CN110577959B

CN110577959B - 一种纤维素外切酶基因及其蛋白和重组载体

Info

Publication number: CN110577959B
Application number: CN201911014486.3A
Authority: CN
Inventors: 胡兴; 李洪波; 李露露; 董海丽
Original assignee: Huaihua University
Current assignee: Huaihua University
Priority date: 2019-10-22
Filing date: 2019-10-22
Publication date: 2021-09-21
Anticipated expiration: 2039-10-22
Also published as: CN110577959A

Abstract

本发明涉及一种茯苓的纤维素外切酶基因，还涉及含有该基因的重组载体及其表达重组蛋白的制备方法，该基因至少含有下列核苷酸序列之一的DNA片：1)序列表中SEQ ID NO.1的核苷酸序列；2)与SEQ ID NO.1所示核苷酸序列具有90％以上同源性、且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列。按照本发明所述的基因序列进一步构建组成型分泌表达载体并转化酵母，筛选的高水平分泌表达转化子能高水平分泌表达重组茯苓纤维素外切酶，通过镍亲和纯化，可得到纯度高于95％活性重组蛋白，该重组蛋白能将滤纸等纤维素类物质水解并产生葡萄糖的能力，在生物能源、饲料及食品行业等方面具有重要应用价值。

Description

一种纤维素外切酶基因及其蛋白和重组载体

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，涉及一种新的来源于茯苓的纤维素外切酶基因及其蛋白和重组载体。

背景技术

纤维素是自然界中最丰富的天然有机物，堪称为世界上总量最大的可再生资源。我国仅农作物秸秆年产量就高达6×10⁸～7×10⁸吨，但这些宝贵的纤维素资源并没有被有效地利用。利用微生物产生的纤维素酶来分解纤维素是一种高效且环保的方法。根据纤维素酶的结构不同，可把纤维素酶分为两类：纤维素酶复合体和非复合体纤维素酶。非复合体纤维素酶由内切糖苷水解酶、外切糖苷水解酶和β-葡聚糖苷酶组成。外切葡聚糖酶，可以随机切割纤维素链产生不同长度的寡糖和新的末端；外切葡聚糖酶，作用于外切葡聚糖酶切割形成的多糖链的末端，产生葡萄糖和纤维二糖；β-葡萄糖苷酶，水解纤维二糖生成2分子的葡萄糖。纤维素酶广泛存在于自然界的生物体中，如细菌、真菌、植物、动物等众多生物体都能产生纤维素酶。可以通过利用生物体产生的纤维素酶添加到纤维素原料中来利用这些原料，因此如何大量生产纤维素酶就成了制约纤维素利用的主要瓶颈。

纤维素是自然界中十分丰富的资源，但纤维素酶的工业化生产受到酶效率低、热稳定性差以及成本较高等诸多因素的限制。随着生物技术的发展，利用基因工程手段开发高活性、高产量的纤维素酶资源越来越受到国内外学者的重视。目前，纤维素酶基因的克隆及表达已经取得了很大的进展，但是还有很大的空间值得人们去研究，开发出越来越多的高活性、高产量的纤维素酶。由于市售纤维素酶往往是众多酶的混合物，很难买到完全由纤维素酶类组成的酶制剂，因此利用基因工程手段逐一生产构成纤维素酶的单体酶成分，再将它们按适当比例混合，是生产纯纤维素酶的可行途径之一。

大肠杆菌的遗传背景清楚，又由于其具有周期短、高效率、易操作、使用安全等特点，成为外源基因的首选表达***。不少研究者将昆虫神经毒素构建大肠杆菌表达载体，经转化E.coli在BL21(DE3)进行表达，但得到的都是无活性的包涵体，通过体外合适的条件下溶解、变性、复性、纯化，从每升培养基可得到仅能得到几十至上百微克的的可溶性蛋白质。在大肠杆菌中表达，可能因为LPS的存在而产生毒性，因此往往需要对表达纯化产物的毒性进行分析测定。最后，要得到高纯度的蛋白往往需要经过多步纯化操作处理，纯化的步骤越多，蛋白质的得率就会越低，且更可能导致目标产物的失活。在申请号为CN201811238622.2中，以pET32为表达载体利用BL21为表达菌株对纤维素外切酶进行了表达并纯化得到一定量活性好的重组蛋白，但利用上述载体表达的蛋白都是胞内蛋白，纯化时需要先破碎菌体，纯化步骤比较麻烦且回收率较低。酵母是一种高效的外源基因表达体系，以Pichiapastoris(毕赤巴斯德酵母)为宿主的外源基因表达***近年来发展最为迅速，应用也最为广泛。但每一种蛋白能否实现在酵母中的高水平分泌表达需要合适的基因序列、筛选高水平分泌表达的转化子、优化表达条件和建立高效的蛋白纯化方法。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明目的在于提供一种新的来源于茯苓的纤维素外切酶基因及其蛋白和重组载体。还提供了纤维素外切酶蛋白的高表达制备方法。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、本发明提供一种基因，为编码纤维素外切酶类蛋白的基因，为如下(1)-(3)中任意一种的DNA分子：

(1)由序列表中SEQ ID No.1所示的DNA分子；

(2)与(1)限定的DNA序列至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码具有水解纤维素活性的蛋白的DNA分子。

其中，序列表中的SEQ ID No.1由1545个脱氧核苷酸组成，本序列包括纤维素外切酶基因的成熟蛋白全长读码框和6个组氨酸残基组成的表达标签和终止密码子，编码具有序列表中SEQ ID No.2的氨基酸残基序列的蛋白质。

由上述序列表中的SEQ ID No.1编码得到的蛋白属于本发明的保护范围。

2、本发明提供一种纤维素外切酶蛋白，是如下(1)或(2)所述的蛋白：

(1)由序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(2)将序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加的蛋白质。

其中，序列表中的SEQ ID No.2由514个氨基酸残基组成，其中前508个氨基酸残基为成熟纤维素外切酶蛋白氨基酸序列，后6个氨基酸残基为组氨酸组成的表达标签，其编码基因的读码框包含1545个核苷酸。

