KR101350955B1 - 신규 엑소글루카나제 및 그의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 서열번호 22 또는 24의 아미노산 서열로 표시되는 엑소글루카나제, 상기 엑소글루카나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체, 상기 형질전환체를 이용하여 상기 엑소글루카나제를 생산하는 방법 및 상기 형질전환체를 이용하여 바이오 에탄올을 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 신규한 엑소글루카나제는 우수한 셀룰로오스 분해 활성을 나타내므로, 목질계 바이오매스로부터의 바이오 에탄올 제조 등의 산업공정에 널리 활용될 수 있다.

Description

신규 엑소글루카나제 및 그의 용도{Novel exoglucanase and the Use thereof}

본 발명은 서열번호 22 또는 24의 아미노산 서열로 표시되는 엑소글루카나제, 상기 엑소글루카나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체, 상기 형질전환체를 이용하여 상기 엑소글루카나제를 생산하는 방법 및 상기 형질전환체를 이용하여 바이오 에탄올을 생산하는 방법에 관한 것이다.

최근 부각된 기후변화 및 에너지 위기 문제해결을 위하여 지속가능한 신재생에너지의 필요성이 대두되고 있다. 녹색연료로서 잠재적 가능성이 큰 바이오에탄올은 석유에너지에 대한 의존도를 줄이고, 지구 온난화와 같은 심각한 환경문제를 동시에 해결할 수 있는 대체 연료로서 활용되고 있다.

전세계적으로 약 800억 리터 정도의 바이오에탄올이 생산(바이오에너지 시장 분석 및 전망, 화학경제연구원, 2008)되고 있는데, 미국과 브라질이 대표적이다. 현재까지 바이오에탄올 생산은 주로 식량자원인 옥수수와 사탕수수 등에서 얻어지는 포도당을 발효시켜 얻은 알코올로서, 석유 유래의 가솔린을 부분적으로 대치함으로써 가솔린의 소비량을 줄이고, 환경오염물질의 배출량도 줄이고 있다. 이처럼 식량자원을 이용하여 생산되는 바이오에탄올을 일반적으로 1세대 바이오에탄올 연료라고 하는데, 급격한 수요증대로 인해 옥수수와 사탕수수와 같은 농작물의 가격이 폭등하고, 다른 곡물의 가격상승을 유발하여 에너지 문제의 해결을 위한 바이오에탄올이 또 다른 식량문제를 일으키는 원인이 되고 있다.

이러한 문제 때문에 2015년 이후부터는 1세대 바이오에탄올의 생산한계가 예상되며, 이에 대한 새로운 대안으로서 이른바 2세대 바이오 연료인 셀룰로오스 에탄올(cellulosic bioethanol)이 각광을 받고 있다. 셀룰로오스 에탄올이란 지구상에서 가장 풍부한 유기물인 식물 세포벽 주요 구성 물질인 셀룰로오스를 분해하여 포도당을 만들고, 이로부터 에탄올을 만드는 것이다. 따라서 2세대 셀룰로오스 에탄올은 현재 옥수수 녹말을 발효시켜 에탄올을 뽑아내는 1세대 방법과는 달리, 방치되거나 태워버렸던 옥수수의 잎, 줄기, 뿌리 등 모든 조직을 사용해서 바이오에탄올을 생산하는 방법이다. 이 방법은 옥수수 껍질, 쌀겨, 목초, 갈대, 억새, 목재 폐기물 등 모든 식물의 조직으로부터 바이오에탄올을 생산할 수 있게 된다.

녹말로부터 에탄올을 생산하는 과정과 비교하여 셀룰로오스로부터 에탄올을 생산하는 과정의 큰 차이점은, 식물 세포벽의 주요 구성물질인 셀룰로오스를 셀룰라제(cellulase)라는 효소를 이용하여 가수분해하여 포도당을 생산하는 당화 과정이다. 그러나, 식물세포벽의 셀룰로오스는 쉽게 분해되지 않는 안정된 구조로 결합된 고분자 물질일 뿐 아니라 리그닌(lignin), 헤미셀룰로오스(hemicellulose), 펙틴(pectin) 등 다른 고분자들과 함께 결합된 복합 물질을 이루고 있기 때문에 이를 분해하기 위해서는 여러 가지 공정이 필요하다. 셀룰로오스로부터 바이오에탄올을 생산하는데 필요한 첫 번째 공정은 전처리(pretreatment) 공정으로 식물의 세포벽을 물리적, 화학적, 또는 생물학적 처리를 가하여 식물 자원으로부터 셀룰로오스 섬유소를 분리하는 공정이다. 두 번째 공정은 당화(saccharification) 공정이며 이는 분리된 셀룰로오스 섬유소를 화학적 또는 생물학적 처리를 가하여 포도당(glucose)을 생산하는 과정을 말한다.

셀룰로오스를 포도당과 같은 저분자 당으로 가수분해시키기 위해서는 셀룰라제라는 효소가 필요하며, 특히 단단한 식물의 섬유질 원료(셀룰로오스)를 효과적으로 분해하기 위해서는 활성이 높은 셀룰라제 효소가 필수적이다. 셀룰라제는 셀룰로오스를 분해하는 효소를 통칭하는 것으로 세 가지 효소로 분류할 수 있다. 셀룰로오스의 β-1,4 글리코시드 결합을 자르는 엔도글루카나제(endo-glucanase, EC 3.2.1.4), 셀룰로오스 사슬의 양 말단에 작용하여 글루코오스 이량체(glucose dimer)인 짧은 사슬의 셀로바이오스(cellobiose)를 만드는 엑소글루카나제(exo-glucanase, EC 3.2.1.91) 및 셀로바이오스를 분해하여 포도당을 만드는 β-글루코시다제(β-glucosidase)가 있다.

엑소글루카나제는 불용성의 섬유소를 효과적으로 분해하기 위해서는 매우 중요한 효소이다. 현재 섬유소 분해를 통해 경제적으로 바이오에탄올을 생산하기 위해서는 활성이 높은 엑소글루카나제가 필요하므로, 이를 확보하기 위하여 기존에 클로닝된 유전자를 개량하여 활성을 증가시키는 연구(Percival Zhang 등, Biotechnol Adv. 24, 452, 2006) 등이 활발히 이루어지고 있다. 그러나 아직까지 우수한 분해능을 가지는 셀룰라제의 개발은 더딘 실정이다.

이에, 본 발명자들은 고활성의 셀룰라제를 확보하기 위하여 섬유소 분해활성을 가지는 곰팡이 페니실리움 균주를 동정하였고, 상기 균주로부터 2종의 엑소글루카나제 유전자를 클로닝한 후, 상기 유전자들을 효모 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae) 균주에 재조합 발현하여 엑소글루카나제 활성이 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 서열번호 22 또는 24의 아미노산 서열로 표시되는 엑소글루카나제를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 엑소글루카나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환체를 이용하여 상기 엑소글루카나제를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환체를 이용하여 바이오 에탄올을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 22 또는 24의 아미노산 서열로 표시되는 엑소글루카나제를 제공한다.

본 발명에서 용어, "엑소글루카나제(exoglucanase)"는 셀룰로오스를 분해하는 효소인 셀룰라제 중 하나로서, 셀룰로오스 사슬의 양 말단에 작용하여 글루코오스 이량체(glucose dimer)인 짧은 사슬의 셀로바이오스(cellobiose)를 만드는 효소로서, 불용성의 섬유소를 효과적으로 분해하기 위하여 매우 중요한 효소이다.

바람직하게, 본 발명의 엑소글루카나제는 페니실리움 속 균주(Penilillium sp.)로부터 발현될 수 있으며, 보다 바람직하게는 페니실리움 속 CF4 균주(Penilillium sp . CF4)로부터 발현될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, 셀룰라제 활성을 나타내는 신규의 페니실리움 속 CF4 균주를 분리 및 동정한 후(실시예 1), 상기 페니실리움 속 CF4 균주로부터 셀룰라제 활성을 나타내는 서열번호 22 또는 24의 아미노산 서열로 표시되는 신규한 엑소글루카나제를 코딩하는 유전자를 클로닝 하였으며(실시예 2 및 3), 상기 엑소글루카나제를 코딩하는 유전자를 사카로마이세스 세레비지아에 균주에 도입하여 발현시킨 결과, 엑소글루카나제 활성을 가지는 단백질이 세포 밖으로 분비됨을 확인하였다(실시예 4 및 도 8, 9).

