CN110574929B - 益生菌株和用于婴儿食品的包含该益生菌株的共生组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及益生菌株和用于婴儿食品的包含该益生菌株的共生组合物。本发明涉及属于双歧杆菌属的益生菌株的筛选以及用于喂养婴儿的包含所述益生菌株的共生组合物。

Description

益生菌株和用于婴儿食品的包含该益生菌株的共生组合物
本申请是国际申请日2012年5月9日、申请号为201280022854.9(国际申请号PCT/IB2012/000897)的专利申请“益生菌株和用于婴儿食品的包含该益生菌株的共生组合物”的分案申请。
技术领域
本发明涉及属于双歧杆菌(Bifidobacterium)属的益生菌株的筛选以及用于婴儿食品的包含该益生菌株的共生组合物。
背景技术
人造食物喂养的婴儿与母乳喂养的婴儿相比在肠道菌群的组成上显示出相当大的差异：特别是可观察到在以消灭其它潜在的病原微生物如大肠杆菌(Escherichia coli)和梭菌属物种(Clostridium spp)的情况下使双歧杆菌浓度的降低。属于双歧杆菌属的微生物集群产生于出生后前4天的母乳喂养的婴儿中，并且双歧杆菌很快成为遍在的微生物群。另一方面，在配方喂养(formula feeding)下，由大肠菌群(coliforms)、拟杆菌(bacteroides)、梭菌(clostridia)和链球菌(streptococci)组成的更多样化的菌群得以发展。正是由于这些原因，配方喂养的婴儿具有较高的产生肠道感染的危险。
另外，肠道气体的过量产生似乎是所谓的“绞痛”的原因，这使众多出生一个月的婴儿受到折磨。
因此，切身需要能够使婴儿获得生理上的通过喂养母乳获得的益菌效应(bifidogenic effect)。特别地，期望能够确保配方喂养婴儿的肠道菌群以避免绞痛。
发明内容
本申请人在大量研究后提供了解决上述需要的答案，最终鉴定出属于双歧杆菌属的菌株的筛选。
本发明的主题涉及属于双歧杆菌属并具有所附独立权利要求所公开的特征的菌株。
本发明的主题还涉及如所述独立权利要求中所公开的包含所述菌株的食品组合物或补充剂产品或药物组合物。所述组合物具有用于治疗绞痛、腹泻和肠紊乱的用途的有效应用，特别是小儿年龄的受试者。
将以随后的详细说明来阐明本发明的优选实施方案。
由申请人筛选的菌株具有益生菌特征，并在遵循特定指南(FAO/WHO,2002)下可给予婴儿，所述特定指南要求：对拮抗菌的抗菌活性、菌株的无毒性和无病原性、其准确的分类学鉴定、对肠道表皮的粘附、对胃肠道(胃液和胆汁)的耐性、遗传稳定性(特别是抗生素抗性的传递性)、和用于工业加工时合适的感官和工艺性能的评价。同样特别重要的是研究益生菌对人细胞的细胞毒性以及验证它们粘附至肠粘膜的能力和本身阻碍病原体粘附肠细胞的能力。
申请人仅在实验证实了上述说明后筛选本发明的菌株。
由本申请人筛选的菌株属于双歧杆菌属并具有抗大肠杆菌的抗菌活性。
此外，所述菌株另外具有抗肠炎沙门氏菌(Salmonella enteriditis)、艰难梭菌(Clostridium difficile)和空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejunii)的抗菌活性。
所筛选的菌株属于短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)和长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)或长双歧杆菌长亚种(Bifidobacterium longumsubsp.longum)的种。
由申请人筛选的菌株为：
(i)短双歧杆菌B632，由诺瓦腊(意大利)的益生菌股份公司通过保藏机构DSMZ于2011年4月7日保藏并具有保藏号DSM 24706。
(ii)短双歧杆菌B2274，由诺瓦腊(意大利)的益生菌股份公司通过保藏机构DSMZ于2011年4月7日保藏并具有保藏号DSM 24707。