所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

3、含有上述基因的重组载体、表达盒或重组菌也属于本发明的保护范围。

进一步，所述重组载体由空载体和***该空载体的目的基因组成，具体为将上述基因合成后直接***表达空载体中，得到表达上述蛋白的重组载体。

进一步，所述重组载体具体为将上述基因***表达空载体pGAPZαA的Xho I和XbaI双酶切位点间，得到表达上述蛋白的重组载体。

4、本发明的第四个目的是提供一种制备纤维素外切酶蛋白的方法，包括以下步骤：

S1：将权利要求1所述的人工合成的基因和表达载体pGAPZαA分别用Xho I和Xba I双酶切并纯化回收，然后利用连接酶在16℃连接，得重组载体pGAPZαA-茯苓纤维素外切酶；

S2：将所述重组载体pGAPZαA-茯苓纤维素外切酶用Sac I单酶切线性化，并用氯化锂转化法转化到毕赤酵母宿主菌中，再经过Zeocin筛选得到阳性克隆；

S3：将所述阳性克隆转接至含有更高Zeocin抗性的YPD平板，筛选更高水平Zeocin抗性的转化子，最终得到了在含有2mg/ml Zeocin的YPD平板能正常生长的转化子。筛选得到高Zeocin抗性的转化子，用含有10ml YPG培养液的100毫升三角瓶培养高抗性的转化子，28℃、250rpm培养至OD₆₀₀＝10左右，离心取上清，将上清液20μl加入到80μl含1％的CMC-Na的磷酸二氢钠与柠檬酸缓冲液中(pH＝4)，40℃下反应1小时；取反应后的样品50μl和2μl的浓度为10mmol/L NAD与ATP的混合液，补加水至总体积为95μl，室温下反应5min后，加入5μl浓度为2μmol/L的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，室温下反应3min后，于340nm测定吸光值。同时，以葡萄糖标准品制作标准曲线。吸光值最大的转化子即为最高水平表达茯苓纤维素外切酶的转化子。

S4：将所述高表达茯苓纤维素外切酶的转化子用YPG培养基培养至OD₆₀₀为10～15作为种子菌，将种子菌按1：10的比例接种到含有无机盐培养基的发酵罐中。在28-30℃继续培养72-96小时并补加60％的甘油作为碳源，甘油补加速率与溶氧串联，设定发酵罐的溶氧为40％；利用浓氨水来调节pH，设定发酵罐的pH为4.5。

优选地，在步骤S4之后，还包括纯化蛋白的如下步骤：

S5：将所述S4发酵后的培养液离心，取上清液利用Tris碱调节pH至7.5～8.5，以大于或等于15000g的转速离心10～20分钟，将获得的上清液加入到经pH 8Tris-HCl缓冲液平衡后的镍亲合层析柱中，用2～4倍层析柱体积的pH 8的含10mM Tris-HCl和30mM咪唑的缓冲液漂洗所述镍亲合层析柱；

S6：用含10mM Tris-HCl和200mM咪唑的缓冲液洗脱所述镍亲合层析柱，将得到的洗脱液利用分子量为10kDa的透析袋于10mM Tris-HCl缓冲液中透析，然后超滤浓缩。

优选地，在步骤S5或S6之后，还包括保存蛋白的如下步骤：

S7：将所述超滤浓缩得到的产品在-80℃下速冻，然后冷冻干燥。

根据上述任一种制备蛋白的方法制备得到的蛋白也属于本发明的保护范围。

通过步骤S3筛选得到的稳定且能高水平分泌表达茯苓纤维素外切酶的酵母转化子也属于本发明保护的范围。

上述蛋白、上述基因或上述重组载体、表达盒的应用也是本发明保护的范围。

进一步，所述应用为将纤维素分解在饲料、纺织、食品和/或生物能源领域中的应用。

本发明提供的技术方案具有以下优点：一是提供了一种新的可高效表达纤维素外切酶的基因，进一步根据本技术方案所述的表达方法分泌表达和纯化得到的具有生物活性的重组纤维素外切酶能够有效防止宿主菌对表达产物的降解，减轻宿主细胞代谢的负荷和表达产物对宿主的毒性作用；二是利用酵母载体pGAPZαA-纤维素外切酶上的分泌信号α-因子信号肽引导目的蛋白的基因分泌表达，目的蛋白会大量分泌到培养液中，且能形成准确的空间结构，从而保持纤维素外切酶的天然活性；三是通过筛选得到了稳定且能高水平分泌表达得纤维素外切酶的酵母转化子，并建立合适的高密度发酵培养体系是关键所在，通过本发明所给出的发酵体系，最高的总蛋白表达量为950mg/L，经电泳灰度扫描得出目标蛋白含量可高达400mg/L，纯化后每微克纤维素外切酶经反应1小时后，能水解产生7.2nmol的葡萄糖。四是摸索出用真核宿主毕赤酵母来表达纤维素外切酶的方法和快速高效纯化纤维素外切酶的方法，可以降低成本且实现大量生产；五是表达的重组蛋白可以利用镍亲合层析快速纯化，纯化的蛋白具有很强的水解纤维素的生物活性。本发明分泌表达目的蛋白的发酵上清液中不含甲醇，且蛋白浓度高，不需要纯化也可以直接使用蛋白进行应用。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

附图说明

图1为本发明实施例中的表达载体pGAPZαA-纤维素外切酶构建示意图。

图2为本发明实施例中高Zeocin抗性(2mg/ml)酵母转化子培养液上清的SDS-PAGE检测结果图。

图3为本发明实施例中在高密度发酵培养条件下，不同时间点目标蛋白表达情况的SDS-PAGE检测结果图。

图4为本发明实施例中不同浓度咪唑洗脱纯化得到的纤维素外切酶蛋白的SDS-PAGE检测结果图。

图5为本发明实施例中纯化得到的纤维素外切酶蛋白的SDS-PAGE检测结果图。

图6为重组蛋白经质谱鉴定所得到的其中一段多肽的二级质谱结果与检索到的序列。

图7为对比例酵母转化子上清液中的目标蛋白的SDS-PAGE检测结果图。

图8为本发明实施例4中纤维素外切酶水解滤纸产生葡萄糖的薄层层析染色结果图。

图9为本发明实施例5中纤维素外切酶水解滤纸产生葡萄糖的薄层层析染色结果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的％，如无特殊说明，均为质量百分含量。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，数据为三次重复实验的平均值或平均值±标准差。

