CN110577902A - 一种深色有隔内生菌根真菌菌剂组合体制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种深色有隔内生菌根真菌菌剂组合体制备方法，具体包括：植物根系的选取与处理、制备培养体系、菌种的分离培养、菌种的纯化培养、制备菌种种子溶液及其发酵培养、制备干粉菌剂以及制备深色有隔内生菌根真菌菌剂组合体的步骤。本发明制备的深色有隔内生菌根真菌菌剂组合体具有菌剂组合质量好、侵染率高、定殖率高、保质期长、侵染效果稳定的优点，本制备方法可广泛应用于科研、生态防治、土壤改良和恢复等领域，实现大规模工厂化运作、满足产业要求。

Description

一种深色有隔内生菌根真菌菌剂组合体制备方法
技术领域
本发明涉及微生物菌剂技术领域，更具体涉及一种深色有隔内生菌根真菌菌剂。
背景技术
深色有隔内生菌根，是自然界中广泛存在的一种植物根系与真菌的共生体。深色有隔内生菌根真菌(Dark Septate Endiphytes，DSE)是一类可以定殖在植物根系内的小型土壤真菌，并与植物根系形成菌根结构。DSE主要分布在极端环境中，如重金属污染区域、荒漠地区、高寒地区和极地等，具有菌根生态学的功能，不仅可以增强植物对生物和非生物因素的抗压能力，帮助植物在干旱环境中维持水分和营养运输，而且能够通过提高植物体内某些酶类的活性来增强植物的抗逆性，促进植物生长，在恢复荒漠化土地和修复重金属污染土壤等方面具有重要意义。
当前，由于DSE的活体营养、专性共生、生长史中不出现产孢现象等特点，使得采用大批量高效生产的方法来获取高质量的菌剂过程非常复杂。现阶段在DSE纯培养方面的主要研究成果有：张海涵等的《黄土高原枸杞根际微生态特征及其共生真菌调控宿主生长与耐旱响应机制》的研究结果表明，不同DSE菌株生长的最适碳源和氮源不同，Phomachrysanthemicola为葡萄糖和甘氨酸，Cladosporium cladosporioides LBF3为甘露醇和脯氨酸，Cladosporium cladosporioides LBF6为木糖和甘氨酸；班宜辉等的一项专利号为CN105918127 B的一种基于DSE快速扩繁建立DSE-植物共生体系的方法的研究结果表明，G.Cylindrosporus生长的最适碳源、氮源、温度和pH分别为葡萄糖、蛋白胨、25℃和5.0；徐凤美等的《松萎蔫病发生区和未发生区油松根部真菌研究》的研究结果表明，DSE菌株Phialocephala fortinii在固体培养时最适碳源和氮源分别为乳糖和麦芽浸粉，而液体培养时最适碳源和氮源分别为可溶性淀粉和蛋白胨，其生长最适温度和pH分别为20℃和3.0。现阶段在DSE对宿主植物侵染率方面的主要研究成果有：王少杰等的《蒙古沙冬青DSE资源分布及接种效应研究的研究》结果表明，DSE在蒙古沙冬青根系中的平均定殖率为52.02％；葛佳丽等的《极旱荒漠植物深色有隔内生真菌定殖及其与土壤因子的相关性》的研究结果表明，DSE在红砂和膜果麻黄根系中的平均定殖率分别为13％和66.7％。这些生产方法都没有形成***框架，无法实现大规模工厂化运作，生产得到的菌剂侵染效果在植物生产***中的表现也较为不稳定，所以不能满足产业需求。
