、阳离子交换层析、超滤和渗滤-II及过滤的逐步过程。该方法中的多个纯化步骤导致低通量操作，从而使该方法繁琐。
因此，迫切需要提供一种便捷的下游程序以获得纯化的抗体片段。鉴于现有技术公开的下游纯化程序带来的缺点，本发明人已经尝试提供一种用于纯化抗体片段的方法。通过本发明获得的所得纯化的抗体片段满足并符合创新产品的纯度和活性标准。
发明目的
本发明的主要目的因此是提供一种用于纯化抗体片段的方法。
本发明的另一个目的是提供一种通过将多元层析纯化步骤与rHu雷珠单抗下游处理整合的用于纯化重组雷珠单抗的方法。
本发明的又一个目的是提供一种方法，所述方法导致生产率比现有的制造方法提高近两倍。
本发明再一个目的是提供一种方法，其中开发的纯化平台适用体外重折叠的和可溶的表达的抗体片段。
发明概述
本发明提供了一种用于纯化重组抗体片段的方法。
在一个实施方案中，本发明涉及一种用于纯化来自重组宿主细胞的重组人雷珠单抗的方法，所述方法包括：获得来自重组宿主细胞中的以包涵体的形式的rHu雷珠单抗；使用溶解缓冲液溶解包涵体以获得溶解的rHu雷珠单抗；使用重折叠缓冲液重折叠溶解的rHu雷珠单抗以获得重折叠的rHu雷珠单抗；通过超滤浓缩重折叠的rHu雷珠单抗以获得浓缩的rHu雷珠单抗；将浓缩的rHu雷珠单抗进行顺序多元层析纯化步骤以除去与产物相关的杂质、宿主细胞蛋白质和宿主细胞核酸，随后渗滤和超滤以获得纯化的rHu雷珠单抗。
在另一个实施方案中，本发明提供了多元层析纯化阶段，包含以下步骤；
(i)将浓缩的重折叠的rHu雷珠单抗进行多元层析，将具有范围为4.0至10.0的pH的浓缩的重折叠的rHu雷珠单抗进料至多元层析树脂上以捕获rHu雷珠单抗并用缓冲液除去杂质，所述缓冲液包含20mM至50mM Tris HCl和0mM至150mM NaCl或20mM至50mM乙酸盐和0mM至150mM NaCl，所述缓冲液具有范围为4.0至10.0的pH；
(ii)在洗脱缓冲液存在下洗脱rHu雷珠单抗至洗脱池(elution pool)中，所述洗脱缓冲液包含20mM至50mM Tris HCl和0mM至1000mM氯化钠或20mM至50mM乙酸盐和0mM至1000mM NaCl，所述洗脱缓冲液具有范围为4.0至10.0的pH，
其中纯化的雷珠单抗具有少于5％的未折叠或错误折叠形式的雷珠单抗和少于2％的聚集形式的雷珠单抗；
(iii)将从步骤(ii)获得的rHu雷珠单抗进料到多元层析树脂上以捕获rHu雷珠单抗，并进一步用包含20mM至50mM乙酸盐和0mM至150mM NaCl的缓冲液除去杂质，所述从步骤(ii)获得的rHu雷珠单抗具有范围为4.5至6.5的pH，所述缓冲液具有范围为4.0至6.5的pH；
(iv)在包含20mM至50mM乙酸盐和0mM至1000mM NaCl的洗脱缓冲液存在下洗脱rHu雷珠单抗，所述洗脱缓冲液具有范围为4.0至6.5的pH；
其中纯化的rHu雷珠单抗具有少于0.1％的未折叠或错误折叠形式的rHu雷珠单抗和少于0.3％的聚集形式的rHu雷珠单抗。
在再一个实施方案中，本发明提供了一种多元层析的方法，其中所述多元层析I和II期的顺序是可互换的。
在又一个实施方案中，本发明提供了通过纯化雷珠单抗的下游方法获得的重组人源化雷珠单抗。
提供本概述以介绍与纯化重组人抗体片段(rHu雷珠单抗)的方法相关的构思。本概述不旨在确定请求保护的主题的必要特征，也不旨在用于确定或限制请求保护的主题的范围。
附图说明
图1描述用于请求保护的多元层析纯化平台的方法步骤；
图2描述多元层析I的层析谱，洗脱峰I：纯化的rHu雷珠单抗，洗脱峰II：与产物相关的杂质(错误折叠和未折叠的雷珠单抗)和与方法相关的杂质(宿主细胞蛋白质和核酸)；
图3描述多元层析II的层析谱，流穿液和洗脱峰I：与方法相关的杂质(宿主细胞蛋白质和核酸)。洗脱峰II：纯化的rHu雷珠单抗，洗脱峰III：与产物相关的杂质(错误折叠和未折叠的雷珠单抗)；
图4描述流穿模式多元层析I的层析谱(进料物质电导率：6.0mS/cm，平衡缓冲液：20.0mM Tris pH 9.0，使用5.0CV盐梯度洗脱的重折叠的rHu雷珠单抗)，流穿液：纯化的rHu雷珠单抗(29.69％纯度)；洗脱峰I：包括rHu雷珠单抗的方法相关的杂质(宿主细胞蛋白质和核酸)，洗脱峰II：错误折叠和未折叠的雷珠单抗和方法相关的杂质；
图5描述流穿模式多元层析I的层析谱(进料物质电导率：12.0mS/cm，平衡缓冲液：20.0mM Tris pH 9.0，使用5.0CV盐梯度洗脱的重折叠的rHu雷珠单抗)，流穿液：纯化的rHu雷珠单抗(33.12％)；洗脱峰I：方法相关的杂质(宿主细胞蛋白质和核酸)，洗脱峰II：错误折叠和未折叠的雷珠单抗和方法相关的杂质；
图6描述多元层析I的层析谱，(平衡缓冲液：20.0mM Tris pH 9.0，通过分级梯度洗脱重折叠的rHu雷珠单抗，第一步是12.5％的洗脱缓冲液和第二步是100％洗脱缓冲液，其中所述洗脱缓冲液包含20mM Tris pH 9.0和1.0M NaCl)；洗脱峰I：纯化的rHu雷珠单抗(38.25％纯度)，洗脱峰II：与产物相关的杂质(错误折叠和未折叠的雷珠单抗)和与方法相关的杂质；
图7描述用于表征与重折叠的rHu雷珠单抗相关的低分子量和高分子量杂质的非还原SDS-PAGE，泳道1：使用本发明的多元层析法的重折叠的纯化的rHu雷珠单抗，泳道2：蛋白质分子量标记物，和泳道3：标准创新雷珠单抗；
图8描述还原SDS-PAGE。泳道1：重折叠的纯化的rHu雷珠单抗，泳道2：蛋白质分子量标记物，和泳道3：标准创新雷珠单抗；
图9描述形成多元层析I的洗脱峰的非还原SDS-PAGE：1：蛋白质分子量标记物。2：标准创新rHu雷珠单抗。3：洗脱峰1(具有38.25％纯度的48kDa的重折叠的rHu雷珠单抗，其具有低分子量杂质)，4：洗脱峰2(显示所有其它方法相关的杂质)，(多元层析I的条件：平衡缓冲液pH 9.0，以5CV盐梯度洗脱重折叠的rHu雷珠单抗)，5：洗脱峰1，6：洗脱峰2(条件平衡缓冲液pH 10.0，以5CV盐梯度洗脱重折叠的rHu雷珠单抗)；7：洗脱峰1，8：洗脱峰2(条件平衡缓冲液pH 10.0，以7.5CV盐梯度洗脱重折叠的rHu雷珠单抗)；9：洗脱峰1，10：洗脱峰2(条件平衡缓冲液pH10.0，以10CV盐梯度洗脱重折叠的rHu雷珠单抗)；