다른 양태로서, 본 발명은 본 발명의 엑소글루카나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명에서 용어, "폴리뉴클레오타이드"는 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA(deoxyribonucleic acid) 또는 RNA(ribonucleic acid) 가닥으로서, 본 발명의 엑소글루카나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드이다.

바람직하게, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 23 또는 25의 염기서열로 표시되는 폴리뉴클레오티드 일 수 있다.

또 다른 실시양태로서, 본 발명은 본 발명의 엑소글루카나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 제공한다.

본 발명에서 용어, "벡터"란 연결되어 있는 다른 핵산을 운반할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 벡터의 하나의 유형인 "플라스미드"는 그 안에 추가적으로 DNA 조각을 연결시킬 수 있는 환형의 이중 가닥 DNA 루프를 의미한다.

본 발명의 벡터는 작동 가능하도록 연결된 목적 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 지시할 수 있는데, 이러한 벡터를 "발현 벡터"라고 한다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술의 사용에 있어서 발현 벡터는 플라스미드 형태이다.

상기 발현벡터는 숙주세포에 따라, 사용가능한 발현벡터의 종류가 결정될 수 있는데, 효모를 숙주로서 사용하는 경우는 발현벡터로서, 예를 들면 YEp13, YCp50, pRS계, pYEX계 벡터 등을 이용할 수 있다. 프로모터로서는, 예를 들면 GAL프로모터, AOD프로모터 등을 사용할 수 있다.

효모에의 재조합체 DNA의 도입방법으로서는, 예를 들면 일렉트로포레이션법(Method Enzymol., 194, 182-187(1990)), 스페로플라스트법(Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 84, 1929-1933(1978)), 아세트산리튬법(J. Bacteriol., 153, 163-168(1983)) 등이 이용가능하다.

아울러, 상기 발현벡터에는, 목적 유전자의 발현의 억제 또는 증폭, 또는 유도를 위한 각종의 기능을 가진 발현억제용의 단편이나, 형질전환체의 선택을 위한 마커나 항생물질에 대한 내성유전자, 균체밖으로의 분비를 목적으로 한 시그널을 코딩하는 유전자, 난발현성 단백질에 적합한 맞춤형 융합인자 등을 추가로 포함할 수도 있다. 특히, 상기 난발현성 단백질에 적합한 맞춤형 융합인자로서, 단백질융합인자(translational fusion partner : TFP)를 사용함이 바람직하며, 본 발명에서 사용가능한 단백질융합인자는 한국특허 제0626753호, 제0798894호, 제0975596호에 개시되어 있다.

본 발명에서 용어, "단백질융합인자(translational fusion partner: TFP)"란 발현율이 낮은 단백질을 코딩하는 유전자와 융합되어 발현율이 낮은 단백질의 분비생산을 유도하는 유전자를 의미하는데, 이러한 단백질융합인자는 박테리아(예를 들어, 대장균, 슈도모나스(Pseudomonas) 및 고초균 종 등), 곰팡이(예를 들어, 효모, 아스퍼질러스(Aspergillus), 페니실리엄(Penicillium), 라이조퍼스(Rhizopus), 트리코더마(Trichoderma) 종 등), 식물(예를 들어, 애기장대, 옥수수, 담배, 감자 등) 및 동물(예를 들어, 인간, 쥐, 토끼, 개, 고양이 및 원숭이 등)을 포함하는 모든 원핵 또는 진핵생물의 DNA로부터 선별될 수 있다.

본 발명에 의하면, 상기 발현벡터에 삽입되는 유전자는 상술한 엑소글루카나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로서, 바람직하게는 서열번호 22 또는 24의 아미노산 서열로 표시되는 엑소글루카나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드일 수 있고, 보다 바람직하게는 페니실리움 속 균주로부터 발현되는 서열번호 22 또는 24의 아미노산 서열로 표시되는 엑소글루카나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.

또 다른 실시양태로서, 본 발명은 본 발명의 발현벡터가 숙주세포에 도입된 형질전환체를 제공한다.

본 발명에서 용어, "형질전환"은 DNA를 숙주세포로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다.

본 발명에 따른 형질전환에 사용되는 숙주 세포는 당업계에 널리 알려져 있는 숙주세포는 어떤 것이나 사용할 수 있으나, 본 발명의 엑소글루카나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 도입효율이 우수하고, 도입된 폴리뉴클레오티드의 발현효율이 높은 숙주를 사용할 수 있는데, 예를 들면 박테리아, 곰팡이, 효모, 식물 또는 동물(예컨대, 포유동물 또는 곤충) 세포를 포함할 수 있다.

바람직하게, 상기 숙주세포는 에탄올 발효능을 가지는 세포를 사용할 수 있으며, 보다 바람직하게 상기 에탄올 발효능을 가지는 세포는 자이모모나스, 효모, 바실러스 일 수 있다.

상기 효모는 특별히 이에 제한되지 않으나, 캔디다(Candida), 디베리오마이세스(Debaryomyces), 한세눌라(Hansenula), 클루이베로마이세스(Kluyveromyces), 피키아(Pichia), 스키조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 야로이야(Yarrowia), 사카로마이세스(Saccharomyces), 사카로마이콥시스(Saccharomycopsis), 슈완니오마이세스(Schwanniomyces), 아르술라(Arxula) 종을 포함하고, 보다 바람직하게는 캔디다 유틸리스(Candida utilis), 캔디다 보이디니(Candida boidinii), 캔디다 알비칸스(Candida albicans), 클루이베로마이세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 피키아 파스토리스(Pichia pastoris), 피키아스티피티스(Pichia stipitis), 스키조카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe), 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이콥시스 피브리게라(Saccharomycopsis fiburigera), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha), 야로이야 리포폴리티카(Yarrowia lipolytica), 슈완니오마이세스 옥시덴탈리스(Schwanniomyces occidentalis), 아르술라 아데니니모란스(Arxula adeninivorans) 등을 사용하며, 가장 바람직하게는 클루이베로마이세스 마르시아누스(Kluyveromyces maxianus), 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 사카로마이콥시스 피브리게라(Saccharomycopsis fiburigera)를 사용할 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는, 효모 사카로마이세스 세레비지에를 본 발명의 엑소글루카나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터를 사용하여 형질전환한 후, 상기 형질전환체로부터 본 발명의 엑소글루카나제가 생산되었음을 확인하였다(실시예 4 및 도 8, 9)

또 다른 실시양태로서, 본 발명은 본 발명의 형질전환체를 배양하고, 이의 배양물 또는 배양상등액으로부터 엑소글루카나제를 회수하는 단계를 포함하는, 본 발명에 따른 엑소글루카나제의 생산방법을 제공한다.

본 발명의 형질전환체를 배양하기 위한 배지 및 배양조건은 숙주 세포에 따라 적절히 선택 이용할 수 있다. 영양배지는 숙주세포의 생육에 필요한 탄소원 무기질소원 또는 유기질소원을 포함하고 있는 것이 바람직하다. 탄소원으로는 글루코오스, 덱스트란, 가용성 전분, 수크로오스, 및 메탄올 등이 예시된다. 무기질소원 또는 유기질소원으로는 암모늄염류, 질산염류, 아미노산, 콘스팁 리쿼(corn steep liquer), 펩톤, 카제인, 소 추출물, 대두백, 및 감자추출물 등이 예시된다. 필요에 따라 다른 영양소, 예를 들어 염화나트륨, 염화칼슘, 인산이수소나트륨, 염화마그네슘 같은 무기염, 비타민류, 및 항생물질(테트라사이클린, 네오마신, 암피실린, 및 카나마이신) 등을 포함할 수 있다. 배양시는 세포의 생육과 단백질의 대량 생산에 적합하도록 온도, 배지의 pH 및 배양 시간 등의 조건들을 적절하게 조절할 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는, 엑소글루카나제를 발현시키기 위하여 GAL10 프로모터 및 GAL7 터미네이터를 가지는 일반적 효모 발현 벡터인 YEp352 유래의 벡터에 TFP를 사용하여 YGaST22-PeCBH1를 제작하였으며, 동일한 벡터에 TFP를 사용하여 YGaST13-PeCBH2를 제작하였다. 각각의 벡터로 사카로마이세스 세레비지에 균주를 형질전환시킨 후, 30℃ YEPD 배지(효모추출액 1%, 펩톤 2%, 포도당 2%) 조건에서 배양하였다(실시예 6).

