CN110573524B

CN110573524B - 针对pd-l1的抗体

Info

Publication number: CN110573524B
Application number: CN201880028897.5A
Authority: CN
Inventors: I.阿尔廷塔斯; D.萨蒂恩; E.范登布林克; D.维齐杰尔; R.拉德梅克; P.帕伦; B.德戈伊杰
Original assignee: Jian Mabao
Current assignee: Jian Mabao
Priority date: 2017-03-09
Filing date: 2018-03-09
Publication date: 2023-07-18
Anticipated expiration: 2038-03-09
Also published as: MA49823A; CA3055127A1; BR112019018533A2; WO2018162749A1; JP2023116610A; KR20190128667A; US20200239579A1; JP2020511133A; SG11201908088RA; CN116836285A; MX2019010583A; CN110573524A; ZA201905822B; AU2018231618A1; EP3592769B1; EP3592769A1; IL269002A; JP7293121B2

Abstract

本发明涉及新型抗体及其在医学中的用途。特别地，本发明涉及能够结合人PD‑L1并且能够结合人CD3的双特异性抗体。还提供了能够结合人PD‑L1的新抗体类别。此外，本发明涉及本发明的抗体的用途以及用于产生本发明的抗体的方法、核酸构建体和宿主细胞。

Description

针对PD-L1的抗体

发明领域

本发明涉及新型抗体及其在医学中的用途。特别地，本发明涉及能够结合人PD-L1并且能够结合人CD3的双特异性抗体。还提供了能够结合人PD-L1的新抗体类别。此外，本发明涉及本发明的抗体的用途以及用于产生本发明的抗体的方法、核酸构建体和宿主细胞。

发明背景

程序性死亡配体1(PD-L1,PDL1,CD274,B7H1,B7-H1)是一种33kDa的单通过I型膜蛋白。基于可变剪接，已经描述了PD-L1的三种同等型。PD-L1属于免疫球蛋白(Ig)超家族，并且含有一个Ig样C2型域和一个Ig样V型域。新鲜分离的T和B细胞表达的PD-L1量可忽略不计，并且一定分数(约16％)的CD14+单核细胞组成性表达PD-L1(Rietz and Chen,2004Am JTransplant 4:8–14)。已知干扰素-γ(IFN-γ)上调肿瘤细胞上的PD-L1(Abiko et al.,2015Br J Cancer 112:1501-1509；Dong et al.,2002Nature Medicine 8(8):793-800)。

PD-L1通过以下方式阻碍抗肿瘤免疫性：1)通过与其在活化的T细胞上的受体PD-1(CD279)结合来耐受肿瘤反应性T细胞(Dong等，同上；Latchman et al.,2004Proc NatlAcad Sci USA 101,10691-6)；2)通过经由肿瘤细胞表达的PD-L1的PD-1信号转导使肿瘤细胞对CD8+T细胞和Fas配体介导的裂解有抗性(Azuma et al.,2008Blood 111,3635-43)；3)通过经由T细胞表达的CD80(B7.1)的反向信号传导耐受T细胞(Butte et al.,2007Immunity 27,111-22；Park et al.,2010Blood 116,1291-8)；和4)促进诱导的T调节细胞的发育和维持(Francisco et al.,2009J Exp Med 206,3015-29)。PD-L1在许多人癌症中表达，包括黑素瘤、卵巢癌、肺癌和结肠癌(Dong等，同上)。

PD-L1阻断抗体已在几种已知过表达PD-L1的癌症(包括黑素瘤，NSCLC)中显示出临床活性。例如，阿特珠单抗(atezolizumab)是针对PD-L1的人源化IgG1单克隆抗体。目前它在临床试验中作为针对多种适应症的免疫疗法，包括各种类型的实体瘤(参见例如Rittmeyer等，2017Lancet 389:255-265)。FDA已经批准阿利库单抗(Avelumab)(一种PD-L1抗体)(Kaufman et al Lancet Oncol.2016；17(10):1374-1385)用于治疗12岁及以上的具有转移性Merkel细胞癌的成人和儿童患者，并且目前在针对多种癌症适应症的临床试验中，包括膀胱癌、胃癌、头颈癌、间皮瘤、NSCLC、卵巢癌和肾癌。德瓦鲁单抗(Durvalumab)(一种PD-L1抗体)批准用于局部晚期或转移性尿路上皮癌适应症，并且在多种实体瘤和血液癌中的临床开发中(参见例如Massard et al.,2016J Clin Oncol.34(26):3119-25)。已经在WO2004004771,WO2007005874,WO2010036959,WO2010077634,WO2013079174,WO2013164694,WO2013173223和WO2014022758中描述了其他抗PD-L1抗体。

尽管在根除癌症方面已取得重大进展，但仍需要进一步改进基于抗体的癌症疗法。

发明概述

在第一方面，本发明提供了新型抗PD-L1抗体，其包含能够结合人PD-L1的抗原结合区。本发明的第二方面的抗体可以是单特异性或多特异性的，并且若是多特异性的，则所述多特异性抗体可以包含或可以不包含能够结合人CD3ε的抗原结合区。

本发明进一步提供了双特异性抗体，该双特异性抗体包含能够结合人PD-L1的抗原结合区和能够结合人CD3ε(epsilon)的抗原结合区。此种双特异性抗体具有双重作用：

首先，抗体通过其PD-L1结合区结合表达PD-L1的肿瘤细胞，而抗体通过其CD3结合区结合T细胞。因此，抗体使T细胞极其接近肿瘤细胞，从而促进T细胞杀死肿瘤细胞。此外，不受任何具体理论的限制，假设使表达PD-L1的细胞和效应T细胞彼此极其接近可启动干扰素-γ的释放，这继而可以上调肿瘤细胞上的PD-L1，从而有助于募集更多的抗体至肿瘤，并进一步增强其杀伤。

其次，本发明的双特异性抗体抑制人PD-L1与人PD-1的结合，从而防止PD-L1阻碍通过PD-1的抗肿瘤免疫。

CD3xPD-L1双特异性抗体在治疗环境中特别有用，其中期望对表达PD-L1的细胞进行特异性靶向和T细胞介导的杀伤。CD3xPD-L1双特异性抗体在介导PD-L1表达细胞(包括在某些实施方案中，具有低PD-L1拷贝数的细胞)的杀伤中是高度有效的。

本发明的抗体能够结合表达PD-L1的细胞，例如MDA-MB-231、PC3或HELA细胞。此外，本发明的抗体抑制PD-L1和PD-1之间的相互作用，并且可以介导纯化的T细胞或PBMC对MDA-MB-231、PC3和/或HELA细胞的杀伤。

在另一方面，本发明涉及本发明的抗体在医学中的用途，特别是在治疗癌症中的用途。

下面进一步详细描述本发明的这些和其他方面。

附图简述

图1：双特异性CD3xPD-L1和b12xPD-L1抗体及其单特异性二价PD-L1对应物与MDA-MB-231细胞的结合。(A)bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx338-FEAR和IgG1-338-FEAR的结合，(B)bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx547-FEAR和IgG1-547-FEAR的结合，(C)bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx511-LC33S-FEAR和IgG1-511-LC33S-FEAR的结合，(D)bsIgG1-b12-FEALx338-FEAR的结合(E)bsIgG1-b12-FEALx547-FEAR的结合，(F)bsIgG1-b12-FEALx511-LC33S-FEAR的结合。显示的数据是如通过流式细胞仪测定的一项代表性实验的平均荧光强度(MFI)。

图2：双特异性CD3xPD-L1和b12xPD-L1抗体及其单特异性二价PD-L1对应物与PC3细胞的结合。(A)bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx338-FEAR和IgG1-338-FEAR的结合，(B)bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx547-FEAR和IgG1-547-FEAR的结合，(C)bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx511-LC33S-FEAR和IgG1-511-LC33S-FEAR的结合，(D)bsIgG1-b12-FEALx338-FEAR的结合，(E)bsIgG1-b12-FEALx547-FEAR的结合，(F)bsIgG1-b12-FEALx511-LC33S-FEAR的结合。显示的数据是如通过流式细胞仪测定的一项代表性实验的平均荧光强度(MFI)。

图3：双特异性CD3xPD-L1和b12xPD-L1抗体及其单特异性二价PD-L1对应物与HELA细胞的结合。(A)bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx338-FEAR和IgG1-338-FEAR的结合，(B)bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx547-FEAR和IgG1-547-FEAR的结合，(C)bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx511-LC33S-FEAR和IgG1-511-LC33S-FEAR的结合，(D)bsIgG1-b12-FEALx338-FEAR的结合，(E)bsIgG1-b12-FEALx547-FEAR的结合，(F)bsIgG1-b12-FEALx511-LC33S-FEAR的结合。显示的数据是如通过流式细胞仪测定的一项代表性实验的平均荧光强度(MFI)。

图4：双特异性b12xPD-L1抗体及其单特异性双价PD-L1对应物与SK-MES-1细胞的结合。(A)bsIgG1-b12-FEALx338-FEAR和IgG1-338-FEAR的结合，(B)bsIgG1-b12-FEALx547-FEAR和IgG1-547-FEAR的结合，(C)bsIgG1-b12-FEALx511-LC33S-FEAR和IgG1-511-LC33S-FEAR的结合。显示的数据是如通过流式细胞仪测定的一项代表性实验的平均荧光强度(MFI)。

图5：双特异性CD3xPD-L1和b12xPD-L1抗体及其单特异性二价PD-L1对应物与用猕猴PD-L1转染的CHO细胞的结合。(A)bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx338-FEAR和IgG1-338-FEAR的结合，(B)bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx547-FEAR和IgG1-547-FEAR的结合，(C)bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx511-LC33S-FEAR和IgG1-511-LC33S-FEAR的结合，(D)bsIgG1-b12-FEALx338-FEAR的结合，(E)bsIgG1-b12-FEALx547-FEAR的结合，(F)bsIgG1-b12-FEALx511-LC33S-FEAR的结合。显示的数据为如通过流式细胞仪测定的一项代表性实验的平均荧光强度(MFI)。

图6：抗体交叉阻断。抗体交叉阻断的测定使用生物层干扰量度法进行。所有抗体均在FEAR IgG1主链中产生。在表中，将≥0.1nm的响应视为非阻断抗体对(结果在表中以纯数字指示)，将低于0.1nm的响应视为阻断抗体对(在表中以粗体数字指示)，而既不是阻断又不是非阻断的某些响应指示为显示置换行为的抗体(结果在表中以星号(*)指示)。MEDI＝MEDI4736；MPDL＝MPDL3280A。显示了(A)置换、(B)阻断和(C)非阻断抗体对的代表图。

图7：双特异性b12xPD-L1抗体及其单特异性双价PD-L1对应物对PD-1/PD-L1相互作用的影响。(A)bsIgG1-b12-FEALx338-FEAR和IgG1-338-FEAR，(B)bsIgG1-b12-FEALx547-FEAR和IgG1-547-FEAR，(C)bsIgG1-b12-FEALx511-LC33S-FEAR和IgG1-511-LC33S-FEAR在PD-1/PD-L1阻断生物测定法中测定。显示的数据是一项代表性实验相对于对照(不添加抗体)的诱导倍数。

图8：MDA-MB-231细胞中体外CD3xPD-L1双特异性抗体的细胞毒性诱导。将MDA-MB-231细胞与bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx338-FEAR,bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx547-FEAR和bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx511-LC33S-FEAR一起温育。纯化的T细胞(A)或PBMC(B)用作效应细胞。显示的数据为一项代表性实验的％活细胞。

图9：在PC-3细胞中体外CD3xPD-L1双特异性抗体的细胞毒性诱导。将PC-3细胞与bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx338-FEAR,bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx547-FEAR和bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx511-LC33S-FEAR温育。纯化的T细胞(A)或PBMC(B)用作效应细胞。显示的数据为一项代表性实验的％活细胞。

图10：HELA细胞中体外CD3xPD-L1双特异性抗体的细胞毒性诱导。将HELA细胞与bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx338-FEAR,bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx547-FEAR和bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx511-LC33S-FEAR一起温育。纯化的T细胞(A)或PBMC(B)用作效应细胞。显示的数据为一项代表性实验的％活细胞。

图11：通过CD3xPD-L1双特异性抗体的T细胞增殖和激活。

使用MDA-MB-231细胞作为靶细胞和纯化的T细胞作为效应细胞，在体外测定法中测试CD3xPD-L1双特异性抗体，以测量T细胞的活化和增殖。(A)总T细胞计数，(B)CD69^pos T细胞计数，(C)CD25^pos T细胞计数。

图12：PD-L1抗体与在位置42至131处具有丙氨酸突变的PD-L1变体的结合的倍数变化。倍数变化定义为Log₁₀(标准化的gMFI_{[ala突变体]}/标准化的gMFI_[wt])。结合倍数变化低于平均倍数变化–1.5x SD(用虚线指示)的残基认为是“结合突变体的丧失”。具有结合的正倍数变化的残基是IgG1-625-FEAR-A488对照抗体的结合残基(残基75和86)的丧失。x轴上方的数字是指氨基酸位置。

图13：PD-L1抗体的抗体依赖性细胞介导的MDA-MB-231细胞的细胞毒性，如在⁵¹Cr释放测定法中测定。

在体外⁵¹Cr释放测定法中使用新鲜分离的来自健康人供体的PBMC以E:T比100:1测定MDA-MB-231细胞的ADCC。对于每个数据点，显示了3个重复样品的平均值和标准偏差。显示了一个供体的PBMC的代表性实例。