图10描述纯化的可溶的表达的rHu雷珠单抗的非还原SDS-PAGE：1：标准创新rHu雷珠单抗，3：本发明的纯化的rHu雷珠单抗；
图11描述纯化的rHu雷珠单抗的纯度分析的反相HPLC层析谱。A：标准创新rHu雷珠单抗。B：纯化的rHu雷珠单抗；
图12描述纯化的rHu雷珠单抗的尺寸排阻层析图。A：标准创新rHu雷珠单抗。B：纯化的rHu雷珠单抗；
图13描述通过MALDI-TOF的完整质量分析。A：标准创新rHu雷珠单抗。B：纯化的rHu雷珠单抗。
发明详述
现在将结合某些优选和可选的实施方案详细描述本发明，以便可以更全面地理解和认识本发明的各个方面。
定义：
为了方便起见，在进一步描述本发明之前，在此收集说明书、实施例和所附权利要求中采用的某些术语。
术语“包涵体”指目标重组蛋白质的不溶的聚集体。目标蛋白质的包涵体含有错误折叠和部分折叠的蛋白质的组合。蛋白质重折叠是蛋白质获得其天然三维结构所藉由的过程，所述天然三维结构是生物学功能性的构象。
术语“还原剂”指引起蛋白质的二硫键的还原并保持分子内和分子间二硫键化学破坏的物质。
术语“促溶剂”指能够改变蛋白质构象使其更可溶于水的物质。这种促溶剂的实例包括乙醇、丁醇、尿素、盐酸胍、硫脲、氯化镁、高氯酸锂等。
术语“宿主细胞蛋白质”指在发酵或细胞培养过程期间，由宿主细胞表达的除目标蛋白质之外的所有蛋白质。
本文所用术语“多元层析”指一种层析技术，其中配体通过多种类型的相互作用(包括离子相互作用、疏水相互作用或氢键作用)与蛋白质相互作用。
本发明提供了纯化来自重组宿主细胞的重组单克隆抗体片段的方法，所述方法包括：
(i)使用溶解缓冲液溶解从重组宿主细胞获得的含有抗体片段的包涵体以获得溶解的抗体片段；
(ii)使用重折叠缓冲液重折叠溶解的抗体片段以获得重折叠的抗体片段；
(iii)通过超滤浓缩重折叠的抗体片段以获得浓缩的抗体片段；和
(iv)将浓缩的抗体片段进行顺序多元层析纯化以除去与产物相关的杂质，即宿主细胞蛋白质和宿主细胞核酸，随后渗滤和超滤以获得纯化的rHu抗体片段。
重组的雷珠单抗是通过在重组宿主细胞中以优选等比例的重链和轻链浓度的所述蛋白质的表达而获得的。本发明中使用的重组宿主细胞是大肠杆菌的重组宿主细胞。本发明中使用的大肠杆菌宿主菌株是大肠杆菌BL21(DE3)。所述菌株从Merck Millipore获得。
本发明提供了在溶解缓冲液存在下溶解含有相等或不等比例的重组人源化(rHu)雷珠单抗的轻链和重链的包涵体以获得rHu雷珠单抗的轻链和重链的溶解的混合物。使用溶解缓冲液溶解从重组宿主细胞提取的rHu包涵体，所述溶解缓冲液包含离液去垢剂、还原剂和变性剂的组合。
离液剂包括尿素和盐酸胍盐。溶解缓冲液的pH维持在7至10的范围内。使用还原剂的组合(包括二硫苏糖醇、β-巯基乙醇)进行30分钟至2小时，实现溶解的包涵体的还原。
离液去垢剂、还原剂和变性剂选自本领域常规使用的那些。
溶解的方法包括首先将从重组宿主细胞中获得的含有雷珠单抗蛋白质的包涵体溶解在15ml溶解缓冲液中。所述溶解缓冲液含有0.1M Tris pH9.0、2mM EDTA和6M盐酸胍作为变性剂，持续30分钟，然后在5mM DTT存在下还原1小时。使可溶的且还原的包涵体溶液保持通过加入10mM氧化型谷胱甘肽的氧化。
在另一个实施方案中，在重折叠缓冲液存在下获得溶解的rHu雷珠单抗的体外重折叠。所述重折叠缓冲液包含蛋白质折叠剂、多元醇和表面活性剂，其中pH维持在8.0至10.0之间。
本文所称的“体外蛋白质重折叠”涉及将错误折叠的雷珠单抗转变成正确折叠的形式的过程。在重折叠缓冲液中使用75倍稀释液在范围是5℃至20℃的温度下实现雷珠单抗重折叠，所述重折叠缓冲液含有0.1M Tris pH 9.0、0.6M精氨酸、5％山梨糖醇和2mMEDTA。
通过使用5kDa超滤UltrasetteTM实验室切流式过滤装置(UltrasetteTM LabTangential Flow Filtration device)的超滤进一步浓缩重折叠的雷珠单抗蛋白质，然后缓冲液交换为20mM Tris pH 9.0。然后将缓冲液交换了的样品用作多元层析的输入。
在最优选的实施方案中，本发明提供了一种用于纯化来自重组宿主细胞的重组人源化(rHu)雷珠单抗的抗体片段的方法，所述方法包括；
(a)溶解来自重组宿主细胞的含有rHu雷珠单抗的轻链和重链的包涵体以获得溶解的rHu雷珠单抗；
(b)重折叠溶解的rHu雷珠单抗以获得重折叠的rHu雷珠单抗；
(c)通过超滤浓缩重折叠的rHu雷珠单抗以获得浓缩的重折叠的雷珠单抗；
(d)将浓缩的重折叠的rHu雷珠单抗进行多元层析，所述层析方法包括：
(i)将具有范围为4.0至10.0的pH的步骤(c)的浓缩的重折叠的rHu雷珠单抗进料至多元层析树脂上以捕获rHu雷珠单抗并用缓冲液除去杂质，所述缓冲液包含20mM至50mMTris HCl和0mM至150mM NaCl或20mM至50mM乙酸盐和0mM至150mM NaCl，所述缓冲液具有范围为4.0至10.0的pH；
(ii)在洗脱缓冲液存在下洗脱rHu雷珠单抗至洗脱池中，所述洗脱缓冲液包含20mM至50mM Tris HCl和0mM至1000mM氯化钠或20mM至50mM乙酸盐和0mM至1000mM NaCl，所述洗脱缓冲液具有范围为4.0至10.0的pH，
其中纯化的雷珠单抗具有少于5％的未折叠或错误折叠形式的雷珠单抗和少于2％的聚集形式的雷珠单抗；
(iii)将来自步骤(ii)的rHu雷珠单抗进料到多元层析树脂上以捕获rHu雷珠单抗，并进一步用包含20mM至50mM乙酸盐和0mM至150mM NaCl的缓冲液除去杂质，所述来自步骤(ii)的rHu雷珠单抗具有范围为4.5至6.5的pH，所述缓冲液具有范围为4.0至6.5的pH；
(iv)在包含20mM至50mM乙酸盐和0mM至1000mM NaCl的洗脱缓冲液存在下洗脱rHu雷珠单抗，所述洗脱缓冲液具有范围为4.0至6.5的pH；
其中纯化的rHu雷珠单抗具有少于0.1％的未折叠或错误折叠形式的rHu雷珠单抗和少于0.3％的聚集形式的rHu雷珠单抗。
上述方法的步骤(i)和(ii)的多元层析纯化所涉及的方法阶段称为多元层析I期，上述方法的步骤(iii)和(iv)中的多元层析纯化所涉及的方法阶段称为多元层析II期。多元层析I和II期以顺序方式进行或任选地交换顺序进行，以除去与rHu雷珠单抗相关联的各种方法和产物相关杂质。