本发明选用毕赤酵母菌株和整合性表达质粒pGAPZαA均购自美国Invritrogen公司。

所用培养基配方如下：

1)YPD培养基

完全溶解10g酵母提取物，20g蛋白胨，定容到900ml，121℃蒸气高压灭菌15-20min，冷却至70℃左右再加入100ml20％灭菌葡萄糖溶液。在其中加入1.5-1.8％的琼脂可制得YPD固体培养基。

2)YPG培养基

完全溶解10g酵母提取物，20g蛋白胨，20g甘油，定容到1000ml，121℃蒸气高压灭菌15-20min。

3)无机盐培养基

每升培养液中包含6克硫酸钾、5克硫酸镁、1克氢氧化钾、7毫升浓磷酸、30克甘油、适量消泡剂和0.3克硫酸钙，氨水调节pH至4.5，湿热灭菌冷却到室后，在接种时，按每升培养基再加入5毫升的微量元素溶液。

4)微量元素溶液

每升微量元素溶液中包含：65g FeSO₄·7H₂O,24g MoNa₂O₄·2H₂O,20g ZnCl₂,6gCuSO₄·5H₂O,3g MnSO₄·H₂O,0.5g CoCl₂,0.2g生物素,0.09g KI,0.02g H₃BO₃和5.0ml浓H₂SO₄，0.22μm细菌过滤器过滤后于4℃冰箱中保存备用。

实施例1

本实施例提供了一种优化的人工合成的C-端带有6×His标签的茯苓纤维素外切酶基因，具体序列如序列表中的SEQ ID No.1所示，该基因所对应的蛋白质序列如序列表中的SEQ ID No.2所示。优化后的DNA序列经NCBI比对，没有明显相似性的天然序列。

茯苓人工种植条件下，三个月即可结苓，六个月可采挖取苓。茯苓种植到收获一般不超过两年，否则因为松木的营养被完全吸收而死亡腐败。木材的主要成分是纤维素、半纤维素和木素，其中，木材纤维素含量为40％～50％。因此，茯苓菌丝中极可能存在高活性的可以降解纤维素、木质素、半纤维素等多糖的酶类。经过筛选，从茯苓中得到了一种具有很高活性的新型纤维素外切酶。因此，利用基因工程手段高效生产该酶蛋白将有助于研究该酶的作用机理并应用于实际工业生产中。

将本发明根据茯苓纤维素外切酶基因自身序列特点和酵母密码子偏好性合成的DNA序列、优化前的茯苓纤维素外切酶的天然DNA和另几种仅仅按酵母密码子偏爱性优化后合成的人工DNA序列分别连接至毕赤酵母分泌型表达载体pGAPZαA上，得到重组载体，然后利用Invitrogen公司操作手册提供的氯化锂转化法分别将重组载体转化到毕赤酵母宿主菌X-33中，转化后用含有100μg/ml Zeocin抗生素的YPD平板进行筛选。将100μg/ml Zeocin抗生素的YPD平板生长的毕赤酵母转化子用无菌水洗下，涂布接种至终浓度为250μg/mlZeocin抗生素的YPD平板，该抗性平板生长的转化子再涂布到500μg/ml Zeocin抗生素的YPD平板，按照Zeocin浓度倍增的方法，最终得到在2mg/ml Zeocinr YPD平板能正常生长的高抗性的毕赤酵母转化子。筛选得到高Zeocin抗性的转化子，用含有10ml YPG培养液的100毫升三角瓶培养高抗性的转化子，28℃、250rpm培养至OD₆₀₀＝10左右，离心取上清，将上清液20μl加入到80μl含1％的CMC-Na的磷酸二氢钠与柠檬酸缓冲液中(pH＝4)，40℃下反应1小时；取反应后的样品50μl和2μl的浓度为10mmol/L NAD与ATP的混合液，补加水至总体积为95μl，室温下反应5min后，加入5μl浓度为2μmol/L的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，室温下反应3min后，于340nm测定吸光值。同时，以葡萄糖标准品制作标准曲线。吸光值最大的转化子即为最高水平表达茯苓纤维素外切酶的转化子。

实施例2

本实施例提供一种制备纤维素外切酶蛋白的方法，具体包括如下步骤：

S1：构建表达载体及转化：将实施例1的基因自身序列特点和酵母密码子偏好性合成的DNA序列即SEQ ID No.1中的DNA连接至毕赤酵母组成型分泌型表达载体pGAPZαA，得到重组载体pGAPZαA-纤维素外切酶，载体构建如图1所示，图1为本发明实施例中的真核表达载体pGAPZαA-纤维素外切酶构建示意图。主要的载体构建步骤优选如下：

(1)用Xho I和Xba I双酶切含合成的茯苓纤维素外切酶基因的质粒，获得目的片断，反应体系如下(所用酶及缓冲液均购自大连TAKARA公司)：

(2)用Xho I和Xba I双酶切pGAPZαA，获得载体片断，反应体系如下(所用酶及缓冲液均购自大连TAKARA公司)：

(3)将步骤(1)和(2)得到的目的片断和载体片断用DNA凝胶收回试剂盒回收，该试剂盒购自大连TAKARA公司，具体操作按试剂盒说明书进行。

(4)将步骤(3)回收得到的目的片断和载体用T4DNA连接酶(购自大连TAKARA公司)进行连接反应，目的基因准确***到含有分泌信号α-因子的分泌型载体读码框内，反应体系如下：

S2：重组质粒的转化：将所述重组载体pGAPZαA-茯苓纤维素外切酶用Sac I单酶切线性化，按照Invitrogen公司操作手册提供的氯化锂转化法，将重组载体转化到毕赤酵母宿主菌中，本实施例选用的是X-33。转化后用含有100μg/ml Zeocin抗生素的YPD平板进行筛选。