图14：PD-L1抗体的抗体依赖性细胞介导的MDA-MB-231细胞的细胞毒性，如在发光ADCC报告生物测定法中所测定的。

使用表达FcγRIIIa的Jurkat报告物细胞定量PD-L1抗体对MDA-MB-231细胞的ADCC，该Jurkat报告物细胞在FcγRIIIa结合后表达萤光素酶。萤光素酶的产生由相对发光单位(RLU)表示。对于每个数据点，显示重复的平均值和标准偏差。

发明详述

定义

术语“免疫球蛋白”是指由两对多肽链，一对轻(L)低分子量链和一对重(H)链组成的一类结构相关的糖蛋白，所有四个通过二硫键相互连接。免疫球蛋白的结构已得到充分表征。例如参见Fundamental Immunology Ch.7(Paul,W.,ed.,2nd ed.Raven Press,N.Y.(1989))。简言之，每条重链通常由重链可变区(本文缩写为VH或VH)和重链恒定区(本文缩写为CH或CH)组成。重链恒定区通常由三个域CH1，CH2和CH3组成。铰链区是重链的CH1和CH2域之间的区域，并且是高柔性的。铰链区中的二硫键是IgG分子中两条重链之间相互作用的一部分。每条轻链通常由轻链可变区(在本文中简称为VL或VL)和轻链恒定区(在本文中简称为CL或CL)组成。轻链恒定区通常由一个域CL组成。VH和VL区可进一步细分为高变性区(或结构上定义的环的序列和/或形式上可高变的高变区)，也称为互补决定区(CDR)，其散布着更为保守的区域，称为框架区(FR)。每个VH和VL通常由三个CDR和四个FR组成，从氨基端到羧基端按以下顺序排列：FR1,CDR1,FR2,CDR2,FR3,CDR3,FR4(另参见Chothia andLesk J.Mol.Biol.196,901-917(1987))。除非另有说明或与上下文矛盾，否则本文的CDR序列是根据DomainGapAlign Version 4.9.2(2016-09-26)(Lefranc MP.,Nucleic AcidsResearch 1999；27:209-212and Ehrenmann F.,Kaas Q.and Lefranc M.-P.NucleicAcids Res.,38,D301-307(2010)；还见因特网http地址http://www.imgt.org/)的IMGT规则鉴定。除非另有说明或与上下文矛盾，在本发明中提及恒定区中的氨基酸位置根据EU编号(Edelman et al.,Proc Natl Acad Sci U S A.1969 May；63(1):78-85；Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第五版1991NIH PublicationNo.91-3242)。例如，本文的SEQ ID NO:93根据EU编号列出了IgG1m(f)重链恒定区的氨基酸位置118-447。

如本文所用，术语“对应于位置…的氨基酸”是指人IgG1重链中的氨基酸位置编号。其他免疫球蛋白中相应的氨基酸位置可通过与人IgG1的比对找到。因此，一个序列中的氨基酸或片段“对应于”另一序列中的氨基酸或片段是使用标准序列比对程序(例如ALIGN，ClustalW或类似物)通常在默认设置与另一氨基酸或片段比对，并且与人IgG1重链具有至少50％，至少80％，至少90％或至少95％的同一性的氨基酸或片段。认为在本领域中公知的是如何比对序列或序列中的片段，从而确定与根据本发明的氨基酸位置的序列中的相应位置。

在本发明的上下文中，术语“抗体”(Ab)是指具有在典型的生理条件下以相当长的时间段的半衰期，例如至少约30分钟，至少约45分钟，至少约1小时，至少约2小时，至少约4小时，至少约8小时，至少约12小时，约24小时或更多，约48小时或更多，约3、4、5、6、7或更多天等，或任何其他相关的功能定义的时段(例如足以诱发，促进，增强和/或调节与抗体与抗原的结合相关的生理应答的时间和/或足以使抗体募集效应器活性的时间)与抗原特异性结合的能力的免疫球蛋白分子、免疫球蛋白分子的片段或其任一者的衍生物。免疫球蛋白分子的重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合域。本文所用的术语“抗体结合区”是指与抗原相互作用并包含VH和VL区的区域。术语抗体在本文中使用时不仅包含单特异性抗体，而且还包括包含多个，例如两个或多个，例如三个或更多个不同的抗原结合区的多特异性抗体。抗体(Ab)的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫***的各种细胞(例如效应细胞)和补体***的成分(例如C1q)，即补体激活的经典途径中的第一成分。如上所述，除非另有说明或与上下文明显矛盾，否则本文中的术语抗体包括作为抗原结合片段，即，保留与抗原特异性结合的能力的抗体片段。已经显示抗体的抗原结合功能可以通过全长抗体的片段进行。术语“抗体”中涵盖的抗原结合片段的实例包括(i)Fab'或Fab片段，由VL，VH，CL和CH1域组成的单价片段或如WO2007059782(Genmab)中所述的单价抗体；(ii)F(ab')₂片段，包含在铰链区处通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)基本上由VH和CH1域组成的Fd片段；(iv)基本上由抗体单臂的VL和VH域组成的Fv片段，(v)基本上由VH域组成，也称为域抗体(Holt et al；Trends Biotechnol.2003Nov；21(11):484-90)的dAb片段(Ward et al.,Nature 341,544-546(1989))；(vi)骆驼科抗体或纳米抗体(Revets et al；Expert Opin Biol Ther.2005Jan；5(1):111-24)和(vii)分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两个域VL和VH由不同的基因编码，但可以使用重组方法通过合成接头将它们连接起来，所述合成接头使它们能够制备成单一蛋白链，其中VL区和VH区配对以形成单价分子(称为单链抗体或单链Fv(scFv)，参见例如Bird et al.,Science 242,423-426(1988)和Huston et al.,PNAS USA 85,5879-5883(1988))。除非另有说明或上下文明确指出，否则此类单链抗体涵盖在术语抗体内。尽管此类片段通常包括在抗体的含义内，但是它们共同且各自独立地是本发明的独特特征，表现出不同的生物学特性和效用。在本发明的上下文中，这些和其他有用的抗体片段以及此类片段的双特异性形式在本文中进一步讨论。还应理解，除非另有说明，术语抗体还包括多克隆抗体、单克隆抗体(mAb)、抗体样多肽，例如嵌合抗体和人源化抗体，以及可通过任何已知技术，例如酶促裂解，肽合成和重组技术提供的保留与抗原特异性结合的能力的抗体片段(抗原结合片段)。产生的抗体可以具有任何同种型。如本文所用，术语“同种型”是指由重链恒定区基因编码的免疫球蛋白类别(例如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgD，IgA，IgE或IgM)。当在本文中提到特定同种型，例如IgG1时，该术语不限于特定的同种型序列，例如特定的IgG1序列，但用于表示抗体在序列上比其他同种型更接近该同种型，例如IgG1。因此，例如本发明的IgG1抗体可以是天然存在的IgG1抗体的序列变体，包括恒定区中的变异。

如本文所用，术语“单克隆抗体”是指单一分子组成的抗体分子的制剂。单克隆抗体组合物显示出对特定表位的单一结合特异性和亲和力。因此，术语“人单克隆抗体”是指显示单一结合特异性的抗体，其具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。人单克隆抗体可以由杂交瘤产生，所述杂交瘤包含与永生化细胞融合的B细胞，所述B细胞获自转基因或转染色体非人动物，例如转基因小鼠，其具有包含人重链转基因和轻链转基因的基因组。

在本发明的上下文中，术语“双特异性抗体”或“bs”是指具有由不同抗体序列限定的两个不同抗原结合区的抗体。在一些实施方案中，所述不同抗原结合区结合相同抗原上的不同表位。然而，在优选的实施方案中，所述不同的抗原结合区结合不同的靶抗原。双特异性抗体可以是任何形式，包括下文所述的任何双特异性抗体形式。

当在本文中使用时，术语“半分子”、“Fab臂”和“臂”是指一个重链-轻链对。

当双特异性抗体描述为包含“源自”第一抗体的半分子抗体和“源自”第二抗体的半分子抗体时，术语“源自”表示双特异性抗体是通过任何已知的方法将来自所述第一抗体和第二抗体中每种的所述半分子重组为所得的双特异性抗体产生的。在此上下文下，“重组”并不旨在受到任何特定的重组方法的限制，因此包括下文所述的所有产生双特异性抗体的方法，包括例如通过半分子交换的重组以及在核酸水平处进行重组和/或通过在同一细胞中两个半分子的共表达。

在本发明的上下文中，术语“单价抗体”是指抗体分子能够结合抗原的单个分子，因此不能够使抗原或细胞交联。

当在抗体的上下文中使用时，术语“全长”表示该抗体不是片段，但是含有通常在自然界中对于该同种型发现的特定同种型的所有域，例如IgG1抗体的VH，CH1，CH2，CH3，铰链，VL和CL域。

当在本文中使用时，除非上下文矛盾，术语“Fc区”是指由免疫球蛋白重链的两个Fc序列组成的抗体区，其中所述Fc序列至少包含铰链区，CH2域和CH3域。

当在本文中使用时，术语“第一和第二CH3区域之间的异二聚体相互作用”是指第一-CH3/第二-CH3异二聚体蛋白质中的第一CH3区域和第二CH3区域之间的相互作用。

当在本文中使用时，术语“第一和第二CH3区的同二聚体相互作用”是指第一-CH3/第一-CH3同二聚体蛋白中的第一CH3区和另一个第一CH3区之间的相互作用以及第二CH3/第二CH3同二聚体蛋白中第二CH3区和另一个第二CH3区之间的相互作用。

如本文所用，在抗体与预定抗原或表位结合的上下文中，术语“能够结合”或“结合”通常是具有对应于约10^-6M或更小，诸如约10^-7M或更小，诸如约10^-8M或更小，诸如约10^-9M或更小，约10^-10M或更小，约10^-11M或甚至更小的K_D的亲和力结合，当使用Bio-Layer干扰量度法(BLI)进行测定时，例如，如实施例8中所述，或例如在使用抗原作为配体和抗体作为分析物，在BIAcore 3000仪器中使用表面等离子体共振(SPR)技术进行测定时。抗体以对应于K_D的亲和力结合预定抗原，所述K_D比所述抗体对除预定抗原或紧密相关抗原以外的非特异性抗原(例如BSA，酪蛋白)的结合亲和力低至少10倍，例如低至少100倍，例如低至少1,000倍，例如低至少10,000倍，例如至少100,000倍。亲和力较低的量取决于抗体的K_D，因此，当抗体的K_D非常低(即抗体具有高度特异性)时，则对抗原的亲和力比对非特异性抗原的亲和力低的程度可以是至少10,000倍。

如本文所用，术语“k_d”(sec^-1)是指特定抗体-抗原相互作用的解离速率常数。所述值也称为k_off或k_dis值。

如本文所用，术语“K_D”(M)是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数。它通过将k_d除以k_a获得。

如本文所用，术语“k_a”(M^-1x sec^-1)是指特定抗体-抗原相互作用的缔合速率常数。所述值也称为k_on值或缔合速率。

在一个优选的实施方案中，本发明的抗体是分离的。如本文所用，“分离的抗体”旨在指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体。在优选的实施方案中，特异性结合PD-L1和第二靶物，例如CD3的分离的双特异性抗体基本上不含特异性结合PD-L1或第二靶物，例如CD3的单特异性抗体。在另一个优选的实施方案中，抗体或包含抗体的药物组合物基本上不含不能结合PD-L1的天然产生的抗体。在另一个优选的实施方案中，相对于天然存在的抗PD-L1抗体的结构，本发明的抗体在其氨基酸序列上具有结构变化，其中所述结构变化导致所述抗体相对于所述天然存在的抗PD-L1抗体表现出的功能性改变的功能性，所述功能性选自下组：(i)PD-L1结合亲和力，(ii)抑制PD-L1与PD-1结合的能力和(iii)诱导Fc介导的效应器功能的能力。

当在本文中使用时，术语“PD-L1”是指程序性死亡配体1蛋白。PD-L1存在于人和其他物种中，因此，除非上下文矛盾，否则术语“PD-L1”不限于人PD-L1。人、猕猴和小鼠PD-L1序列可分别通过Genbank登录号NP_054862.1,XP_005581836和NP_068693找到。

当在本文中使用时，术语“PD-L2”是指人程序性死亡1-配体2蛋白(Genbank登录号NP_079515)。

当在本文中使用时，术语“PD-1”是指人程序性死亡1蛋白，也称为CD279。

如本文所用，术语“CD3”是指人分化簇3蛋白，其是T细胞共受体蛋白复合物的一部分并且由四个不同的链组成。CD3也存在于其他物种中，因此，除非上下文矛盾，术语“CD3”不限于人CD3。在哺乳动物中，复合物含有CD3γ(gamma)链(人CD3γ链UniProtKB/Swiss-Prot No P09693或食蟹猴CD3γUniProtKB/Swiss-Prot No Q95LI7)、CD3δ(delta)链(人CD3δUniProtKB/Swiss-Prot No P04234或食蟹猴CD3δUniProtKB/Swiss-Prot NoQ95LI8)、两个CD3ε(epsilon)链(人CD3εUniProtKB/Swiss-Prot No P07766(SEQ ID NO:95)；食蟹猴CD3εUniProtKB/Swiss-Prot No Q95LI5；或猕猴CD3εUniProtKB/Swiss-ProtNo G7NCB9)和CD3ζ-链(zeta)链(人CD3ζUniProtKB/Swiss-Prot No P20963,食蟹猴CD3ζUniProtKB/Swiss-Prot No Q09TK0)。这些链与称为T细胞受体(TCR)的分子结合，并在T淋巴细胞中产生激活信号。TCR和CD3分子一起构成TCR复合物。