发明内容
本发明需要解决的技术问题是提供一种深色有隔内生菌根真菌菌剂组合体的制备方法，以解决目前深色有隔内生菌根生产方法没有形成***构架、无法实现大规模工厂化运作以及制得的菌剂侵染效果不稳定的问题；进一步达到菌剂制备低成本、无污染、原料利用率高、菌剂侵染率高、延长菌剂保质期的目的，实现深色有隔内生菌根的工厂化运作。
为解决上述技术问题，本发明提供了一种深色有隔内生菌根真菌菌剂组合体制备方法。
一种深色有隔内生菌根真菌菌剂组合体制备方法，具体制备方法如下：
S1：选取野生一年生须根草本植物，将其根系洗净、切段和消毒；
S2：制备马铃薯葡萄糖琼脂固体培养体系、马铃薯葡萄糖液体培养体系和马铃薯葡萄糖琼脂双抗固体培养体系；
S3：将S1处理的根系接种到马铃薯葡萄糖琼脂双抗固体培养体系上进行菌种分离培养；
S4：挑取成熟菌丝接种到马铃薯葡萄糖琼脂固体培养体系上进行菌种纯化培养；
S5：制备菌种种子液；
S6：将种子液接种到马铃薯葡萄糖液体培养体系中进行发酵培养，获取发酵液和菌丝球；
S7：将发酵液和菌丝球制成10-12份干粉菌剂，并按照比例在干粉菌剂中加入保水剂70-75份、营养剂15-20份和缓释剂0.5-1.0份，充分混合均匀即得到深色有隔内生菌根真菌菌剂组合体。
进一步的，所述S1中的一年生须根草本植物包括栉齿黄鹌菜、泥胡菜和朝天委陵菜。
进一步的，所述步骤S2中所述马铃薯葡萄糖琼脂双抗固体培养体系中添加的抗性因子为氨苄青霉素和硫酸链霉素。
进一步的，所述抗性因子的用量为每1000mL蒸馏水中加入50mg/L的氨苄青霉素和硫酸链霉素各100μL。
进一步的，所述S2中的马铃薯葡萄糖琼脂双抗固体培养体系上接种3-5个根系小段。
进一步的，所述S6中的种子液的接种量为10％。
进一步的，所述S7中的保水剂为灭菌后的硅藻土和孔隙岩颗粒。
进一步的，所述S7中的营养剂为灭菌后的组合腐殖土。
进一步的，所述S7中的缓释剂为聚丙烯酸酯。
由于采用了以上技术方案，本发明所取得技术进步如下。
本发明提供的深色有隔内生菌根真菌菌剂组合体制备方法，在组分中添加了保水剂、营养剂和缓释剂，具有质量好、侵染率高、定殖率高、保质期长、侵染效果稳定的优点，可广泛应用于科研、生态防治、土壤改良和恢复等领域，本发明提供了深色有隔内生菌根真菌菌剂组合体生产方法的***框架，可实现大规模工厂化运作、满足产业要求。
附图说明
图1为本发明所制备的深色有隔内生菌根真菌菌剂组合体对车前草植株根段的侵染效果图；
图2本发明所制备的深色有隔内生菌根真菌菌剂组合体保存1年之后的活化培养生长状况图。
具体实施方式
一种深色有隔内生菌根真菌菌剂组合体制备方法，具体制备方法如下：
S1：采集生长良好、健康无病害的野生一年生须根草本植物，如：栉齿黄鹌菜、泥胡菜、朝天委陵菜等，剪下植株根系，在流水下冲洗干净，剪成长1cm左右的根段。将镜检含有深色有隔内生菌根真菌菌丝的新鲜根段的两端切掉，并将根段切成0.3～0.5cm的根小段，用75％乙醇表面消毒3min后，无菌水清洗3次，再用8％次氯酸钠溶液消毒8min，无菌水清洗3次。
