CN110577895A - 一种模拟体内动态环境的动态细胞培养方法及培养装置 - Google Patents

一种模拟体内动态环境的动态细胞培养方法及培养装置 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种模拟体内动态环境的动态细胞培养方法及培养装置，培养方法为：在体外将细胞粘附在柔性基材上进行培养，并在培养过程中对柔性基材施加频率一定且方向一定的循环动态载荷，各循环周期内载荷先随时间逐渐增大，至达到最大值时，再随时间逐渐减小，柔性基材的形变率与载荷同步变化，先线性增大，再线性减小；培养装置包括细胞培养室、用于夹持柔性基材的夹持装置、用于对柔性基材施加载荷的压头以及用于带动压头沿垂直于柔性基材的方向作往复运动的对心式曲柄滑块机构，夹持装置和压头位于细胞培养室内。本发明的培养方法能够准确地模拟柔性植入物‑细胞在体内的相互作用关系；本发明的培养装置组装简便，使用方便，极具推广价值。

Description

一种模拟体内动态环境的动态细胞培养方法及培养装置
技术领域
本发明属于细胞培养技术领域，涉及一种模拟体内动态环境的动态细胞培养方法及培养装置。
背景技术
体外细胞培养对于判断材料植入体内后细胞生长发育情况、材料与组织的整合性能等具有重要意义。体外细胞培养是指在体外环境下，通过模拟体内环境使细胞生长、发育、迁移。与动物实验和体内实验相比，体外细胞培养具备成本较低、操作简便、易于观察且无伦理问题的优点。然而目前体外细胞培养仍存在较多缺点，体外细胞培养主要为静态培养，包括培养瓶法、培养皿法、培养板法等，无法准确模拟体内环境，特别是受力情况，无法达到实验设计预期效果。以疝修补片为例，补片为柔性材料，随着人呼吸过程中腹壁的律动，补片材料因受到收缩或拉伸而发生形变，使得应力传导及细胞生长环境发生变化，而静态细胞培养无法模拟出这一体内变化，得到的结果不具有代表性。
因此，在体外更真实地模拟体内的生长环境，特别是模拟不同的受力条件下的情况以实现体外的细胞动态培养具有十分重要的意义。
发明内容
本发明的目的是解决现有技术中体外细胞培养无法准确模拟体内环境特别是不同受力情况下的动态环境的问题，提供一种模拟体内动态环境的动态细胞培养方法及培养装置，特别提供一种模拟柔性基材在体内受到轴向和径向机械刺激的体外动态细胞培养方法及培养装置，该方法可在体外培养过程中模拟体内环境，使细胞在更加贴合体内环境的条件下进行培养，得到的数据更加贴近实际体内情况，与体内实验相比，该方法的实验成本大大降低，且该方法所使用的培养装置操作简便，可根据需要设置不同的参数。该方法和装置使动态模拟实验重复性高，操作简便，降低了实验成本。
为达到上述目的，本发明采用的方案如下：
一种模拟体内动态环境的动态细胞培养方法，在体外将细胞粘附在柔性基材上进行培养，并在培养过程中对柔性基材施加循环动态载荷，以模拟体内细胞力学环境，实现模拟体内动态环境的动态细胞培养；
循环动态载荷的施加频率为Fr，施加方向为Di；
各循环周期内载荷先随时间逐渐增大，至达到最大值时，再随时间逐渐减小；
柔性基材的形变率与载荷同步变化，先由a线性增大至b，再由b线性减小至a；
b＝b1/b0*100％，b1为柔性基材沿Di的最大位移，b0为柔性基材未受到循环动态载荷时的等效圆直径，等效圆为周长等于柔性基材边长的圆。
作为优选的技术方案：
如上所述的一种模拟体内动态环境的动态细胞培养方法，所述体内细胞力学环境为人肌腱和韧带运动时肌腱和韧带处细胞力学环境，Fr的取值范围为0.5～2Hz，Di为平行于柔性基材的方向，a为0％，b的取值范围为4％～10％，Fr的取值范围是根据人日常行为时的肌腱和韧带的运动频率确定的，a和b是根据日常肌腱和韧带的形变范围确定的，所以Fr、a和b的取值在此范围内能模拟人体情况，从而较好地模拟人肌腱和韧带运动时肌腱和韧带处细胞力学环境。
如上所述的一种模拟体内动态环境的动态细胞培养方法，所述体内细胞力学环境为成人日常行为时腹壁内细胞力学环境，Fr的取值范围为0.1～0.5Hz，Di为垂直于柔性基材的方向，a为0％；