(iii)短双歧杆菌B7840，由诺瓦腊(意大利)的益生菌股份公司通过保藏机构DSMZ于2011年4月7日保藏并具有保藏号DSM 24708。
(iv)长双歧杆菌长亚种B1975，由诺瓦腊(意大利)的益生菌股份公司通过保藏机构DSMZ于2011年4月7日保藏并具有保藏号DSM 24709。
所有上述菌株均可在由布达佩斯条约规定的条件下由公众可得和获取。
本发明的食品组合物或补充剂产品或药物组合物包括细菌混合物，其用于治疗绞痛、腹泻和肠道紊乱的用途，优选小儿年龄的受试者，所述细菌混合物反过来包括至少一种上述菌株。
在一个实施方案中，细菌混合物包括或者可选择地由菌株(i)或(ii)或(iii)或(iv)组成。
在一个实施方案中，细菌混合物包括或者可选择地由菌株(i)和(ii)组成。
在一个实施方案中，细菌混合物包括或者可选择地由(i)和(iii)组成。
在一个实施方案中，细菌混合物包括或者可选择地由(i)和(iv)组成。
在一个实施方案中，细菌混合物包括或者可选择地由(ii)和(iii)组成。
在一个实施方案中，细菌混合物包括或者可选择地由(ii)和(iv)组成。
在一个实施方案中，细菌混合物包括或者可选择地由(iii)和(iv)组成。
在一个实施方案中，细菌混合物包括或者可选择地由(i)和(ii)和(iii)组成。
在一个实施方案中，细菌混合物包括或者可选择地由(i)和(ii)和(iv)组成。
在一个实施方案中，细菌混合物包括或者可选择地由(ii)和(iii)和(iv)组成。
在一个实施方案中，细菌混合物包括或者可选择地由(i)和(iii)和(iv)组成。
在一个实施方案中，细菌混合物包括或者可选择地由(i)和(ii)和(iii)和(iv)组成。
此外，本发明的主题涉及包括至少一种上述益生菌株与至少一种益生元纤维组合的共生组合物。所述组合能够有利地选择性增加要获得的现有的有益菌，因而诱导宿主有利的局部和协同效应。该共生组合物用于婴儿。
特别地，选自包括低聚半乳糖(GOS)、低聚果糖(FOS)和菊粉的组的几种“非消化性寡糖”作为本发明上下文中的纤维具有有效应用。
优选的实施方案涉及包括喂养婴儿用配方、至少一种本发明的菌株和至少一种选自上述提及的那些中的益生元纤维的组合物。有利地，所述组合物能够为婴儿提供显著的与人乳非常类似的“益菌”效应。
本发明的主题涉及属于短双歧杆菌、长双歧杆菌或长双歧杆菌长亚种的种并对病原体大肠杆菌、肠炎沙门氏菌、艰难梭菌和空肠弯曲杆菌具有抗菌活性的菌株。病原体大肠杆菌包括生物型大肠杆菌O157:H7。属于短双歧杆菌的种的菌株选自包括以下菌株的组或者可选择地由以下菌株组成的组：短双歧杆菌B632，其由诺瓦腊(意大利)的益生菌股份公司通过保藏机构DSMZ于2011年4月7日保藏并具有保藏号DSM 24706；短双歧杆菌B2274，其由诺瓦腊(意大利)的益生菌股份公司通过保藏机构DSMZ于2011年4月7日保藏并具有保藏号DSM 24707；短双歧杆菌B7840，其由诺瓦腊(意大利)的益生菌股份公司通过保藏机构DSMZ于2011年4月7日保藏并具有保藏号DSM 24708，和短双歧杆菌BR03，其由诺瓦腊(意大利)的益生菌股份公司通过保藏机构DSMZ保藏并具有保藏号DSM 16604；优选地，所述菌株为短双歧杆菌BR03，其由诺瓦腊(意大利)的益生菌股份公司通过保藏机构DSMZ保藏并具有保藏号DSM 16604。属于长双歧杆菌的种的菌株为长双歧杆菌长亚种B1975，由诺瓦腊(意大利)的益生菌股份公司通过保藏机构DSMZ于2011年4月7日保藏并具有保藏号DSM 24709。
本发明的主题涉及与短双歧杆菌BR03组合的菌株短双歧杆菌B632，所述短双歧杆菌B632由诺瓦腊(意大利)的益生菌股份公司通过保藏机构DSMZ于2011年4月7日保藏并具有保藏号DSM 24706，所述短双歧杆菌BR03由诺瓦腊(意大利)的益生菌股份公司通过保藏机构DSMZ保藏并具有保藏号DSM16604。
本发明的主题涉及与植物乳杆菌LP01组合的菌株短双歧杆菌BR03，所述短双歧杆菌BR03由诺瓦腊(意大利)的益生菌股份公司通过保藏机构DSMZ保藏并具有保藏号DSM16604，所述植物乳杆菌LP01由诺瓦腊(意大利)的莫菲因有限公司(Mofin Srl)通过保藏机构BCCM-LMG于2001年10月16日保藏并具有保藏号LMG P-21021。有利地，如下述实验部分所示的菌株植物乳杆菌LP01显示大的对病原菌株的抑制活性(图1-5)。