“PD-L1抗体”或“抗PD-L1抗体”是特异性结合抗原PD-L1，特别是人PD-L1的如上所述的抗体。

“CD3抗体”或“抗CD3抗体”是特异性结合抗原CD3，特别是人CD3ε(epsilon)的如上所述的抗体。

“CD3xPD-L1抗体”、“抗CD3xPD-L1抗体”、“PD-L1xCD3抗体”或“抗PD-L1xCD3抗体”是包含两个不同的抗原结合区的双特异性抗体，所述抗原结合区之一特异性结合抗原PD-L1并且所述抗原结合区之一特异性结合抗原CD3。

本发明还提供了包含实施例抗体的VL区，VH区或一个或多个CDR的功能性变体的抗体。在抗体的上下文中使用的VL，VH或CDR的功能性变体仍然允许抗体至少保留“参考”或“亲本”抗体的相当大比例(至少约50％，60％，70％，80％，90％，95％或更多)亲和力和/或特异性/选择性，在某些情况下，此类抗体可以比亲本抗体以更大的亲和力，选择性和/或特异性结合。

此类功能性变体通常与亲本抗体保持相当大的序列同一性。两个序列之间的同一性百分比是序列共享的相同位置数的函数(即，％同源性＝相同位置数/位置总数x 100)，其中要考虑到缺口的数量和每个缺口的长度，其需要被引入以实现两个序列的最佳比对。两个核苷酸或氨基酸序列之间的同一性百分比可以例如使用已经并入ALIGN program(第2.0版)中的E.Meyers and W.Miller,Comput.Appl.Biosci 4,11-17(1988)的算法，使用PAM120加权残基表，12的缺口长度罚分和4缺口方法确定。此外，两个氨基酸序列之间的同一性百分比可以使用Needleman and Wunsch,J.Mol.Biol.48,444-453(1970)算法确定。

示例性的变体包括那些与亲本抗体序列的VH和/或VL和/或CDR区主要相差保守取代的变体。例如，变体中的10个，例如9、8、7、6、5、4、3、2或1个取代是保守的氨基酸残基取代。

在本发明的上下文中，保守取代可以通过下表中反映的氨基酸类别内的取代来定义：

用于保守取代的氨基酸残基类别

在本发明的上下文中，除非另外指出，否则以下标记用于描述突变；i)将给定位置中的氨基酸取代写为例如K409R，意指用精氨酸取代位置409处的赖氨酸；ii)对于特定的变体，使用特定的三字母或一字母代码，包括代码Xaa和X表示任何氨基酸残基。因此，在位置409处用精氨酸取代赖氨酸称为：K409R，并且在位置409处用任何氨基酸残基取代赖氨酸称为K409X。若在位置409处缺失赖氨酸，则用K409*表示它。

在本发明的上下文中，“竞争”是指特定分子结合特定结合配偶体的倾向在存在结合结合配偶体的另一个分子的情况下显著降低。“竞争”可以指“阻断”或“置换”两者，即竞争分子可以是阻断分子或置换分子。“置换”是指第二抗体可以从抗原-抗体复合物(较早形成)置换抗原而导致抗原交换的情况(Abdiche et al.,2017Plos One 12(1):e0169535)。通过两种或更多种抗PD-L1抗体竞争与PD-L1的结合可以通过任何合适的技术来确定。在一个实施方案中，如本文实施例9中所述确定竞争。

类似地，在本发明的上下文中，“抑制PD-L1与PD-1的结合”是指在能够结合PD-L1的抗体存在下，PD-L1与PD-1的结合的任何可检测的显著降低。通常，抑制是指由抗PD-L1抗体的存在引起的PD-L1与PD-1之间的结合的至少约10％的降低，例如至少约15％的降低，例如至少约20％的降低，例如至少40％的降低。PD-L1与PD-1结合的抑制可以通过任何合适的技术来确定。在一个实施方案中，如本文实施例10中所述确定抑制。

术语“表位”是指能够特异性结合抗体的蛋白质决定簇。表位通常由诸如氨基酸或糖侧链等的分子的表面分组组成，并且通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。构象性和非构象性表位的区别在于，在存在变性溶剂的情况下，与前者而非后者的结合丧失。表位可以包含直接参与结合的氨基酸残基和不直接参与结合的其他氨基酸残基，例如被特异性抗原结合肽有效阻断或覆盖的氨基酸残基(换言之，氨基酸残基在特异性抗原结合肽的足迹内)。

如本文所用，术语“嵌合抗体”是指下述抗体，其中可变区源自非人物种(例如，源自啮齿动物)并且恒定区源自不同物种，例如人。开发出用于治疗应用的嵌合单克隆抗体以降低抗体的免疫原性。如在嵌合抗体的上下文中使用，术语“可变区”或“可变域”是指包含免疫球蛋白的重链和轻链两者的CDR和框架区的区域。嵌合抗体可通过使用标准DNA技术，如Sambrook et al.,1989,Molecular Cloning:A laboratory Manual,New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press,第15章中所述来产生。嵌合抗体可以是遗传或酶工程化重组抗体。产生嵌合抗体在本领域技术人员的知识范围内，因此，可以通过除本文所述方法之外的方法来进行根据本发明的嵌合抗体的产生。

如本文所用，术语“人源化抗体”是指遗传工程化的非人抗体，其含有人抗体恒定域和经修饰以与人可变域含有高水平序列同源性的非人可变域。这可以通过将6个一起形成抗原结合位点的非人抗体互补决定区(CDR)移植到同源人受体框架区(FR)上来实现(参WO92/22653和EP0629240)。为了完全重建亲本抗体的结合亲和力和特异性，可能需要将亲本抗体(即非人抗体)的框架残基替换为人构架区(反向突变)。结构同源性建模可以帮助鉴定框架区中对于抗体的结合特性重要的氨基酸残基。因此，人源化抗体可包含非人CDR序列，主要是人框架区(其任选地包含一个或多个向非人氨基酸序列的氨基酸反向突变)，以及完全人恒定区。任选地，可以应用不一定是反向突变的其他氨基酸修饰，以获得具有优选特性，例如亲和力和生物化学特性的人源化抗体。

如本文所用，术语“人抗体”是指具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。人抗体可包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，由体外随机或位点特异性诱变或体内体细胞突变引入的突变)。然而，如本文所用，术语“人抗体”不意图包括其中源自另一哺乳动物物种，例如小鼠的种系的CDR序列已被植入到人框架序列上的抗体。本发明的人单克隆抗体可以通过多种技术产生，包括常规的单克隆抗体方法，例如，Kohler and Milstein,Nature 256:495(1975)的标准体细胞杂交技术。尽管体细胞杂交程序是优选的，但是原则上可以采用其他产生单克隆抗体的技术，例如，使用人抗体基因文库的B淋巴细胞的病毒或致癌转化或噬菌体展示技术。用于制备分泌人单克隆抗体的杂交瘤的合适的动物***是鼠***。在小鼠中产生杂交瘤是一种非常完善建立的程序。用于分离经免疫的脾细胞用于融合的免疫方案和技术是本领域已知的。融合配偶体(例如鼠骨髓瘤细胞)和融合程序也是已知的。因此，人单克隆抗体可以例如使用携带部分的人免疫***而非小鼠或大鼠***的转基因或转染色体小鼠或大鼠产生。因此，在一个实施方案中，人抗体获自转基因动物，例如小鼠或大鼠，其携带人种系免疫球蛋白序列替换动物免疫球蛋白序列。在此类实施方案中，抗体源自引入动物中的人种系免疫球蛋白序列，但是最终的抗体序列是所述人种系免疫球蛋白序列被内源性动物抗体机制通过体细胞超突变和亲和力成熟进一步修饰的结果，参见例如Mendez et al.1997Nat Genet.15(2):146-56。术语“还原条件”或“还原环境”是指底物(本文为抗体铰链区中的半胱氨酸残基)相比于被氧化更可能被还原的条件或环境。

如本文所用，术语“重组宿主细胞”(或简称为“宿主细胞”)旨在指已经引入有表达载体，例如编码本发明的抗体的表达载体的细胞。重组宿主细胞包括例如转染瘤，如CHO，CHO-S，HEK，HEK293，HEK-293F，Expi293F，PER.C6或NS0细胞，以及淋巴细胞。

术语“治疗/处理”是指以缓解，改善，阻止或消除(治愈)症状或疾病状态为目的施用有效量的本发明的治疗活性抗体。

术语“有效量”或“治疗有效量”是指在必需的剂量且持续必需的时间段对于实现期望的治疗结果有效的量。抗体的治疗有效量可以随着因素，诸如个体的疾病状态，年龄，性别和体重以及抗体在个体中引起期望的应答的能力而变化。治疗有效量也是抗体或抗体部分的任何毒性或有害作用均被治疗有益作用超过的量。

术语“抗独特型抗体”是指识别通常与抗体的抗原结合位点相关的独特决定簇的抗体。

本发明的其他方面和实施方案

如上所述，在第一方面，本发明涉及一种双特异性抗体，其包含能够结合人PD-L1的抗原结合区和能够结合人CD3ε(epsilon)的抗原结合区，其中该抗体抑制人PD-L1与人PD-1的结合。因此，此类双特异性抗体包含两个不同的抗原结合区，一个对PD-L1具有结合特异性的抗原结合区和另一个对CD3具有结合特异性的抗原结合区。

在一个实施方案中，所述能够结合人PD-L1的抗原结合区包括含有CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区(VH)和含有CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区(VL)。其中VH CDR3序列选自以SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:21所示的序列。

在另一个实施方案中，所述能够结合人PD-L1的抗原结合区包括：

(i)包含分别以SEQ ID NO:2、3和4所示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区(VH)和包含分别具有以SEQ ID NO:6所示的序列、序列KAS和以SEQ ID NO:7所示的序列的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区(VL)，或

(ii)包含分别以SEQ ID NO:9、10和11所示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区(VH)和包含分别具有以SEQ ID NO:16所示的序列、序列EDS和以SEQ ID NO:17所示的序列的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区(VL)，或

(iii)包含分别以SEQ ID NO:19、20和21所示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区(VH)和包含分别具有以SEQID NO:23所示的序列，序列DDN和以SEQ ID NO:24所示的序列的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区(VL)。

在另一个实施方案中，所述能够结合人PD-L1的抗原结合区包含与选自下组的VH序列具有至少90％，至少95％，至少97％，至少99％或100％氨基酸序列同一性的VH序列：以SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:8和以SEQ ID NO:18所示的序列。

在另一个实施方案中，其中所述能够结合人PD-L1的抗原结合区包含与选自下组的VL序列具有至少90％，至少95％，至少97％，至少99％或100％氨基酸序列的VL序列：以SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:22所示的序列。

(i)与以SEQ ID NO:1所示的VH序列具有至少90％，至少95％，至少97％，至少99％或100％的氨基酸序列同一性的VH序列和与SEQ ID NO:5所示的VL序列具有至少90％，至少95％，至少97％，至少99％或100％氨基酸序列同一性的VL序列，或

(ii)与以SEQ ID NO:8所示的VH序列具有至少90％，至少95％，至少97％，至少99％或100％的氨基酸序列同一性的VH序列和与SEQ ID NO:15所示的VL序列具有至少90％，至少95％，至少97％，至少99％或100％氨基酸序列同一性的VL序列，或

(iii)与以SEQ ID NO:18所示的VH序列具有至少90％，至少95％，至少97％，至少99％或100％的氨基酸序列同一性的VH序列和与SEQ ID NO:22所示的VL序列具有至少90％，至少95％，至少97％，至少99％或100％氨基酸序列同一性的VL序列。

因此，例如，所述能够结合人PD-L1的抗原结合区包括：

与以SEQ ID NO:1所示的VH序列具有至少95％氨基酸序列同一性的VH序列和与以SEQ ID NO:5所示的VL序列具有至少95％氨基酸序列同一性的VL序列，或

与以SEQ ID NO:1所示的VH序列具有至少97％氨基酸序列同一性的VH序列和与以SEQ ID NO:5所示的VL序列具有至少97％氨基酸序列同一性的VL序列，或

与以SEQ ID NO:1所示的VH序列具有至少99％氨基酸序列同一性的VH序列和与以SEQ ID NO:5所示的VL序列具有至少99％氨基酸序列同一性的VL序列，或

与以SEQ ID NO:8所示的VH序列具有至少95％氨基酸序列同一性的VH序列和与以SEQ ID NO:15所示的VL序列具有至少95％氨基酸序列同一性的VL序列，或

与以SEQ ID NO:8所示的VH序列具有至少97％氨基酸序列同一性的VH序列和与以SEQ ID NO:15所示的VL序列具有至少97％氨基酸序列同一性的VL序列，或

与以SEQ ID NO:8所示的VH序列具有至少99％氨基酸序列同一性的VH序列和与以SEQ ID NO:15所示的VL序列具有至少99％氨基酸序列同一性的VL序列，或

与以SEQ ID NO:18所示的VH序列具有至少95％氨基酸序列同一性的VH序列和与SEQ ID NO:22所示的VL序列具有至少95％氨基酸序列同一性的VL序列，或

与以SEQ ID NO:18所示的VH序列具有至少97％氨基酸序列同一性的VH序列和与SEQ ID NO:22所示的VL序列具有至少97％氨基酸序列同一性的VL序列，或

与以SEQ ID NO:18所示的VH序列具有至少99％氨基酸序列同一性的VH序列和与SEQ ID NO:22所示的VL序列具有至少99％氨基酸序列同一性的VL序列。