상기 엑소글루카나제를 회수하는 단계는 통상적인 생화학 분리 기술에 의하거나 단백질의 한 부분 또는 다른 부분에 대한 항체를 사용하는 면역친화적인 방법으로 엑소글루카나제를 분리, 정제할 수 있다. 또 다른 방법은 단백질 서열에 태그(tag)를 가하여, 항체 또는 이러한 태그에 대하여 적절하게 높은 친화성을 갖는 기타 물질을 이용하는 친화 방법에 의해 정제할 수도 있다. 통상적인 생화학 분리 기술로는 단백질 침전제의 의한 처리(염석법), 원심분리, 초음파파쇄, 한외여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피(겔여과), 흡착크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 및 친화성 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피 등이 있고, 통상적으로 이들을 조합, 사용하여 순도가 높은 단백질을 분리할 수 있다.

또 다른 실시양태로서, 본 발명은 엑소글루카나제 기질의 존재하에 상기 형질전환체를 배양하고, 이로부터 바이오 에탄올을 회수하는 단계를 포함하는, 바이오 에탄올의 생산방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명의 바이오 에탄올의 생산방법은 (ⅰ) 본 발명의 발현벡터가 에탄올 발효능을 가지는 숙주세포에 도입된 형질전환체를 수득하는 단계; (ⅱ) 상기 수득한 형질전환체를 엑소글루카나제의 기질을 포함하는 배양액에서 배양하는 단계; 및 (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)에서 수득한 배양물 또는 배양상등액으로부터 바이오 에탄올을 회수하는 단계를 포함한다.

상기 에탄올 발효능을 가지는 숙주세포는 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 자이모모나스(Zymomonas Mobilis) 균주, 효모균주 또는 바실러스 균주를 사용할 수 있으며, 보다 바람직하게는 엔도글루카나제 또는 베타-글루코시다제를 각각 발현하거나 동시에 발현하는 미생물을 사용할 수 있다.

상기 엑소글루카나제의 기질은 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 엑소글루카나제에 의해 분해될 수 있는 글루칸(glucan) 또는 다당류(polysaccharide)일 수 있으며, 보다 바람직하게는 녹말, 덱스트란, 풀룰란 및 셀룰로오스로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.

상기 엑소글루카나제의 기질을 포함하는 배양액은 엔도글루카나제 또는 베타-글루코시다제 또는 이를 발현하는 미생물을 추가로 더 포함할 수 있다.

배양방법은 특별히 이에 제한되지 않으나, 배치(batch)식, 유동배치식, 연속배양, 리액터형식 등, 통상의 미생물의 배양에 사용하는 어떠한 방법도 사용할 수 있다.

본 발명의 신규한 엑소글루카나제는 우수한 셀룰로오스 분해 활성을 나타내므로, 목질계 바이오매스로부터의 바이오 에탄올 제조 등의 산업공정에 널리 활용될 수 있다.

도 1은 본 발명에서 분리한 페니실리움(penicillium sp . CF4) 균주의 셀룰라제 활성을 보여주는 사진이다.
도 2의 A는 본 발명에서 분리한 페니실리움(penicillium sp . CF4) 유래의 PeCBH1 유전자를 클로닝하는 방법을 나타낸 모식도이고, 도 2의 B는 PeCBH2 유전자를 클로닝하는 방법을 나타낸 모식도이며, 도 2의 C는 PCR 결과를 전기영동한 결과를 나타내는 사진이다.
도 3은 페니실리움(penicillium sp . CF4) 유래의 PeCBH1 단백질의 아미노산 서열과 페니실리움 옥살리쿰(Penicillium oxalicum) 유래의 엑소클루카나제 효소의 아미노산 서열을 비교하여 나타낸 모식도이다.
도 4는 페니실리움(penicillium sp . CF4) 유래의 PeCBH2 단백질의 아미노산 서열과 페니실리움 데쿰벤스(Penicillium decumbens) 유래의 엑소클루카나제 효소의 아미노산 서열을 비교하여 나타낸 모식도이다.
도 5는 페니실리움(penicillium sp . CF4) 유래의 PeCBH1 단백질의 아미노산 서열과 PeCBH2 단백질의 아미노산 서열을 비교하여 나타낸 모식도이다.
도 6은 페니실리움(penicillium sp . CF4) 유래의 PeCBH1 유전자와 PeCBH2 유전자를 24종의 효모 단백질 분비융합인자(TFP) 및 GAL10 프로모터에 연결하여 사카로마이세스 세레비지에 균주에 도입하는 in vivo recombination 과정을 보여주는 모식도이다.
도 7은 본 발명에서 분리한 페니실리움(penicillium sp . CF4) 유래의 PeCBH1 유전자 발현 벡터를 나타내는 모식도(A) 및 PeCBH2 유전자 발현 벡터를 나타내는 모식도(B)이다.
도 8은 사카로마이세스 세레비지에 균주 24종에서 발현되어 세포 밖으로 분비된 PeCBH1 단백질을 SDS-PAGE로 분석한 결과를 나타내는 전기영동 사진이다.
도 9는 사카로마이세스 세레비지에 균주 24종에서 발현되어 세포 밖으로 분비된 PeCBH2 단백질을 SDS-PAGE로 분석한 결과를 나타내는 전기영동 사진이다.
도 10은 분비시그널에 따른 PeCBH1 및 PeCBH2의 분비율 비교를 위해 선별된 단백질융합인자(Translational Fusion Partner; TFP), 자체 분비시그널, 효모 mating factor alpha(MFα) 분비시그널을 이용하여 각각 분비생산된 PeCBH1 단백질을 SDS-PAGE로 분석한 결과를 나타내는 전기영동사진(A) 및 PeCBH2 단백질을 SDS-PAGE로 분석한 결과를 나타내는 전기영동사진(B)이다.
도 11은 PeCBH1 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 사카로마이세스 세레비지에 균주를 5L 발효조에서 유가식 발효하여 시간별로 취한 배지를 SDS-PAGE로 분석한 결과를 나타내는 전기영동사진(A) 및 각 시간별 세포 OD 및 엑소글루카나제의 활성을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다(B).
도 12는 PeCBH2 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 사카로마이세스 세레비지에 균주를 5L 발효조에서 유가식 발효하여 시간별로 취한 배지를 SDS-PAGE로 분석한 결과를 나타내는 전기영동사진(A) 및 각 시간별 세포 OD 및 엑소글루카나제의 활성을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다(B).
도 13은 재조합 PeCBH1 정제를 위한 이온 교환 크로마토그래피 프로파일을 나타내는 그래프(13의 A) 및 정제 분획에 대한 단백질 SDS-PAGE(B) 분석 결과를 나타내는 전기영동사진(13의 B)이다.
도 14는 재조합 PeCBH2 정제를 위한 이온 교환 크로마토그래피 프로파일을 나타내는 그래프(A) 및 정제 분획에 대한 단백질 SDS-PAGE 분석 결과를 나타내는 전기영동사진(B)이다.
도 15는 정제한 PeCBH1 단백질의 효소 특성 확인을 위해 최적 pH 분석 결과를 나타내는 그래프(A) 및 최적 온도 분석 결과를 나타내는 그래프(B)이다.
도 16은 정제한 PeCBH2 단백질의 효소 특성 확인하기 위하여 최적 pH 분석 결과를 나타내는 그래프(A) 및 최적 온도 분석 결과를 나타내는 그래프(B)이다.
도 17은 PeCBH1 단백질 및 PeCBH2 단백질이 선호하는 섬유소 기질 말단 타입 결정을 위한, 표준물질에 대한 TLC 결과를 나타내는 사진(A) 및 반응산물에 대한 TLC 결과를 나타내는 사진(B)이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.