本发明涉及包括细菌混合物的食品组合物或补充剂产品或医疗设备或药物组合物，所述细菌混合物包括或者可选择地由如上所述的属于短双歧杆菌、长双歧杆菌或长双歧杆菌长亚种的种的至少一种菌株组成，用于治疗绞痛、腹泻和肠紊乱的用途，优选小儿年龄的受试者。所述细菌混合物包括以下或者可选择地由以下组成：与短双歧杆菌BR03组合的菌株短双歧杆菌B632，或可选地与植物乳杆菌LP01组合的短双歧杆菌BR03。所述食品组合物或补充剂产品或医疗设备或药物组合物包括如上所述的细菌混合物，其中所述细菌混合物添加或悬浮或分散于选自橄榄油、玉米油、葵花油、种子油和棕榈油的植物油中。所述植物油优选为玉米油。
所述食品组合物或补充剂产品或医疗设备或药物组合物可为油性悬浮剂或颗粒剂、粉末剂、胶囊剂、片剂和袋剂(sachet)形式。
本发明的主题涉及作为共生组合物的食品组合物或补充剂产品或医疗设备或药物组合物。所述共生组合物包括至少一种植物物质，所述至少一种植物物质选自包括以下物质或者可选择地由以下物质组成的组：甾醇类或植物甾醇类，甾烷醇(stanol)类或植物甾烷醇类，葡甘露聚糖，魔芋胶，和/或选自包括低聚果糖-FOS、低聚半乳糖-GOS、低聚木糖-XOS、菊粉、落叶松纤维(larch fibre)或***半乳聚糖的至少一种益生元纤维，和/或发酵红米，和/或来自燕麦、燕麦麸、大麦、大麦麸的β葡聚糖，和/或冻干形式的木立芦荟(aloearborescens)凝胶。在一个实施方案中，所述共生组合物包括西甲硅油(simethicone)。在另一实施方案中，所述共生组合物包括至少一种选自包括低聚半乳糖(GOS)、低聚果糖(FOS)和菊粉的组的植物物质。
具体实施方式
实验部分
1.双歧杆菌的筛选
研究46株双歧杆菌属菌株；它们普遍分离自婴儿***物并属于5个不同的种(两歧双歧杆菌(B.bifidum)、短双歧杆菌(B.breve)、长双歧杆菌婴儿亚种(B.longumsubsp.infantis)、长双歧杆菌长亚种(B.longum subsp.longum)、青春双歧杆菌(B.adolescentis)和假链状双歧杆菌(B.pseudocatenulatum))。所考虑的微生物为存在于DiSTA的BUSCoB保藏中心(博洛尼亚大学斯卡尔多维双歧杆菌保藏中心(BolognaUniversity Scardovi Collection of Bifidobacteria)，博洛尼亚大学，意大利)的部分。
2.目标病原微生物的筛选
考虑大肠杆菌的各种菌株：1株来自于保藏中心的大肠杆菌菌株(ATCC11105)、1株分离自***时的***物的大肠杆菌菌株(菌株M85)(已在以前的研究中证实为良好的目标微生物)、和两株分离自受绞痛影响的婴儿的大肠杆菌(菌株GC6a和GC23a)。大肠杆菌为儿童急性腹泻的主要病原体菌。此外，对为造成意大利儿童细菌源腹泻的主要微生物的肠炎沙门氏菌(Infante Pina等,2008)的菌株；为儿童急性腹泻的主要病原体菌的艰难梭菌(Infante Pina等,2008)的菌株；和同样为儿童急性腹泻成因的空肠弯曲杆菌(InfantePina等,2008)的菌株进行检查。
3.所选微生物的抗菌活性的研究
分析所有46种微生物抑制大肠杆菌ATCC 11105TM、M85、GC 6a、GC23a和肠炎沙门氏菌(S.enteriditis)M94的生长的能力。使用“斑点琼脂试验(spot agar test)”根据此处简要总结的方案进行抗菌活性的初步筛选。
斑点琼脂试验：使用过夜(o.n.)培养的双歧杆菌的各菌株，对应于全对数生长期的600nm的吸光度(A600)为约0.7-1。使用TPY-琼脂板；将板分成4份，每四分之一份接种10ηl过夜培养的各菌株。在37℃下厌氧培养板24h。一旦生长发生，将表面用7-8ml的大肠杆菌用软琼脂培养基层(NB+0.7％琼脂)覆盖，接种100ηl过夜培养的标记菌株。在允许标记菌株生长的条件下培养板。培养24-48小时后，根据所用标记菌株，可观察双歧杆菌各菌株接种体周围的抑菌圈。用尺测量该抑菌圈。重复试验至少两次。所得结果-两次实验的平均值-示于表1。表1示出仅由46株试验株中的16株的5种标记菌株产生的抑菌圈。