当所述成人日常行为为平躺或静止站立时，b的取值范围为5％～30％；当所述成人日常行为为慢走或坐立时，b的取值范围为10％～30％，Fr的取值范围是根据人日常行为时的呼吸频率确定的，a和b是根据日常腹壁的形变范围确定的，所以Fr、a和b的取值在此范围内能较好地模拟成人日常行为时腹壁内细胞力学环境；
或者，所述体内细胞力学环境为人心肌运动时心肌处细胞力学环境，Fr的取值范围为0.1～0.5Hz，Di为垂直于柔性基材的方向，a为0％，b的取值范围为10％～20％，Fr的取值范围是根据人日常行为时的心脏搏动频率确定的，a和b是根据心肌扩张和收缩时的形变范围确定的，所以Fr、a和b的取值在此范围内能较好地模拟人心肌运动时心肌处细胞力学环境；
或者，所述体内细胞力学环境为人成骨过程中成骨处细胞力学环境，Fr的取值范围为0.5～2Hz，Di为垂直于柔性基材的方向，a为0％，b的取值范围为5％～15％，Fr的取值范围是根据人日常行为时的成骨处组织受到的压力频率确定的，a和b是根据组织形变范围确定的，所以Fr、a和b的取值在此范围内能较好地模拟人成骨过程中成骨处细胞力学环境，循环动态载荷的施加时间的取值范围为1～2h；施加循环动态载荷结束后，施加静态载荷，静态载荷的方向为垂直于柔性基材的方向，柔性基材沿静态载荷方向的最大位移占柔性基材未受到静态载荷时的等效圆直径的百分比为0.5％，循环动态载荷的施加时间与静态载荷的施加时间之和为24h；
或者，所述体内细胞力学环境为人膀胱日常行为时膀胱内细胞力学环境(模拟过程即为加速模拟憋尿的过程)，Fr的取值范围为0.02～0.1Hz，Di为垂直于柔性基材的方向，a为0％，b的取值范围为0～10％，Fr的取值范围是根据人日常行为时的膀胱受到的压力频率确定的，表示逐渐充满的过程，a和b是根据膀胱形变范围确定的，其中b的上限10％是根据人憋尿(学名为强制性尿潴留)时膀胱形变确定的，所以Fr、a和b的取值在此范围内能较好地模拟人膀胱日常行为时膀胱内细胞力学环境；
或者，所述体内细胞力学环境为人膀胱日常行为时膀胱内细胞力学环境(模拟过程即为未加速的模拟人日常膀胱变化的过程，此过程不含憋尿且频率符合人的收缩扩张频率)，Di为垂直于柔性基材的方向，a为0.5％，b的取值范围为0.5～5.5％，Fr的取值范围是根据人日常行为时的膀胱受到的压力频率确定的，a和b是根据膀胱形变范围确定的，即从无尿到逐渐积累至需要排出，正常排出至无尿再至逐渐积累的循环过程，所以Fr、a和b的取值在此范围内能较好地模拟人膀胱日常行为时膀胱内细胞力学环境；施加循环动态载荷开始前、相邻两个循环周期之间以及施加循环动态载荷结束后，施加静态载荷，静态载荷的方向为垂直于柔性基材的方向，柔性基材沿静态载荷方向的最大位移占柔性基材未受到静态载荷时的等效圆直径的百分比为0.5％，循环周期的数量为4，施加循环动态载荷开始前静态载荷的施加时间为2～2.5h，相邻两个循环周期之间静态载荷的施加时间为2.5～3h，施加循环动态载荷结束后静态载荷的施加时间为8h，循环动态载荷的施加时间与静态载荷的施加时间之和为24h。
本发明还提供了采用如上所述的一种模拟体内动态环境的动态细胞培养方法的一种模拟体内动态环境的动态细胞培养装置，具体是模拟柔性基材在体内受到轴向机械刺激的体外动态细胞培养装置，包括细胞培养室、用于夹持柔性基材的夹持装置、用于对柔性基材施加载荷的压头以及用于带动压头沿垂直于柔性基材的方向作往复运动的对心式曲柄滑块机构，夹持装置和压头位于细胞培养室内(因为夹持装置需要夹持培养细胞的材料，压头需要与材料接触，而细胞培养环境需要在细胞培养室内进行，所以夹持装置和压头位于细胞培养室内)，本发明的保护范围不限于此，其他能够实现带动压头沿垂直于柔性基材的方向作往复运动的机构同样适用于本发明，相对而言，对心式曲柄滑块机构结构较为简单，因而本发明采用该机构。
作为优选的方案：
如上所述的一种模拟体内动态环境的动态细胞培养装置，对心式曲柄滑块机构主要由计算机、驱动电机、第一连接杆、圆盘、第二连接杆、滑块、压头杆、滑槽、齿条和正齿轮组成，压头杆为L形杆，由水平杆和竖直杆组成，竖直杆远离水平杆的一端与压头连接；