참고 실시예 1: 사용 균주 및 실험 재료

페니실리움 sp CF4 균주는 YMA 배지(Difco사)를 사용하여 25℃에서 7일 동안 배양하였고, 사카로마이세스 세레비지아에 형질전환체는 SD Ura- 배지(0.67% 아미노산이 결여된 효모 질소 베이스, 2% 글루코오스, 0.5% 카사미노산)에서 선별한 후 YPDG(1% 효모 추출물, 2% 박토 펩톤, 1% 글루코오스, 1% 갈락토오스) 배지에서 40시간 동안 배양하였으며, 상등액 0.6 ㎖을 0.4 ㎖의 아세톤으로 침전시킨 후 SDS-PAGE 분석하였다. 일반적인 유전자 조작을 위하여 대장균 DH5α를 사용하였다.

참고 실시예 2: 유전자 조작 및 염기서열 분석 방법

일반적인 유전자 조작은 Sambrook(Molecular cloning: a laboratory manual, 2nd ed, 1989) 등의 기술에 따라서 수행하였고, 아가로스 겔로부터 유전자를 회수할 경우는 겔 추출 키트(Viogene사)를 사용하였다. Al-Samarrai 및 Schmid(Lett Appl Microbiol . 30,53-56, 2000)가 사용한 방법에 따라 곰팡이로부터 게놈 DNA를 추출하였으며, Gietz(Yeast 11, 355-360, 1995)등이 기술한 방법에 따라 효모 형질전환을 수행하였다. 대장균의 형질전환은 Inoue(Gene 96, 23-28, 1990) 등의 방법을 사용하였다. 유전자의 염기서열분석은 Applied Biosystems사의 Model 373A를 사용하여 분석하였으며, 중합효소 연쇄반응에 사용할 프라이머는 Genotech사에서 합성하였다.

실시예 1: 셀룰라제 활성을 나타내는 곰팡이 균주의 분리 및 동정

셀룰라제를 생산하는 곰팡이 균주를 분리하기 위해 낙엽 및 나뭇가지 등이 떨어져 부식하고 있는 다양한 산림 토양을 대전 근교에서 수집하여 균주 분리원으로 사용하였다.

곰팡이 균주 분리를 위한 기본 배지는 감자한천배지(potato dextrose agar; PDA, Difco)를 사용하였으며, 곰팡이 분리 실험시 성장이 빠른 균주(fast-growing fungi)의 생육을 억제하기 위하여 Triton X-100 및 L-소르보오스를 각각 0.1% 및 0.4% 농도로 첨가하였고, 세균 발생을 억제하기 위해 클로람페니콜을 0.01% 농도로 첨가하여 사용하였다.

곰팡이 분리실험을 수행하기 위하여, 수집된 다양한 토양시료 각 1 g 씩을 멸균된 생리식염수(0.85%, w/w) 9 ㎖에 첨가하고 20분 동안 충분히 현탁한 후, 상등액을 연차적으로 희석하여 상기에 전술한 기본배지에 100 ㎕ 씩 접종하고 도말하였다. 접종한 PDA 플레이트는 25℃ 배양기에서 5 내지 7일 동안 배양하며 관찰하였으며, 생육한 곰팡이 균주의 콜로니 각각을 새로운 PDA 배지에 접종 및 배양하여 각 곰팡이 균주를 순수분리하였다. 셀룰라제 활성 검증은 CMC가 0.5% 함유된 YMA 배지에서 테스트할 곰팡이 균주를 접종하여 25℃에서 7일 동안 배양한 후, 곰팡이가 배양된 플레이트를 0.1% 콩고 레드(congo red) 용액으로 염색하고, 다시 1M NaCl 용액으로 탈색한 후 셀룰라제 활성을 나타내는 클리어 존(clear zone) 생성 유무를 확인하고 크기를 비교하는 방법으로 실시하였다.

분리된 곰팡이 중 4 균주(Cf2, Cf4, Cf12 및 Cf14 균주)의 활성을 비교한 결과, 8 내지 12 ㎜ 크기의 클리어 존을 형성하여 셀룰라제 활성이 높게 나타난 Cf4 균주를 셀룰라제 유전자 클로닝을 위한 균주로 선별하였다(도 1). 도 1은 본 발명에서 분리한 페니실리움(penicillium sp. CF4) 균주의 셀룰라제 활성을 보여주는 사진이다.

염기서열 분석법은 분자분류법의 한 방법으로서, 신속하고 신뢰할 만한 미생물 동정법으로 널리 인식되어 있다. 곰팡이의 경우, 18S 유전자, 26S D1/D2 도메인 및 ITS(Internal Transcribed Spacer region) 영역의 염기서열이 동정에 널리 이용되고 있다. 이중 ITS 염기서열은 가장 많은 데이타베이스(DB)를 확보하고 있으며, 이 영역의 염기서열을 비교하여 99% 이상의 유사도를 나타내면 비교한 균주와 동일한 종으로 판단하고 있다. 따라서, 셀룰라제 활성을 나타내는 Cf4 곰팡이 균주를 동정하기 위하여 염기서열 분석방법에 근거한 분자분류 방법을 활용하였으며, ITS 영역의 염기서열을 분석한 후 각 서열을 진뱅크(GenBank)에 수록된 다양한 곰팡이 균주의 염기서열 데이타베이스와 비교분석하였다.

실험결과 곰팡이 Cf4 균주로부터 총 548 bp 길이의 ITS 영역 염기서열이 분석되었으며, 블라스트(Blast) 검색 결과, Penicillium decaturense NRRL 28152, Penicillium waksmanii strain NRRL 777, Penicillium canescens NRRL 2147, Penicillium rivolii NRRL 906, Penicillium miczynskii NRRL 1077 및 Penicillium manginii NRRL 2134 균주들과 99% 수준의 유사도를 나타내었으며, Penicillium 속에 속하는 다양한 균주들과 ITS 영역의 염기서열이 92 내지 99% 수준의 유사도를 나타내어 Penicillium sp. Cf4 균주로 동정하였다.

실시예 2 : 디제너레이트 프라이머를 이용한 셀룰라제 유전자의 부분 증폭

탄수화물의 글리코시드 결합에 영향을 주는 효소 유전자를 모아놓은 CAZy 데이타베이스(http//www.CAZy.org)에 의하면, 글리코시드 결합을 절단하는 글리코시드 하이드롤라제 패밀리(glycoside hydrolase family; GH)는 112개로 분류되어 있다. 데이타베이스를 조사한 결과, 진핵세포 유래의 셀룰라제가 포함된 패밀리는 GH5, 6, 7, 9, 12, 및 61이었고, 선별된 각각의 패밀리로부터 보존된 아미노산 서열을 분석하였다.

아미노산 서열을 바탕으로 GH5 패밀리 및 GH7 패밀리는 각각 4개의 디제너레이트 프라이머(degenerate primer)를 제작하였고, GH6, 9, 및 12 패밀리는 각각 2개의 디제너레이트 프라이머를 제작하였다(서열번호 1 내지 14).