多元层析I期(方法步骤(i)和(ii))和II期(方法步骤(iii)和(iv))涉及两个步骤，各自用于纯化rHu雷珠单抗。
在一个实施方案中，本发明提供了多元层析I期，其包含多元层析的结合洗脱模式和多元层析的流穿模式。
在另一个实施方案中，本发明提供了多元层析II期，其包含多元层析的结合洗脱模式和多元层析的流穿模式。
多元层析I期：
在I期中采用的多元层析模式选自结合洗脱层析模式或流穿模式。多元层析树脂I选自由HEA Hypercel、PPA Hypercel、BAKERBONDTM XWP500PolyPEI-35或Capto粘附树脂(Capto adhere resin)组成的组。
本发明提供了涉及层析的结合洗脱模式的多元层析I期，其包含；
(i)将浓缩的重折叠的rHu雷珠单抗结合到多元层析树脂I上以捕获rHu雷珠单抗并用缓冲液洗脱杂质，所述缓冲液包含20mM至50mMTris HCl和0mM至150mM NaCl，所述缓冲液具有范围为8.0至10.0的pH；
(ii)在洗脱缓冲液存在下洗脱rHu雷珠单抗至洗脱池中，所述洗脱缓冲液包含20mM至50mM Tris HCl和0mM至1000mM氯化钠，所述洗脱缓冲液具有范围为8.0至10.0的pH。
涉及结合-洗脱层析的多元层析I期的第一阶段包含结合重折叠的rHu雷珠单抗和洗脱纯化的重折叠的rHu雷珠单抗。在多元层析树脂I中，从8.0到10.0改变样品输入pH和以从5CV到10CV的不同盐梯度中洗脱，在杂质的去除和纯化方法的优化中起重要作用。
在多元层析I期的结合和洗脱模式下，从8.0到10.0改变平衡缓冲液pH，改变蛋白质的电荷分布和的三维构象变化。通过在不同盐梯度中的离子相互作用、疏水相互作用和洗脱的组合，观察到在平衡缓冲液pH 9.0和5CV盐梯度中，获得了67.56％的回收率和38.79％的产物纯度。
在一个实施方案中，本发明提供了用于将rHu雷珠单抗结合至多元层析树脂I的结合缓冲液，其包含；
(i)20mM至50mM Tris-HCl，和
(ii)0mM至150mM氯化钠，
具有在8.0至10.0范围内的pH。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于将rHu雷珠单抗从多元层析树脂I洗脱至洗脱池中的洗脱缓冲液，其包含；
(i)20mM至50mM Tris-HCl，和
(ii)0mM至1000mM氯化钠，
具有在8.0至10.0范围内的pH。
本发明提供了涉及层析的流穿模式的多元层析I期，其包括；
(i)将具有范围为6.0mS/cm至12mS/cm的输入电导率的浓缩的重折叠的rHu雷珠单抗进料到多元层析树脂I上以捕获rHu雷珠单抗并用缓冲液除去杂质，所述缓冲液包含20mM至50mM乙酸盐和0mM至150mM NaCl，所述缓冲液具有范围为4.0至6.5的pH；和
(ii)在洗脱缓冲液存在下洗脱杂质至洗脱池中，所述洗脱缓冲液包含20mM至50mM乙酸盐和0mM至1000mM氯化钠，所述洗脱缓冲液具有范围为4.0至6.5的pH。
在多元层析I期的流穿模式下，改变重组雷珠单抗的重折叠浓度级分的输入电导率导致重折叠的rHu雷珠单抗和杂质的结合亲和力的改变。在12mS/cm的样品输入电导率时，杂质与树脂结合并且将重折叠的rHu雷珠单抗洗脱出在流穿液中。在这样的条件下观察到获得了76.98％的回收率和33.12％的产物纯度。
多元层析II期：
将从多元层析I期的洗脱获得的rHu雷珠单抗调整至范围为4.5至6.5的pH，进料至多元层析树脂II上以捕获rHu雷珠单抗，并进一步用缓冲液除去杂质，所述缓冲液包含20mM至50mM乙酸盐和0mM至150mM NaCl，所述缓冲液具有范围为4.0至6.5的pH。
本发明提供了采用结合洗脱层析进行的多元层析II期，所述方法包括：
(i)将从多元层析I期的洗脱池中获得的rHu雷珠单抗以范围为6.0mS/cm至12mS/cm的输入电导率进料至多元层析树脂II上以捕获rHu雷珠单抗并进一步用缓冲液除去杂质，所述从多元层析I期的洗脱池中获得的rHu雷珠单抗具有范围为4.5至6.5的pH，所述缓冲液包含20mM至50mM乙酸盐和0mM至150mM NaCl，所述缓冲液具有范围为4.0至6.5的pH。
(ii)在包含20mM至50mM乙酸盐和0mM至1000mM NaCl的洗脱缓冲液存在下洗脱rHu雷珠单抗，所述洗脱缓冲液具有范围为4.0至6.5的pH。
本发明提供了采用多元层析的流穿模式进行的多元层析II期，所述方法包括：
(i)将从多元层析I期的洗脱池中获得的rHu雷珠单抗进料至多元层析树脂II上以捕获rHu雷珠单抗并进一步用缓冲液除去杂质，所述从多元层析I期的洗脱池中获得的rHu雷珠单抗具有范围为8.0至10.0的pH，所述缓冲液包含20mM至50mM Tris-HCl和0mM至150mMNaCl，所述缓冲液具有范围为8.0至10.0的pH；和
(ii)在包含20mM至50mM Tris-HCl和0mM至1000mM NaCl的洗脱缓冲液存在下洗脱rHu雷珠单抗，所述洗脱缓冲液具有范围为8.0至10.0的pH。
在再一个实施方案中，本发明提供了用于将rHu雷珠单抗结合至多元层析树脂II的结合缓冲液，其包含：
(i)20mM至50mM乙酸盐，和
(ii)0mM至150mM氯化钠，
具有在4.0至6.0的范围内的pH。
在又一个实施方案中，本发明提供了用于将rHu雷珠单抗从多元层析树脂II洗脱到洗脱池中的洗脱缓冲液，其包含；
(i)20mM至50mM Tris-HCl，和
(ii)0mM至1000mM氯化钠，
具有在4.0至6.0的范围内的pH。
多元层析树脂II选自由HEA Hypercel、PPA Hypercel和BAKERBONDTM XWP500PolyCSX-35或Capto MMC树脂组成的组。
在多元层析树脂II的结合和洗脱模式下，从4.0至6.5改变平衡缓冲液pH导致蛋白质的电荷分布和三维构象的改变。通过离子相互作用、疏水相互作用和样品输入电导率的组合，观察到在平衡缓冲液pH 5.5和6.0mS/cm样品输入电导率中，获得了46.57％的回收率和99.50％的产物纯度。
表1：不同pH的平衡缓冲液和洗脱梯度对通过多元层析I洗脱的rHu雷珠单抗的回收率和纯度的影响
上述表1列出了平衡缓冲液pH和盐浓度的变化条件，其对于与从不同实验组回收的rHu雷珠单抗一起进行了条件的优化检测。
pH的增加在增加rHu雷珠单抗上的负电荷中起作用，导致rHu雷珠单抗和树脂配体之间更强的静电相互作用。