S3：高水平分泌表达酵母转化子的筛选和蛋白的表达：转化后用含有100μg/mlZeocin抗生素的YPD平板进行筛选。将100μg/ml Zeocin抗生素的YPD平板生长的毕赤酵母转化子用无菌水洗下，涂布接种至终浓度为250μg/ml Zeocin抗生素的YPD平板，该抗性平板生长的转化子再涂布到500μg/ml Zeocin抗生素的YPD平板，按照Zeocin浓度倍增的方法，最终得到在2mg/ml Zeocinr YPD平板能正常生长的毕赤酵母转化子。挑取筛选得到高Zeocin抗性的转化子，用含有10ml YPG培养液的100ml三角瓶于28℃、250rpm培养至OD₆₀₀＝10左右，离心取上清，将上清液20μl加入到80μl含1％的CMC-Na的磷酸二氢钠与柠檬酸缓冲液中(pH＝4)，40℃下反应1小时；取反应后的样品50μl和2μl的浓度为10mmol/L NAD与ATP的混合液，补加水至总体积为95μl，室温下反应5min后，加入5μl浓度为2μmol/L的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，室温下反应3min后，于340nm测定吸光值。同时，以葡萄糖标准品制作标准曲线。吸光值最大的转化子即为最高水平表达茯苓纤维素外切酶的转化子。吸光值大小和纤维素外切酶的转化子表达水平有一定的正相关性。

S4：将所述高表达茯苓纤维素外切酶的转化子用YPG培养基培养至OD₆₀₀为10～15作为种子菌，将种子菌按1：10的比例接种到含有无机盐培养基的发酵罐中。在28℃继续培养96小时并自动补加60％的甘油作为碳源，甘油补加速率与溶氧串联，设定发酵罐的溶氧为40％；利用浓氨水来调节pH，设定发酵罐的pH为4.5。

需要说明的是，将高Zeocin抗性的转化子用YPG培养基小量表达，经SDS-PAGE分析，从高抗性(抗性水平为2mg/ml Zeocin)转化子中筛选得到4株稳定且高水平分泌表达茯苓纤维素外切酶的酵母转化子，而从50株抗性水平低于500μg/ml Zeocin YPD平板的转化子分泌表达目标蛋白的能力明显低于高抗性的转化子且酶活检测具有同样的结果，部分高Zeocin抗性转化子分泌目标蛋白的SDS-PAGE结果如图2所示，在70kDa左右有明显目的蛋白表达。

同样需要说明的是，用SDS-PAGE检测发酵罐中补料培养条件下不同时间目标蛋白表达情况分析，电泳结果如图3所示，图3为本发明实施例中在不同时间点目标蛋白表达情况的SDS-PAGE检测结果图。经培养1～4天，通过继续补加甘油，培养得到的目的蛋白总量更高，具体目的蛋白占上清液蛋白的总量结果如下表1所示。

表1总蛋白含量

培养时间	1天	2天	3天	4天
					总蛋白浓度(mg/L)	250	360	880	950

取培养1～4天的发酵液上清，经SDS-PAGE，在70kDa左右有明显目的蛋白表达，且通过继续补加甘油，培养得到的目的蛋白总量更高，SDS-PAG胶的灰度扫描结果显示，目标蛋白的比例与培养时间成正相关，目的蛋白占上清液总蛋白的比例结果如下表2所示。

表2不同诱导时间得到的目的蛋白占上清液蛋白的百分比含量结果

培养时间	1天	2天	3天	4天
					百分比含量(％)	12	18	39	42

经计算，虽然目标蛋白比例在下降，但由于总蛋白增加得更快，因此目标蛋白总量仍在明显增加，目的蛋白含量结果如下表3所示。

表3目标蛋白总量

培养时间	1天	2天	3天	4天
					纤维素外切酶(mg/L)	30	65	340	400

取培养1～4天的发酵液上清，将上清液10μl加入到80μl含1％的CMC-Na的磷酸二氢钠与柠檬酸缓冲液中(pH＝4)，40℃下反应1小时；取反应后的样品10μl和2μl的浓度为10mmol/L NAD与ATP的混合液，补加水至总体积为95μl，室温下反应5min后，加入5μl浓度为2μmol/L的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，室温下反应3min后，于340nm测定吸光值。。所得的吸光值变化如表4所示。从结果可以看出，在培养到第3天之后，酶活已接近最大值。

表4吸光值变化结果

培养时间	1天	2天	3天	4天
					340nm测定吸光值	0.22	0.45	1.89	1.95

由于组成型的转化子在菌体生长过程中无需使用到甲醇等易燃有害物质，因此实现该新型茯苓纤维素外切酶基因在毕赤酵母中的组成型分泌表达并建立高密度发酵培养体系是关键所在。

优选地，在步骤S4之后，还包括纯化蛋白的如下步骤：

S5：将所述S4发酵后的培养液离心，取上清液利用Tris碱调节pH至7.5～8.5，以大于或等于15000g的转速离心10～20分钟，将获得的上清液加入到经pH 8 Tris-HCl缓冲液平衡后的镍亲合层析柱中，用2～4倍层析柱体积的pH 8的含10mM Tris-HCl和30mM咪唑的缓冲液漂洗所述镍亲合层析柱；

S6：分别用含50mM、100mM、200mM咪唑的10mM Tris-HCl缓冲液按咪唑浓度的由低到高依次洗脱所述镍亲合层析柱，洗脱蛋白的SDS-PAGE结果如图4所示，从图中可以看出，50mM和100mM咪唑的缓冲液洗脱的蛋白还含有不少杂质蛋白，当收集200mM咪唑的缓冲液洗脱的样品时，目标蛋白具有很高的纯度。将得到的洗脱液利用分子量为10kDa的透析袋于10mM Tris-HCl缓冲液中透析，然后将重组蛋白超滤浓缩至5mg/ml以上。每100ml发酵液上清各步骤蛋白纯化的效率和回收率如表5所示。

表5各步骤蛋白纯化结果

在申请号为CN201811238622.2中，以pET 32为表达载体，BL21为表达菌株(后以大肠杆菌表达***表示)，在IPTG的诱导下，以超声波破碎后，可溶性的目标蛋白经镍亲合层析进行纯化，每100ml培养基仅能纯化到1.1mg的目标蛋白。而本发明的SEQ ID No.1以pGAPZαA为表达载体，X33为表达菌株，经高密度发酵每100ml发本酵液可以纯化到的目标蛋白为25mg，最终目标蛋白的回收率可达63％且纯度都在95％以上，其回收率和纯度均高于大肠杆菌表达***。相较于大肠杆菌表达***，以pGAPZαA为表达载体，X33为表达菌株在高密度发酵条件下实现了重组外切酶的高水平分泌表达和高效纯化，相同培养体积条件下，最终本发明提供的方法得到的重组酶是对比专利的25倍。