计算机用于控制驱动电机的工作频率，以控制压头位移，圆盘的一侧盘面与驱动电机的输出轴通过第一连接杆连接，另一侧盘面与第二连接杆通过销钉连接，第二连接杆与滑块连接，滑块安装在滑槽内，同时与水平杆通过T型块连接，正齿轮套在水平杆上且与齿条啮合，滑槽、齿条和竖直杆相互平行。
如上所述的一种模拟体内动态环境的动态细胞培养装置，驱动电机、第一连接杆和圆盘位于箱体内，可以减轻电机带动圆盘运动时对培养箱(培养箱即细胞培养箱，为细胞培养提供气体、温度和湿度环境，整个装置需要放在培养箱中，来为细胞培养提供合适环境，箱体指的是动态细胞培养装置的外壳，避免内部构造直接暴露在外，细胞培养室是施加动态培养的那个小仓，里面培养着细胞，细胞培养室在箱体的外部，箱体内是传动装置，细胞培养室和箱体都在培养箱里)内造成的气体环境的干扰，第二连接杆穿过箱体；滑槽设置在金属板上；压头底部设有压力传感器，压力传感器与计算机连接；箱体的材质为铁或钢，压头和压头杆的材质为聚乙烯或钢，第一连接杆和第二连接杆的材质为聚乙烯、有机玻璃或钢。
如上所述的一种模拟体内动态环境的动态细胞培养装置，细胞培养室顶部设有第一螺纹卡槽，可通过旋转从整体装置上取下进行操作，第一螺纹卡槽顶部设有密封圈，密封圈套在压头杆上，细胞培养室侧壁开有通风孔贯通内外，连接内外气体环境，细胞培养室的材质为聚乙烯或有机玻璃。由于压头杆经密封圈进入细胞培养室，可以减缓动态培养过程中压头杆运动导致的气流干扰，从而提供相对稳定的环境。
如上所述的一种模拟体内动态环境的动态细胞培养装置，夹持装置浸泡在培养基中，夹持装置由第二螺纹卡槽以及位于其下方的上下两个硅胶圆环组成。通过旋转第二螺纹卡槽可控制上下两个硅胶圆环的间距，进而夹持柔性基材。
如上所述的一种模拟体内动态环境的动态细胞培养装置，第一螺纹卡槽和第二螺纹卡槽的材质为聚乙烯、有机玻璃或钢。
采用如上所述的一种模拟体内动态环境的动态细胞培养装置进行动态细胞培养的步骤如下：
(1)将箱体和传动装置(圆盘、销钉、第二连接杆、金属板、正齿轮、滑槽、滑块、齿条、压头杆)连接后置于培养箱中；
(2)将细胞种植在柔性基材上，使细胞在柔性基材上生长，将柔性基材放入细胞培养室中夹紧；
(3)设置循环动态载荷的施加频率、形变率、时间等参数，进行动态培养，控制压头在竖直方向作往复运动，使柔性基材发生轴向应变，关闭培养箱箱门；
(4)动态培养可人为终止或至培养时间结束终止，打开细胞培养室进行细胞换液或将柔性基材取出进行后续观察，完成动态培养。
有益效果：
(1)本发明制备的培养装置可模拟腹壁等部位的力学环境，在动态条件下培养细胞，可在无菌环境下对材料施加循环应变，从而影响黏附在材料上的细胞行为，更加准确的模拟柔性植入物-细胞在体内的相互作用关系；
(2)本发明制备的培养装置，其组装简便，使用方便，通过更换加压夹头可对细胞培养室内的柔性基材施加不同作用面积的轴向应变；
(3)本发明制备的培养装置加压频率和位移可控，可满足多种材料要求；
(4)本发明制备的培养装置采用的材料均具有生物相容性和细胞相容性；
(5)本发明制备的培养装置在体外细胞培养领域具有广泛的应用前景；
(6)本发明制备的培养装置可通过简单的改装用于模拟多种体内动态环境。
(7)与静态培养相比，本发明的培养方法可在体外培养过程中模拟体内环境，使细胞在更加贴合体内环境的条件下进行培养，得到的数据更加贴近实际体内情况。
(8)与体内实验相比，本发明的培养方法能以更低的实验成本完成动态培养，极具推广价值。
附图说明
图1为模拟人肌腱和韧带运动时肌腱和韧带处细胞力学环境时的形变率-时间曲线图；
图2为模拟成人平躺或静止站立时腹壁内细胞力学环境时的形变率-时间曲线图；
图3为模拟人心肌运动时心肌处细胞力学环境时的形变率-时间曲线图；
图4为实施例6模拟人膀胱日常行为时膀胱内细胞力学环境时的形变率-时间曲线图；
图5为实施例7模拟人膀胱日常行为时膀胱内细胞力学环境时的形变率-时间曲线图；
图6为动态细胞培养装置的结构示意图；