在另一个实施方案中，所述VH和VL序列各自包含三个CDR序列，分别为CDR1、CDR2和CDR3，以及四个框架序列，分别为FR1、FR2、FR3和FR4，以及VH的各自组合的FR1、FR2、FR3和FR4框架序列与所述VH序列的相应组合的FR1、FR2、FR3和FR4框架序列具有至少90％，至少95％，至少97％或至少99％的氨基酸序列同一性，并且其中VH CDR序列未突变，和其中VL的相应组合的FR1、FR2、FR3和FR4框架序列与所述VL序列的相应组合的FR1、FR2、FR3和FR4框架序列具有至少90％，至少95％，至少97％或至少99％的氨基酸序列同一性，并且其中VLCDR序列未突变。在该实施方案的背景中，同一性％是指将框架序列作为一个连续序列而没有中间CDR序列理解时所获得的同一性百分比。

在本发明抗体的一个优选实施方案中，所述能够结合人PD-L1的抗原结合区包括：

(i)以SEQ ID NO:1所示的VH序列和SEQ ID NO:5所示的VL序列，或

(ii)以SEQ ID NO:8所示的VH序列和SEQ ID NO:15所示的VL序列，或

(iii)以SEQ ID NO:18所示的VH序列和SEQ ID NO:22所示的VL序列。

能够结合相同抗原(例如PD-L1)的不同抗体可以结合所述抗原的不同区域。在某些情况下，一种PD-L1抗体与PD-L1的结合仍可允许不同PD-L1抗体与PD-L1的结合。然而，在其他情况下，一种PD-L1抗体与PD-L1的结合可以与不同PD-L1抗体与PD-L1的结合竞争(阻止或置换)。因此，竞争实验提供了抗体在靶抗原上结合(这可能影响抗体结合的功能效果)的位置的信息。

在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体：

(i)与包含以SEQ ID NO:8所示的VH序列和以SEQ ID NO:15所示的VL序列的抗体竞争与人PD-L1的结合，但不与包含以SEQ ID NO:18所示的VH序列和SEQ ID NO:22所示的VL序列的抗体竞争与人PD-L1的结合，或

(ii)与包含以SEQ ID NO:18所示的VH序列和以SEQ ID NO:22所示的VL序列的抗体竞争与人PD-L1的结合，但不与包含以SEQ ID NO:8所示的VH序列和SEQ ID NO:15所示的VL序列的抗体竞争与人PD-L1的结合。

在本发明的另一个实施方案中，所述抗体与包含以SEQ ID NO:1所示的VH序列和以SEQ ID NO:5所示的VL序列的抗体竞争与人PD-L1的结合。

竞争靶抗原结合的抗体可以结合抗原上的不同表位，其中表位彼此如此接近，使得与一个表位结合的第一抗体阻止第二抗体与另一表位的结合。然而，在其他情况下，两种不同的抗体可以结合抗原上的相同表位。

因此，在一个实施方案中，本发明的抗体：

(i)能够与包含以SEQ ID NO:1所示的VH序列和以SEQ ID NO:5所示的VL序列的抗体结合人PD-L1的相同表位，或

(ii)能够与包含以SEQ ID NO:8所示的VH序列和以SEQ ID NO:15所示的VL序列的抗体结合人PD-L1的相同表位，或

(iii)能够与包含以SEQ ID NO:18所示的VH序列和SEQ ID NO:22所示的VL序列的抗体结合人PD-L1的相同表位。

在另一个实施方案中，双特异性抗体与人PD-L1的结合不被包含以SEQ ID NO:53所示的VH序列和S以EQ ID NO:57所示的VL序列的抗体置换。

在另一个实施方案中，双特异性抗体与人PD-L1的结合被包含以SEQ ID NO:18所示的VH序列和以SEQ ID NO:22所示的VL序列的抗体阻断。本文中的“阻断”指包含以SEQ IDNO:18所示的VH序列和以SEQ ID NO:22所示的VL序列的抗体与双特异性抗体竞争，但不置换它的抗体。

如上所述，本发明的第一方面的上述双特异性抗体包含能够结合人CD3ε的抗原结合区。

在一个实施方案中，能够结合人CD3ε的抗原结合区包含分别具有以SEQID NO:26、27和28所示的序列的重链可变(VH)区CDR1、CDR2和CDR3，并且包含分别具有以SEQID NO:30所示的序列、序列GTN和SEQ ID NO:31所示的序列的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区(VL)。

如上定义的六个CDR序列源自称为SP34的小鼠抗体。已经产生了该抗体的人源化形式，并且人源化抗体在本文中表示为huCD3，并在WO2015001085(Genmab)中进一步公开。

在本发明的双特异性抗体的一个优选实施方案中，所述双特异性抗体包含：

(i)能够结合人PD-L1的抗原结合区，其包含分别以SEQ ID NO:2、3和4所示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区(VH)和包含分别具有以SEQ ID NO:6所示的序列，序列KAS和以SEQ ID NO:7所示的序列的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区(VL)，和能够结合人CD3ε的抗原结合区，其包含：(a)包含分别具有以SEQ ID NO:26、27和28所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区(VH)和包含分别具有以SEQ ID NO:30所示序列、序列GTN和SEQ IDNO:31所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区(VL)，或

(ii)能够结合人PD-L1的抗原结合区，其包含分别以SEQ ID NO:9、10和11所示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区(VH)和包含分别具有以SEQ ID NO:16所示序列、CDREDS和以SEQ ID NO:17所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区(VL)，和能够结合人CD3ε的抗原结合区，其包含(a)包含分别具有以SEQ ID NO:26、27和28所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区(VH)和包含分别具有以SEQ ID NO:30所示的序列、序列GTN和以SEQ IDNO:31所示的序列的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区(VL)，

或

(iii)能够结合人PD-L1的抗原结合区，其包含分别以SEQ ID NO:19、20和21所示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区(VH)和包含分别具有以SEQ ID NO:23所示序列、序列DDN和以SEQ ID NO:24所示序列的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区(VL)，和能够结合人CD3ε的抗原结合区，其包括(a)包含分别具有以SEQ ID NO:26、27和28所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区(VH)和包含分别具有以SEQ ID NO:30所示序列、序列GTN和SEQID NO:31所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区(VL)。

在一个实施方案中，双特异性抗体包含能够结合人CD3ε的抗原结合区，其包含重链可变区(VH)，其中所述VH序列与以SEQ ID NO:25所示的氨基酸序列具有至少90％，至少95％，至少97％，至少99％或100％的氨基酸序列同一性。

在另一个实施方案中，双特异性抗体包含能够结合人CD3ε的抗原结合区，其包含轻链可变区(VL)，其中所述VL序列与以SEQ ID NO:29所示的氨基酸序列具有至少90％，至少95％，至少97％，至少99％或100％的氨基酸序列同一性

在一个优选的实施方案中，能够结合人CD3ε的抗原结合区包含以SEQ ID NO:25所示的VH序列和以SEQ ID NO:29所示的VL序列。

一方面，可以修饰根据本发明的双特异性抗体以降低抗体的亲和力。这在某些情况下可能是有利的，并导致功效增加。特别地，结合人CD3ε的低亲和力可以对循环中和肿瘤部位处T细胞的迁移率具有影响，从而导致T细胞与肿瘤细胞的更好结合，参见etal.,Molecular Immunology 44(2007)。

因此，在包含能够结合人PD-L1的抗原结合区和能够结合人CD3ε的抗原结合区的本发明的双特异性抗体的不同实施方案中，所述双特异性抗体

(i)与具有能够包含以SEQ ID NO:25所示的VH序列和以SEQ ID NO:29所示的VL序列的抗原结合区的抗体相比具有更低的人CD3ε结合亲和力，优选其中所述亲和力低至少2倍，例如低至少5倍，例如低至少10倍，例如低至少25倍，例如低至少50倍，并且

(ii)当使用PBMC或纯化的T细胞作为效应细胞时，能够介导MDA-MB-231细胞、PC-3细胞和/或HELA细胞的浓度依赖性细胞毒性。

类似地，在一个实施方案中，本发明的抗体包含能够结合人CD3ε的抗原结合区，其中所述能够结合人CD3ε的抗原结合区：

(ii)当使用PBMC或纯化的T细胞作为效应细胞时，能够介导MDA-MB-231细胞、PC-3细胞和/或HELA细胞的浓度依赖性细胞毒性，。

例如，可以使用如WO2017009442的实施例7中所述的octet结合亲和力测定来测量对人CD3ε的亲和力。

抗体介导PBMC或纯化的T细胞的细胞毒性的能力可以例如如本文实施例11所描述的那样测定，例如将MDA-MB-231、PC-3细胞或HELA细胞在孔中接种并培养。添加肿瘤细胞、PBMC和抗体的连续稀释液，并在温育后针对存活力对肿瘤细胞进行染色。

本文中，huCD3-H1L1指具有如SEQ ID NO:25和29所示的VH和VL序列的抗CD3抗体。IgG1-huCD3-FEAL指其包含L234F，L235E，D265A和F405L取代的变体(另参见本文别处)。

对人CD3ε具有降低的亲和力的IgG1-huCD3-FEAL的变体的实例已在WO2017009442(Genmab)中描述。WO2017009442的实施例7(表6)公开了IgG1-huCD3-FEAL及其七个变体的亲和力，其使用octet结合亲和力测定法测量：

抗体	<KD>(nM)	SDEV	SEM	CV
					IgG1-huCD3-FEAL	15	6	3	37
IgG1-huCD3-Y114V-FEAL	29	8	4	26
					IgG1-huCD3-T31P-FEAL	42	9	4	21
IgG1-huCD3-Y114M-FEAL	42	14	8	33
					IgG1-huCD3-Y114R-FEAL	46	10	6	22
IgG1-huCD3-S110A-FEAL	72	15	6	21
					IgG1-huCD3-T31M-FEAL	99	23	13	23
IgG1-huCD3-H101G-FEAL	683	169	97	25

在本发明的双特异性抗体的一个实施方案中，能够结合人CD3ε的抗原结合区包含：

(i)包含分别具有以SEQ ID NO:99、27和28所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区(VH)和包含分别具有以SEQ ID NO:30所示序列、序列GTN和SEQ ID NO:31所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区(VL)，或

(ii)包含分别具有以SEQ ID NO:100、27和28所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区(VH)和包含分别具有以SEQ ID NO:30所示序列，序列GTN和SEQ ID NO:31所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区(VL)，或

(iii)包含分别具有以SEQ ID NO:26、27和101所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区(VH)和包含分别具有以SEQ ID NO:30所示的序列，序列GTN和SEQ ID NO:31所示的序列的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区(VL)，或

(iv)包含分别具有以SEQ ID NO:26、27和102所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区(VH)和包含分别具有以SEQ ID NO:30所示的序列，序列GTN和SEQ ID NO:31所示的序列CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区(VL)，或

(v)包含分别具有以SEQ ID NO:26、27和103所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区(VH)和包含分别具有以SEQ ID NO:30所示序列、序列GTN和SEQ ID NO:31所示序列的CDR1 CDR2和CDR3的轻链可变区(VL)，或

(vi)包含分别具有以SEQ ID NO:26、27和104所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区(VH)和包含分别具有以SEQID NO:30所示序列，序列GTN和SEQ ID NO:31所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区(VL)，或

(vii)包含分别具有以SEQ ID NO:26、27和105所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区(VH)和包含分别具有以SEQID NO:30所示的序列，序列GTN和SEQ ID NO:31所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区(VL)。

在另一个实施方案中，能够结合人CD3ε的抗原结合区包括：

(i)以SEQ ID NO:39所示的VH序列和以SEQ ID NO:29所示的VL序列，或

(ii)以SEQ ID NO:40所示的VH序列和以SEQ ID NO:29所示的VL序列，或

(iii)以SEQ ID NO:41所示的VH序列和以SEQ ID NO:29所示的VL序列，或

(iv)以SEQ ID NO:42所示的VH序列和以SEQ ID NO:29所示的VL序列，或

(v)以SEQ ID NO:43所示的VH序列和以SEQ ID NO:29所示的VL序列，或

(vi)以SEQ ID NO:44所示的VH序列和以SEQ ID NO:29所示的VL序列，或

(vii)以SEQ ID NO:45所示的VH序列和以SEQ ID NO:29所示的VL序列。

在本发明的双特异性抗体的进一步优选的实施方案中，每个抗原结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，并且其中所述可变区各自包含三个CDR序列，分别为CDR1，CDR2和CDR3，以及四个框架序列，分别为FR1、FR2、FR3和FR4。

在本发明的双特异性抗体的进一步优选的实施方案中，该抗体包含两个重链恒定区(CH)和两个链恒定区(CL)。

在一个优选的实施方案中，双特异性抗体包含第一和第二重链，其中所述第一和第二重链中的每个至少包含铰链区、CH2和CH3区，其中在所述第一重链中对应于选自T366,L368,K370,D399,F405,Y407,和K409(根据EU编号)的位置的位置中的至少一个氨基酸已被取代，并且在所述第二重链中在对应于选自T366,L368,K370,D399,F405,Y407和K409(根据EU编号)的位置的位置中的至少一个氨基酸已被取代，其中所述第一重链和所述第二重链不在相同位置中取代。

最优选地，(i)在所述第一重链中对应于F405(根据EU编号)的位置中的氨基酸是L，并且在所述第二重链中对应于K409(根据EU编号)的位置中的氨基酸是R，或(ii)在所述第一重链中对应于K409(根据EU编号)的位置中的氨基酸是R，并且在所述第二重链中对应于F405(根据EU编号)的位置中的氨基酸是L。