S2：将新鲜马铃薯削皮、洗净、切块后，称取200g的马铃薯三份，每份马铃薯均加入蒸馏水1000mL煮沸30min，然后用四层纱布过滤得到三份滤液。
取其中两份滤液，均先加入葡萄糖20g和琼脂20g煮沸至溶解，再置于103.4KPa、121.3℃条件下维持15～20min进行高温湿热灭菌，制得两份马铃薯葡萄糖琼脂固体培养体系。
向另一份滤液中加入葡萄糖20g煮沸至溶解，再置于103.4KPa、121.3℃条件下维持15～20min进行高温湿热灭菌，制得马铃薯葡萄糖液体培养体系。
量取1000mL蒸馏水，加入50mg/L氨苄青霉素和硫酸链霉素各100μL，混合均匀。
将制得的一份马铃薯葡萄糖琼脂固体培养体系倒入平皿，待凝固后，在培养体系表面均匀涂抹配制的氨苄青霉素和硫酸链霉素，即得马铃薯葡萄糖琼脂-氨苄青霉素/硫酸链霉素双抗固体培养体系。
S3：将消毒后的根小段轻轻放到马铃薯葡萄糖琼脂-氨苄青霉素/硫酸链霉素双抗固体培养体系表面，在28℃条件下恒温黑暗培养。
S4：待根小段长出深色菌丝后，挑取成熟的深色菌丝接种在S2中制得的马铃薯葡萄糖琼脂固体培养体系表面进行纯化培养，并进行2次继代培养。
S5：将马铃薯葡萄糖液体培养体系分装到锥形瓶中，将S3中最后一次继代培养得到的成熟菌丝接种到培养体系中摇匀，在28℃、110r/min条件下恒温黑暗培养72h，待菌液颜色变为深褐色时，即为种子液。
S6：将种子液接种到马铃薯葡萄糖液体培养体系中，控制种子液的接种量为10％，在28℃、110r/min条件下恒温黑暗培养96h，收集发酵液和菌丝球。
S7：将发酵液和菌丝球一同置于200目标准检验筛中过滤，收集菌丝球后在28℃条件下干燥，将干燥后的菌丝球研磨成粉末状，即为干粉菌剂。
将10-12份干粉菌剂中加入灭菌后的硅藻土和孔隙岩颗粒70-75份、灭菌后的组合腐殖土15-20份和聚丙烯酸酯0.5-1.0份，充分混合均匀，即得深色有隔内生菌根真菌菌剂组合体。
下面将结合附图和具体实施例对本发明进行进一步详细说明。
实施例1
S1：采集生长良好、健康无病害的野生一年生须根草本植物朝天委陵菜，剪下朝天委陵菜的根系，在流水下冲洗干净，剪成长1cm左右的根段。将根段进行镜检，选出镜检含有深色有隔内生菌根真菌菌丝的新鲜根段，切掉两端，并将根段切成0.3～0.5cm的根小段，用75％乙醇表面消毒3min后，无菌水清洗3次，再用8％次氯酸钠溶液消毒8min，无菌水清洗3次。
S2：将新鲜马铃薯削皮、洗净、切块后，称取200g的新鲜马铃薯三份，每份马铃薯均加入蒸馏水1000mL煮沸30min，然后用四层纱布过滤得到三份滤液。
取其中两份滤液，均先加入琼脂20g和葡萄糖20g煮沸至溶解，再置于103.4KPa、121.3℃条件下维持15～20min进行高温湿热灭菌，制得两份马铃薯葡萄糖琼脂固体培养体系。
向另一份滤液中加入葡萄糖20g煮沸至溶解，再置于103.4KPa、121.3℃条件下维持15～20min进行高温湿热灭菌，制得马铃薯葡萄糖液体培养体系。
量取1000mL蒸馏水，加入50mg/L氨苄青霉素和硫酸链霉素各100μL，混合均匀。
将制得的一份马铃薯葡萄糖琼脂固体培养体系倒入平皿，待凝固后，在培养体系表面均匀涂抹配制的氨苄青霉素和硫酸链霉素，即得马铃薯葡萄糖琼脂-氨苄青霉素/硫酸链霉素双抗固体培养体系。