其中，1-箱体，2-驱动电机，3-第一连接杆，4-圆盘，5-销钉，6-第二连接杆，7-金属板，8-正齿轮，9-滑槽，10-滑块，11-齿条，12-压头杆，13-密封圈，14-第一螺纹卡槽，15-通风孔，16-压头，17-压力传感器，18-细胞培养室，19-上硅胶圆环，20-下硅胶圆环，21-第二螺纹卡槽。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
一种模拟体内动态环境的动态细胞培养方法，在体外将细胞粘附在柔性基材上进行培养，并在培养过程中对柔性基材施加循环动态载荷，以模拟人肌腱和韧带运动时肌腱和韧带处细胞力学环境，实现模拟体内动态环境的动态细胞培养；
循环动态载荷的施加频率为Fr，Fr的取值范围为0.5～2Hz，施加方向为Di，Di为平行于柔性基材的方向；
各循环周期内载荷先随时间逐渐增大，至达到最大值时，再随时间逐渐减小；
如图1所示，柔性基材的形变率与载荷同步变化，先由a线性增大至b，再由b线性减小至a，a为0％，b的取值范围为4％～10％；
b＝b1/b0*100％，b1为柔性基材沿Di的最大位移，b0为柔性基材未受到循环动态载荷时的等效圆直径，等效圆为周长等于柔性基材边长的圆。
实施例2
一种模拟体内动态环境的动态细胞培养方法，在体外将细胞粘附在柔性基材上进行培养，并在培养过程中对柔性基材施加循环动态载荷，以模拟成人平躺或静止站立时腹壁内细胞力学环境，实现模拟体内动态环境的动态细胞培养；
循环动态载荷的施加频率为Fr，Fr的取值范围为0.1～0.5Hz，施加方向为Di，Di为垂直于柔性基材的方向；
各循环周期内载荷先随时间逐渐增大，至达到最大值时，再随时间逐渐减小；
如图2所示，柔性基材的形变率与载荷同步变化，先由a线性增大至b，再由b线性减小至a，a为0％，b的取值范围为5％～30％；
b＝b1/b0*100％，b1为柔性基材沿Di的最大位移，b0为柔性基材未受到循环动态载荷时的等效圆直径，等效圆为周长等于柔性基材边长的圆。
实施例3
一种模拟体内动态环境的动态细胞培养方法，在体外将细胞粘附在柔性基材上进行培养，并在培养过程中对柔性基材施加循环动态载荷，以模拟成人慢走或坐立时腹壁内细胞力学环境，实现模拟体内动态环境的动态细胞培养；
循环动态载荷的施加频率为Fr，Fr的取值范围为0.1～0.5Hz，施加方向为Di，Di为垂直于柔性基材的方向；
各循环周期内载荷先随时间逐渐增大，至达到最大值时，再随时间逐渐减小；
柔性基材的形变率与载荷同步变化，先由a线性增大至b，再由b线性减小至a，a为0％，b的取值范围为10％～30％；
b＝b1/b0*100％，b1为柔性基材沿Di的最大位移，b0为柔性基材未受到循环动态载荷时的等效圆直径，等效圆为周长等于柔性基材边长的圆。
实施例4
一种模拟体内动态环境的动态细胞培养方法，在体外将细胞粘附在柔性基材上进行培养，并在培养过程中对柔性基材施加循环动态载荷，以模拟人心肌运动时心肌处细胞力学环境，实现模拟体内动态环境的动态细胞培养；
循环动态载荷的施加频率为Fr，Fr的取值范围为0.1～0.5Hz，施加方向为Di，Di为垂直于柔性基材的方向；
各循环周期内载荷先随时间逐渐增大，至达到最大值时，再随时间逐渐减小；
如图3所示，柔性基材的形变率与载荷同步变化，先由a线性增大至b，再由b线性减小至a，a为0％，b的取值范围为10％～20％；
b＝b1/b0*100％，b1为柔性基材沿Di的最大位移，b0为柔性基材未受到循环动态载荷时的等效圆直径，等效圆为周长等于柔性基材边长的圆。
实施例5
一种模拟体内动态环境的动态细胞培养方法，在体外将细胞粘附在柔性基材上进行培养，并在培养过程中对柔性基材施加循环动态载荷，以模拟人成骨过程中成骨处细胞力学环境，实现模拟体内动态环境的动态细胞培养；
循环动态载荷的施加频率为Fr，Fr的取值范围为0.5～2Hz，施加方向为Di，Di为垂直于柔性基材的方向；
各循环周期内载荷先随时间逐渐增大，至达到最大值时，再随时间逐渐减小；
柔性基材的形变率与载荷同步变化，先由a线性增大至b，再由b线性减小至a，a为0％，b的取值范围为5％～15％；