盐梯度在rHu雷珠单抗的选择性洗脱中起关键作用。观察到包含pH9.0的20mMTris-HCl缓冲液的洗脱缓冲液和5CV盐洗脱梯度有助于获得38.25％的高纯产物rHu雷珠单抗。在这种条件下，观察到重折叠的rHu雷珠单抗的最大纯度，因为洗脱中的样品输入电导率和盐浓度对杂质与树脂的疏水相互作用和洗脱的最大纯化的重折叠的rHu雷珠单抗具有关键影响。
表2：平衡缓冲液的不同pH和样品上样条件对在多元层析II中洗脱的rHu雷珠单抗的回收率和纯度的影响
实验 平衡缓冲液pH 样品上样电导率 ％回收率 ％纯度
1 pH 5.5 6.0mS/cm 46.57 99.50±0.08
2 pH 5.5 7.5mS/cm 29.22 85.00±0.50
3 pH 5.5 10.0mS/cm 14.10 80.00±0.10
4 pH 4.5 6.0mS/cm 42.84 60.00±3.02
5 pH 6.5 6.0mS/cm 72.30 55.00±1.05
表2显示了平衡缓冲液的不同pH和样品上样条件对在多元层析II中洗脱的rHu雷珠单抗的回收率和纯度的影响。pH的减少在增加rHu雷珠单抗上的正电荷中起作用，导致rHu雷珠单抗和树脂配体之间更强的静电相互作用。蛋白质分子的疏水性在不同的溶液电导率中发生不同的变化，这最终导致与树脂的不同的结合亲和力。观察到包含pH 5.5的20mm乙酸盐缓冲液和6.0mS/cm样品上样电导率的洗脱缓冲液有助于获得99.50％的高纯rHu雷珠单抗。
表3：使用本发明的多元层析纯化获得的方法回收率和纯度
序号 方法步骤 纯度(％) 产率(％)
1 多元层析1 38.79±0.65 67.56±2.15
2 多元层析2 99.50±0.08 46.57±1.00
3 整个方法 99.50±0.08 32.55±2.55
表4：使用多元层析产生的药物物质的杂质分布
序号 杂质 使用要求保护的纯化平台产生的雷珠单抗
1 宿主细胞蛋白质 ＜100PPM
2 宿主细胞DNA 41.89±0.54PPM
3 聚集体 0.49±0.01％
4 片段 ＜LOQ
在图2中观察到，从多元树脂层析柱I洗脱后，在洗脱峰I中纯化的雷珠单抗表明38.79％纯度。洗脱峰II含有错误折叠和未折叠的雷珠单抗和与方法相关的杂质(诸如宿主细胞蛋白质和核酸)。
通过图3，证实了在流穿液和洗脱峰I中观察到了与方法相关的杂质，其包括宿主细胞蛋白质和核酸，而在洗脱峰II中观察到了纯化的雷珠单抗，其表明99.50％的纯度，并且在洗脱峰III中观察到了与产物相关的杂质，诸如错误折叠和未折叠的雷珠单抗。
在另一个优选的实施方案中，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含通过纯化方法获得的雷珠单抗，所述纯化方法包括：
(i)从重组宿主细胞中以包涵体的形式获得rHu雷珠单抗；
(ii)使用溶解缓冲液溶解包涵体以获得溶解的rHu雷珠单抗；
(iii)使用重折叠缓冲液重折叠溶解的rHu雷珠单抗以获得重折叠的rHu雷珠单抗；
(iv)通过超滤浓缩重折叠的rHu雷珠单抗以获得浓缩的rHu雷珠单抗；
(v)将浓缩的rHu雷珠单抗进行多元层析纯化步骤的顺序，以除去与产物相关的杂质、宿主细胞蛋白质和宿主细胞核酸，并获得纯化的rHu雷珠单抗。
在一个更优选的实施方案中，本发明提供了通过本发明方法获得的重组人源化雷珠单抗。
在再一个实施方案中，本发明提供了一种用于玻璃体内施用的包含从本方法获得的雷珠单抗的水性组合物，其中所述组合物应用于治疗和控制年龄相关性黄斑变性和相关疾病。
实施例
以下实施例仅以举例说明的方式给出，因此不应被解释为以任何方式限制本发明的范围。
实施例1：结合/洗脱模式的多元层析
(i)包涵体的溶解
本发明使用在大肠杆菌中表达的重组人雷珠单抗，将0.8克包涵体首先溶解在40ml溶解缓冲液中30分钟，所述溶解缓冲液含有0.1M Tris pH9.0、2mM EDTA和6M盐酸胍作为变性剂。在25℃温度下通过使用磁力搅拌器溶解包涵体30分钟。在IB溶解后，以7000rpm离心10分钟，并用孔径为1.0μm的滤纸过滤。加入二硫苏糖醇(DTT)作为还原剂，使得溶解缓冲液中0.5M DTT的浓度为5.0mM。将溶液在搅拌条件下25℃保持30分钟用于还原。使可溶的和还原的包涵体溶液保持通过加入10.0mM氧化型谷胱甘肽的氧化3小时。
(ii)包含雷珠单抗的溶解的IB的重折叠
将约40mL溶解的、还原的和氧化的包涵体溶液加入960mL重折叠缓冲液中，所述重折叠缓冲液包含0.1M Tris、0.6M精氨酸、5.0％山梨糖醇和2MM EDTA、0.60mM胱氨酸和0.75mM半胱氨酸，pH 9.0。重折叠过程在50rpm、10±2℃下实施120小时。
(iii)重折叠的rHu雷珠单抗的超滤和渗滤
通过使用5kDa UltrasetteTM实验室切流式过滤装置的超滤浓缩重折叠的雷珠单抗蛋白质。使用连续渗滤操作将浓缩蛋白质缓冲液交换为20mM Tris pH 9.0。然后将缓冲液交换了的样品用作多元层析的输入。
(iv)多元层析I
用聚PEI-35树脂进行多元层析I。将浓缩的重折叠的雷珠单抗的pH调整至9.0，并用作进料物质。捕获重折叠的rHu雷珠单抗的实验使用20mM Tris pH 9.0作为平衡缓冲液，随后使用含有1M NaCl的20mM Tris pH9.0的3CV盐梯度而进行。在这种条件下，在流穿液中没有观察到蛋白质。在洗脱峰的RP-HPLC分析后，证实了在洗脱峰I中观察到了纯化的雷珠单抗(38.79％纯度)(图2)。洗脱峰II含有与产物相关的杂质(错误折叠和未折叠的雷珠单抗)和与方法相关的杂质(宿主细胞蛋白和核酸)。在图2中，多元层析的洗脱峰1含有纯化的rHu雷珠单抗(其使用SDS PAGE表征(图9，泳道3，48kDa))。
(v)多元层析II
使用聚CSX-35树脂进行多元层析II。捕获rHu雷珠单抗的实验使用10mM乙酸盐缓冲液pH 5.50作为平衡缓冲液进行。将多元层析I的洗脱池用作多元层析II的进料物质。用冰醋酸将进料物质的pH调整至pH 5.50。使用基于盐的分级梯度含有1M NaCl的10mM乙酸盐缓冲液pH 5.50进行洗脱。在梯度的10％中选择性除去与方法相关的杂质后，使用45％洗脱分级梯度洗脱纯的雷珠单抗。在这些峰的RP-HPLC分析后，证实了在流穿液和洗脱峰I中观察到了与方法相关的杂质(宿主细胞蛋白质和核酸)，而在洗脱峰II中观察到了纯化的雷珠单抗(99.50％纯度)和在洗脱峰III中观察到了与产物相关的杂质(错误折叠和未折叠的雷珠单抗)(图3)。使用SDS PAGE分析核实产物的质量，发现与标准的雷珠单抗的质量非常一致(图7中泳道1，48kDa)。