패밀리	프라이머	서열	서열번호
GH5 패밀리	GH5F1	5'-TTCTTCYCYGGYAAYGA-3'	1
	GH5F2	5'-ATYCCWGTYGGYTANTC-3'	2
	GH5R1	5'-TTRCARCCNWAYTCRGA-3'	3
	GH5R2	5'-TARACNADRCCRCCRGA-3'	4
GH6 패밀리	GH6F	5'-GARCCWGAYWCYHTNGSYAA-3'	5
	GH6R	5'-GYRCCRTCNCSYTCRCC-3'	6
GH7 패밀리	GH7F1	5'-GARTTCWCYTTCGAYGT-3'	7
	GH7F2	5'-TANGGYACYGGYTANTG-3'	8
	GH7R1	5'-CARCCRTCNGWATCRCA-3'	9
	GH7R2	5'-AATTGRGTRACRACRGT-3'	10
GH9 패밀리	GH9F	5'-GGYTGGTANGATGCYGA-3'	11
	GH9R	5'-CCNTARCCRGTRAYNSARGA-3'	12
GH12 패밀리	GH12F	5'-GGYATYAARTCYTANCC-3'	13
	GH12R	5'-CCSGGRGARGARGTRATYTC-3'	14

동정된 Penicillium sp. Cf4 균주의 게놈 DNA를 주형으로 11가지 프라이머 조합(GH5F1/GH5R1, GH5F1/GH5R2, GH5F2/GH5R1, GH5F2/GH5R2, GH6F/GH6R, GH7F1/GH7R1, GH7F1/GH5R2, GH7F2/GH7R1, GH7F2/GH5R2, GH9F/GH9R, 및 GH12F/GH12R)으로 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 95℃ 5분 반응 후 95℃ 30초, 50℃ 30초, 72℃ 30초 조건으로 30 사이클 반응하고, 72℃에서 10분 동안 추가 반응하였다. 아가로스 겔에 전기영동하여 PCR 산물을 분석하였다.

그 결과, GH7F1/GH7R1 프라이머 조합에서 400 bp 및 460 bp 크기의 단편이 증폭되었다. pGEM-T Easy 벡터에 클로닝 후 염기서열을 분석한 결과, 두 개의 유전자 단편 모두 서로 다른 염기 서열이었으며, 페니실리움 유래 엑소글루카네이즈와 높은 염기서열 유사성을 나타내었으나, 동일한 염기서열은 발표된 유전자 데이타베이스에서 발견할 수 없었다. 따라서 상기 방법으로 부분 증폭된 셀룰라제 유전자 단편은 신규한 엑소글루카네이즈의 일부분임을 확인할 수 있었다.

실시예 3: 게놈워킹 기술( Template blocking PCR )을 이용한 셀룰라제 유전자의 클로닝

밝혀진 염기 서열을 바탕으로 전체 유전자를 확보하기 위하여 프라이머를 합성한 후 게놈워킹 기술(한국특허출원 10-2009-0061895호)을 이용하여 전체 유전자를 확보하고자 하였다. 게놈워킹 기술 방법을 이용하기 위하여 먼저 카세트를 제조하였다. 카세트는 제한효소 처리된 게놈 DNA에 연결될 수 있도록 고안된 짧은 이중가닥 DNA이다. BamHI, BglII, 및 Sau3A로 절단된 후 ddGTP로 한 개의 염기가 채워진 게놈 DNA와 연결될 수 있도록 하기 위하여, 서열번호 15의 CSF 프라이머 및 서열번호 16의 CSR 프라이머를 합성하고, 100 μM CSF 및 100 μM CSR 프라이머를 각각 40 ㎕를 섞은 후 250 mM Tris.Cl(pH8.0), 100 mM MgCl₂ 완충용액 10 ㎕, 증류수 10 ㎕를 첨가하여 95℃ 항온 수조에서 5분 동안 가열한 후 수조의 온도가 실온까지 내려오도록 방치하였다.

프라이머	서열	서열번호
CSF	5'-GACGCGTAATACGACTCACTATAGGGA-3'	15
CSR	5'-ATCTCCCTATAGTGAGTCGTATTACGCGTC-3'	16

이러한 방법으로 제작된 카세트는 한쪽은 평활 말단이고 다른 한쪽은 5'에 GAT 세 개의 염기가 돌출된 구조이다. 두 가지 제한효소로 처리된 카세트 라이브러리를 제작하기 위하여 Penicillium sp . CF4 게놈 DNA 2 ㎍을 1X BamHI 완충액(Takara사) 및 1X BglII 완충액(Takara사) 조건하에서 10 unit의 BamHI 및 BglII를 사용하여 37℃에서 2시간 동안 각각 반응 후 아가로스 겔에서 전기영동하여 완전히 절단되었음을 확인하였다.

70℃ 항온 수조에서 20분 동안 처리하여 제한효소를 불활성화 시킨 후에 ddGTP를 0.2 mM이 되도록 첨가하고, 8 unit의 클레나우 절편(Klenow fragment, Takara사)로 37℃에서 30분 동안 반응하였다. Qiagen사의 PCR 정제 키트를 사용하여 DNA를 정제한 후 상기한 40 pmol의 카세트 및 DNA 라이게이션 키트(Takara사)를 사용하여 연결하였다. 연결 반응은 16℃에서 10시간 반응 하였으며, 다시 Qiagen사의 PCR 정제 키트을 사용하여 DNA를 정제한 후 20 ㎕ 증류수로 용출하여 BamHI 카세트 라이브러리 및 BglII 카세트 라이브러리를 각각 제작하였다.

첫 번째 셀룰라제 유전자를 클로닝하기 위하여 0.4 kb PCR 산물의 염기 서열을 바탕으로 셀룰라제 특이 프라이머[CBH1F(서열번호 17) 및 CBH1R(서열번호 18)]를 양방향으로 제작한 후 각각의 카세트 라이브러리 1 ㎕를 주형으로 카세트 프라이머 CP(서열번호 21)와 PCR을 수행하였다.

프라이머	서열	서열번호
CBH1F	5'-GTTTCCAATCTCCCCTGTGGTCTC-3'	17
CBH1R	5'-GTGCCTGCATATCGATCAGAGCTG-3'	18
CP	5'-ACGCGTAATACGACTCACTATAGGGAGATC-3'	21

셀룰라제 유전자의 5' 부위를 클로닝하기 위한 반응 조성은 다음과 같으며[게놈 카세트 라이브러리 1 ㎕, CP 1 pmol, CBH1R 1 pmol, EX taq buffer(Takara사) 5 ㎕, 2.5 mM dNTP 5 ㎕, 증류수 37 ㎕, 및 EX taq DNA polymerase(Takara사) 1 ㎕] 셀룰라제 유전자의 3' 부위를 클로닝하기 위한 반응은 CBH1R 프라이머 대신 CBH1F 프라이머를 사용한다. PCR 조건은 95℃ 5분 반응 후 95℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 3분 조건으로 30 사이클 반응하고, 72℃에서 10분 동안 추가로 반응하였다. 반응 후 10 ㎕의 반응액을 아가로스 겔에서 전기영동하여 분석한 결과, CP 프라이머 및 CBH1R 프라이머를 사용한 5' 부위 클로닝 반응에서는 2.6 kb 크기의 단편이 BglII 카세트 라이브러리로부터 증폭되었고, CP 프라이머 및 CBH1F 프라이머를 사용한 3' 부위 클로닝 반응에서는 3.7 kb 크기의 단편이 BamHI 카세트 라이브러리로부터 증폭되었다(도 2). 도 2의 A는 본 발명에서 분리한 페니실리움(penicillium sp. CF4) 유래의 PeCBH1 유전자를 클로닝하는 방법을 나타낸 모식도이고, 도 2의 B는 PeCBH2 유전자를 클로닝하는 방법을 나타낸 모식도이며, 도 2의 C는 PCR 결과를 전기영동한 결과를 나타내는 사진으로서, 각 레인의 시료는 다음과 같다: 레인1 : 크기 표지자, 레인 2: PeCBH1 유전자의 5부위를 증폭한 결과, 레인 3: PeCBH1 유전자의 3부위를 증폭한 결과, 레인 4: PeCBH2 유전자의 5부위를 증폭한 결과, 레인 5: PeCBH2 유전자의 3부위를 증폭한 결과, 레인 6: 크기 표지자.