b＝b1/b0*100％，b1为柔性基材沿Di的最大位移，b0为柔性基材未受到循环动态载荷时的等效圆直径，等效圆为周长等于柔性基材边长的圆；
循环动态载荷的施加时间的取值范围为1～2h；施加循环动态载荷结束后，施加静态载荷，静态载荷的方向为垂直于柔性基材的方向，柔性基材沿静态载荷方向的最大位移占柔性基材未受到静态载荷时的等效圆直径的百分比为0.5％，循环动态载荷的施加时间与静态载荷的施加时间之和为24h。
实施例6
一种模拟体内动态环境的动态细胞培养方法，在体外将细胞粘附在柔性基材上进行培养，并在培养过程中对柔性基材施加循环动态载荷，以模拟人膀胱日常行为时膀胱内细胞力学环境，实现模拟体内动态环境的动态细胞培养；
循环动态载荷的施加频率为Fr，Fr的取值范围为0.02～0.1Hz，施加方向为Di，Di为垂直于柔性基材的方向；
各循环周期内载荷先随时间逐渐增大，至达到最大值时，再随时间逐渐减小；
如图4所示，柔性基材的形变率与载荷同步变化，先由a线性增大至b，再由b线性减小至a，a为0％，b的取值范围为0～10％；
b＝b1/b0*100％，b1为柔性基材沿Di的最大位移，b0为柔性基材未受到循环动态载荷时的等效圆直径，等效圆为周长等于柔性基材边长的圆。
实施例7
一种模拟体内动态环境的动态细胞培养方法，在体外将细胞粘附在柔性基材上进行培养，并在培养过程中对柔性基材施加循环动态载荷，以模拟人膀胱日常行为时膀胱内细胞力学环境，实现模拟体内动态环境的动态细胞培养；
循环动态载荷的施加频率为Fr，施加方向为Di，Di为垂直于柔性基材的方向；
各循环周期内载荷先随时间逐渐增大，至达到最大值时，再随时间逐渐减小；
如图5所示，柔性基材的形变率与载荷同步变化，先由a线性增大至b，再由b线性减小至a，a为0.5％，b的取值范围为0.5～5.5％；
b＝b1/b0*100％，b1为柔性基材沿Di的最大位移，b0为柔性基材未受到循环动态载荷时的等效圆直径，等效圆为周长等于柔性基材边长的圆；
施加循环动态载荷开始前、相邻两个循环周期之间以及施加循环动态载荷结束后，施加静态载荷，静态载荷的方向为垂直于柔性基材的方向，柔性基材沿静态载荷方向的最大位移占柔性基材未受到静态载荷时的等效圆直径的百分比为0.5％，循环周期的数量为4，施加循环动态载荷开始前静态载荷的施加时间为2～2.5h，相邻两个循环周期之间静态载荷的施加时间为2.5～3h，施加循环动态载荷结束后静态载荷的施加时间为8h，循环动态载荷的施加时间与静态载荷的施加时间之和为24h。
实施例8
采用如实施例2～7任一项所述的一种模拟体内动态环境的动态细胞培养方法的一种模拟体内动态环境的动态细胞培养装置，如图6所示，包括细胞培养室18、用于夹持柔性基材的夹持装置、用于对柔性基材施加载荷的压头16以及用于带动压头16沿垂直于柔性基材的方向作往复运动的对心式曲柄滑块10机构，夹持装置和压头16位于细胞培养室18内；
对心式曲柄滑块10机构主要由计算机、驱动电机2、第一连接杆3、圆盘4、第二连接杆6、滑块10、压头杆12、滑槽9、齿条11和正齿轮8组成，压头杆12为L形杆，由水平杆和竖直杆组成，竖直杆远离水平杆的一端与压头16连接；
计算机用于控制驱动电机2的工作频率，以控制压头16位移，圆盘4的一侧盘面与驱动电机2的输出轴通过第一连接杆3连接，另一侧盘面与第二连接杆6通过销钉5连接，第二连接杆6与滑块10连接，滑块10安装在滑槽9内，同时与水平杆通过T型块连接，正齿轮8套在水平杆上且与齿条11啮合，滑槽9、齿条11和竖直杆相互平行；
驱动电机2、第一连接杆3和圆盘4位于箱体1内，可以减轻电机带动圆盘4运动时对培养箱内造成的气体环境的干扰，第二连接杆6穿过箱体1；滑槽9设置在金属板7上；压头16底部设有压力传感器17，压力传感器17与计算机连接；箱体1的材质为铁或钢，压头16和压头杆12的材质为聚乙烯或钢，第一连接杆3和第二连接杆6的材质为聚乙烯、有机玻璃或钢；
细胞培养室18顶部设有第一螺纹卡槽14，第一螺纹卡槽14顶部设有密封圈13，密封圈13套在压头杆12上，细胞培养室18侧壁开有通风孔15，细胞培养室18的材质为聚乙烯或有机玻璃；