优选地，在步骤S5或S6之后，还包括保存蛋白的如下步骤：

S7：将所述超滤浓缩得到的产品在-80℃下速冻，然后冷冻干燥，即得到冻干粉蛋白。冻干粉溶解于生理盐水中，4℃、15000g的转速离心20分钟，取上清液进行SDS-PAGE分析，结果如图5所示，检测到了目标蛋白且目标蛋白极为单一条带，说明该蛋白处理的方法不会使蛋白大量变性蛋白和降解。利用Nano-LC-MS/MS对纯化的重组外切酶蛋白进行了质谱鉴定，共得到了10段序列，这些序列与都属于本发明提供的SEQ ID No.2中的一段，其中的一段检测到的二级质谱的结果和其匹配的序列如图6所示，该检测到的肽段CSGSDCGQGSDR正是全长序列中的一段。该结果说明纯化到的蛋白就是目标蛋白。

对比例

发明人利用转录组技术对茯苓的茯苓纤维素外切酶基因的表达谱进行分析发现了几个高丰度的纤维素分解的酶基因。利用转录组得到的数据，设计引物，经RT-PCR扩增目标基因并连接至克隆载体，扩增的目标基因天然序列如序列表中SEQ ID NO.3所示；同样，也合成了另几种仅仅按酵母密码子偏爱性优化后合成的人工DNA序列分别连接至毕赤酵母分泌型表达载体pGAPZαA上，其中的一种仅按酵母密码子偏爱性优化后合成的人工序列如序列表中SEQ ID NO.4所示(以该序列为代表)。将上述茯苓纤维素外切酶基因序列用Xho I和Xba I双酶切，并连接到同样经Xho I和Xba I双酶切的pGAPZαA表达载体。重组载体pGAPZαA-茯苓纤维素外切酶用Sac I单酶切线性化，并用氯化锂转化法转化到毕赤酵母宿主菌中，再经过Zeocin筛选得能在2mg/ml Zeocin的YPD平板正常生长的转化子。挑取筛选得到高Zeocin抗性的转化子，用含有10ml YPG培养液的100ml三角瓶于28℃、250rpm培养至OD₆₀₀＝10左右，离心取上清，将上清液20μl加入到80μl含1％的CMC-Na的磷酸二氢钠与柠檬酸缓冲液中(pH＝4)，40℃下反应1小时；取反应后的样品50μl和2μl的浓度为10mmol/L NAD与ATP的混合液，补加水至总体积为95μl，室温下反应5min后，加入5μl浓度为2μmol/L的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，室温下反应3min后，于340nm测定吸光值。同时，以葡萄糖标准品制作标准曲线。结果表明，几乎检测不到上述转化子的吸光值差异且几乎全部为0。同时，以SDS-PAGE检测上清蛋白中目标蛋白的表达情况，SDS-PAGE的检测结果如图7所示，未在目标位置检测到目标蛋白条带。结果说明，只有本发明提供的根据茯苓纤维素外切酶基因自身序列特点和酵母密码子偏好性合成的DNA序列表所示SEQ ID NO.1的序列转化到毕赤酵母中才能实现目标蛋白的高水平分泌表达。

实施例3

本实施例对纯化的可溶性茯苓纤维素外切酶的酶活力进行检测，具体步骤和结果如下：

以对硝基苯-β-D-吡喃葡糖苷为底物，对硝基苯酚为标准品，对实施例2经S7步骤纯化、浓缩后并冷冻干燥的重组茯苓纤维素外切酶冻干粉重新溶于生理盐水，调节蛋白浓度至1mg/ml后再进行酶活检测。

(1)标准曲线的绘制：取1g/L的葡萄糖，将其用pH4.0的20mM的柠檬酸缓冲液溶液分别稀释至800、400、200、100、50、25和0μg/ml。取上述稀释液各10μl，加入到90μl含1％的CMC-Na的磷酸二氢钠与柠檬酸缓冲液中(pH＝4)，40℃下反应1小时；取反应后的样品50μl和2μl的浓度为10mmol/L NAD与ATP的混合液，补加水至总体积为95μl，室温下反应5min后，加入5μl浓度为2μmol/L的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，室温下反应3min后，于340nm测定吸光值。并绘制标准曲线，所得的标准曲线方程为：Y＝0.0023X-0.0073，R²＝0.9999，标准品的检测结果表如表6所示。

表6标准品的检测结果

标准品浓度(μg/ml)	0	25	50	100	200	400	800
								OD<sub>340</sub>	0	0.05	0.11	0.23	0.45	0.93	1.87

(2)样品酶活的测定：取1μl浓度为5mg/ml的纯化的茯苓纤维素外切酶、pH4.0的20mM的柠檬酸盐缓冲溶液10μl加入到90μl含1％的CMC-Na的磷酸二氢钠与柠檬酸缓冲液中(pH＝4)，40℃下反应1小时；取反应后的样品50μl和2μl的浓度为10mmol/L NAD与ATP的混合液，补加水至总体积为95μl，室温下反应5min后，加入5μl浓度为2μmol/L的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，室温下反应3min后，于340nm测定吸光值。根据标准曲线，计算出经反应后产生的葡萄糖量。经计算，每微克纤维素外切酶经反应1小时后，能水解产生7.2nmol的葡萄糖。

(3)根据(2)的方法，分别利用pH3-7的柠檬酸和磷酸盐缓冲液，对酶活进行了检测。在不同pH值下，相对活力如表7所示，该酶的最适pH为4左右。表7为不同pH值下相对酶活的检测结果。在pH3-6下，都能保持73％以上的蛋白酶活性。