在另一个特别优选的实施方案中，所述抗体是包含第一和第二重链的CD3xPD-L1双特异性抗体，其中根据第一重链和第二重链两者的EU编号，对应于人IgG1重链中位置L234和L235的位置分别为F和E，其中(i)根据第一重链的EU编号对应于人IgG1重链中F405的位置为L，并且根据第二重链的EU编号对应于人IgG1重链中K409的位置为R，或(ii)根据第一重链的EU编号对应于人IgG1重链中K409的位置为R，并且根据第二重链的EU编号对应于人IgG1重链中F405的位置为L。

在另一个特别优选的实施方案中，抗体是包含第一和第二重链的CD3xPD-L1双特异性抗体，其中根据第一重链和第二重链两者的EU编号，对应于人IgG1重链中位置L234,L235和D265的位置分别为F,E和A，其中(i)根据第一重链的EU编号对应于人IgG1重链中F405的位置为L，并且根据第二重链的EU编号对应于人IgG1重链中K409的位置为R，或(ii)根据第一重链的EU编号对应于人IgG1重链中K409的位置为R，并且根据第二重链的EU编号对应于人IgG1重链中F405的位置为L。

新的PD-L1抗体类别

在另一方面，本发明提供了新型抗PD-L1抗体，其包含能够结合人PD-L1的抗原结合区。本发明的此方面的抗体可以是单特异性或多特异性的，并且，若是多特异性的，则所述多特异性抗体可以包含或可以不包含能够结合人CD3ε的抗原结合区。

在一个实施方案中，本发明提供了包含能够结合人PD-L1的抗原结合区的抗体，其中所述能够结合人PD-L1的抗原结合区具有如上文所定义的特征。

在一个实施方案中，本发明提供了包含能够结合人PD-L1的抗原结合区的抗体，其中抗体与突变体PD-L1的结合与具有以SEQ ID NO:94所示的氨基酸序列的野生型PD-L1的结合相比降低，在所述突变体PD-L1中对应于SEQ ID NO:94中位置113(R113)、123(Y123)和125(R125)的位置处的任何一个或多个氨基酸残基已经用丙氨酸取代；降低的结合以所述抗体结合的倍数变化小于所有丙氨酸突变体的结合平均倍数变化-1.5xSD确定，其中SD是所述抗体与所述突变体PDL1的所有计算的倍数变化的标准偏差并且结合的倍数变化如实施例13所述计算。

所述抗体可以结合PD-L1(SEQ ID NO:94)上的表位，所述表位包含SEQ ID NO:94的位置113处的氨基酸残基(R113)、位置123处的氨基酸残基(Y123)和/或位置125处的氨基酸残基(R125)。

在一个实施方案中，本发明提供了包含能够结合人PD-L1的抗原结合区的抗体，其中抗体与突变体PD-L1的结合与具有以SEQ ID NO:94所示的氨基酸序列的野生型PD-L1的结合相比降低，在所述突变体PD-L1中对应于SEQ ID NO:94中位置19(F19),42(F42),45(E45),46(K46),94(L94)和116(I116)的位置处的任何一个或多个氨基酸残基已经用丙氨酸取代；降低的结合以所述抗体结合的倍数变化小于所有丙氨酸突变体的结合平均倍数变化-1.5xSD确定，其中SD是所述抗体与所述突变体PDL1的所有计算的倍数变化的标准偏差并且结合的倍数变化如实施例13所述计算。

抗体可以结合PD-L1(SEQ ID NO:94)上的表位，所述表位包含一个或多个选自下组的氨基酸残基：SEQ ID NO:94的位置45处的氨基酸残基(E45)、位置46处的氨基酸残基(K46)和/或位置94处的氨基酸残基(L94)。

在一个实施方案中，本发明提供了包含能够结合人PD-L1的抗原结合区的抗体，其中抗体与突变体PD-L1的结合与具有以SEQ ID NO:94所示的氨基酸序列的野生型PD-L1的结合相比降低，在所述突变体PD-L1中对应于SEQ ID NO:94中位置58(E58)和113(R113)的位置处的任何一个或多个氨基酸残基已经用丙氨酸取代；降低的结合以所述抗体结合的倍数变化小于所有丙氨酸突变体的结合平均倍数变化-1.5xSD确定，其中SD是所述抗体与所述突变体PDL1的所有计算的倍数变化的标准偏差并且结合的倍数变化如实施例13所述计算。

抗体可以结合PD-L1(SEQ ID NO:94)上的表位，所述表位包含SEQ ID NO:94的位置58处的氨基酸残基(E58)和/或位置113处的氨基酸残基(R113)。

在进一步的实施方案中，根据本发明的抗体能够通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)来诱导腺癌的上皮细胞(例如MDA-MB-231)的剂量依赖性裂解。

在其他实施方案中，根据本发明的抗体能够由于细胞裂解而使所述上皮细胞培养物中的细胞数目减少至少5％，例如至少6％，7％，8％，9％或至少10％。

可以在⁵¹Cr释放测定法，例如实施例14中公开的测定法中体外测定ADCC。特别地，通过于37℃,5％CO₂将所述上皮细胞与包含所述抗体和效应细胞，例如外周血单个核细胞(PBMC)的组合物一起温育4小时在体外测定ADCC，所述组合物中抗体的量在0.1-1μg/mL的范围内，并且效应细胞与上皮细胞的比率为100:1。

可以在作为ADCC替代的萤光素酶报告物测定法，例如实施例14中公开的发光ADCC报告物生物测定法中体外测定上皮细胞的裂解。

特别地，可以如下体外测定ADCC：

i)以效应细胞:上皮细胞比率为1:1使所述上皮细胞的培养物与包含抗体和稳定表达FcγRIIIa(CD16)和萤火虫萤光素酶的Jurkat人T细胞(效应细胞)的组合物接触。

ii)将所述上皮细胞和效应细胞的培养物调节至室温15分钟，

iii)将所述上皮细胞和效应细胞的培养物与萤光素酶底物一起温育，以及

iv)测定所述细胞培养物中的萤光素酶产生；

所述组合物中抗体的量在0.5-250ng/mL的范围内，并且效应细胞与上皮细胞的比率为1:1。

可以在萤光素酶报告物测定法，例如权利要求23或24中定义的报告物测定法中来测定所述上皮细胞的ADCC，则在所述上皮细胞培养物与包含所述抗体的测试组合物的温育后观察到的ADCC是在所述上皮细胞培养物与包含参考抗体的组合物温育后观察到的ADCC的至少1.5倍；ADCC以相对发光单位(RLU)测定，所述测试组合物中和包含参考抗体的所述组合物中的抗体浓度相同并且在20至250ng/ml的范围内，并且所述参考抗体选自：

a)包含以SEQ ID NO:74所示的VH序列和以SEQ ID NO:78所示的VL序列的抗体；和

b)包含以SEQ ID NO:81所示的VH序列和以SEQ ID NO:85所示的VL序列的抗体。

在一个实施方案中，提供了包含能够结合人PD-L1的抗原结合区的抗体，其中所述能够结合人PD-L1的抗原结合区包括包含CDR1，CDR2和CDR3序列的重链可变区(VH)以及包含CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区(VL)，其中VH CDR3序列选自下组：以SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:21所示的序列。

在另一个实施方案中，提供了包含能够结合人PD-L1的抗原结合区的抗体，其中所述能够结合人PD-L1的抗原结合区包含：

(i)包含分别以SEQ ID NO:2、3和4所示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区(VH)和包含分别具有以SEQID NO:6所示的序列、序列KAS和以SEQ ID NO:7所示的序列的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区(VL)，或

(ii)包含分别以SEQ ID NO:9、10和11所示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区(VH)和包含分别具有以SEQID NO:16所示序列、序列EDS和以SEQ ID NO:17所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区(VL)或

(iii)包含分别以SEQ ID NO:19、20和21所示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区(VH)和包含分别具有以SEQID NO:23所示的序列、序列DDN和以SEQ ID NO:24所示的序列的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区(VL)。

在另一个实施方案中，提供了包含能够结合人PD-L1的抗原结合区的抗体，其中所述能够结合人PD-L1的抗原结合区包含与选自下组的VH序列的氨基酸序列具有至少90％，至少95％，至少97％，至少99％或100％的氨基酸序列同一性的VH序列：以SEQ ID NO:1，SEQID NO:8和SEQ ID NO:18所示的序列。

在另一个实施方案中，提供了包含能够结合人PD-L1的抗原结合区的抗体，其中所述能够结合人PD-L1的抗原结合区包含与选自下组的VL序列的氨基酸序列具有至少90％，至少95％，至少97％，至少99％或100％的氨基酸序列同一性的VL序列：以SEQ ID NO:52、以SEQ ID NO:15和以SEQ ID NO:22所示的序列。

(i)与以SEQ ID NO:1所示的VH序列具有至少90％，至少95％，至少97％，至少99％或100％的氨基酸序列同一性的VH序列和与SEQ ID NO:5所示的VL序列具有至少90％，至少95％，至少97％，至少99％或100％的氨基酸序列同一性的VL序列，或

(ii)与以SEQ ID NO:8所示的VH序列具有至少90％，至少95％，至少97％，至少99％或100％的氨基酸序列同一性的VH序列和与SEQ ID NO:15所示的VL序列具有至少90％，至少95％，至少97％，至少99％或100％的氨基酸序列同一性的VL序列，或

(iii)与以SEQ ID NO:18所示的VH序列具有至少90％，至少95％，至少97％，至少99％或100％的氨基酸序列同一性的VH序列和与SEQ ID NO:22所示的VL序列具有至少90％，至少95％，至少97％，至少99％或100％的氨基酸序列同一性的VL序列。

在另一个实施方案中，提供了包含能够结合人PD-L1的抗原结合区的抗体，其中所述能够结合人PD-L1的抗原结合区包含VH和VL序列，所述VH和VL序列各自包含三个CDR序列，分别为CDR1、CDR2和CDR3和四个框架序列，分别为FR1、FR2、FR3和FR4，并且其中VH的相应组合的FR1、FR1、FR2、FR3和FR4框架序列与所述VH序列的相应组合的的FR1、FR2、FR3和FR4框架序列具有至少90％，至少95％，至少97％或至少99％的氨基酸序列同一性，并且其中VH CDR序列未突变，并且其中VL的相应组合的FR1、FR2、FR3和FR4框架序列与所述VL序列的相应组合的FR1、FR2、FR3和FR4框架序列具有至少90％，至少95％，至少97％或至少99％的氨基酸序列同一性，并且其中所述VL CDR序列未突变。

在另一个实施方案中，提供了包含能够结合人PD-L1的抗原结合区的抗体，其中所述能够结合人PD-L1的抗原结合区：

(i)以SEQ ID NO:1所示的VH序列和以SEQ ID NO:5所示的VL序列，或

(ii)以SEQ ID NO:8所示的VH序列和以SEQ ID NO:15所示的VL序列，或

(iii)如以SEQ ID NO:18所示的VH序列和以SEQ ID NO:22所示的VL序列。

在另一个实施方案中，提供了包含能够结合人PD-L1的抗原结合区的抗体，其中所述抗体：

(i)与包含以SEQ ID NO:8所示的VH序列和以SEQ ID NO:15所示的VL序列的抗体竞争与人PD-L1的结合，但不与包含以SEQ ID NO:18所示的VH序列和以SEQ ID NO:22所示的VL序列的抗体竞争与人PD-L1的结合，或

(ii)与包含以SEQ ID NO:18所示的VH序列和以SEQ ID NO:22所示的VL序列的抗体竞争与人PD-L1的结合，但不与包含以SEQ ID NO:8所示的VH序列和以SEQ ID NO:15所示的VL序列的抗体竞争与人PD-L1的结合。

优选地，所述抗体与包含以SEQ ID NO:1所示的VH序列和以SEQ ID NO:5所示的VL序列的抗体竞争与人PD-L1的结合。

在另一个实施方案中，提供了包含能够结合人PD-L1的抗原结合区的抗体，其中所述抗体与人PD-L1的结合不被包含以SEQ ID NO:53所示的VH序列和SEQ ID NO:57所示的VL序列的抗体置换。

在另一个实施方案中，提供了包含能够结合人PD-L1的抗原结合区的抗体，其中所述抗体与人PD-L1的结合不被包含以SEQ ID NO:106所示的VH序列和以SEQ ID NO:110所示的VL序列的抗体的结合阻断。

在另一个实施方案中，提供了包含能够结合人PD-L1的抗原结合区的抗体，其中所述抗体与人PD-L1的结合不被包含以SEQ ID NO:53所示的VH序列和以SEQ ID NO:57所示的VL序列的抗体置换，且其中所述抗体抑制人PD-L1与人PD-1的结合。

在另一个实施方案中，提供了包含能够结合人PD-L1的抗原结合区的抗体，其中所述抗体与人PD-L1的结合不被包含以SEQ ID NO:53所示的VH序列和以SEQ ID NO:57所示的VL序列的抗体置换，且其中所述抗体与包含以SEQ ID NO:18所示的VH序列和以SEQ ID NO:22所示的VL序列的抗体竞争与人PD-L1的结合。

在另一个实施方案中，提供了包含能够结合人PD-L1的抗原结合区的抗体，其中所述抗体与人PD-L1的结合不被包含以SEQ ID NO:53所示的VH序列和以SEQ ID NO:57所示的VL序列的抗体置，且其中所述抗体与人PD-L1的结合被包含以SEQ ID NO:18中所述的VH序列和以SEQ ID NO:22所示的VL序列的抗体阻断。本文中的“阻断”指示包含以SEQ ID NO:18所示的VH序列和SEQ ID NO:22所示的VL序列的抗体与双特异性抗体竞争，但不置换它。