实施例2：结合-洗脱多元层析I和II
重折叠rHu雷珠单抗及其预处理
(i)包涵体的溶解
将0.4克包含在大肠杆菌中表达的重组人雷尼珠单抗的IB溶解在20mL溶解缓冲液中30分钟，所述溶解缓冲液含有0.1M Tris pH 9.0、2.0mM EDTA和6.0M盐酸胍作为变性剂。按照实施例1(i)的方法进行进一步的处理。
(ii)溶解的包涵体的重折叠
根据实施例1(ii)中公开的方法进行重折叠。
(iii)重折叠的rHu雷珠单抗的超滤和渗滤
按照实施例1(iii)中公开的方法进行重折叠的rHu雷珠单抗的超滤和渗滤。
(iv)多元层析I
用聚PEI-35树脂进行多元层析I。将浓缩的重折叠的雷珠单抗的pH调整至10.0，并用作进料物质。捕获重折叠的rHu雷珠单抗的实验使用20.0mM Tris pH 10.0作为平衡缓冲液，随后使用5.0CV盐梯度而进行，所述5.0CV盐梯度使用含有1.0M NaCl的20.0mM Tris pH10.0。在流穿液中没有观察到蛋白质。在洗脱峰的RP-HPLC分析后，证实了在洗脱峰I中观察到了纯化的雷珠单抗(37.97％纯度)。洗脱峰II含有与产物相关的杂质(错误折叠和未折叠的雷珠单抗)和与方法相关的杂质(宿主细胞蛋白和核酸)。
(v)多元层析II
使用聚CSX-35树脂进行多元层析II。捕获rHu雷珠单抗的实验使用pH 5.5的10.0mM乙酸盐缓冲液作为平衡缓冲液进行。将多元层析I的洗脱池用作多元层析II的进料物质。用冰醋酸将进料物质的pH调整至pH5.5。使用基于盐的分级梯度含有1.0M NaCl的10mM乙酸盐缓冲液pH 5.5进行洗脱。在梯度的10％中选择性除去与方法相关的杂质后，使用洗脱分级梯度的45％洗脱纯的雷珠单抗。在这些峰的RP-HPLC分析后，证实了在流穿液和洗脱峰I中观察到了与方法相关的杂质(宿主细胞蛋白质和核酸)，而在洗脱峰II中观察到了纯化的雷珠单抗(99.50％纯度)(图3)和在洗脱峰III中观察到了与产物相关的杂质(错误折叠和未折叠的雷珠单抗)。
实施例3：流穿模式多元层析I和结合和洗脱模式多元层析II
rHu雷珠单抗的重折叠及预处理
(i)包涵体的溶解
本研究使用在大肠杆菌中表达的重组人雷珠单抗。将0.267克包涵体(IB)溶于13.3mL溶解缓冲液中。按照实施例1(i)中进行的方法进行进一步处理。
(ii)溶解的包涵体的重折叠
将13.3mL溶解的、还原的和氧化的包涵体加入986.7mL重折叠缓冲液中，并根据实施例1(ii)进行该方法。
(iii)重折叠的rHu雷珠单抗的超滤和渗滤
通过使用5kDa UltrasetteTM实验室切流式过滤装置的超滤浓缩重折叠的雷珠单抗蛋白质。使用连续渗滤操作将浓缩的蛋白质缓冲液交换为20mM Tris pH 8.0。然后将缓冲液交换了的样品用作多元层析的输入。
(iv)多元层析I
用聚PEI-35树脂进行多元层析I。将浓缩的重折叠的雷珠单抗的pH调整至8.0，并用作进料物质。捕获重折叠的rHu雷珠单抗的实验使用20.0mM Tris pH 8.0作为平衡缓冲液，随后使用5.0CV盐梯度而进行，所述5.0CV盐梯度使用含有1.0M NaCl的20.0mM Tris pH8.0。在这种条件下，在流穿液中观察到重折叠的rHu雷珠单抗。在流穿液的RP-HPLC分析后，证实了在流穿液中观察到了纯化的雷珠单抗(31.24％纯度)。洗脱峰I和洗脱峰11分别含有与产物相关的杂质(错误折叠和未折叠的雷珠单抗)和与方法相关的杂质(宿主细胞蛋白和核酸)。
(v)多元层析II
使用聚CSX-35树脂进行多元层析II。捕获rHu雷珠单抗的实验使用pH 5.5的10.0mM乙酸盐缓冲液作为平衡缓冲液进行。将多元层析I的流穿液用作多元层析II的进料物质。用冰醋酸将进料物质的pH调整至pH5.5。使用基于盐的分级梯度含有1.0M NaCl的10.0mM乙酸盐缓冲液pH5.5进行洗脱。在梯度的10％中选择性除去与方法相关的杂质后，使用洗脱分级梯度的45％洗脱纯的雷珠单抗。在这些峰的RP-HPLC分析后，证实了在流穿液和洗脱峰I中观察到了与方法相关的杂质(宿主细胞蛋白质和核酸)，而在洗脱峰II中观察到了纯化的雷珠单抗(99.50％纯度)和在洗脱峰III中观察到了与产物相关的杂质(错误折叠和未折叠的雷珠单抗)。
实施例4：流穿模式多元层析I和结合和洗脱模式多元层析II
(i)包涵体的溶解
按照实施例2(i)的方法进行溶解。
(ii)溶解的包涵体的重折叠
按照实施例2(ii)的方法进行重折叠。
(iii)重折叠的rHu雷珠单抗的超滤
通过使用5kDa UltrasetteTM实验室切流式过滤设计的超滤浓缩重折叠的雷珠单抗蛋白质。然后将浓缩的蛋白质样品用作多元层析I的输入。
(iv)多元层析I
在流穿模式下用聚PEI-35树脂进行多元层析I。将浓缩的重折叠的雷珠单抗的pH调整至9.0，将电导率调整至6.0mS/cm，并用作进料物质。捕获流穿液中的重折叠的rHu雷珠单抗的实验使用20.0mM Tris pH 9.0作为平衡缓冲液，随后使用5.0CV盐梯度而进行以除去杂质，所述5.0CV盐梯度使用含有1.0M NaCl的20.0mM Tris pH 9.0。在这种实验条件下，在流穿液中观察到了重折叠的rHu雷珠单抗。在流穿液的RP-HPLC分析后，证实了在流穿液中观察了到纯化的雷珠单抗(29.69％纯度)。洗脱峰I和洗脱峰II含有与产物相关的杂质(错误折叠和未折叠的雷珠单抗)和与方法相关的杂质(宿主细胞蛋白和核酸)。图4显示实施用于rHu雷珠单抗的纯化的多元层析I的层析谱。
(v)多元层析II
使用聚CSX-35树脂进行多元层析II。捕获rHu雷珠单抗的实验使用10.0mM乙酸盐缓冲液pH 5.50作为平衡缓冲液进行。将多元层析I的洗脱池用作多元层析II的进料物质。用冰醋酸将进料物质的pH调整至pH5.5。使用基于盐的分级梯度含有1M NaCl的10.0mM乙酸盐缓冲液pH 5.5进行洗脱。在该梯度的10.0％中选择性除去与方法相关的杂质后，使用洗脱分级梯度的45.0％洗脱纯的雷珠单抗。在这些峰的RP-HPLC分析后，证实了在流穿液和洗脱峰I中观察到了与方法相关的杂质(宿主细胞蛋白质和核酸)，而在洗脱峰II中观察到了纯化的雷珠单抗(99.50％纯度)和在洗脱峰III中观察到了与产物相关的杂质(错误折叠和未折叠的雷珠单抗)。