表7不同pH值相对酶活

pH	3	4	5	6	7
						相对酶活(％)	84	100	87	73	51

因此，根据以上结果，本发明所制备的新的茯苓纤维素外切酶是一种能高效水解纤维素的外切酶，最适pH为4左右。

实施例4

本实施例对纯化的可溶性茯苓纤维素外切酶的纤维素水解活力进行薄层层析检测，具体步骤和结果如下：

将终浓度为1mg/ml的茯苓纤维素外切酶100μl加入到10mg/ml的滤纸溶液100μl中，40℃下分别反应0、1、2和4小时。取硅胶G板于100℃烘箱活化后冷却至室温，用毛细管点样1μL，点样位置为从硅胶板下端1.5cm，两侧2～3cm，每个样品点相距1～1.5cm。将展层剂(乙酸乙酯∶乙酸∶水＝2∶1∶1)于层析缸中平衡，数分钟后，将硅胶板放入。当展层剂移至距上端2～3cm时，取出硅胶板吹干，均匀喷上显色剂(25％硫酸)，于100℃显色5～30min后从烘箱取出。显色结果如图8所示，从图中可以看出，该酶在加入茯苓纤维素外切酶与不加(0小时)酶的情况下，说明加入茯苓纤维素外切酶使滤纸出现了水解并产生了葡萄糖，因此在与葡萄糖标准品相同的位置出现了斑点，且斑点着色的深浅与酶作用的时间正相关。

实施例5

将本发明纯化的纤维素外切酶100μg和CN201811238622.2中利用大肠杆菌表达***表达的该等量纤维素外切酶分别加到pH为4的含1％的羧甲基纤维素钠溶液中，40℃下反应1小时；反应结束后，40℃下反应1小时；取反应后的样品10μl、2μl的浓度为10mmol/L NAD与ATP的混合液，补加水至总体积为95μl，室温下反应5min后，加入5μl浓度为2μmol/L的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，室温下反应3min后，于340nm测定吸光值。经计算，本发明纯化的纤维素外切酶作用下产生的葡萄糖的浓度约为274ng/μL，而大肠杆菌表达的重组酶作用下产生的葡萄糖的浓度为95ng/μL。由此表明，本发明以pGAPZαA为表达载体，X33为表达菌株表达的纤维素外切酶的活力是以pET 32为表达载体，BL21为表达菌株表达的相同纤维素外切酶活力的约2.85倍。

此外，将纯化的大肠杆菌表达的和毕赤酵母表达的重组茯苓纤维素外切酶分别溶于pH4.0的20mM的柠檬酸盐缓冲溶液中，终浓度为1mg/ml，加入等质量的经研磨成浆状的滤纸到以上酶溶液中，40℃下反应1小时。取硅胶G板于100℃烘箱活化后冷却至室温，用毛细管分别取未加入酶的滤纸液上清、大肠杆菌表达***表达的重组外切酶与滤纸的反应液和酵母表达***表达的重组外切酶与滤纸的反应液各2μL，点样至薄层硅胶板，点样位置为从硅胶板下端1.5cm，两侧2cm，每个样品点相距1cm。将展层剂(乙酸乙酯∶乙酸∶水＝2∶1∶1)于层析缸中平衡，数分钟后，将硅胶板放入。当展层剂移至距上端2cm时，取出硅胶板吹干，均匀喷上显色剂(25％硫酸)，于100℃显色20min后从烘箱取出。显色结果如图9所示，从图中可以看出，在加入有20μg的葡萄糖标准品的位置有显著的显色斑点；在未加入重组外切酶的滤纸液上清中，没有检测到葡萄糖的显色斑点；在加入大肠杆菌表达的重组外切酶样品中，经显色，在葡萄糖标准品的位置也出现了较弱的显色斑点，说明大肠杆菌表达的重组外切酶有将滤纸水解产生葡萄糖的能力，但斑点的显色较弱，说明产生的葡萄糖量较少；在加入毕赤酵母表达的重组纤维素外切酶样品中，经显色，在葡萄糖标准品的位置也出现了明显的显色斑点，说明酵母表达的重组外切酶有较强的水解滤纸产生葡萄糖的能力，其葡萄糖的产生量显著高于大肠杆菌的表达产物。可见本发明提供的方法比大肠杆菌的表达方法提供更为高效且酶活力更强的纤维素外切酶。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型，而并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型，而并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围，其均应涵盖在本发明的权利要求和说明书的范围当中。

序列表

<110> 怀化学院

<120> 一种纤维素外切酶基因及其蛋白和重组载体

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1545

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cagcaagctg gtactcagac cgctgagaac catccacagt tgtcctctca aaagtgtact 60

gccggtggat cttgtacttc tgcttccact tcggttgtcc tggactctaa ttggagatgg 120

gttcacacca cttccggtta caccaactgc tacactggta acacttggga cgcctccatc 180

tgttctgacc cagttacttg tgctcagaac tgcgctttgg atggtgctga ttacgccggt 240

acttacggaa ttactacttc tggtgacgcc ctgaccttga agttcgttac tggttctaac 300

gtcggattca gagtctacct gatggaagat gagactaact accagctgtt caagctgatg 360

aatcaagagt tcaccttcga cgtggacgtt tccaacttgc catgtggttt gaacggtgcc 420

gtttacttcg ttcaaatgga ccaagatggt ggttcctcta agttcccaaa caacaaggct 480

ggtgccaagt tcggaactgg ttactgtgat tcccaatgtc cacaggacat caagttcatc 540

aacggtgagg ccaacatcgt taactggacc gcttctgcag gtgatgctaa ctctggaact 600

ggttccttcg gtacttgttg ccaagagatg gatatctggg aagccaactc tatctccgct 660

gcctacactc cacatccatg taccgttact gagcagacca gatgttctgg ttctgattgt 720

ggacaaggtt ccgacagata caacggtatt tgcgacccag acggttgcga cttcaactcc 780

tttagaatgg gaaacaccga gttctacggt aagggattga ctgttgacac ttctcagaag 840

ttcaccatcg tcacacagtt catttccgac gatggcactg ctgacggtaa cttggctgag 900

atcagaagat tctacgtcca gaacggtaag gtcatcccaa actctgttgt tcagatcact 960

ggtatcgacc cagtcaactc tatcaccgag gatttctgta cacagcaaaa gaccgtgttc 1020

ggcgacaaca acaacttcgc tgcaaaaggt ggtctgcagc aaatgggaga agctgtcaag 1080

aacggtatgg ttctggcttt gtctctgtgg gatgactacg ctgcacaaat gttgtggctg 1140

gactctgact acccaactac cgctgatcca tctaagccag gagttgccag aggcacttgt 1200

ccaaccactt caggtgttcc atcgcaggtt gaaggtcaag aaggatcttc ctctgttatc 1260

tactccaaca ttaagttcgg cgacctgaac tccactttca ccggtacttt gactaaccca 1320

tcctctccag cttctccacc agttacatct tcaccatctc aaccatctca gtccactcag 1380

ccttctcagc ctgctcaacc ttcacaacca gctggaactg ctgctcaatg ggcccagtgt 1440

ggaggtatgg gttttactgg tccaaccgtt tgtgcttctc cattcacttg tcacgtcttg 1500

aacccttact actcccaatg ctaccatcac caccaccatc attaa 1545

<210> 2

<211> 514

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Gln Gln Ala Gly Thr Gln Thr Ala Glu Asn His Pro Gln Leu Ser Ser