表1
Figure BDA0002186591690000071
如从表1检查中可注意到的，该研究揭示了存在特别针对分离自绞痛婴儿的两株大肠杆菌和肠炎沙门氏菌具有良好拮抗活性的菌株。仅筛选整体上显示较大尺寸抑菌圈的菌株。
然后评估16株筛选菌株对艰难梭菌M216和空肠弯曲杆菌LMG8841的拮抗活性。所得结果-两次实验的平均值-示于表2。
表2.16株筛选的双歧杆菌属菌株的由艰难梭菌M216和空肠弯曲杆菌LMG8841产生的抑菌圈尺寸(cm)。
菌株 空肠弯曲杆菌(C.jejuni)LMG8841 艰难梭菌(C.difficile)M216
B2091 0.8 0.4
B2274 1 0.5
B2021 1 0.4
B 632 0.8 0.5
B2150 0.8 0.4
B2195 1.2 0.5
B1412 1.1 0.5
Re 12 1.1 0.4
B2101 0.8 0
B1975 0.8 0.5
B8452 0.8 0.4
B2192 1 0.4
B2055 1 0.3
B7958 1.1 0.4
B7947 0.3 0.3
B7840 1.4 0.3
所得结果揭示出对空肠弯曲杆菌LMG8846的高抑制活性和较弱的-尽管明显存在于大多数菌株中-对艰难菌株M216活性。
然后对由16株筛选的微生物过夜培养所得的上清液对两株分离自受绞痛影响的婴儿的菌株和对肠炎沙门氏菌的抗菌力进行评估。具有包含于5.5-6.2之间的pH的上清液在进行试验前调为pH6.5。使用此处简要说明的两种方法进行试验：“孔扩散法”和“空盘试验法”。
孔扩散法：使用过夜培养的各双歧杆菌属菌株，其对应于全对数生长期且A600为约0.7-1。在10000rpm下对培养物离心10分钟；14000rpm下再离心上清液15分钟并立即再离心。然后用NaOH 1N调整pH为6.5。接种有500ηL 106CFU/ml的大肠杆菌悬浮液(或所使用的任何其它标记菌株)的软琼脂层涂布在平板上。琼脂凝固后，用无菌巴斯德移液管制孔，并将50-80ηl的双歧杆菌属菌株的中性上清液接种至孔内。在允许标记菌株(37℃好氧大肠杆菌)生长的条件下于37℃过夜培养平板。
空盘法：如上进行双歧杆菌属培养物的离心和上清液的中和。在大肠杆菌的情况下使用营养琼脂(NA)板，或者如果使用其他菌株则使用其他培养基。从具有106CFU/ml的细胞浓度的悬浮液开始将标记菌株接种至表面。将直径1cm的盘(预先灭菌)用0.1ml上清液(为中性和非中性的)浸透并静止于板上。在适合于标记菌株生长的条件下培养板。
由斑点琼脂试验所揭示的所述微生物对标记微生物的抑制效果似乎主要是因为酸性代谢产物的产生，但不仅限于此，所产生的酸性代谢产物通过降低周围环境的pH，导致病原体的抑制。然而，细菌素的产生似乎也是可能的。
然而，为了更好地表征用于本研究的微生物上清液的抗菌活性，在已知量的各双歧杆菌属菌株上清液的存在下对某些标记菌株(大肠杆菌ATCC11105TM、肠炎沙门氏菌M94、大肠杆菌GC 6a和大肠杆菌GC 23a)的生长动力学进行评估。将标记菌株接种至无添加(这表示对照)和在已知量的源自双歧杆菌属菌株的过夜培养物的上清液的存在下的NB(营养肉汤)培养基中。使用原本的以及三种不同浓度中和后的上清液：12.5％(v/v)、25％(v/v)和50％(v/v)。在限定的时间间隔下测定标记菌株的A620，来说明微生物的生长。首次试验后除去最高浓度的上清液，因为其完全阻碍了标记微生物的生长。
所得数据证实上述结论。
4.筛选的双歧杆菌对不同抗生素的敏感性或抗性的测定以及最低抑菌浓度(MIC)的测定