각각의 PCR 산물을 pGEM-T Easy vector(Promega사)에 클로닝하여 염기서열을 분석한 결과, 클로닝 하고자 하는 부위가 증폭되었음을 확인하였으며, 셀룰라제 유전자의 전체서열을 확인할 수 있었다. 위 방법으로 클로닝된 Penicillium sp . CF4 유래의 셀룰라제 유전자(PeCBH1)(서열번호 23)는 인트론이 없는 1,641 bp의 염기로 구성되어 있으며, 유추된 아미노산 서열(서열번호 22)은 26개의 분비시그널과 셀룰로오스 결합 모듈(cellulose binding module, CBM)을 포함하는 547개의 아미노산으로 구성된 엑소글루카나제였으며, Penicillium oxalicum 유래의 엑소글루카나제와 74.3 % 아미노산 유사성을 나타내었다(도 3). 도 3는 페니실리움(penicillium sp. CF4) 유래의 PeCBH1 단백질의 아미노산 서열과 페니실리움 옥살리쿰(Penicillium oxalicum) 유래의 엑소클루카나제 효소의 아미노산 서열을 비교하여 나타낸 모식도이다.

두 번째 셀룰라제 유전자를 클로닝하기 위하여 0.45 kb PCR 산물의 염기 서열을 바탕으로 셀룰라제 특이 프라이머[CBH2F(서열번호 19) 및 CBH2R(서열번호 20)]를 양방향으로 제작한 후 상기한 방법과 동일한 방법으로 PCR을 수행하였다.

프라이머	서열	서열번호
CBH2F	5'-CGCTCTGTACTTCGTCTCCATGGATGC-3'	19
CBH2R	5'-CGCACATGGTCTGTCCAGCCTCCTTGC-3'	20

CP 프라이머 및 CBH2R 프라이머를 사용한 5' 부위 클로닝 반응에서는 1.5 kb 크기의 단편이 BglII 카세트 라이브러리로부터 증폭되었고 CP 프라이머 및 CBH2F 프라이머를 사용한 3' 부위 클로닝 반응에서는 4.0 kb 크기의 단편이 BamHI 카세트 라이브러리로부터 증폭되었다.각각의 PCR 산물을 pGEM-T Easy vector(Promega사)에 클로닝하여 염기서열을 분석한 결과, 클로닝 하고자 하는 부위가 증폭되었음을 확인하였으며, 두 번째 셀룰라제 유전자의 전체서열을 확인할 수 있었다. Penicillium sp . CF4 유래의 두 번째 셀룰라제 유전자(PeCBH2)(서열번호 25)는 인트론을 2개 포함하고 있는 1,359 bp의 염기로 구성되어 있으며, 유추된 아미노산 서열(서열번호 24)은 17개의 분비시그널을 포함하는 452개의 아미노산으로 구성된 엑소글루카나제였으며, Penicillium decumbens 유래의 엑소글루카나제와 78.4% 아미노산 유사성을 나타내었다(도 4). 도 4는 페니실리움(penicillium sp. CF4) 유래의 PeCBH2 단백질의 아미노산 서열과 페니실리움 데쿰벤스(Penicillium decumbens) 유래의 엑소클루카나제 효소의 아미노산 서열을 비교하여 나타낸 모식도이다.

PeCBH1 및 PeCBH2 단백질 간의 유사성을 확인하기 위하여 두 단백질의 아미노산 서열을 비교한 결과, 71.1%의 유사도를 나타내었다(도 5). 도 5는 페니실리움(penicillium sp. CF4) 유래의 PeCBH1 단백질의 아미노산 서열과 PeCBH2 단백질의 아미노산 서열을 비교하여 나타낸 모식도이다.

실시예 4: 사카로마이세스 세레비지아에 균주에 분비발현을 통한 PeCBH1 및 PeCBH2 유전자의 활성확인

실시예 3에서 분리한 PeCBH1 , PeCBH2 유전자를 사카로마이세스 세레비지에 균주에서 발현하기 위한 발현 벡터를 제작하였다. 먼저 PeCBH1 유전자를 발현하기 위하여 분비시그널을 제외한 PeCBH1 유전자를 서열번호 26 및 27 프라이머를 사용하여 Penicillium sp . CF4 게놈 DNA로부터 증폭하였다. In vivo recombination을 이용하여 벡터를 제작하기 위하여 서열번호 26 및 27로 증폭한 PeCBH1 유전자를 다시 LNK39(서열번호 28) 및 GT50R(서열번호29) 프라이머로 증폭한 후 효모에서 단백질의 분비발현을 도와주는 24 종류의 단백질 분비융합인자(Translational Fusion Partner; TFP, 한국특허 제10-0975596호)를 이용하여 Y2805(Mat a pep4 :: His3 prb1 can1 his3 -200 ura3 -52)균주에 in vivo recombination을 통하여 도입하였다(도 6). 도 6은 페니실리움(penicillium sp. CF4) 유래의 PeCBH1 유전자와 PeCBH2 유전자를 24종의 효모 단백질 분비융합인자(TFP) 및 GAL10 프로모터에 연결하여 사카로마이세스 세레비지에 균주에 도입하는 in vivo recombination 과정을 보여주는 모식도이다.

스물 네 종류의 각 형질전환체를 YPDG 배지에서 40시간 배양한 후 원심 분리하여 균체를 제거하고 남은 배양 상등액 0.6 ㎖을 0.4 ㎖ 아세톤으로 침전시켜 SDS-PAGE 상에서 분석하였다(도 8). 도 8은 사카로마이세스 세레비지에 균주 24종에서 발현되어 세포 밖으로 분비된 PeCBH1 단백질을 SDS-PAGE로 분석한 결과를 나타내는 전기영동사진이다.

24 종류의 단백질 분비융합인자 중 PeCBH1의 분비능이 우수한 TFP22 벡터(도 7의 A)를 선택하였다. 도 7의 A는 본 발명에서 분리한 페니실리움(penicillium sp. CF4) 유래의 PeCBH1 유전자 발현 벡터를 나타내는 모식도이다.

이와 같은 방법으로 제작된 벡터는 갈락토오스에 의하여 발현이 강력히 유도되는 GAL10 프로모터 및 PeCBH1 단백질의 분비를 유도하는 TFP22로 구성되며, YEGα-HIR525 벡터(Sohn 등, Process Biochem. 1995, 30, 653)의 골격을 사용한다. In vivo recombination을 이용하여 벡터를 제작하는 경우 대장균을 거치지 않고 곧바로 제작하고자 하는 벡터로 형질전환된 사카로마이세스 세레비지에 균주를 얻을 수 있는 장점이 있다. PeCBH2 유전자는 2개의 인트론을 포함하고 있기 때문에, 사카로마이세스 세레비지에 균주에서 발현하기 위해서는 인트론이 제거된 cDNA를 제작하였다. 서열번호 30/서열번호 31, 서열번호 32/서열번호 33, 및 서열번호 34/서열번호 35 프라이머를 제작하여 세 개의 엑손 유전자 각각을 증폭한 후 LNK39(서열번호 28) 및 GT50R(서열번호 29) 프라이머로 중복 확장 PCR(overlap extension PCR)을 통하여 연결하였다. 이후 단계는 PeCBH1의 경우와 동일한 방법을 사용하여 24 종류의 단백질 분비융합인자와 함께 Y2805에 in vivo recombination하고, 각 형질전환체를 YPDG 배지에서 40시간 배양한 후 원심 분리하여 균체를 제거하고 남은 배양 상등액 0.6 ㎖을 0.4 ㎖ 아세톤으로 침전시켜 SDS-PAGE 상에서 분석하였다(도 9). 도 9는 사카로마이세스 세레비지에 균주 24종에서 발현되어 세포 밖으로 분비된 PeCBH2 단백질을 SDS-PAGE로 분석한 결과를 나타내는 전기영동사진이다.

그 중 PeCBH2의 분비능이 우수한 TFP 13 융합인자의 통제하에 PeCBH2를 발현하는 벡터로 형질전환된 사카로마이세스 세레비지에 균주를 제작하였다(도 7의 B). 도 7의 B는 PeCBH2 유전자 발현 벡터를 나타내는 모식도이다.