1 5 10 15

Gln Lys Cys Thr Ala Gly Gly Ser Cys Thr Ser Ala Ser Thr Ser Val

20 25 30

Val Leu Asp Ser Asn Trp Arg Trp Val His Thr Thr Ser Gly Tyr Thr

35 40 45

Asn Cys Tyr Thr Gly Asn Thr Trp Asp Ala Ser Ile Cys Ser Asp Pro

50 55 60

Val Thr Cys Ala Gln Asn Cys Ala Leu Asp Gly Ala Asp Tyr Ala Gly

65 70 75 80

Thr Tyr Gly Ile Thr Thr Ser Gly Asp Ala Leu Thr Leu Lys Phe Val

85 90 95

Thr Gly Ser Asn Val Gly Phe Arg Val Tyr Leu Met Glu Asp Glu Thr

100 105 110

Asn Tyr Gln Leu Phe Lys Leu Met Asn Gln Glu Phe Thr Phe Asp Val

115 120 125

Asp Val Ser Asn Leu Pro Cys Gly Leu Asn Gly Ala Val Tyr Phe Val

130 135 140

Gln Met Asp Gln Asp Gly Gly Ser Ser Lys Phe Pro Asn Asn Lys Ala

145 150 155 160

Gly Ala Lys Phe Gly Thr Gly Tyr Cys Asp Ser Gln Cys Pro Gln Asp

165 170 175

Ile Lys Phe Ile Asn Gly Glu Ala Asn Ile Val Asn Trp Thr Ala Ser

180 185 190

Ala Gly Asp Ala Asn Ser Gly Thr Gly Ser Phe Gly Thr Cys Cys Gln

195 200 205

Glu Met Asp Ile Trp Glu Ala Asn Ser Ile Ser Ala Ala Tyr Thr Pro

210 215 220

His Pro Cys Thr Val Thr Glu Gln Thr Arg Cys Ser Gly Ser Asp Cys

225 230 235 240

Gly Gln Gly Ser Asp Arg Tyr Asn Gly Ile Cys Asp Pro Asp Gly Cys

245 250 255

Asp Phe Asn Ser Phe Arg Met Gly Asn Thr Glu Phe Tyr Gly Lys Gly

260 265 270

Leu Thr Val Asp Thr Ser Gln Lys Phe Thr Ile Val Thr Gln Phe Ile

275 280 285

Ser Asp Asp Gly Thr Ala Asp Gly Asn Leu Ala Glu Ile Arg Arg Phe

290 295 300

Tyr Val Gln Asn Gly Lys Val Ile Pro Asn Ser Val Val Gln Ile Thr

305 310 315 320

Gly Ile Asp Pro Val Asn Ser Ile Thr Glu Asp Phe Cys Thr Gln Gln

325 330 335

Lys Thr Val Phe Gly Asp Asn Asn Asn Phe Ala Ala Lys Gly Gly Leu

340 345 350

Gln Gln Met Gly Glu Ala Val Lys Asn Gly Met Val Leu Ala Leu Ser

355 360 365

Leu Trp Asp Asp Tyr Ala Ala Gln Met Leu Trp Leu Asp Ser Asp Tyr

370 375 380

Pro Thr Thr Ala Asp Pro Ser Lys Pro Gly Val Ala Arg Gly Thr Cys

385 390 395 400

Pro Thr Thr Ser Gly Val Pro Ser Gln Val Glu Gly Gln Glu Gly Ser

405 410 415

Ser Ser Val Ile Tyr Ser Asn Ile Lys Phe Gly Asp Leu Asn Ser Thr

420 425 430

Phe Thr Gly Thr Leu Thr Asn Pro Ser Ser Pro Ala Ser Pro Pro Val

435 440 445

Thr Ser Ser Pro Ser Gln Pro Ser Gln Ser Thr Gln Pro Ser Gln Pro

450 455 460

Ala Gln Pro Ser Gln Pro Ala Gly Thr Ala Ala Gln Trp Ala Gln Cys

465 470 475 480

Gly Gly Met Gly Phe Thr Gly Pro Thr Val Cys Ala Ser Pro Phe Thr

485 490 495

Cys His Val Leu Asn Pro Tyr Tyr Ser Gln Cys Tyr His His His His

500 505 510

His His

<210> 3

<211> 1524

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cagcaggcag gtacacagac cgcagaaaat catccgcagc tgagcagcca gaaatgtacc 60