抗生素敏感性或抗性试验为评价微生物用于体外试验中的可能性的基础研究之一。对于微生物重要的是，尽可能对用于治疗的主要抗生素敏感，以便避免将抗生素抗性传递给其它肠道微生物的风险；另一方面，益生菌通常与抗生素治疗联合给药，因此抗生素抗性成为共给药的基本要求(Ouba等人，2008)。在该研究中，考虑10种常规用于评价益生菌株的抗生素抗性的抗生素(氨苄青霉素、氯霉素、红霉素、四环素、万古霉素、卡那霉素、链霉素、甲氧苄氨嘧啶(trimethoprim)、头孢呋辛和庆大霉素)；它们以2-1024μg/ml的浓度区间试验。此外，测定另外三种常规用于新生儿治疗的抗生素(阿莫西林、头孢曲松和克拉霉素)的MIC(以相同浓度进行试验)。通过在增加的抗生素浓度的存在下分析筛选的双歧杆菌的生长来评价MIC；通过测定A620来评价生长。使用欧洲委员会(EU委员会,2002)和欧洲食品***(EFSA,2005)出版的指南评价对抗生素的抗性或敏感性。
所得结果表明，筛选的菌株显示对氨苄青霉素、卡那霉素和阿莫西林的抗性，然而总的来说，许多试验菌株显示对所考虑的其它抗生素的敏感性。
所得结果使得能够筛选4种本发明所涉及的双歧杆菌属的菌株，这是因为它们展现了对大肠杆菌不同菌株(在患绞痛的婴儿中浓度高于不患绞痛的婴儿的产气菌)的抗菌活性。此外，所述菌株显示对婴儿细菌源腹泻最常见起因的细菌(肠炎沙门氏菌、艰难梭菌和空肠弯曲杆菌)的令人关注的抗菌活性，以及仅对有限量的抗生素的抗性。甚至在双歧杆菌染色体DNA经PCR鉴定基因的情况下，4种筛选的菌株均未表明能够将抗生素抗性基因转移至双歧杆菌或乳酸杆菌。
5.平板抑制试验方法具有抑制作用的细菌
a.将意欲证实对***物细菌的抑制活性的细菌在MRS肉汤培养基(含15ml的试管)中进行至少两次连续移植。
i.如果细菌属于双歧杆菌属，则用1％半胱氨酸盐酸盐(5％溶液)增补MRS肉汤。
b.离心新鲜的肉汤培养基(培养22+/-2小时)并在无菌水中洗涤细胞一次。
c.然后将细胞离心并悬浮在5ml新鲜的MRS肉汤培养基中。
2.敏感性***物细菌
a.待进行抑制的细菌在MacConkey肉汤培养基(含10ml的试管)中进行至少两次连续移植。
b.用水稀释新鲜肉汤培养基，从而获得600nm波长下的0.600-0.700的光密度。
c.使用适合的无菌压舌板(sterile spatula)将100ml该细菌悬浮液涂布在MacConkey琼脂板上并均匀分布在整个表面直至液体完全吸收。
3.将11mm直径的纸盘(抗菌谱盘)置于平板的表面上，使其吸收100ml待试验菌株的细菌悬浮液(参见步骤1-c)。
4.于37℃恒温器中培养平板24小时。
结果：如果细菌受到抑制，则在盘的周围可见表示无生长的圈。圈的尺寸与菌株产生的遍布琼脂的具有抑菌/杀菌作用的物质的能力成比例。
6.平板抑制试验
对于各可能的抑制性益生菌，制备培养物并在MRS肉汤中培养24小时。然后洗涤细胞并在新鲜的MRS肉汤培养基中重悬。将病原菌的新鲜肉汤培养物以1/10倍稀释的每平板100l的量均匀涂布在包含琼脂化培养基(特别针对意欲抑制的病原物种)的平板表面。将由此处理的细胞以每盘100l的量吸附至纸盘上。37℃下培养24小时后，测定由盘边缘与试验病原菌的生长边缘之间延伸的区域表示的抑菌圈。
6种益生菌对5种病原体的抑制活性试验列示如下。结果记录为以毫米表示的抑菌圈。
6.1单核细胞增多性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)ATCC 19112，结果示于图1。
图1示出：
益生菌菌株mm：
1.罗伊氏乳杆菌(L.reuteri)DLLRE08,DSM 25684 0mm
2.罗伊氏乳杆菌ID 1774LRE 02,DSM 23878 0mm
3.罗伊氏乳杆菌DSM 17938(阳性参考(Positive ref.))0mm
4.植物乳杆菌(L.plantarum)LP01 LMG P-21021 5mm
5.德式乳杆菌保加利亚亚种(L.delbr.susp.bulgaricus)LDD01 2mm
6.戊糖乳杆菌(L.pentosus)PCB 101 4mm6.2肠球菌(Enterococcus sp.)(来自婴儿***物)，结果示于图2。
图2示出(沿顺时针方向，从箭头开始-板后)：
益生菌株mm：
1.罗伊氏乳杆菌DLLRE08,DSM 25684
2.罗伊氏乳杆菌ID 1774LRE 02,DSM 23878