实施例5：流穿模式多元层析I和结合和洗脱模式多元层析II
(i)包涵体的溶解
按照实施例2(i)的方法进行包涵体的溶解。
(ii)溶解的包涵体的重折叠
按照实施例2(ii)的方法进行重折叠。
(iii)重折叠的rHu雷珠单抗的超滤和渗滤
按照实施例4(iii)的方法进行重折叠的rHu雷珠单抗的超滤。
(iv)多元层析I
在流穿模式下用聚PEI-35树脂进行多元层析I。将浓缩的重折叠的雷珠单抗的pH调整至9.0，将电导率调整至12.0mS/cm，并用作进料物质。捕获流穿液中的重折叠的rHu雷珠单抗的实验使用20.0mM Tris pH 9.0作为平衡缓冲液，随后使用5.0CV盐梯度而进行以除去杂质，所述5.0CV盐梯度使用含有1.0M NaCl的20.0mM Tris pH 9.0。在这种实验条件下，在流穿液中观察了到重折叠的rHu雷珠单抗。在流穿液的RP-HPLC分析后，证实了在流穿液中观察到了纯化的雷珠单抗(33.12％纯度)(图5)。洗脱峰I和洗脱峰II含有与产物相关的杂质(错误折叠和未折叠的雷珠单抗)和与方法相关的杂质(宿主细胞蛋白和核酸)。图5显示了实施用于rHu雷珠单抗的纯化的多元层析I的层析谱。
(v)多元层析II
使用聚CSX-35树脂进行多元层析II。捕获rHu雷珠单抗的实验使用pH 5.5的10.0mM乙酸盐缓冲液作为平衡缓冲液进行。将多元层析I的洗脱池用作多元层析II的进料物质。用冰醋酸将进料物质的pH调整至pH5.5。使用基于盐的分级梯度含有1.0M NaCl的10mM乙酸盐缓冲液pH 5.5进行洗脱。在该梯度的10.0％中选择性除去与方法相关的杂质后，使用洗脱分级梯度的45.0％洗脱纯的雷珠单抗。在这些峰的RP-HPLC分析后，证实了在流穿液和洗脱峰I中观察到了与方法相关的杂质(宿主细胞蛋白质和核酸)，而在洗脱峰II中观察到了纯化的雷珠单抗(99.50％纯度)和在洗脱峰III中观察到了与产物相关的杂质(错误折叠和未折叠的雷珠单抗)。
实施例6：结合和洗脱模式多元层析II，随后是结合和洗脱模式多元层析I
(i)包涵体的溶解
按照实施例1(i)的方法进行溶解方法。
(ii)溶解的包涵体的重折叠
按照实施例1(ii)的方法进行重折叠方法。
(iii)重折叠的rHu雷珠单抗的超滤和渗滤
通过使用5kDa UltrasetteTM实验室切流式过滤设计的超滤浓缩重折叠的雷珠单抗蛋白质。然后用冰醋酸将浓缩的蛋白质样品的pH调整至pH5.5。将浓缩的重折叠的蛋白质样品的电导率调整至10.0mS/cm。宿主细胞蛋白质在pH 5.5沉淀。通过8000rpm离心15分钟除去沉淀的宿主细胞蛋白质，然后将重折叠的蛋白质的上清液用作多元层析II的输入。
(iv)多元层析II
使用聚CSX-35树脂进行多元层析II。捕获rHu雷珠单抗的实验使用10.0mM乙酸盐缓冲液pH 5.50作为平衡缓冲液进行。使用基于盐的分级梯度含有1.0M NaCl的10.0mM乙酸盐缓冲液pH 5.5进行洗脱。在梯度的10％中选择性除去与方法相关的杂质后，使用洗脱分级梯度的45％洗脱纯的雷珠单抗。在这些峰的RP-HPLC分析后，证实了在流穿液和洗脱峰I中观察到了与方法相关的杂质(宿主细胞蛋白质和核酸)，而在洗脱峰II中观察到了纯化的雷珠单抗和在洗脱峰III中观察到了与产物相关的杂质(错误折叠和未折叠的雷珠单抗)。
(v)多元层析I
在流穿模式下用聚PEI-35树脂进行多元层析I。将多元层析II的输出物的pH调整至pH 9.0。捕获流穿液中的重折叠的rHu雷珠单抗的实验使用20.0mM Tris pH 9.0作为平衡缓冲液，随后使用5CV盐梯度而进行以除去杂质，所述5CV盐梯度使用含有1.0M NaCl的20.0mM Tris pH 9.0。在这种实验条件下，在流穿液中观察到了重折叠的rHu雷珠单抗。在流穿液的RP-HPLC分析后，证实了在流穿液中观察到了纯化的雷珠单抗。洗脱峰I和洗脱峰II含有与产物相关的杂质(错误折叠和未折叠的雷珠单抗)和与方法相关的杂质(宿主细胞蛋白和核酸)。
实施例7：结合-洗脱模式多元层析I和II
rHu雷珠单抗的体内可溶性表达和预处理：
(i)可溶性rHu雷珠单抗在突变的大肠杆菌中的表达
收获包含表达的重组人雷珠单抗的大肠杆菌细胞，并将其以1∶10(w/v)的细胞团块：缓冲液比例重悬于裂解缓冲液(20.0mM Tris，0.1mM EDTA，pH 9.0)中。细胞裂解使用高压匀浆器在15000bar压力下进行20分钟。将细胞裂解液在4℃以10000rpm离心30分钟，以获得细胞裂解液的上清液。
(ii)重折叠的rHu雷珠单抗的超滤和渗滤
使用连续渗滤操作将可溶的rHu雷珠单抗缓冲液交换为20.0mM Tris pH 9.0。将缓冲液交换了的样品用作多元层析的输入。
(iii)多元层析I
用聚PEI-35树脂进行多元层析I。将浓缩的可溶的rHu雷珠单抗的pH调整至9.0，并用作进料物质。捕获可溶的rHu雷珠单抗的实验使用20.0mM Tris pH 9.0作为平衡缓冲液，随后使用5.0CV盐梯度而进行，所述5.0CV盐梯度使用含有1.0M NaCl的20.0mM Tris pH9.0。在这种实验条件下，在流穿液中没有观察到蛋白质。在洗脱峰的RP-HPLC分析后，证实了在洗脱峰I中观察到了纯化的雷珠单抗(38.79％纯度)。洗脱峰II含有与产物相关的杂质(错误折叠和未折叠的雷珠单抗)和与方法相关的杂质(宿主细胞蛋白和核酸)。
(iv)多元层析II
使用聚CSX-35树脂进行多元层析II。捕获rHu雷珠单抗的实验使用10.0mM乙酸盐缓冲液pH 5.50作为平衡缓冲液进行。将多元层析I的洗脱池用作多元层析II的进料物质。用冰醋酸将进料物质的pH调整至pH5.50。使用基于盐的分级梯度含有1.0M NaCl的10.0mM乙酸盐缓冲液pH 5.50进行洗脱。在该盐梯度的10.0％中选择性除去与方法相关的杂质后，使用洗脱分级梯度的45.0％洗脱纯的rHu雷珠单抗。在这些峰的RP-HPLC分析后，证实了在流穿液和洗脱峰I中观察到了与方法相关的杂质(宿主细胞蛋白质和核酸)，而在洗脱峰II中观察到了纯化的雷珠单抗(图3)和在洗脱峰III中观察到了与产物相关的杂质(错误折叠和未折叠的雷珠单抗)。使用SDS PAGE分析核实产物的质量，发现与标准的雷珠单抗的质量非常一致(图10的泳道3，48kDa)。