夹持装置由第二螺纹卡槽21以及位于其下方的上硅胶圆环19和下硅胶圆环20组成；
第一螺纹卡槽14和第二螺纹卡槽21的材质为聚乙烯、有机玻璃或钢。
实施例9
采用实施例8的一种模拟体内动态环境的动态细胞培养装置进行动态细胞培养的步骤如下：
(1)对培养装置进行灭菌处理，将无菌箱体及连接于箱体内外的传动装置(圆盘、销钉、第二连接杆、金属板、正齿轮、滑槽、滑块、齿条、压头杆)置于培养箱中；
(2)将柔性基材-静电纺聚己内酯纤维膜材料裁剪至3×3cm2，在超净工作台中将人成纤维细胞接种到柔性基材上；
(3)将静电纺聚己内酯纤维膜材料置于显微镜下观察细胞是否生长在材料上，在超净工作台中将柔性基材置入培养装置的细胞培养室中，旋紧第二螺纹卡槽使柔性基材被夹紧在两个硅胶圆环间；
(4)将细胞培养室安装到箱体外的第一螺纹卡槽处并且旋紧，使用计算机设置动态培养时间为24小时，循环动态载荷的施加频率Fr为0.2Hz，a为0％，b为10％，设立对照组，即将相同大小的静电纺聚己内酯纤维膜材料在静态条件下培养24小时，关闭培养箱进行细胞培养；
(5)24小时后将细胞培养室取下，将细胞培养室放入超净工作台中，旋松第二螺纹卡槽，取出柔性基材；
(6)将柔性基材进行处理，使用扫描电子显微镜观察材料上的细胞形态，使用CCK8对细胞进行处理测量细胞增殖率，使用鬼笔环肽对细胞进行染色观察肌动蛋白应力纤维的分布情况，使用试剂盒测量胶原产量。
经过以上步骤对生长在静电纺聚己内酯纤维膜材料上的细胞进行动态培养后，实验结果表明静态培养使成纤维细胞排列规律，动态培养使成纤维细胞生长更加无序，并使肌动蛋白应力纤维无序排列。动态培养的成纤维细胞的增殖率比静态培养的细胞增加了33％，且胶原产量增加了150％。
实施例10
采用实施例8的一种模拟体内动态环境的动态细胞培养装置进行动态细胞培养的步骤如下：
(1)对培养装置进行灭菌处理，将无菌箱体及连接于箱体内外的传动装置(圆盘、销钉、第二连接杆、金属板、正齿轮、滑槽、滑块、齿条、压头杆)置于培养箱中；
(2)将柔性基材-静电纺聚己内酯纤维膜材料裁剪至3×3cm2，在超净工作台中将人成纤维细胞接种到柔性基材上；
(3)将静电纺聚己内酯纤维膜材料置于显微镜下观察细胞是否生长在材料上，在超净工作台中将柔性基材置入培养装置的细胞培养室中，旋紧第二螺纹卡槽使柔性基材被夹紧在两个硅胶圆环间；
(4)将细胞培养室安装到箱体外的第一螺纹卡槽处并且旋紧，使用计算机设置动态培养时间为24小时，循环动态载荷的施加频率Fr为0.2Hz，a为0％，b为5％、10％、20％，关闭培养箱进行细胞培养；
(5)24小时后将细胞培养室取下，将细胞培养室放入超净工作台中，旋松第二螺纹卡槽，取出柔性基材；
(6)将柔性基材进行处理，使用扫描电子显微镜观察材料上的细胞形态，使用CCK8对细胞进行处理测量细胞增殖率，使用鬼笔环肽对细胞进行染色观察肌动蛋白应力纤维的分布情况，使用试剂盒测量胶原产量。
经过以上步骤对生长在静电纺聚己内酯纤维膜材料上的细胞进行动态培养后，实验结果表明随着动态培养压强增加，成纤维细胞生长无序程度增加，肌动蛋白应力纤维无序排列程度增加。b为20％的细胞增殖率比b为5％的细胞增殖率低30％，说明压强过大会抑制细胞增殖，b为20％的成纤维细胞的胶原产量比b为5％的细胞胶原产量低41％，说明压强过大会抑制细胞的胶原产量。
实施例11
采用实施例8的一种模拟体内动态环境的动态细胞培养装置进行动态细胞培养的步骤如下：
(1)对培养装置进行灭菌处理，将无菌箱体及连接于箱体内外的传动装置(圆盘、销钉、第二连接杆、金属板、正齿轮、滑槽、滑块、齿条、压头杆)置于培养箱中；
(2)将柔性基材-热牵伸成型的膨体聚四氟乙烯膜材料裁剪至3×3cm2，在超净工作台中将人软骨细胞接种到柔性基材上；
(3)将聚四氟乙烯材料置于显微镜下观察细胞是否生长在材料上，在超净工作台中将柔性基材置入培养装置的细胞培养室中，旋紧第二螺纹卡槽使柔性基材被夹紧在两个硅胶圆环间；