S3：将消毒后的根小段轻轻放到马铃薯葡萄糖琼脂-氨苄青霉素/硫酸链霉素双抗固体培养体系表面，在28℃条件下恒温黑暗培养。
S4：待根小段长出深色菌丝后，挑取成熟的深色菌丝接种在马铃薯葡萄糖琼脂固体培养体系表面进行纯化培养，并进行2次继代培养。
S5：将马铃薯葡萄糖液体培养体系分装到锥形瓶中，将S3中最后一次继代培养得到的成熟菌丝接种到培养体系中摇匀，在28℃、110r/min条件下恒温黑暗培养72h，待菌液颜色变为深褐色时，制得种子液。
S6：将种子液接种到马铃薯葡萄糖液体培养体系中，接种量为10％，在28℃、110r/min条件下恒温黑暗培养96h，收集发酵液和菌丝球。
S7：将发酵液和菌丝球一同置于200目标准检验筛中过滤，收集菌丝球后在28℃条件下干燥，将干燥后的菌丝球研磨成粉末状，即为干粉菌剂。
在10份干粉菌剂中加入灭菌后的硅藻土和孔隙岩颗粒73份、灭菌后的组合腐殖土20份和聚丙烯酸酯1.0份，充分混合均匀，得深色有隔内生菌根真菌菌剂组合体。
实施例2
S1：采集生长良好、健康无病害的野生一年生须根草本植物泥胡菜，剪下泥胡菜的根系，在流水下冲洗干净，剪成长1cm左右的根段。将根段进行镜检，选出镜检含有深色有隔内生菌根真菌菌丝的新鲜根段，切掉两端，并将根段切成0.3～0.5cm的根小段，用75％乙醇表面消毒3min后，无菌水清洗3次，再用8％次氯酸钠溶液消毒8min，无菌水清洗3次。
S2：将新鲜马铃薯削皮、洗净、切块后，称取200g的新鲜马铃薯三份，每份马铃薯均加入蒸馏水1000mL煮沸30min，然后用四层纱布过滤得到三份滤液。
取其中两份滤液，均先加入琼脂20g和葡萄糖20g煮沸至溶解，再置于103.4KPa、121.3℃条件下维持15～20min进行高温湿热灭菌，制得两份马铃薯葡萄糖琼脂固体培养体系。
向另一份滤液中加入葡萄糖20g煮沸至溶解，再置于103.4KPa、121.3℃条件下维持15～20min进行高温湿热灭菌，制得马铃薯葡萄糖液体培养体系。
量取1000mL蒸馏水，加入50mg/L氨苄青霉素和硫酸链霉素各100μL，混合均匀。
将制得的一份马铃薯葡萄糖琼脂固体培养体系倒入平皿，待凝固后，在培养体系表面均匀涂抹配制的氨苄青霉素和硫酸链霉素，即得马铃薯葡萄糖琼脂-氨苄青霉素/硫酸链霉素双抗固体培养体系。
S3：将消毒后的根小段轻轻放到马铃薯葡萄糖琼脂-氨苄青霉素/硫酸链霉素双抗固体培养体系表面，在28℃条件下恒温黑暗培养。
S4：待根小段长出深色菌丝后，挑取成熟的深色菌丝接种在马铃薯葡萄糖琼脂固体培养体系表面进行纯化培养，并进行2次继代培养。
S5：将马铃薯葡萄糖液体培养体系分装到锥形瓶中，将S3中最后一次继代培养得到的成熟菌丝接种到培养体系中摇匀，在28℃、110r/min条件下恒温黑暗培养72h，待菌液颜色变为深褐色时，制得种子液。
S6：将种子液接种到马铃薯葡萄糖液体培养体系中，接种量为10％，在28℃、110r/min条件下恒温黑暗培养96h，收集发酵液和菌丝球。
S7：将发酵液和菌丝球一同置于200目标准检验筛中过滤，收集菌丝球后在28℃条件下干燥，将干燥后的菌丝球研磨成粉末状，即为干粉菌剂。