实施例8：结合和洗脱模式多元层析I和II
(i)包涵体的溶解
根据实施例1(i)进行溶解。
(ii)溶解的包涵体的重折叠
根据实施例1(ii)进行重折叠。
(iii)重折叠的rHu雷珠单抗的超滤和渗滤
根据实施例1(iii)进行过滤。
(iv)多元层析I
用Capto粘附树脂进行多元层析I。将浓缩的重折叠的雷珠单抗的pH调整至9.0，并用作进料物质。捕获重折叠的rHu雷珠单抗的实验使用20.0mM Tris pH 9.0作为平衡缓冲液，随后使用5.0CV盐梯度而进行，所述5.0CV盐梯度使用含有1.0M NaCl的20.0mM Tris pH9.0。在这种实验条件下，在流穿液中没有观察到蛋白质。在洗脱峰的RP-HPLC分析后，证实了在洗脱峰I中观察到了纯化的雷珠单抗(38.79％纯度)。洗脱峰II含有与产物相关的杂质(错误折叠和未折叠的雷珠单抗)和与方法相关的杂质(宿主细胞蛋白和核酸)。
(v)多元层析II
使用Capto MMC树脂进行多元层析II。捕获rHu雷珠单抗的实验使用10.0mM乙酸盐缓冲液pH 5.50作为平衡缓冲液进行。将多元层析I的洗脱池用作多元层析II的进料物质。用冰醋酸将进料物质的pH调整至pH5.50。使用基于盐的分级梯度含有1.0M NaCl的10mM乙酸盐缓冲液pH5.50进行洗脱。在该盐梯度的10.0％中选择性除去与方法相关的杂质后，使用洗脱分级梯度的45.0％洗脱纯的rHu雷珠单抗。在这些峰的RP-HPLC分析后。证实了在流穿液和洗脱峰I中观察到了与方法相关的杂质(宿主细胞蛋白质和核酸)，而在洗脱峰II中观察到了纯化的雷珠单抗和在洗脱峰III中观察到了与产物相关的杂质(错误折叠和未折叠的雷珠单抗)。
实施例9：重组雷珠单抗的分析表征
(i)在A280测定雷珠单抗样品的吸光度
重折叠和层析输出物中的总蛋白质使用UV吸光度测定在280nm处来确定。所有收集的级分使用Nanodrop 2000和UV-1800Shimadzu UV可见分光光度计在280nm读取。
(ii)用于雷珠单抗的总蛋白质评估的Bradford测定法
用于总蛋白质评估的正交技术是使用Nanodrop 2000在595nm处的Bradford测定法。将5μl样品加入250μl Bradford试剂中后，在振荡器上进行混合30秒。混合后，样品在染料存在下温育25分钟，并在595nm处测定吸光度。
(iii)用于定量雷珠单抗的反相HPLC分析
各种层析输出物中rHu雷珠单抗的浓度在Agilent 1260HPLC***上使用4.6mm×150mm AerisTM 3.6um WIDEPORE XB C18柱测定(图11)。流动相由水中0.1％(v/v)TFA(溶剂A)和水中0.1％(v/v)TFA、70％(v/v)乙腈、20％(v/v)异丙醇(溶剂B)组成。在214nm波长处，使用A至B的线性梯度，将流速维持在1ml/min。对于通过本发明的方法获得的图11(b)中纯化的重折叠的雷珠单抗，峰(保留时间：28.1分钟)与图11(a)中获得的对于创新雷珠单抗的峰相似。
(iv)雷珠单抗样品的SDS PAGE分析
在非还原(图7)和还原条件(图8)下在浓缩胶恒定电压120V和分离胶恒定电压100V条件下，使用12％(厚度1mm)的分离胶，实施用于鉴定与雷珠单抗相关联的与方法和产物相关的杂质的SDS PAGE分析。在上样入凝胶前，将每个样品在起始缓冲液中煮沸10分钟。在聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离后，使用4∶1∶5(水∶冰醋酸∶甲醇)中的0.05％(w/v)考马斯亮蓝G-250检测蛋白质。图7中凝胶的分析表明，在针对纯化的重折叠的蛋白质的泳道1中存在一条48kDa蛋白质条带，从而证实rHu雷珠单抗的存在。图8中的还原凝胶结果显示存在雷珠单抗的轻链和重链。图7和8显示了与创新分子的生物相似性。
(v)用于雷珠单抗样品的体外生物活性的定量的ELISA分析
免疫酶测定法(兰尼单抗(Lucentis)/雷珠单抗，用于人的抗VEGF ELISA试剂盒，来自阿尔法诊断国际(Alpha Diagnostic International)，美国)。将含有纯化的重折叠的雷珠单抗的样品与涂覆在平板上的VEGF抗原反应。利用辣根过氧化物酶(HRP)酶标记的抗人IgG检测结合的雷珠单抗。免疫反应导致固相VEGF结合的抗体-雷珠单抗-酶标记的抗体的夹心复合物的形成。洗涤微量滴定条(microtiter strip)以除去任何未结合的反应物。然后使底物四甲基联苯胺(TMB)反应。在微量滴定板读数器上在450nm下读取水解底物的量，并且与存在的雷珠单抗的浓度直接成比例。
(vi)用于雷珠单抗的宿主细胞蛋白(HCP)定量ELISA分析
使用双位点免疫酶测定法(Cygnus大肠杆菌，HCP分析试剂盒F 410)分析阴离子交换层析流穿液中的宿主细胞蛋白质污染。含有大肠杆菌HCP的样品在微量滴定条中(所述微量滴定条中涂覆有亲和纯化的捕获抗大肠杆菌抗体)同时与辣根过氧化物酶(HRP)酶标记的抗大肠杆菌抗体反应。免疫反应导致固相抗体-HCP-酶标记的抗体的夹心复合物的形成。洗涤微量滴定条以除去任何未结合的反应物。然后使底物四甲基联苯胺(TMB)反应。在微量滴定板读数器上在450nm处读取水解底物的量，并且与存在的大肠杆菌HCP的浓度直接成比例。
(vii)雷珠单抗样品的SE HPLC分析
使用用YarraTM 3um SEC-2000(300×7.8mm ID)柱进行的SEC-HPLC分析确定在各种方法输出物中的聚集体含量(图12)。流动相由20mM乙酸盐缓冲液和50mM氯化钠缓冲液组成，pH为5.50。以等度模式进行分析，25℃，流速为0.5ml/min。用光电二极管阵列检测器在280nm处进行蛋白质检测。
(viii)双链DNA评估
使用Quant-iTTM picogreen测定法(Invitrogen BioServices印度私营有限公司，印度)评估输出样品中DNA的存在。使用双链λDNA制备标准曲线。将0.5ml的方法输出样品加入到0.5ml的稀释的Quant-iTTM dsDNA BR试剂中，并将反应混合物温育5分钟。5分钟后，用荧光分光光度计(激发波长480nm和发射波长520nm)测定荧光。