3.罗伊氏乳杆菌DSM 17938(阳性参考)
4.植物乳杆菌LP01 LMG P-21021
5.德式乳杆菌保加利亚亚种LDD01
6.戊糖乳杆菌PCB 101
图2示出(沿顺时针方向，从箭头开始-板内)：
益生菌株mm：
1.罗伊氏乳杆菌DLLRE08,DSM 25684
2.罗伊氏乳杆菌ID 1774LRE 02,DSM 23878
3.罗伊氏乳杆菌DSM 17938(阳性参考)
4.植物乳杆菌LP01 LMG P-21021
5.德式乳杆菌保加利亚亚种LDD01
6.戊糖乳杆菌PCB 101
结果：抑菌圈以毫米表示益生菌株mm：
1.罗伊氏乳杆菌DLLRE08,DSM 25684 3mm
2.罗伊氏乳杆菌ID 1774LRE 02,DSM 23878 3mm
3.罗伊氏乳杆菌DSM 17938(阳性参考)3mm
4.植物乳杆菌LP01 LMG P-21021 5mm
5.德式乳杆菌保加利亚亚种LDD01 4mm
6.戊糖乳杆菌PCB 101 2mm6.3大肠杆菌ATCC 8739，结果示于图3。
图3示出(沿顺时针方向，从箭头开始-板后)：
益生菌株mm：
1.罗伊氏乳杆菌DLLRE08,DSM 25684
2.罗伊氏乳杆菌ID 1774LRE 02,DSM 23878
3.罗伊氏乳杆菌DSM 17938(阳性参考)
4.植物乳杆菌LP01 LMG P-21021
5.德式乳杆菌保加利亚亚种LDD01
6.戊糖乳杆菌PCB 101
图3示出(沿顺时针方向，从箭头开始–板内)：
益生菌株mm:
1.罗伊氏乳杆菌DLLRE08,DSM 25684
2.罗伊氏乳杆菌ID 1774LRE 02,DSM 23878
3.罗伊氏乳杆菌DSM 17938(阳性参考)
4.植物乳杆菌LP01 LMG P-21021
5.德式乳杆菌保加利亚亚种LDD01
6.戊糖乳杆菌PCB 101
结果：抑菌圈以毫米表示
益生菌株mm：
1.罗伊氏乳杆菌DLLRE08,DSM 25684 0mm
2.罗伊氏乳杆菌ID 1774LRE 02,DSM 23878 1mm
3.罗伊氏乳杆菌DSM 17938(阳性参考)2mm
4.植物乳杆菌LP01 LMG P-21021 4mm
5.德式乳杆菌保加利亚亚种LDD01 2mm
6.戊糖乳杆菌PCB 101 1mm6.4大肠杆菌ATCC 35218，结果示于图4。
图4示出(沿顺时针方向，从箭头开始-板后)：
益生菌株mm：
1.罗伊氏乳杆菌DLLRE08,DSM 25684
2.罗伊氏乳杆菌ID 1774LRE 02,DSM 23878
3.罗伊氏乳杆菌DSM 17938(阳性参考)
4.植物乳杆菌LP01 LMG P-21021
5.德式乳杆菌保加利亚亚种LDD01
6.戊糖乳杆菌PCB 101
图4示出(沿顺时针方向，从箭头开始-板内)：
益生菌株mm：
1.罗伊氏乳杆菌DLLRE08,DSM 25684
2.罗伊氏乳杆菌ID 1774LRE 02,DSM 23878
3.罗伊氏乳杆菌DSM 17938(阳性参考)
4.植物乳杆菌LP01 LMG P-21021
5.德式乳杆菌保加利亚亚种LDD01
6.戊糖乳杆菌PCB 101
结果：抑菌圈以毫米表示
益生菌株mm：
1.罗伊氏乳杆菌DLLRE08,DSM 25684 4mm
2.罗伊氏乳杆菌ID 1774LRE 02,DSM 23878 2mm
3.罗伊氏乳杆菌DSM 17938(阳性参考)5mm
4.植物乳杆菌LP01 LMG P-21021 5mm
5.德式乳杆菌保加利亚亚种LDD01 2mm
6.戊糖乳杆菌PCB 101 1mm
6.5克雷伯氏菌(Klebsiella sp)(来自婴儿***物)，结果示于图5。
图5示出(沿顺时针方向，从箭头开始-板后)：
益生菌株mm：
1.罗伊氏乳杆菌DLLRE08,DSM 25684
2.罗伊氏乳杆菌ID 1774LRE 02,DSM 23878
3.罗伊氏乳杆菌DSM 17938(阳性参考)
4.植物乳杆菌LP01 LMG P-21021
5.德式乳杆菌保加利亚亚种LDD01
6.戊糖乳杆菌PCB 101