각각의 형질전환체로부터 분비된 단백질의 활성을 확인하기 위하여 0.1 ㎖의 효소 용액을 0.9 ㎖의 기질용액(50 mM Sodium acetate buffer(pH 5.0), 1 ㎎/㎖의 p-Nitrophenyl-beta-D-cellobioside)과 50℃에서 30분간 반응하였다. 반응 용액과 동량의 2% 탄산 나트륨을 첨가해 반응을 멈추고 410 ㎚에서 흡광도를 측정한 결과, PeCBH1 발현 벡터로 형질전환된 사카로마이세스 세레비지에 균주에서는 0.92 unit, PeCBH2 발현 벡터로 형질전환된 사카로마이세스 세레비지에 균주에서는 0.59 unit의 엑소글루카나제 활성을 확인하였다. 이때 효소 활성은 1분에 1 μM의 니트로페놀을 생성할 수 있는 효소량을 1 unit로 정하였다.

실시예 5: PeCBH1 , PeCBH2 유전자의 자체 시그널, MFa ( mating factor alpha ) 분비시그널, 단백질 분비 융합인자 )를 융합파트너로 이용한 발현 비교

PeCBH1 유전자의 자체 분비시그널을 이용하여 발현하기 위하여 서열번호 36/서열번호 27로 중합효소 연쇄반응을 수행 후 약 1.7kb 절편을 회수하고 EcoR1/Sal1으로 절단한 YEGα-HIR525 벡터에 결합하여 대장균 DH5a에 형질전환한 형질전환체로부터 자체 분비시그널 유전자가 삽입된 플라스미드를 획득하였으며, 획득한 플라스미드를 Y2805 균주에 형질전환하여 단일콜로니를 선별하였다. MFa 분비시그널을 이용하기 위해 TFP 6번 벡터를 사용하여 동일한 균주에 형질전환 하였고, 단일콜로니를 선별하였다. 자체 분비시그널, MFa 분비시그널, TFP22-PeCBH1 각각의 선별된 단일형질전환체를 YPDG 배지에서 40시간 배양한 후 원심 분리하여 균체를 제거하고 남은 배양 상등액 0.6 ㎖을 0.4 ㎖ 아세톤으로 침전시켜 SDS-PAGE 분석을 수행하였다(도 10의 A 및 표 5). 도 10은 분비시그널에 따른 PeCBH1 및 PeCBH2의 분비율 비교를 위해 선별된 단백질분비융합인자(Translational Fusion Partner; TFP), 자체 분비시그널, 효모 mating factor alpha(MFα) 분비시그널을 이용하여 각각 분비생산된 PeCBH1 단백질을 SDS-PAGE로 분석한 결과를 나타내는 전기영동사진(10의 A) 및 PeCBH2 단백질을 SDS-PAGE로 분석한 결과를 나타내는 전기영동사진(10의 B)이다.

PeCBH1에서 선별한 균주들의 엑소글루카나제 활성 분석

	엑소글루카나제 활성 (u/㎖)
TFP22	0.974
자체 분비시그널	0.649
MFa 분비시그널	0.675

상기 도 10의 A에서 보듯이, TFP22-PeCBH1 균주에서 강한 밴드들이 관찰되었고, 상기 표 5에서 보듯이, 1 ㎎/㎖의 p-Nitrophenyl-beta-cellobioside를 기질로 엑소글루카나제 활성을 분석한 결과, TFP22-PeCBH1을 사용할 경우 자체 시그널 보다 약 33%, MFa 보다 약 31% 더 높은 활성을 확인하였다.

한편, PeCBH2 유전자의 자체 분비시그널을 이용하여 발현하기 위하여 서열번호 37/서열번호 35로 중합효소 연쇄반응을 수행하여 약 1.3kb 절편을 회수하고 PeCBH1과 마찬가지 방법으로 선별한 단일형질전환체를 분석하였다(도 10의 B 및 표 6).

PeCBH2에서 선별한 균주들의 엑소글루카나제 활성 분석

	엑소글루카나제 활성 (u/㎖)
TFP13	0.623
자체 분비시그널	0.491
MFa 분비시그널	0.473

그 결과, 도 10의 B에서 보듯이, TFP13-PeCBH2 균주에서 강한 밴드가 관찰되었으며, 상기 표 6에서 보듯이, TFP13-PeCBH2를 사용할 경우 자체 분비시그널보다 약 21%, MFa 분비시그널 보다 약 24% 더 높은 활성을 나타냄을 확인하였다

따라서 TFP22-PeCBH1, TFP13-PeCBH2 를 최적융합인자로 선택하여 추가적인 연구를 수행하였다.

실시예 6: 엑소글루카나제의 대량 생산 및 정제

상기한 Y2805/ST22-PeCBH1 및 Y2805/ST13-PeCBH2 생산균주를 이용하여 셀룰라제를 대량생산하기 위하여, 5L 발효조에서 유가식 배양을 수행하였다. 본 배양에 들어가기 전에 50 ㎖ YNB(0.67% 아미노산이 결여된 효모기질, 0.5% 카사미노산, 및 2% 글루코오스)배지에 초기 배양한 후 다시 200 ㎖의 YEPD 액체배지에서 배양하여 활성화하고 본 배양액에 접종하여 30℃에서 48시간 동안 배양하였다. 배지에 분비된 PeCBH1 엑소글루카나제를 확인하기 위하여 시간별 배양상등액을 SDS-PAGE 분석하고, 48시간 동안 발효 배양 후 약 16 unit/㎖의 활성을 확인하였다(도 11의 A 및 B). 도 11은 PeCBH1 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 사카로마이세스 세레비지에 균주를 5L 발효조에서 유가식 발효하여 시간별로 취한 배지를 SDS-PAGE로 분석한 결과를 나타내는 전기영동사진(11의 A) 및, 각 시간별 세포 OD 및 엑소글루카나제의 활성을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다(11의 B).

PeCBH2 엑소글루카나제도 상기와 동일한 방법으로 발효 생산 후 배지에 분비된 효소를 확인하기 위하여 시간별 배양상등액을 SDS-PAGE 분석하고, 48시간 동안 발효 배양 후 약 13.6 unit/㎖의 활성을 확인하였다(도 12의 A 및 B). 도 12는 PeCBH2 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 사카로마이세스 세레비지에 균주를 5L 발효조에서 유가식 발효하여 시간별로 취한 배지를 SDS-PAGE로 분석한 결과를 나타내는 전기영동사진(12의 A) 및 각 시간별 세포 OD 및 엑소글루카나제의 활성을 측정한 결과를 나타내는 그래프이다(12의 B).

발효 생산된 PeCBH1 단백질은 50 mM Tris 완충용액(pH8.0)으로 한외여과(분자량 30 kDa cut-off)를 이용하여 농축하였고, 이온 교환 크로마토그래피 방법으로 정제하기 위하여 50 mM Tris 완충용액(pH8.0)으로 효소농축액을 HiTrap DEAE 컬럼에 흡착시킨 뒤 0에서 1M까지의 NaCl(pH8.0) 상승 농도 기울기로 효소를 용출시켰다(도 13). 도 13은 재조합 PeCBH1 정제를 위한 이온 교환 크로마토그래피 프로파일을 나타내는 그래프(13의 A) 및 정제 분획에 대한 단백질 SDS-PAGE 분석 결과를 나타내는 전기영동사진(13의 B)이다.