在另一方面，本发明涉及包含能够结合人PD-L1的抗原结合区的抗体，其中所述抗体包含：

(i)包含分别以SEQ ID NO:33、34和35所示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区(VH)和包含分别具有以SEQ ID NO:37所示的序列、序列KAS和以SEQ ID NO:38所示的序列的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区(VL)，或

(ii)包含分别以SEQ ID NO:47、48和49所示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区(VH)和包含分别具有以SEQ ID NO:51所示的序列、序列DVI和以SEQ ID NO:52所示的序列的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区(VL)，或

(iii)包含分别以SEQ ID NO:54、55和56所示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区(VH)和包含分别具有以SEQ ID NO:58所示的序列、序列RDS和以SEQ ID NO:59所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区(VL)或

(iv)包含以分别SEQ ID NO:61、62和63所示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区(VH)和包含分别具有以SEQ ID NO:65所示的序列，序列DDS和以SEQ ID NO:66所示的序列的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区(VL)，或

(v)包含以分别SEQ ID NO:107、108和109所示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区(VH)和包含分别具有以SEQ ID NO:111所示的序列、序列EDS和以SEQ ID NO:113所示的序列的CDR1，CDR2和CDR的轻链可变区(VL)

(vi)包含以分别EQ ID NO：68、69和70所示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区(VH)和包含分别具有以SEQ ID NO:72所示的序列、序列EDS和以SEQ ID NO:73所示的序列的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区(VL)。

在另一个实施方案中，抗体包含：

(i)以SEQ ID NO:32所示的VH序列和以SEQ ID NO:36所示的VL序列，或

(ii)以SEQ ID NO:46所示的VH序列和以SEQ ID NO:50所示的VL序列，或

(iii)以SEQ ID NO:53所示的VH序列和以SEQ ID NO:57所示的VL序列，或

(iv)以SEQ ID NO:60所示的VH序列和以SEQ ID NO:64所示的VL序列，或

(v)以SEQ ID NO:106所示的VH序列和以SEQ ID NO:110所示的VL序列，或

(v)以SEQ ID NO:67所示的VH序列和以SEQ ID NO:71所示的VL序列。

在一个实施方案中，包含能够结合人PD-L1的抗原结合区的抗体是单价的。

在另一个实施方案中，包含能够结合人PD-L1的抗原结合区的抗体是包含两个或更多个相同抗原结合区的单特异性抗体。

在另一个实施方案中，包含能够结合人PD-L1的抗原结合区的抗体是具有两个能够结合人PD-L1的抗原结合区的二价抗体，并且其中所述两个抗原结合区具有相同的可变区序列。

在不同的实施方案中，包含能够结合人PD-L1的抗原结合区的抗体是二价双特异性抗体，除了能够结合人PD-L1的所述(第一)抗原结合区之外，它还包括能够结合第二抗原的(第二)抗原结合区，其中所述第二抗原是人CD3ε。

在不同的实施方案中，包含能够结合人PD-L1的抗原结合区的抗体是二价双特异性抗体，除了能够结合人PD-L1的所述(第一)抗原结合区之外，它还包含能够结合第二抗原或人PD-L1的不同表位的(第二)抗原结合区，其中所述第二抗原不是人CD3ε。

在另一方面，本发明涉及多特异性抗体，其包含能够结合人PD-L1的第一抗原结合区和能够结合第二抗原或人PD-L1的不同表位的第二抗原结合区，其中所述第二抗原任选地不是人CD3ε，并且其中所述能够结合人PD-L1的抗原结合区包括包含CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区(VH)和包含CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区(VL)，其中VH CDR3序列选自下组：以SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:11，SEQ ID NO:21，SEQ ID NO:35，SEQ ID NO:49，SEQID NO:56，SEQ ID NO:63和SEQ ID NO:70所示的序列。本文中的“不同表位”是指第二抗原结合区结合的表位不同于第一抗原结合区结合的表位。

在所述多特异性抗体的一个实施方案中，所述能够结合人PD-L1的抗原结合区包含：

(ii)包含分别以SEQ ID NO:9、10和11所示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区(VH)和包含分别具有以SEQID NO:16所示序列、序列EDS和以SEQ ID NO:17所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区(VL)，或

(iii)包含分别以SEQ ID NO:19、20和21所示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区(VH)和包含分别具有以SEQ ID NO:23所示序列，序列DDN和以SEQ ID NO:24所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区(VL)，

(iv)包含分别以SEQ ID NO:33、34和35所示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区(VH)和包含分别具有以SEQID NO:37所示序列，序列KAS和SEQ ID NO:38所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区(VL)，或

(v)包含分别以SEQ ID NO:47、48和49所示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区(VH)和包含分别具有以SEQ ID NO:51所示序列，序列DVI和SEQ ID NO:52所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区(VL)，或

(vi)包含分别以SEQ ID NO:54、55和56所示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区(VH)和包含分别具有以SEQID NO:58所示序列，序列RDS和SEQ ID NO:59所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区(VL)，或

(vii)包含分别以SEQ ID NO:61、62和63所示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区(VH)和包含分别具有以SEQID NO:65所示序列，序列DDS和SEQ ID NO:66所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区(VL)，或

(viii)包含分别以SEQ ID NO:68、69和70所示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区(VH)和包含分别具有以SEQID NO:72所示的序列，序列EDS和SEQ ID NO:73所示的序列的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区(VL)。

在所述多特异性抗体的另一个实施方案中，所述能够结合人PD-L1的抗原结合区包含与选自下组的VH序列的具有至少90％，至少95％，至少97％，至少99％或100％氨基酸序列同一性的VH序列：以SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:18所示的序列。

在所述多特异性抗体的另一个实施方案中，所述能够结合人PD-L1的抗原结合区包含与选自下组的VL序列的具有至少90％，至少95％，至少97％，至少99％或100％氨基酸序列同一性的VL序列：以SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:22所示的序列。

在所述多特异性抗体的另一个实施方案中，所述能够结合人PD-L1的抗原结合区包含：

在所述多特异性抗体的另一个实施方案中，所述VH和VL序列各自包含三个CDR序列，分别为CDR1、CDR2和CDR3，以及四个框架序列，分别为FR1、FR2、FR3和FR4，并且其中VH的相应组合的FR1、FR2、FR3和FR4框架序列与所述VH序列的相应组合的的FR1、FR2、FR3和FR4框架序列具有至少90％，至少95％，至少97％或至少99％的氨基酸序列同一性，并且其中VHCDR序列未突变，和其中VL的相应组合的FR1、FR2、FR3和FR4框架序列与所述VL序列的相应组合的FR1、FR2、FR3和FR4框架序列具有至少90％，至少95％，至少97％或至少99％的氨基酸序列同一性，并且其中所述VL CDR序列未突变。

(i)以SEQ ID NO:1所示的VH序列和以SEQ ID NO:5所示的VL序列，或

(ii)以SEQ ID NO:8所示的VH序列和以SEQ ID NO:15所示的VL序列，或

(iii)以SEQ ID NO:18所示的VH序列和以SEQ ID NO:22所示的VL序列，或

(iv)SEQ ID NO:32所示的VH序列和以SEQ ID NO:36所示的VL序列，或

(v)SEQ ID NO:46所示的VH序列和以SEQ ID NO:50所示的VL序列，或

(vi)以SEQ ID NO:53所示的VH序列和以SEQ ID NO:57所示的VL序列，或

(v)以SEQ ID NO:106所示的VH序列和以SEQ ID NO:110所示的VL序列，或

(vii)以SEQ ID NO:60所示的VH序列和以SEQ ID NO:64所示的VL序列，或

(viii)以SEQ ID NO:67所示的VH序列和以SEQ ID NO:71所示的VL序列。

在另一方面，本发明涉及多特异性抗体，其包含能够结合人PD-L1的第一抗原结合区和能够结的第二抗原或人PD-L1的不同表位的第二抗原结合区，其中所述第二抗原任选地不是人CD3ε，其中所述抗体：

在所述多特异性抗体的一个实施方案中，所述抗体与包含以SEQ ID NO:1所示的VH序列和以SEQ ID NO:5所示的VL序列的抗体竞争与人PD-L1的结合。

在另一方面，本发明涉及多特异性抗体，其包含能够结合人PD-L1的第一抗原结合区和能够结合第二抗原或人PD-L1的不同表位的第二抗原结合区，其中所述抗体与人PD-L1的结合不被包含以SEQ ID NO:53所示的VH序列和SEQ ID NO:57所示的VL序列的抗体置换。

在本文的一个实施方案中，抗体抑制人PD-L1与人PD-1的结合。

在另一个实施方案中，抗体与包含以SEQ ID NO:18所示的VH序列和以SEQ ID NO:22所示的VL序列的抗体竞争与人PD-L1的结合。

在另一个实施方案中，所述抗体与人PD-L1的结合被包含以SEQ ID NO:18所示的VH序列和SEQ ID NO:22所示的VL序列的抗体阻断。本文中的“阻断”指示包含以SEQ ID NO:18所示的VH序列和SEQ ID NO:22所示的VL序列的抗体与双特异性抗体竞争，但不置换它。

在另一方面，本发明涉及多特异性抗体，其包含能够结合人PD-L1的第一抗原结合区和能够结合第二抗原或人PD-L1的不同表位的第二抗原结合区，其中所述第二抗原任选地不是人CD3ε，并且其中所述第一抗原结合区：

另一方面，本发明涉及二价双特异性抗体，其包含能够结合人PD-L1的第一抗原结合区和能够结合第二抗原或人PD-L1的不同表位的第二抗原结合区，其中所述第二抗原任选地不是人CD3ε，并且其中所述能够结合人PD-L1的抗原结合区包含包含CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区(VH)和包含CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区(VL)，其中VH CDR3序列选自下组：以SEQ ID NO:4，SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:21所示的序列。

在所述二价双特异性抗体的一个实施方案中，所述能够结合人PD-L1的抗原结合区包含：

(i)包含分别以SEQ ID NO:2、3和4所示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区(VH)和包含分别具有以SEQ ID NO:6所示序列、序列KAS和以SEQ ID NO:7所示序列的CDR1，CDR2和CDR3的轻链可变区(VL)，或

(ii)包含分别以SEQ ID NO:9、10和11所示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区(VH)和包含分别具有以SEQ ID NO:16所示序列，序列EDS和以SEQ ID NO:17所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区(VL)，或

(iii)包含分别以SEQ ID NO:19、20和21所示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区(VH)和包含分别具有以SEQ ID NO:23所示的序列，序列DDN和以SEQ ID NO:24所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区(VL)。

在所述二价双特异性抗体的另一个实施方案中，所述能够结合人PD-L1的抗原结合区包含与选自下组的VH序列具有至少90％，至少95％，至少97％，至少99％或100％氨基酸序列同一性的VH序列：以SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:18所示的序列。

在所述二价双特异性抗体的另一个实施方案中，所述能够结合人PD-L1的抗原结合区包含与选自下组的VL序列具有至少90％，至少95％，至少97％，至少99％或100％氨基酸序列同一性的VL序列：以SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:22所示的序列

在所述二价双特异性抗体的另一个实施方案中，所述能够结合人PD-L1的抗原结合区包含：

在所述二价双特异性抗体的另一个实施方案中，所述VH和VL序列各自包含三个CDR序列，分别为CDR1、CDR2和CDR3和四个框架序列，分别为FR1、FR2、FR3和FR4，并且其中VH的相应组合的FR1、FR2、FR3和FR4框架序列与所述VH序列的相应组合的的FR1、FR2、FR3和FR4框架序列具有至少90％，至少95％，至少97％或至少99％的氨基酸序列同一性，并且其中VH CDR序列未突变，和其中VL的相应组合的FR1、FR2、FR3和FR4框架序列与所述VL序列的相应组合的FR1、FR2、FR3和FR4框架序列具有至少90％，至少95％，至少97％或至少99％的氨基酸序列同一性，并且其中所述VL CDR序列未突变。

(i)以SEQ ID NO:1所示的VH序列和以SEQ ID NO:5所示的VL序列，或

(ii)以SEQ ID NO:8所示的VH序列和以SEQ ID NO:15所示的VL序列，或

(iii)以SEQ ID NO:18所示的VH序列和以SEQ ID NO:22所示的VL序列。

另一方面，本发明涉及二价双特异性抗体，其包含能够结合人PD-L1的第一抗原结合区和能够结合第二抗原或人PD-L1的不同表位的第二抗原结合区，其中所述第二抗原任选地不是人CD3ε，其中所述抗体：

在所述二价双特异性抗体的一个实施方案中，所述抗体与包含以SEQ ID NO:1所示的VH序列和SEQ ID NO:5所示的VL序列的抗体竞争与人PD-L1的结合。

另一方面，本发明涉及二价双特异性抗体，其包含能够结合人PD-L1的第一抗原结合区和能够结合第二抗原或人PD-L1的不同表位结合的第二抗原结合区，其中所述抗体与人PD-L1的结合不被包含以SEQ ID NO:53所示的VH序列和以SEQ ID NO:57所示的VL序列的抗体置换。

在本文的一个实施方案中，抗体抑制人PD-L1与人PD-1的结合。

在另一个实施方案中，所述抗体与人PD-L1的结合被包含以SEQ ID NO:18所示的VH序列和SEQ ID NO:22所示的VL序列的抗体阻断。本文中的“阻断的”指示包含以SEQ IDNO:18所示的VH序列和以SEQ ID NO:22所示的VL序列的抗体与双特异性抗体竞争，但不置换它。