图5示出(沿顺时针方向，从箭头开始-板内)：
益生菌株mm：
1.罗伊氏乳杆菌DLLRE08,DSM 25684
2.罗伊氏乳杆菌ID 1774LRE 02,DSM 23878
3.罗伊氏乳杆菌DSM 17938(阳性参考)
4.植物乳杆菌LP01 LMG P-21021
5.德式乳杆菌保加利亚亚种LDD01
6.戊糖乳杆菌PCB 101
结果：抑菌圈以毫米表示
益生菌株mm：
1.罗伊氏乳杆菌DLLRE08,DSM 25684 0mm
2.罗伊氏乳杆菌ID 1774LRE 02,DSM 23878 2mm
3.罗伊氏乳杆菌DSM 17938(阳性参考)2mm
4.植物乳杆菌LP01 LMG P-21021 3mm
5.德式乳杆菌保加利亚亚种LDD01 1mm
6.戊糖乳杆菌PCB 101 0mm
生物材料保藏信息说明
保藏编号：DSM 24706
分类命名：短双歧杆菌B632
保藏日期：2011年4月7日
保藏单位：DSMZ-德国微生物保藏中心
保藏单位地址：德国
保藏编号：DSM 24707
分类命名：短双歧杆菌B2274
保藏日期：2011年4月7日
保藏单位：DSMZ-德国微生物保藏中心
保藏单位地址：德国
保藏编号：DSM 24708
分类命名：短双歧杆菌B7840
保藏日期：2011年4月7日
保藏单位：DSMZ-德国微生物保藏中心
保藏单位地址：德国
保藏编号：DSM 24709
分类命名：长双歧杆菌长亚种B1975
保藏日期：2011年4月7日
保藏单位：DSMZ-德国微生物保藏中心
保藏单位地址：德国
保藏编号：DSM 16604
分类命名：短双歧杆菌BR03
保藏日期：2004年07月20日
保藏单位：DSMZ-德国微生物保藏中心
保藏单位地址：德国
保藏编号：DSM 23878
分类命名：罗伊氏乳杆菌LRE02 ID 1774
保藏日期：2010年08月05日
保藏单位：DSMZ-德国微生物保藏中心
保藏单位地址：德国
保藏编号：DSM 25684
分类命名：罗伊氏乳杆菌DLLRE 08
保藏日期：2012年02月16日
保藏单位：DSMZ-德国微生物保藏中心
保藏单位地址：德国
保藏编号：LMG P-21021
分类命名：植物乳杆菌LP01
保藏日期：2001年10月16日
保藏单位：BCCM-比利时微生物协调保藏中心
保藏单位地址：比利时

Claims (18)

1.一种菌株在制备用于治疗由病原体大肠杆菌、肠炎沙门氏菌、艰难梭菌或空肠弯曲杆菌引起的绞痛、腹泻和肠紊乱的组合物中的用途，所述菌株属于短双歧杆菌的种并具有对病原体大肠杆菌、肠炎沙门氏菌、艰难梭菌和空肠弯曲杆菌的抗菌活性，
其中属于短双歧杆菌的种的所述菌株包括：
短双歧杆菌B632，其由位于意大利诺瓦腊的益生菌股份公司通过保藏机构DSMZ于2011年4月7日保藏并具有保藏号DSM 24706。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述病原体大肠杆菌包括生物型大肠杆菌O157:H7。
3.根据权利要求1所述的用途，其中属于短双歧杆菌的种的所述菌株还包括选自包括以下菌株的组或由以下菌株组成的组：
短双歧杆菌B2274，其由位于意大利诺瓦腊的益生菌股份公司通过保藏机构DSMZ于2011年4月7日保藏并具有保藏号DSM 24707；
短双歧杆菌B7840，其由位于意大利诺瓦腊的益生菌股份公司通过保藏机构DSMZ于2011年4月7日保藏并具有保藏号DSM 24708；和
短双歧杆菌BR03，其由位于意大利诺瓦腊的益生菌股份公司通过保藏机构DSMZ保藏并具有保藏号DSM 16604。
4.根据权利要求1所述的用途，其中所述菌株为与长双歧杆菌长亚种B1975组合的短双歧杆菌B632，所述长双歧杆菌长亚种B1975由位于意大利诺瓦腊的益生菌股份公司通过保藏机构DSMZ于2011年4月7日保藏并具有保藏号DSM 24709。
5.根据权利要求1至4任一项所述的用途，其中所述菌株为与短双歧杆菌BR03组合的短双歧杆菌B632，所述短双歧杆菌B632由位于意大利诺瓦腊的益生菌股份公司通过保藏机构DSMZ于2011年4月7日保藏并具有保藏号DSM 24706，所述短双歧杆菌BR03由位于意大利诺瓦腊的益生菌股份公司通过保藏机构DSMZ保藏并具有保藏号DSM 16604。