(4)将细胞培养室安装到箱体外的第一螺纹卡槽处并且旋紧，使用计算机设置动态培养时间为24小时，循环动态载荷的施加频率Fr为1Hz，a为0％，b为20％，设立对照组，即将相同大小的聚四氟乙烯材料在静态条件下培养24小时，关闭培养箱进行细胞培养；
(5)24小时后暂停动态培养，将细胞培养室取下，将细胞培养室放入超净工作台中，旋松第二螺纹卡槽，取出柔性基材，将细胞培养室内培养基吸出进行换液，换液后将材料重新放入细胞培养室中，旋紧第二螺纹卡槽使柔性基材被夹紧在两个硅胶圆环间；
(6)将细胞培养室安装到箱体外的接口处并且旋紧，使用计算机设置相同动态培养时间、循环动态载荷的施加频率Fr、a和b，开始进行循环加压，关闭培养箱继续培养24小时；
(7)动态培养结束后，将细胞培养室取下，将细胞培养室放入超净工作台中，旋松第二螺纹卡槽，取出柔性基材；
(8)将柔性基材进行处理，使用扫描电子显微镜观察材料上的细胞形态，使用CCK8对细胞进行处理测量细胞增殖率，使用试剂盒测量胶原产量。
经过以上步骤对生长在热牵伸成型的膨体聚四氟乙烯膜材料上的细胞进行动态培养后，实验结果表明静态培养使软骨纤维细胞排列规律。动态培养的软骨细胞的增殖率比静态培养的细胞增加了23％，且胶原产量增加了140％。
实施例12
采用实施例8的一种模拟体内动态环境的动态细胞培养装置进行动态细胞培养的步骤如下：
(1)对培养装置进行灭菌处理，将无菌箱体及连接于箱体内外的传动装置(圆盘、销钉、第二连接杆、金属板、正齿轮、滑槽、滑块、齿条、压头杆)置于培养箱中；
(2)将柔性基材-热牵伸成型的膨体聚四氟乙烯膜材料裁剪至3×3cm2，在超净工作台中将人软骨细胞接种到柔性基材上；
(3)将聚四氟乙烯材料置于显微镜下观察细胞是否生长在材料上，在超净工作台中将柔性基材置入培养装置的细胞培养室中，旋紧第二螺纹卡槽使柔性基材被夹紧在两个硅胶圆环间；
(4)将细胞培养室安装到箱体外的第一螺纹卡槽处并且旋紧，使用计算机设置动态培养时间为24小时，循环动态载荷的施加频率Fr为1Hz，a为0％，b为5％、10％、20％，关闭培养箱进行细胞培养；
(5)24小时后暂停动态培养，将细胞培养室取下，将细胞培养室放入超净工作台中，旋松第二螺纹卡槽，取出柔性基材，将细胞培养室内培养基吸出进行换液，换液后将材料重新放入细胞培养室中，旋紧第二螺纹卡槽使柔性基材被夹紧在两个硅胶圆环间；
(6)将细胞培养室安装到箱体外的接口处并且旋紧，使用计算机设置相同动态培养时间、循环动态载荷的施加频率Fr、a和b，开始进行循环加压，关闭培养箱继续培养24小时；
(7)动态培养结束后，将细胞培养室取下，将细胞培养室放入超净工作台中，旋松第二螺纹卡槽，取出柔性基材；
(8)将柔性基材进行处理，使用扫描电子显微镜观察材料上的细胞形态，使用CCK8对细胞进行处理测量细胞增殖率，使用试剂盒测量胶原产量。
经过以上步骤对生长在热牵伸成型的膨体聚四氟乙烯膜材料上的细胞进行动态培养后，实验结果表明随着动态培养压强增加，人软骨细胞生长无序程度增加。b为20％的细胞增殖率比b为5％的细胞增殖率低28％，说明压强过大会抑制细胞增殖，b为20％的人软骨细胞的胶原产量比b为5％的细胞胶原产量低60％，说明压强过大会抑制细胞的胶原产量。

Claims (9)

1.一种模拟体内动态环境的动态细胞培养方法，其特征是：在体外将细胞粘附在柔性基材上进行培养，并在培养过程中对柔性基材施加循环动态载荷，以模拟体内细胞力学环境，实现模拟体内动态环境的动态细胞培养；
循环动态载荷的施加频率为Fr，施加方向为Di；
各循环周期内载荷先随时间逐渐增大，至达到最大值时，再随时间逐渐减小；
柔性基材的形变率与载荷同步变化，先由a线性增大至b，再由b线性减小至a；
b＝b1/b0*100％，b1为柔性基材沿Di的最大位移，b0为柔性基材未受到循环动态载荷时的等效圆直径，等效圆为周长等于柔性基材边长的圆。
2.根据权利要求1所述的一种模拟体内动态环境的动态细胞培养方法，其特征在于，所述体内细胞力学环境为人肌腱和韧带运动时肌腱和韧带处细胞力学环境，Fr的取值范围为0.5～2Hz，Di为平行于柔性基材的方向，a为0％，b的取值范围为4％～10％。