另一方面，本发明涉及二价双特异性抗体，其包含能够结合人PD-L1的第一抗原结合区和能够结合第二抗原或人PD-L1的不同表位的第二抗原结合区，其中所述第二抗原任选地不是人CD3ε，并且其中所述第一抗原结合区：

(iii)能够与包含以SEQ ID NO:18所示的VH序列和以SEQ ID NO:22所示的VL序列的抗体结合人PD-L1的相同表位。

本发明的抗体的其他实施方案

在一个实施方案中，当如本文实施例8所述测定时，根据本发明的抗体以约10^-8M或更低，例如约10^-9M或更低，例如约10^-10或更低的KD结合人PD-L1。

在另一个实施方案中，当在本文的实施例11中所述测定时，当使用纯化的T细胞作为效应细胞时，本发明的抗体介导MDA-MB-231细胞、PC-3细胞和/或HELA细胞的浓度依赖性细胞毒性。

在一个优选的实施方案中，本发明的抗体不结合人PD-L2。

抗体形式

如上所述，本领域已经描述了多种形式的抗体。本发明的抗体原则上可以是任何同种型。同种型的选择通常将由期望的Fc介导的效应器功能(如ADCC诱导)或对缺少Fc介导的效应器功能的抗体(“惰性”抗体)的需要引导。示例性的同种型是IgG1，IgG2，IgG3和IgG4。可以使用人轻链恒定区中的kappa或lambda。本发明的抗体的效应器功能可以通过同种型转换成例如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgD，IgA，IgE或IgM抗体改变，用于各种治疗用途。在一个实施方案中，本发明的抗体的两条重链均为IgG1同种型，例如IgG1，κ。任选地，重链可以在铰链和/或CH3区中修饰，如本文其他地方所述。

优选地，每个抗原结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，并且其中所述可变区各自包含三个CDR序列，分别为CDR1、CDR2和CDR3，以及四个框架序列，分别为FR1、FR2、FR3和FR4。此外，优选地，抗体包含两个重链恒定区(CH)和两个轻链恒定区(CL)。

在一个实施方案中，抗体是全长抗体，例如全长IgG1抗体。在另一个实施方案中，抗体是全长IgG4抗体，优选具有稳定化的铰链区。使IgG4铰链区稳定化的修饰，例如核心铰链中的S228P突变已经在本领域中进行了描述，参见例如Labrijn et al.,2009NatBiotechnol.27(8):767-71。

在其他实施方案中，本发明的抗体是抗体片段，例如Fab'或Fab片段、由VL、VH、CL和CH1域组成的单价片段、如WO2007059782(Genmab)中所述的单价抗体、F(ab')₂片段、Fd片段、Fv片段、dAb片段、骆驼科(camelid)抗体或纳米抗体(nanobodies)、或分离的互补决定区(CDR)。

本发明的抗体优选是人的、人源化的或嵌合的。在抗体是双特异性抗体的实施方案中，两个半分子可以是人的、人源化的或嵌合的，或者半分子可以就序列起源而言特征不同。

例如，在一个实施方案中，双特异性抗体包含两个各包含抗原结合区的半分子，其中

(i)包含能够结合人PD-L1的抗原结合区的半分子是嵌合的，和/或

(ii)包含能够结合人CD3ε(epsilon)的抗原结合区的半分子(若有的话)是嵌合的。

例如，在另一个实施方案中，双特异性抗体包含两个各包含抗原结合区的半分子，其中

(i)包含能够结合人PD-L1的抗原结合区的半分子是人源化的，和/或

(ii)包含能够结合CD3ε(epsilon)的抗原结合区的半分子(若有的话)是人源化的。

(i)包含能够结合人PD-L1的抗原结合区的半分子是人的和/或

(ii)包含能够结合人CD3ε(epsilon)的抗原结合区的半分子(若有的话)是人的。

因此，例如，在一个实施方案中，能够结合人PD-L1的抗原结合区是人源化的，并且若存在的话，能够结合人CD3ε(epsilon)的抗原结合区是人源化的。

在另一个实施方案中，能够结合人PD-L1的抗原结合区是人的，并且若存在的话，能够结合人CD3ε(epsilon)的抗原结合区是人的。

在另一个实施方案中，抗体是双特异性抗体，其包含能够结合人PD-L1的抗原结合区和能够结合人CD3ε(epsilon)的抗原结合区，其中包含能够结合人PD-L1的抗原结合区域的半分子是人的、人源化的或嵌合的，并且包含能够结合人CD3ε(epsilon)的抗原结合区的半分子是人源化的。

优选地，包含能够结合人PD-L1的抗原结合区的半分子是人的，并且包含能够结合人CD3ε(epsilon)的抗原结合区的半分子是人源化的。

双特异性抗体形式

双特异性抗体的许多不同形式和用途是本领域已知的，并且已由Kontermann；Drug Discov Today,2015Jul；20(7):838-47和MAbs,2012 Mar-Apr；4(2):182-97进行了综述。

根据本发明的双特异性抗体不限于任何特定的双特异性形式或生产它的方法。

可用于本发明的双特异性抗体分子的实例包括：(i)具有包含不同抗原结合区的两个臂的单一抗体；和(ii)对两个不同表位具有特异性的单链抗体，例如，通过两个额外的肽接头串联连接的scFv；(iii)双重可变域抗体(DVD-Ig)，其中每个轻链和重链含有通过短肽连接串联的两个可变域(Wu et al.,Generation and Characterization of a DualVariable Domain Immunoglobulin(DVD-Ig^TM)Molecule,于:Antibody Engineering,Springer Berlin Heidelberg(2010))；(iv)化学连接的双特异性(Fab’)2片段；(v)Tandab，其是两个单链双抗体(diabodies)的融合体，产生四价双特异性抗体，该四价双特异性抗体对每个靶抗原具有两个结合位点；(vi)柔性体(flexibody)，其是scFv与双抗体的组合，产生多价分子；(vii)基于蛋白质激酶A中“二聚化和对接域”的所谓“对接和锁定”分子，其当应用于Fab时可以产生由与不同Fab片段连接的两个相同的Fab片段组成的三价双特异性结合蛋白；(viii)所谓的Scorpion分子，其包含例如与人Fab臂的两个末端融合的两个scFv；和(ix)双抗体。

在一个实施方案中，本发明的双特异性抗体是通过受控Fab臂交换获得的双抗体、交叉抗体(cross-body)或双特异性抗体(例如WO2011131746(Genmab)中所述)。

不同类别的双特异性抗体的实例包括但不限于：(i)具有互补CH3域以迫使异二聚化的IgG样分子；(ii)重组IgG样双重靶向分子，其中分子的两侧各含有至少两种不同抗体的Fab片段或Fab片段的部分；(iii)IgG融合分子，其中全长IgG抗体与额外的Fab片段或Fab片段的部分融合；(iv)Fc融合分子，其中单链Fv分子或稳定化的双抗体与重链恒定域、Fc区或其部分融合；(v)Fab融合分子，其中不同的Fab片段融合在一起，融合至重链恒定域，Fc区或其部分；和(vi)基于ScFv和双抗体的重链抗体(例如，域抗体，纳米抗体)，其中不同的单链Fv分子或不同的双抗体或不同的重链抗体(例如，域抗体，纳米抗体)彼此融合或融合到另一种蛋白质或载体分子，其融合到重链恒定域、Fc区或其部分。

具有互补CH3域分子的IgG类分子的实例包括但不限于Triomab/Quadroma分子(Trion Pharma/Fresenius Biotech；Roche,WO2011069104)、所谓的突出-入-空穴分子(Genentech,WO9850431)、CrossMAbs(Roche,WO2011117329)和静电匹配分子(Amgen,EP1870459和WO2009089004；Chugai,US201000155133；Oncomed,WO2010129304)、LUZ-Y分子(Genentech,Wranik et al.J.Biol.Chem.2012,287(52):43331-9,doi:10.1074/jbc.M112.397869.Epub 2012Nov 1)、DIG-body和PIG-body分子(Pharmabcine,WO2010134666,WO2014081202)、链交换工程化域体(SEEDbody)分子(EMD Serono,WO2007110205)、Biclonics分子(Merus,WO2013157953)、FcΔAdp分子(Regeneron,WO201015792)、双特异性IgG1和IgG2分子(Pfizer/Rinat,WO11143545)、Azymetric支架分子(Zymeworks/Merck,WO2012058768)、mAb-Fv分子(Xencor,WO2011028952)、二价双特异性抗体(WO2009080254)和分子(Genmab,WO2011131746)。

重组IgG样双重靶向分子的实例包括但不限于双重靶向(DT)-Ig分子(WO2009058383)、二合一抗体(Genentech；Bostrom,et al 2009.Science 323,1610–1614.)、交联的Mab(Karmanos Cancer Center)、mAb2(F-Star,WO2008003116)、Zybody分子(Zyngenia；LaFleur et al.MAbs.2013Mar-Apr；5(2):208-18)、采用共同轻链的方法(Crucell/Merus,US7,262,028),κλBodies(NovImmune,WO2012023053)和CovX-body(CovX/Pfizer；Doppalapudi,V.R.,et al 2007.Bioorg.Med.Chem.Lett.17,501–506.)。

IgG融合分子的实例包括但不限于双重可变域(DVD)-Ig分子(Abbott,US7,612,181)、双重域双头抗体(Unilever；Sanofi Aventis,WO20100226923)、IgG类双特异性分子(ImClone/Eli Lilly,Lewis etal.Nat Biotechnol.2014Feb；32(2):191-8)、Ts2Ab(MedImmune/AZ；Dimasi et al.J Mol Biol.2009Oct30；393(3):672-92)和BsAb分子(Zymogenetics,WO2010111625)、HERCULES分子(Biogen Idec,US007951918)、scFv融合分子(Novartis)、scFv融合分子(Changzhou Adam Biotech Inc,CN 102250246)和TvAb分子(Roche,WO2012025525,WO2012025530)。

Fc融合分子的实例包括但不限于ScFv/Fc融合体(Pearce et al.,Biochem MolBiol Int.1997Sep；42(6):1179-88)、SCORPION分子(Emergent BioSolutions/Trubion,Blankenship JW,et al.AACR 100th Annual meeting 2009(Abstract#5465)；Zymogenetics/BMS,WO2010111625)、双重亲和力再靶向技术(Fc-DART)分子(MacroGenics,WO2008157379,WO2010080538)和Dual(ScFv)2-Fab分子(National Research Center forAntibody Medicine–China)。

Fab融合双特异性抗体的实例包括但不限于F(ab)2分子(Medarex/AMGEN；Deo etal J Immunol.1998Feb 15；160(4):1677-86.)、双重作用或Bis-Fab分子(Genentech,Bostrom,et al 2009.Science 323,1610–1614.)、锁定对接(DNL)分子(ImmunoMedics,WO2003074569,WO2005004809)、二价双特异性分子(Biotecnol,Schoonjans,JImmunol.2000Dec 15；165(12):7050-7.)和Fab-Fv分子(UCB-Celltech,WO2009040562A1)。

基于ScFv，基于双抗体的抗体和域抗体的实例包括但不限于双特异性T细胞结合剂(BiTE)分子(Micromet,WO2005061547)、串联双抗体分子(TandAb)(Affimed)Le Gall etal.,Protein Eng Des Sel.2004Apr；17(4):357-66.)、双重亲和力再靶向技术(DART)分子(MacroGenics,WO2008157379,WO2010080538)、单链双抗体分子(Lawrence,FEBSLett.1998Apr3；425(3):479-84)、TCR样分子(AIT,ReceptorLogics)、人血清清蛋白ScFv融合体(Merrimack,WO2010059315)和COMBODY分子(Epigen Biotech,Zhu et al.ImmunolCell Biol.2010Aug；88(6):667-75.)、双重靶向纳米抗体(Ablynx,Hmila et al.,FASEBJ.2010)和双重靶向仅重链域抗体。

一方面，本发明的双特异性抗体包括包含第一CH3区域的第一Fc序列和包含第二CH3区域的第二Fc序列，其中第一和第二CH3区域的序列不同并且使得所述第一和第二CH3区域之间的异二聚体相互作用比所述第一和第二CH3区域的每个同二聚体相互作用更强。在WO2011131746和WO2013060867(Genmab)(其通过引用并入本文)中提供了关于这些相互作用以及可以如何实现它们的更多细节。

如本文进一步所述，基于一种同二聚体起始PD-L1抗体和在CH3区中仅含有几个保守的不对称突变的一种能够结合不同PD-L1表位或其他抗原的同二聚体起始抗体(例如同源二聚体起始CD3抗体)，可以使用特定方法以高收率获得稳定的双特异性抗体，例如双特异性CD3xPD-L1抗体。不对称突变是指所述第一和第二CH3区的序列在不同位置处含有氨基酸取代。

在如本文中公开的任何实施方案中限定的双特异性抗体的一个实施方案中，第一CH3区具有选自下组的位置处的氨基酸取代：366,368,370,399,405,407和409并且第二CH3区具有选自下组的位置处的氨基酸取代：366,368,370,399,405,407和409，并且其中第一和第二CH3区在相同位置中未取代。

在如本文中公开的任何实施方案中限定的双特异性抗体的一个实施方案中，第一CH3区具有位置366处的氨基酸取代，并且所述第二CH3区具有选自下组的位置处的氨基酸取代：368,370,399,405,407和409。在一个实施方案中，位置366处的氨基酸取代选自Ala,Asp,Glu,His,Asn,Val或Gln。