엑소글루카나제 활성을 가지는 분획을 모아 50 mM Tris 완충용액(pH8.0)으로 투석한 후 2차 이온 교환 크로마토그래피 방법으로 HiTrap Qff 컬럼을 선택하여 같은 완충용액으로 효소 투석액을 흡착시키고 0에서 1M까지의 NaCl(pH8.0) 상승 농도 기울기로 효소를 융출시켜 높은 엑소글루카나제 활성을 가지는 분획을 모았다. 발효 생산된 PeCBH2 단백질은 상기 PeCBH1과 동일하게 50 mM Tris 완충용액(pH8.0)으로 한외여과(분자량 30 kDa cut-off)를 이용하여 농축하였고, 이온 교환 크로마토그래피 방법으로 정제하기 위하여 50 mM Tris 완충용액(pH8.0)으로 효소농축액을 HiTrap DEAE 컬럼에 흡착시킨 뒤 0에서 1M까지의 NaCl(pH8.0) 상승 농도 기울기로 효소를 용출시켜 높은 엑소글루카나제 활성을 가지는 분획을 모았다(도 14). 도 14는 재조합 PeCBH2 정제를 위한 이온 교환 크로마토그래피 프로파일을 나타내는 그래프(14의 A) 및 정제 분획에 대한 단백질 SDS-PAGE 분석 결과를 나타내는 전기영동사진(14의 B)이다.

효소 정량은 Bradford 방법을 사용하였고, 소혈청알부민(bovine serum albumin; BSA)을 표준물질로 이용하였으며, 정제 과정에 따른 결과는 표 7 및 표 8과 같다.

PeCBH1의 정제결과

방법	전체 단백질 (㎎)	전체 활성 (U)	특이 활성(U/㎎)	수득	배수
한외여과	58.60	1434.10	24.47	1.00	1.00
DEAE 이온교환 크로마토그라피	13.52	527.12	38.99	0.63	1.59
Qff 이온교환 크로마토그라피	1.90	84.49	44.47	0.88	1.82

PeCBH2 의 정제결과

방법	전체 단백질 (㎎)	전체 활성 (U)	특이 활성(U/㎎)	수득	배수
한외여과	1232.55	1112.40	0.90	1.00	1.00
DEAE 이온교환 크로마토그라피	69.78	337.53	4.84	0.19	5.36

실시예 7: 신규 엑소글루카나제의 효소 특성 분석

정제한 PeCBH1 및 PeCBH2 효소를 대상으로 각각의 최적 pH 및 최적 온도를 조사하였다. 효소의 최적 pH를 분석하기 위하여 시트르산 나트륨(pH3.0 내지 4.5), 아세트산 나트륨(pH 4.5 내지 5.5), 인산염(pH 5.5 내지 8.0) 완충용액을 사용하였고, 최적 온도를 분석하기 위하여 30℃에서 70℃까지 사용하여 실시예 4에서 기술한 엑소글루카나제 활성을 분석하였다. 이러한 결과로부터 PeCBH1은 pH 5와 50℃ 에서 최대 활성을 나타내었고(도 15), 도 15에서 정제한 PeCBH1 단백질의 효소 특성 확인을 위해 최적 pH 분석 결과를 나타내는 그래프(15의 A)와 최적 온도 분석결과를 나타내는 그래프(15의 B)이다.

PeCBH2는 pH 5와 55℃에서 최대 활성을 나타내었다(도 16). 도 16은 정제한 PeCBH2 단백질의 효소 특성 확인하기 위하여 최적 pH 분석 결과를 나타내는 그래프(16의 A)와 최적 온도 분석결과를 나타내는 그래프(16의 B)이다.

또한 정제한 PeCBH1 및 PeCBH2 효소를 대상으로 각 엑소글루카나제가 선호하는 섬유소기질 타입이 reducing end 인지 non-reducing end 인지 확인하기 위해 TLC 실험을 하였다. 0.1 ㎖의 정제한 효소 용액을 0.9 ㎖의 기질용액 (50 mM 아세트산 나트륨 완충용액(pH 5.0) 및 1 ㎎/㎖의 p-Nitrophenyl-beta-D-cellotetraoside)과 50℃에서 0분에서 15분 동안 5분 간격으로 반응한 후 반응 용액과 동량의 2% 탄산나트륨을 첨가해 반응을 멈추고 각 시간별 가수분해 산물을 TLC용 유리 실리카겔 위에 점을 찍어 건조하는데, 이 때 사용한 표준물질은 글루코스(G1), 셀로바이오스(G2), 셀로트리오스(G3), 셀로테트라오사이드(G4), pNP-beta-D-glucopyranoside(pNPG1), pNP-beta-D-cellobioside(pNPG2), pNP-beta-D-cellotrioside(pNPG3), 및 pNP-beta-D-cellotetraoside(pNPG4)의 여덟 종류로 시간별 각 효소의 분해산물을 보여주는 지표로 사용하였다(도 17의 A). 도 17의 A는 PeCBH1 단백질 및 PeCBH2 단백질이 선호하는 섬유소 기질 말단 타입 결정을 위한, 표준물질에 대한 TLC 결과를 나타내는 사진이다.

표준물질과 시간별 효소 산물의 분리 목적으로 사용한 용리액은 아세토니트릴과 증류수의 비율이 80:20(v/v)이 되도록 하였고, 건조 후 당을 탐지하기 위하여 100 ㎖ 스탁 용액(stock solution) (100 ㎖ 아세톤, 1 ㎖ 아닐린, 및 1 g 다이페닐아민)에 10 ㎖ 인산(phosphoric acid)를 섞은 용액을 실리카겔에 뿌려서 건조하였다. 120℃에서 유리 실리카겔의 당이 발색될 때까지 반응하였고, 이로부터 섬유소의 non-reducing 말단에 셀룰라제 활성을 갖는 것으로 알려져 있는 T. reesei CBH2는 pNP-beta-D-cellotetraoside 기질을 시간이 지날수록 셀로바이오스 및 pNP-beta-D-cellobioside로 자르는 반면, PeCBH1 및 PeCBH2는 사용한 기질을 셀로트리오스 및 pNP-beta-D-glucopyranoside로 자르는 reducing 말단 셀룰라제 활성을 가지는 것을 확인할 수 있었다(도 17의 B). 도 17의 B는 PeCBH1 단백질 및 PeCBH2 단백질이 선호하는 섬유소 기질 말단 타입 결정을 위한, 반응산물에 대한 TLC 결과를 나타내는 사진이다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (13)

1. 서열번호 22 또는 24의 아미노산 서열로 표시되는 엑소글루카나제.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 엑소글루카나제는 페니실리움 속 균주로부터 발현되는 것인 엑소글루카나제.
   
3. 제1항의 엑소글루카나제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
   
4. 제3항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 23 또는 25의 염기서열로 표시되는 것인 폴리뉴클레오티드.
   
5. 제3항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터.
   
6. 제5항에 있어서, 단백질융합인자(translational fusion partner: TFP)를 추가로 포함하는 것인 발현벡터.
   
7. 제5항의 발현벡터가 숙주세포에 도입된 형질전환체.
   
8. 제7항에 있어서, 상기 숙주세포는 에탄올 발효능을 가지는 것인 형질전환체.
   
9. 제7항의 형질전환체를 배양하고, 이의 배양물 또는 배양상등액으로부터 엑소글루카나제를 회수하는 단계를 포함하는, 제1항 또는 제2항에 따른 엑소글루카나제의 생산방법.
   
10. (ｉ) 제5항의 발현벡터가 에탄올 발효능을 가지는 숙주세포에 도입된 형질전환체를 수득하는 단계;
    (ⅱ) 상기 수득한 형질전환체를 엑소글루카나제의 기질을 포함하는 배양액에서 배양하는 단계; 및,
    (ⅲ) 상기 단계 (ⅱ)에서 수득한 배양물 또는 배양상등액으로부터 바이오 에탄올을 회수하는 단계를 포함하는, 바이오 에탄올의 생산방법.
    
11. 제10항에 있어서, 상기 에탄올 발효능을 가지는 숙주세포는 엔도글루카나제 또는 베타-글루코시다제를 각각 또는 동시발현하는 것인 바이오 에탄올의 생산방법.
    
12. 제10항에 있어서, 상기 기질은 글루칸(glucan) 또는 다당류(polysaccharide)인 것인 바이오 에탄올의 생산방법.
    
13. 제10항에 있어서, 상기 기질은 녹말, 덱스트란, 풀룰란 및 셀룰로오스로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종 이상인 것인 바이오 에탄올의 생산방법.

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