gcaggcggta gctgtaccag cgcaagcacc agcgttgttc tggatagcaa ttggcgttgg 120

gttcatacca ccagtggtta taccaattgt tataccggta atacctggga tgcaagcatt 180

tgtagcgatc cggttacctg tgcgcagaat tgtgcactgg atggtgcaga ttatgcaggc 240

acctatggta ttaccacctc aggtgatgca ctgaccctga aatttgttac cggtagcaat 300

gttggtagcc gtgtttatct gatggaagat gaaaccaatt accagctgtt caaactgatg 360

aatcaagagt ttaccttcga tgtggatgtt agcaatctgc cgtgtggtct gaatggtgcc 420

gtttattttg ttcagatgga tcaggatggt ggcagcagca aatttccgaa taacaaagcc 480

ggtgcaaaat ttggtacagg ttattgtgat agccagtgtc cgcaggatat caaatttatc 540

aatggcgaag ccaacattgt taattggacc gcaagtgccg gtgatgcaaa tagcggcacc 600

ggtagctttg gcacctgttg tcaagaaatg gatatttggg aagccaatag cattagcgca 660

gcatatacac cgcatccgtg taccgttacc gaacagaccc gttgtagcgg tagcgattgt 720

ggtcagggta gcgatcgtta taatggtatt tgtgatccgg atggctgtga tttcaatagc 780

tttcgtatgg gcaacaccga gttttatggt aaaggtctga ccgttgatac ctcgcagaaa 840

tttaccattg tgacccagtt tattagtgat gatggcaccg cagatggtaa tctggcagaa 900

attcgtcgtt tttatgtgca gaatggtaaa gtgattccga atagcgtggt tcagattacc 960

ggcattgatc cggtgaatag tattaccgaa gatttttgta cccagcagaa aaccgtgttt 1020

ggcgataata acaattttgc agcaaaaggt ggtctgcagc agatgggtga agcagttaaa 1080

aatggtatgg ttctggcact gagcctgtgg gatgattatg ccgcacagat gctgtggctg 1140

gatagcgatt atccgaccac agcagatccg agcaaaccgg gtgttgcacg tggtacatgt 1200

ccgacaacca gcggtgttcc gagccaggtt gaaggtcaag aaggtagcag cagcgttatc 1260

tatagcaaca tcaaatttgg cgatctgaac agcaccttta ccggtacact gaccaatccg 1320

agcagtccgg caagccctcc ggtgaccagc agtccgagtc agccgagcca gagcacccag 1380

ccgtcacagc ctgcacagcc gagtcaaccg gcaggtacgg cagcacagtg ggcacagtgc 1440

ggtggtatgg gttttaccgg tccgaccgtt tgtgcaagcc cgtttacctg tcatgttctg 1500

aatccgtatt acagccagtg ctat 1524

<210> 4

<211> 1524

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

caacaggccg gcacgcagac cgctgagaac caccctcagc tgtcatccca aaagtgtact 60

gctggtggta gctgcacctc cgcctccacc agtgttgtgc tcgactccaa ctggcgttgg 120

gtccacacca cttccggtta cactaactgc tacactggaa acacgtggga tgcctccatc 180

tgctctgacc cagttacctg tgcccagaac tgtgccctcg atggcgctga ctatgccggc 240

acttacggta tcaccaccag tggcgacgct cttactctca agtttgtgac gggctccaac 300

gtcggctctc gtgtctacct catggaggac gagaccaact accagctgtt caagctcatg 360

aaccaggagt tcactttcga cgtcgacgtc tccaacctcc cctgcggtct taacggtgct 420

gtttacttcg tccagatgga tcaggacggt ggtagctcca agttccccaa caacaaggct 480

ggagccaagt tcggtaccgg ttactgtgac tctcagtgcc ctcaggacat caagttcatc 540

aacggagagg ccaacatcgt caactggact gcctctgctg gagatgctaa ctccggtact 600

ggttctttcg gtacttgctg ccaggagatg gacatctggg aggccaactc catctccgct 660

gcctacaccc ctcacccttg cacggtcact gagcagaccc gctgctctgg ctctgactgt 720

ggacagggca gcgaccgcta caacggtatc tgcgaccccg atggctgtga cttcaactcc 780

ttccgcatgg gtaacaccga gttctacggc aagggcctta ccgttgacac tagccagaag 840

ttcaccatcg tcacccagtt catctctgac gacggcactg ctgacggaaa cctcgccgaa 900

attcgtcgct tctacgtcca aaacggcaag gttatcccta acagcgttgt tcagatcact 960

ggcatcgacc ctgtcaactc catcactgag gacttctgca ctcaacaaaa gaccgtgttc 1020

ggcgacaaca acaacttcgc cgctaagggt ggcctccagc agatgggtga ggctgtcaag 1080

aacggaatgg tcctcgctct ttcgctctgg gacgactacg ccgctcagat gctctggctc 1140

gactccgact accccaccac cgctgacccg tccaagcccg gtgttgctcg tggtacctgc 1200

cccaccacct ccggtgtccc cagccaagtc gagggtcagg aaggcagctc gtccgtcatc 1260

tactcgaaca tcaagttcgg tgacctcaac tcgactttca ccggcaccct caccaacccc 1320

agcagcccag ctagcccacc cgtcaccagc tctccctcgc agccatccca gtctactcag 1380

ccttctcagc ccgctcaacc ctcccagccg gctggtaccg ctgctcagtg ggctcagtgt 1440

ggtggtatgg gcttcaccgg cccaaccgtc tgcgcaagtc ccttcacttg ccacgtcctc 1500

aacccctact actctcagtg ctac 1524

Claims

1.一种纤维素外切酶基因，其特征在于，所述基因如序列表中SEQ ID NO.1的核苷酸序列所示。

2.含有权利要求1所述基因的重组载体、表达盒或重组菌。

3.根据权利要求2所述的重组载体，由空载体和***该空载体的目的基因组成，其特征在于，所述目的基因为权利要求1所述的基因。

4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述空载体为pGAPZαA载体。

5.一种利用权利要求1所述的纤维素外切酶基因制备纤维素外切酶的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将权利要求1所述的基因构建到pGAPZαA载体中，经转化到毕赤酵母宿主菌细胞中，再利用Zeocin筛选高表达纤维素外切酶的转化子；

2)将步骤1)所得的高表达纤维素外切酶的转化子用YPG培养基培养至OD₆₀₀为10～15作为种子菌，将种子菌按体积比1：10的比例接种到含有无机盐培养基中进行发酵，发酵在28℃继续培养72-96小时并补加60％的甘油作为碳源，甘油补加速率与溶氧串联，设定溶氧为40％；利用浓氨水来调节pH为4.5，发酵上清液中含有大量的纤维素外切酶。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤1)用2mg/mlZeocin筛选高水平表达的转化子。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，还包括蛋白纯化步骤：用镍亲合层析柱对步骤2)得到的上清液进行纯化，先用平衡缓冲液平衡层析柱，再将上清液过柱，用含30mM咪唑的pH 8.0缓冲液预洗柱子，然后用含200mM咪唑的pH 8.0缓冲液溶液将融合蛋白洗脱下来即可。