在11份干粉菌剂中加入灭菌后的硅藻土和孔隙岩颗粒75份、灭菌后的组合腐殖土15份和聚丙烯酸酯0.5份，充分混合均匀，得深色有隔内生菌根真菌菌剂组合体。
实施例3
S1：采集生长良好、健康无病害的野生一年生须根草本植物栉齿黄鹌菜，剪下栉齿黄鹌菜的根系，在流水下冲洗干净，剪成长1cm左右的根段。将根段进行镜检，选出镜检含有深色有隔内生菌根真菌菌丝的新鲜根段，切掉两端，并将根段切成0.3～0.5cm的根小段，用75％乙醇表面消毒3min后，无菌水清洗3次，再用8％次氯酸钠溶液消毒8min，无菌水清洗3次。
S2：将新鲜马铃薯削皮、洗净、切块后，称取200g的新鲜马铃薯三份，每份马铃薯均加入蒸馏水1000mL煮沸30min，然后用四层纱布过滤得到三份滤液。
取其中两份滤液，均先加入琼脂20g和葡萄糖20g煮沸至溶解，再置于103.4KPa、121.3℃条件下维持15～20min进行高温湿热灭菌，制得两份马铃薯葡萄糖琼脂固体培养体系。
向另一份滤液中加入葡萄糖20g，煮沸至溶解，再置于103.4KPa、121.3℃条件下维持15～20min进行高温湿热灭菌，制得马铃薯葡萄糖液体培养体系。
量取1000mL蒸馏水，加入50mg/L氨苄青霉素和硫酸链霉素各100μL，混合均匀。将制得的一份马铃薯葡萄糖琼脂固体培养体系倒入平皿，待凝固后，在培养体系表面均匀涂抹配制的氨苄青霉素和硫酸链霉素，即得马铃薯葡萄糖琼脂-氨苄青霉素/硫酸链霉素双抗固体培养体系。
S3：将消毒后的根小段轻轻放到马铃薯葡萄糖琼脂-氨苄青霉素/硫酸链霉素双抗固体培养体系表面，在28℃条件下恒温黑暗培养。
S4：待根小段长出深色菌丝后，挑取成熟的深色菌丝接种在马铃薯葡萄糖琼脂固体培养体系表面进行纯化培养，并进行2次继代培养。
S5：将马铃薯葡萄糖液体培养体系分装到锥形瓶中，将S3中最后一次继代培养得到的成熟菌丝接种到培养体系中摇匀，在28℃、110r/min条件下恒温黑暗培养72h，待菌液颜色变为深褐色时，制得种子液。
S6：将种子液接种到马铃薯葡萄糖液体培养体系中，接种量为10％，在28℃、110r/min条件下恒温黑暗培养96h，收集发酵液和菌丝球。
S7：将发酵液和菌丝球一同置于200目标准检验筛中过滤，收集菌丝球后在28℃条件下干燥，将干燥后的菌丝球研磨成粉末状，即为干粉菌剂。
在12份干粉菌剂中加入灭菌后的硅藻土和孔隙岩颗粒70份、灭菌后的组合腐殖土17份和聚丙烯酸酯0.7份，充分混合均匀，得深色有隔内生菌根真菌菌剂组合体。
对实施例1至实施例3制备的深色有隔内生菌根真菌菌剂组合体分别进行定殖率检测实验与保质期检测实验。
1)定殖率检测试验：
用实施例1至实施例3制备的深色有隔内生菌根真菌菌剂组合体以及普通的深色有隔内生菌根真菌菌剂分别侵染幼嫩车前草植株，待成熟后，收集车前草根段，将根段剪成1cm长，放入质量分数为10％的KOH溶液的碱液中，100℃水浴加热30min，滤去碱液并用蒸馏水漂洗3次；之后用质量分数为0.5％的酸性品红溶液染色2.5h，在室温下用乳酸甘油(乳酸∶甘油＝1∶1)脱色三次后，进行镜检与现阶段平均定殖率做对比。