3.根据权利要求1所述的一种模拟体内动态环境的动态细胞培养方法，其特征在于，所述体内细胞力学环境为成人日常行为时腹壁内细胞力学环境，Fr的取值范围为0.1～0.5Hz，Di为垂直于柔性基材的方向，a为0％；
当所述成人日常行为为平躺或静止站立时，b的取值范围为5％～30％；当所述成人日常行为为慢走或坐立时，b的取值范围为10％～30％；
或者，所述体内细胞力学环境为人心肌运动时心肌处细胞力学环境，Fr的取值范围为0.1～0.5Hz，Di为垂直于柔性基材的方向，a为0％，b的取值范围为10％～20％；
或者，所述体内细胞力学环境为人成骨过程中成骨处细胞力学环境，Fr的取值范围为0.5～2Hz，Di为垂直于柔性基材的方向，a为0％，b的取值范围为5％～15％，循环动态载荷的施加时间的取值范围为1～2h；施加循环动态载荷结束后，施加静态载荷，静态载荷的方向为垂直于柔性基材的方向，柔性基材沿静态载荷方向的最大位移占柔性基材未受到静态载荷时的等效圆直径的百分比为0.5％，循环动态载荷的施加时间与静态载荷的施加时间之和为24h；
或者，所述体内细胞力学环境为人膀胱日常行为时膀胱内细胞力学环境，Fr的取值范围为0.02～0.1Hz，Di为垂直于柔性基材的方向，a为0％，b的取值范围为0～10％；
或者，所述体内细胞力学环境为人膀胱日常行为时膀胱内细胞力学环境，Di为垂直于柔性基材的方向，a为0.5％，b的取值范围为0.5～5.5％；施加循环动态载荷开始前、相邻两个循环周期之间以及施加循环动态载荷结束后，施加静态载荷，静态载荷的方向为垂直于柔性基材的方向，柔性基材沿静态载荷方向的最大位移占柔性基材未受到静态载荷时的等效圆直径的百分比为0.5％，循环周期的数量为4，施加循环动态载荷开始前静态载荷的施加时间为2～2.5h，相邻两个循环周期之间静态载荷的施加时间为2.5～3h，施加循环动态载荷结束后静态载荷的施加时间为8h，循环动态载荷的施加时间与静态载荷的施加时间之和为24h。
4.采用如权利要求3所述的一种模拟体内动态环境的动态细胞培养方法的一种模拟体内动态环境的动态细胞培养装置，其特征是：包括细胞培养室、用于夹持柔性基材的夹持装置、用于对柔性基材施加载荷的压头以及用于带动压头沿垂直于柔性基材的方向作往复运动的对心式曲柄滑块机构，夹持装置和压头位于细胞培养室内。
5.根据权利要求4所述的一种模拟体内动态环境的动态细胞培养装置，其特征在于，对心式曲柄滑块机构主要由计算机、驱动电机、第一连接杆、圆盘、第二连接杆、滑块、压头杆、滑槽、齿条和正齿轮组成，压头杆为L形杆，由水平杆和竖直杆组成，竖直杆远离水平杆的一端与压头连接；
计算机用于控制驱动电机的工作频率，圆盘的一侧盘面与驱动电机的输出轴通过第一连接杆连接，另一侧盘面与第二连接杆通过销钉连接，第二连接杆与滑块连接，滑块安装在滑槽内，同时与水平杆通过T型块连接，正齿轮套在水平杆上且与齿条啮合，滑槽、齿条和竖直杆相互平行。
6.根据权利要求5所述的一种模拟体内动态环境的动态细胞培养装置，其特征在于，驱动电机、第一连接杆和圆盘位于箱体内，第二连接杆穿过箱体；滑槽设置在金属板上；压头底部设有压力传感器，压力传感器与计算机连接；箱体的材质为铁或钢，压头和压头杆的材质为聚乙烯或钢，第一连接杆和第二连接杆的材质为聚乙烯、有机玻璃或钢。
7.根据权利要求6所述的一种模拟体内动态环境的动态细胞培养装置，其特征在于，细胞培养室顶部设有第一螺纹卡槽，第一螺纹卡槽顶部设有密封圈，密封圈套在压头杆上，细胞培养室侧壁开有通风孔，细胞培养室的材质为聚乙烯或有机玻璃。
8.根据权利要求7所述的一种模拟体内动态环境的动态细胞培养装置，其特征在于，夹持装置由第二螺纹卡槽以及位于其下方的上下两个硅胶圆环组成。
9.根据权利要求8所述的一种模拟体内动态环境的动态细胞培养装置，其特征在于，第一螺纹卡槽和第二螺纹卡槽的材质为聚乙烯、有机玻璃或钢。
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