6.根据权利要求1至4任一项所述的用途，其中所述菌株还包括与植物乳杆菌LP01组合的短双歧杆菌BR03，所述短双歧杆菌BR03由位于意大利诺瓦腊的益生菌股份公司通过保藏机构DSMZ保藏并具有保藏号DSM 16604，所述植物乳杆菌LP01由位于意大利诺瓦腊的莫菲因有限公司通过保藏机构BCCM-LMG于2001年10月16日保藏并具有保藏号LMG P-21021。
7.一种包括细菌混合物的组合物在制备用于治疗由病原体大肠杆菌、肠炎沙门氏菌、艰难梭菌或空肠弯曲杆菌引起的绞痛、腹泻和肠紊乱的组合物中的用途，所述细菌混合物包括以下菌株或者由以下菌株组成：属于短双歧杆菌的种的至少一种菌株，
其中属于短双歧杆菌的种的所述菌株包括：
短双歧杆菌B632，其由位于意大利诺瓦腊的益生菌股份公司通过保藏机构DSMZ于2011年4月7日保藏并具有保藏号DSM 24706。
8.根据权利要求7所述的用途，所述绞痛、腹泻和肠紊乱为在小儿年龄的受试者中的绞痛、腹泻和肠紊乱。
9.根据权利要求7所述的用途，其中所述至少一种菌株还包括选自包括以下菌株的组或由以下菌株组成的组的属于短双歧杆菌的种的菌株：
短双歧杆菌B2274，其由位于意大利诺瓦腊的益生菌股份公司通过保藏机构DSMZ于2011年4月7日保藏并具有保藏号DSM 24707；
短双歧杆菌B7840，其由位于意大利诺瓦腊的益生菌股份公司通过保藏机构DSMZ于2011年4月7日保藏并具有保藏号DSM 24708；和
短双歧杆菌BR03，其由位于意大利诺瓦腊的益生菌股份公司通过保藏机构DSMZ保藏并具有保藏号DSM 16604。
10.根据权利要求7所述的用途，其中所述细菌混合物包括与长双歧杆菌长亚种B1975组合的短双歧杆菌B632，所述长双歧杆菌长亚种B1975由位于意大利诺瓦腊的益生菌股份公司通过保藏机构DSMZ于2011年4月7日保藏并具有保藏号DSM 24709。
11.根据权利要求7至9任一项所述的用途，其中所述细菌混合物包括与短双歧杆菌BR03组合的短双歧杆菌B632或者由与短双歧杆菌BR03组合的短双歧杆菌B632组成，所述短双歧杆菌B632由位于意大利诺瓦腊的益生菌股份公司通过保藏机构DSMZ于2011年4月7日保藏并具有保藏号DSM24706，所述短双歧杆菌BR03由位于意大利诺瓦腊的益生菌股份公司通过保藏机构DSMZ保藏并具有保藏号DSM 16604。
12.根据权利要求7至9任一项所述的用途，其中所述细菌混合物还包括与植物乳杆菌LP01组合的短双歧杆菌BR03，所述短双歧杆菌BR03由位于意大利诺瓦腊的益生菌股份公司通过保藏机构DSMZ保藏并具有保藏号DSM16604，所述植物乳杆菌LP01由位于意大利诺瓦腊的莫菲因有限公司通过保藏机构BCCM-LMG于2001年10月16日保藏并具有保藏号LMG P-21021。
13.根据权利要求7至9任一项所述的用途，其中所述细菌混合物添加或悬浮或分散于选自橄榄油、玉米油、葵花油、种子油和棕榈油的植物油中。
14.根据权利要求13所述的用途，其中所述植物油为玉米油。
15.根据权利要求7至9任一项所述的用途，其中所述组合物为包括至少一种植物物质的共生组合物，所述至少一种植物物质选自包括以下物质或者可选择地由以下物质组成的组：甾醇类，甾烷醇类，葡甘露聚糖，魔芋胶，和/或选自包括低聚果糖-FOS、低聚半乳糖-GOS、低聚木糖-XOS、菊粉、落叶松纤维或***半乳聚糖的至少一种益生元纤维，和/或发酵红米，和/或来自燕麦、燕麦麸、大麦、大麦麸的β葡聚糖，和/或冻干形式的木立芦荟凝胶。
16.根据权利要求15所述的用途，其中所述甾醇类包括植物甾醇类，所述甾烷醇类包括植物甾烷醇类。
17.根据权利要求7至9任一项所述的用途，其中所述组合物包括西甲硅油。
18.根据权利要求15所述的用途，其中所述至少一种植物物质选自包括低聚半乳糖GOS、低聚果糖FOS和菊粉的组。
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