定殖率的计算公式为：
定殖率(％)＝定殖根段数/被镜检根段总数×100％
实施例1-3的染色结果见附图1，定殖率统计结果见表1。
表1：定殖率(单位：％)
由以上实验结果可以看出，本发明所制备的深色有隔内生菌根真菌菌剂组合体的平均侵染率达到81.33％与普通深色有隔内生菌根真菌菌剂的侵染率52.02％相比，有了大幅提高。
2)保质期的检测：
将实施例1至实施例3制备的深色有隔内生菌根真菌菌剂组合体在20℃下于密封袋中黑暗干燥保存1年。一年后随机取出3份，分别用无菌水活化、在马铃薯葡萄糖琼脂固体培养体系中培养，观察深色有隔内生菌菌株生长状况，结果见附图2。
由实验结果可以看出，保存一年后，菌株仍然正常生长，表明本发明所采用的深色有隔内生菌根真菌菌剂组合体的生产方法，可以生产出高侵染率和高稳定性的深色有隔内生菌根真菌菌剂组合体，取得了突出的效果。

Claims (9)

1.一种深色有隔内生菌根真菌菌剂组合体制备方法，其特征在于，具体制备方法如下：
S1：选取野生一年生须根草本植物，将其根系洗净、切段和消毒；
S2：制备马铃薯葡萄糖琼脂固体培养体系、马铃薯葡萄糖液体培养体系和马铃薯葡萄糖琼脂双抗固体培养体系；
S3：将S1处理的根系接种到马铃薯葡萄糖琼脂双抗固体培养体系上进行菌种分离培养；
S4：挑取成熟菌丝接种到马铃薯葡萄糖琼脂固体培养体系上进行菌种纯化培养；
S5：制备菌种种子液；
S6：将种子液接种到马铃薯葡萄糖液体培养体系中进行发酵培养，获取发酵液和菌丝球；
S7：将发酵液和菌丝球制成10-12份干粉菌剂，并按照比例在干粉菌剂中加入保水剂70-75份、营养剂15-20份和缓释剂0.5-1.0份，充分混合均匀即得到深色有隔内生菌根真菌菌剂组合体。
2.根据权利要求1所述的一种深色有隔内生菌根真菌菌剂组合体制备方法，其特征在于：所述S1中的一年生须根草本植物包括栉齿黄鹌菜、泥胡菜和朝天委陵菜。
3.根据权利要求1所述的一种深色有隔内生菌根真菌菌剂组合体制备方法，其特征在于：步骤S2中所述马铃薯葡萄糖琼脂双抗固体培养体系中添加的抗性因子为氨苄青霉素和硫酸链霉素。
4.根据权利要求3所述的一种深色有隔内生菌根真菌菌剂组合体制备方法，其特征在于：所述抗性因子的用量为每1000mL蒸馏水中加入50mg/L的氨苄青霉素和硫酸链霉素各100μL。
5.根据权利要求1所述的一种深色有隔内生菌根真菌菌剂组合体制备方法，其特征在于：所述S2中的马铃薯葡萄糖琼脂双抗固体培养体系上接种3-5个根系小段。
6.根据权利要求1所述的一种深色有隔内生菌根真菌菌剂组合体制备方法，其特征在于：所述S6中的种子液的接种量为10％。
7.根据权利要求1所述的一种深色有隔内生菌根真菌菌剂组合体制备方法，其特征在于：所述S7中的保水剂为灭菌后的硅藻土和孔隙岩颗粒。
8.根据权利要求1所述的一种深色有隔内生菌根真菌菌剂组合体制备方法，其特征在于：所述S7中的营养剂为灭菌后的组合腐殖土。
9.根据权利要求1所述的一种深色有隔内生菌根真菌菌剂组合体制备方法，其特征在于：所述S7中的缓释剂为聚丙烯酸酯。
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