(viii)通过基质辅助激光解吸/电离(MALDI-TOF)对纯化的rHu雷珠单抗的完整的质量分析
将标准的和纯化的rHu雷珠单抗与芥子酸基质以1∶1的比例混合以进行MALDI-TOF分析。基质芥子酸(10mg/m1)在高纯水中的30％v/v乙腈，0.1％v/v TFA中制备。将1μl样品和基质的均质混合物存放在干净的384孔MALDI平板上。将平板***AB SCIEX TOF/TOFTM5800仪器中。仪器以正离子模式使用。337nm辐射的氮激光器保持作为电离源。4000到5000之间的激光强度用于样品的分析。结果分析使用ProteinPilotTM软件进行(图13)。图13的分析显示了使用开发的纯化平台获得的完整质量的纯化的rHu雷珠单抗与创新雷珠单抗分子之间的可比性。
(ix)通过LC-MS的肽指纹分析
切下来自SDS-PAGE分析的考马斯染色的蛋白质条带，并用解剖刀在玻璃板上切成小块。凝胶块用100mM NH4HCO3洗涤，并通过加入200μl50％乙腈和50％50mM NH4HCO3保留，涡旋并将其温育10分钟。除去液体，再次用100％乙腈洗涤以使凝胶块脱水。除去乙腈，并在通风橱中空气干燥10分钟。凝胶块用50μl在100mM NH4HCO3中的10mM DTT在56℃下覆盖45-60分钟用于还原和烷基化。除去DTT溶液，并加入50μl在100mM NH4HCO3中的55mM碘乙酰胺，在室温下在暗处温育45分钟。除去碘乙酰胺。用100μl 100mM NH4HCO3振荡洗涤凝胶块5分钟，然后用50％乙腈+50％50mM NH4HCO3振荡凝胶块两次5分钟。用100μL如上所述的乙腈使凝胶脱水。除去剩余的液体并通过使用真空离心蒸发浓缩器将其干燥。加入20μL胰蛋白酶(12.5ng/μL)溶液用于胰蛋白酶消化至刚好覆盖凝胶块。在含有50mM NH4HCO3和胰蛋白酶的缓冲液中，在4℃下对凝胶块复水30分钟。将凝胶块在37℃下过夜消化。将消化的上清液转移到干净的1.5mL Eppendorf管中用于肽提取。将30HL 50％乙腈和2％甲酸加入凝胶块中，温育20分钟。肽溶液在不加热的水浴中超声处理5分钟。除去上清液并与使之初始消化溶液合并。然后通过真空离心蒸发浓缩器干燥肽溶液。将肽样品重构到在高纯水中的3.0％v/v乙腈、0.1％v/v甲酸中。将4μL样品(2.5μg)上样入Agilent ZORBAX RRHD 300SB-C18，0.3×100mm 3μm柱中，并通过Q Exactive Orbitrap LC-MS/MS***分析。
本发明的优点
·通过整合用于rHu雷珠单抗下游处理的多元层析纯化步骤，获得了与现有制造方法相比在生产率方面近两倍的改进。
·正交分析测试建立了使用本发明获得的纯化药物物质与创新雷珠单抗分子之间的分析可比性。
·开发的纯化平台可应用于体外重折叠和可溶性表达的抗体片段。

Claims (5)

1.一种用于纯化来自重组宿主细胞的表达为包涵体或可溶形式的重组人源化(rHu)雷珠单抗的抗体片段的方法，所述方法包括：
(a)溶解来自重组宿主细胞的含有rHu雷珠单抗的轻链和重链的包涵体以获得溶解的rHu雷珠单抗；
(b)重折叠步骤(a)的所述溶解的rHu雷珠单抗以获得重折叠的rHu雷珠单抗；
(c)通过超滤浓缩步骤(b)的所述重折叠的rHu雷珠单抗以获得浓缩的重折叠的雷珠单抗；
(d)将步骤(c)的所述浓缩的重折叠/可溶形式的rHu雷珠单抗进行多元层析I期，所述层析方法包括：
(d)(i)将具有范围为8.0至10.0的pH的步骤(c)的浓缩的重折叠的rHu雷珠单抗进料至多元层析树脂上以捕获rHu雷珠单抗并用缓冲液除去杂质，所述缓冲液包含20mM至50mMTris HC1和0mM至150mMNaCl或包含20mM至50mM乙酸盐和0mM至150mM NaCl，所述缓冲液具有范围为8.0至10.0的pH；
(d)(ii)在洗脱缓冲液存在下洗脱rHu雷珠单抗至洗脱池中，所述洗脱缓冲液包含20mM至50mM乙酸盐或Tris HC1和0mM至1000mM氯化钠，所述洗脱缓冲液具有范围为8.0至10.0的pH，
其中盐浓度梯度在5-10CV范围内；其中所述多元层析树脂为PolyPEI-35或Capto粘附阴离子交换树脂，且其中纯化的雷珠单抗具有少于5％的未折叠或错误折叠形式的雷珠单抗和少于2％的聚集形式的雷珠单抗；
(e)将步骤(d)(ii)的所述rHu雷珠单抗进行多元层析II期，所述层析方法包括：
(e)(iii)用缓冲液将来自步骤(d)(ii)的所述洗脱池的rHu雷珠单抗进料到多元层析树脂上以捕获rHu雷珠单抗，所述来自步骤(d)(ii)的所述洗脱池的rHu雷珠单抗具有pH5.5，所述缓冲液包含20mM至50mM乙酸盐和0mM至150mM NaCl，所述缓冲液具有pH 5.5；
(e)(iv)用洗脱缓冲液洗脱rHu雷珠单抗，所述洗脱缓冲液包含20mM至50mM乙酸盐和0mM至1000mM NaCl，所述洗脱缓冲液具有范围为5.5的pH；
其中多元层析树脂为PolyCSX-35或Capto MMC阳离子交换树脂，且
其中纯化的rHu雷珠单抗具有少于0.1％的未折叠或错误折叠形式的rHu雷珠单抗和少于0.3％的聚集形式的rHu雷珠单抗，且
其中纯化的rHu雷珠单抗的纯度和产率为99.50％±0.08％和32.55％±2.55％。
2.如权利要求1所述的方法，其中多元层析模式选自包含流穿多元层析和结合-洗脱多元层析的组。
3.如权利要求2所述的方法，其中采用流穿模式的多元层析包括：
将范围为6.0mS/cm至12mS/cm的输入电导率施加至步骤(c)的浓缩的重折叠的雷珠单抗。
4.如权利要求1所述的方法，其中步骤(d)(i)和(d)(ii)分别与步骤(e)(iii)和(e)(iv)可互换。
5.如权利要求1所述的方法，其中在多元层析的第一阶段后，将包含rHu雷珠单抗的所述洗脱池的pH调整至对应于顺序多元层析阶段中的pH的范围，其中所述步骤包括：
(a)在所述多元层析方法步骤(d)(i)和(d)(ii)的第一阶段之后，将所述洗脱池的pH调整至pH 5.5，或
(b)在所述多元层析方法步骤(e)(iii)和(e)(iv)的第一阶段之后，将所述洗脱池的pH调整至范围为8.0至10.0的pH。
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