在如本文中公开的任何实施方案中限定的双特异性抗体的一个实施方案中，第一CH3区具有位置368处的氨基酸取代，并且所述第二CH3区具有选自下组的位置处的氨基酸取代：366,370,399,405,407和409。

在如本文中公开的任何实施方案中限定的双特异性抗体的一个实施方案中，第一CH3区具有位置370处的氨基酸取代，并且所述第二CH3区具有选自下组的位置处的氨基酸取代：366,368,399,405,407和409。

在如本文中公开的任何实施方案中限定的双特异性抗体的一个实施方案中，第一CH3区具有位置399处的氨基酸取代，并且所述第二CH3区具有选自下组的位置处的氨基酸取代：366,368,370,405,407和409。

在如本文中公开的任何实施方案中限定的双特异性抗体的一个实施方案中，第一CH3区具有位置405处的氨基酸取代，并且所述第二CH3区具有选自下组的位置处的氨基酸取代：366,368,370,399,407和409。

在如本文中公开的任何实施方案中限定的双特异性抗体的一个实施方案中，第一CH3区具有位置407处的氨基酸取代，并且所述第二CH3区具有选自下组的位置处的氨基酸取代：366,368,370,399,405和409。

在如本文中公开的任何实施方案中限定的双特异性抗体的一个实施方案中，第一CH3区具有位置409处的氨基酸取代，并且所述第二CH3区具有选自下组的位置处的氨基酸取代：366,368,370,399,405和407。

因而，在如本文中公开的任何实施方案中限定的双特异性抗体的一个实施方案中，所述第一和第二CH3区的序列含有不对称突变，即两个CH3区中的不同位置处的突变，例如CH3区之一中位置405处的突变和另一个CH3区中的位置409处的突变。

在如本文中公开的任何实施方案中限定的双特异性抗体的一个实施方案中，第一CH3区具有409位置处的除Lys,Leu或Met以外的氨基酸，例如Gly,Ala,Val,Ile,Ser,Thr,Phe,Arg,His,Asp,Asn,Glu,Gln,Pro,Trp,Tyr或Cys并且所述第二CH3区具有选自下组的位置处的氨基酸取代：366,368,370,399,405和407。在一个此类实施方案中，所述第一CH3区具有409位置处的除Lys,Leu或Met以外的氨基酸，例如Gly,Ala,Val,Ile,Ser,Thr,Phe,Arg,His,Asp,Asn,Glu,Gln,Pro,Trp,Tyr或Cys，并且所述第二CH3区具有405位置处的除Phe外的氨基酸，例如Gly,Ala,Val,Ile,Ser,Thr,Lys,Arg,His,Asp,Asn,Glu,Gln,Pro,Trp,Tyr,Cys,Lys或Leu。在本文的进一步的实施方案中，所述第一CH3区具有409位置处的除Lys,Leu或Met以外的氨基酸，例如Gly,Ala,Val,Ile,Ser,Thr,Phe,Arg,His,Asp,Asn,Glu,Gln,Pro,Trp,Tyr或Cys，并且所述第二CH3区具有405位置处的除Phe,Arg或Gly以外的氨基酸，例如Leu,Ala,Val,Ile,Ser,Thr,Met,Lys,His,Asp,Asn,Glu,Gln,Pro,Trp,Tyr或Cys。

在如本文中公开的任何实施方案中限定的双特异性抗体的另一个实施方案中，所述第一CH3区包含405位置处的Phe和409位置处的除Lys,Leu或Met以外的氨基酸，例如Gly,Ala,Val,Ile,Ser,Thr,Phe,Arg,His,Asp,Asn,Glu,Gln,Pro,Trp,Tyr或Cys并且所述第二CH3区包含405位置处的除Phe以外的氨基酸，例如Gly,Ala,Val,Ile,Ser,Thr,Lys,Arg,His,Asp,Asn,Glu,Gln,Pro,Trp,Tyr,Leu,Met或Cys和409位置处的Lys。在本文的进一步实施方案中，所述第一CH3区包含405位置处的Phe和409位置处的除Lys,Leu或Met以外的氨基酸，例如Gly,Ala,Val,Ile,Ser,Thr,Phe,Arg,His,Asp,Asn,Glu,Gln,Pro,Trp,Tyr,或Cys并且所述第二CH3区包含405位置处的除Phe,Arg或Gly以外的氨基酸，例如Leu,Ala,Val,Ile,Ser,Thr,Met,Lys,His,Asp,Asn,Glu,Gln,Pro,Trp,Tyr或Cys和409位置处的Lys。

在如本文中公开的任何实施方案中限定的双特异性抗体的另一个实施方案中，所述第一CH3区包含405位置处的Phe和409位置处的除Lys,Leu或Met以外的氨基酸，例如Gly,Ala,Val,Ile,Ser,Thr,Phe,Arg,His,Asp,Asn,Glu,Gln,Pro,Trp,Tyr或Cys并且所述第二CH3区包含位置405处的Leu和位置409处的Lys。在本文的进一步的实施方案中，所述第一CH3区包含位置405处的Phe和位置409处的Arg并且所述第二CH3区包含位置405处的除Phe,Arg或Gly以外的氨基酸，例如Leu,Ala,Val,Ile,Ser,Thr,Lys,Met,His,Asp,Asn,Glu,Gln,Pro,Trp,Tyr或Cys和位置409处的Lys。在另一个实施方案中，所述第一CH3区包含位置405处的Phe和位置409处的Arg并且所述第二CH3区包含位置405处的Leu和位置409处的Lys。

在如本文中公开的任何实施方案中限定的双特异性抗体的另一个实施方案中，所述第一CH3区包含位置409处的除Lys,Leu或Met外的氨基酸，例如Gly,Ala,Val,Ile,Ser,Thr,Phe,Arg,His,Asp,Asn,Glu,Gln,Pro,Trp,Tyr或Cys并且所述第二CH3区包含位置409处的Lys、位置370处的Thr和位置405处的Leu。在另一个实施方案中，所述第一CH3区包含位置409处的Arg并且所述第二CH3区包含位置409处的Lys、位置370处的Thr和位置405处的Leu。

在如本文中公开的任何实施方案中限定的双特异性抗体的另一个实施方案中，所述第一CH3区包含位置370处的Lys、位置405处的Phe和位置409处的Arg，并且所述第二CH3区包含位置409处的Lys、位置370处的Thr和位置405处的Leu。

在如本文中公开的任何实施方案中限定的双特异性抗体的另一个实施方案中，所述第一CH3区包含位置409处的除Lys,Leu或Met以外的氨基酸，例如Gly,Ala,Val,Ile,Ser,Thr,Phe,Arg,His,Asp,Asn,Glu,Gln,Pro,Trp,Tyr或Cys并且所述第二CH3区包含位置409处的Lys和：a)位置350处的Ile和位置405处的Leu，或b)位置370处的Thr和位置405处的Leu。

在如本文中公开的任何实施方案中限定的双特异性抗体的另一个实施方案中，所述第一CH3区包含位置409处的Arg并且所述第二CH3区包含位置409处的Lys和：a)位置350处的Ile和位置405处的Leu，或b)位置370处的Thr和位置405处的Leu。

在如本文中公开的任何实施方案中限定的双特异性抗体的另一个实施方案中，所述第一CH3区包含位置350处的Thr、位置370处的Lys、位置405处的Phe和位置409处的Arg并且所述第二CH3区包含位置409处的Lys和：a)位置350处的Ile和位置405处的Leu，或b)位置370处的Thr和位置405处的Leu。

在如本文中公开的任何实施方案中限定的双特异性抗体的另一个实施方案中，所述第一CH3区包含位置350处的Thr、位置370处的Lys、位置405处的Phe和位置409处的Arg，并且所述第二CH3区包含位置350处的Ile、位置370处的Thr、位置405处的Leu和位置409处的Lys。

在如本文中公开的任何实施方案中限定的双特异性抗体的一个实施方案中，所述第一CH3区具有位置409处的除Lys,Leu或Met以外的氨基酸并且所述第二CH3区具有位置405处的除Phe以外的氨基酸，诸如除Phe,Arg或Gly以外；或者所述第一CH3区具有位置409处的除Lys,Leu或Met以外的氨基酸并且所述第二CH3区具有位置407处的除Tyr,Asp,Glu,Phe,Lys,Gln,Arg,Ser或Thr以外的氨基酸。

在一个实施方案中，如本文中公开的任何实施方案中限定的双特异性抗体包含具有位置409处的除Lys,Leu或Met以外的氨基酸的第一CH3区和具有位置407处的除Tyr,Asp,Glu,Phe,Lys,Gln,Arg,Ser或Thr以外的氨基酸的第二CH3区。

在一个实施方案中，如本文中公开的任何实施方案中限定的双特异性抗体包含具有位置407处的Tyr和位置409处的除Lys,Leu或Met以外的氨基酸的第一CH3区和具有位置407处的除Tyr,Asp,Glu,Phe,Lys,Gln,Arg,Ser或Thr以外的氨基酸和位置409处的Lys的第二CH3区。

在一个实施方案中，如本文中公开的任何实施方案中限定的双特异性抗体包含具有位置407处的Tyr和位置409处的Arg的第一CH3区和具有位置407处的除Tyr,Asp,Glu,Phe,Lys,Gln,Arg,Ser或Thr以外的氨基酸和位置409处的Lys的第二CH3区。

在另一个实施方案中，所述第一CH3区具有位置409处的除Lys,Leu或Met以外的氨基酸，例如Gly,Ala,Val,Ile,Ser,Thr,Phe,Arg,His,Asp,Asn,Glu,Gln,Pro,Trp,Tyr或Cys并且所述第二CH3区具有位置407处的除Tyr,Asp,Glu,Phe,Lys,Gln,Arg,Ser或Thr以外的氨基酸，例如Leu,Met,Gly,Ala,Val,Ile,His,Asn,Pro,Trp或Cys。在另一个实施方案中，所述第一CH3区具有位置409处的除Lys,Leu或Met以外的氨基酸，例如Gly,Ala,Val,Ile,Ser,Thr,Phe,Arg,His,Asp,Asn,Glu,Gln,Pro,Trp,Tyr或Cys并且所述第二CH3区具有位置407处的Ala,Gly,His,Ile,Leu,Met,Asn,Val或Trp。

在如本文中公开的任何实施方案中限定的双特异性抗体的另一个实施方案中，所述第一CH3区具有位置409处的除Lys,Leu或Met以外的氨基酸，例如Gly,Ala,Val,Ile,Ser,Thr,Phe,Arg,His,Asp,Asn,Glu,Gln,Pro,Trp,Tyr,或Cys并且所述第二CH3区具有位置407处的Gly,Leu,Met,Asn或Trp。

在如本文中公开的任何实施方案中限定的双特异性抗体的另一个实施方案中，所述第一CH3区具有位置407处的Tyr和位置409处的除Lys,Leu或Met以外的氨基酸，例如Gly,Ala,Val,Ile,Ser,Thr,Phe,Arg,His,Asp,Asn,Glu,Gln,Pro,Trp,Tyr或Cys并且所述第二CH3区具有位置407处的除Tyr,Asp,Glu,Phe,Lys,Gln,Arg,Ser或Thr以外的氨基酸，例如Leu,Met,Gly,Ala,Val,Ile,His,Asn,Pro,Trp或Cys和位置409处的Lys。

在如本文中公开的任何实施方案中限定的双特异性抗体的另一个实施方案中，所述第一CH3区具有位置407处的Tyr和位置409处的除Lys,Leu或Met以外的氨基酸，例如Gly,Ala,Val,Ile,Ser,Thr,Phe,Arg,His,Asp,Asn,Glu,Gln,Pro,Trp,Tyr或Cys，并且所述第二CH3区具有位置407处的Ala,Gly,His,Ile,Leu,Met,Asn,Val或Trp和位置409处的Lys。

在如本文中公开的任何实施方案中限定的双特异性抗体的另一个实施方案中，所述第一CH3区具有位置407处的Tyr和位置409处的除Lys,Leu或Met以外的氨基酸，例如Gly,Ala,Val,Ile,Ser,Thr,Phe,Arg,His,Asp,Asn,Glu,Gln,Pro,Trp,Tyr或Cys，并且所述第二CH3区具有位置407处的Gly,Leu,Met,Asn或Trp和位置409处的Lys。

在如本文中公开的任何实施方案中限定的双特异性抗体的另一个实施方案中，所述第一CH3区具有位置407处的Tyr和位置409处的Arg并且所述第二CH3区具有位置407处的除Tyr,Asp,Glu,Phe,Lys,Gln,Arg,Ser或Thr以外的氨基酸，例如Leu,Met,Gly,Ala,Val,Ile,His,Asn,Pro,Trp或Cys和位置409处的Lys。

在如本文中公开的任何实施方案中限定的双特异性抗体的另一个实施方案中，所述第一CH3区具有位置407处的Tyr和位置409处的Arg，并且所述第二CH3区具有位置407处的Ala,Gly,His,Ile,Leu,Met,Asn,Val或Trp和位置409处的Lys。

在如本文中公开的任何实施方案中限定的双特异性抗体的另一个实施方案中，所述第一CH3区具有位置407处的Tyr和位置409处的Arg并且所述第二CH3区具有位置407处的Gly,Leu,Met,Asn或Trp和位置409处的Lys。

在如本文中公开的任何实施方案中限定的双特异性抗体的另一个实施方案中，第一CH3区具有位置409处的除Lys,Leu或Met以外的氨基酸，例如Gly,Ala,Val,Ile,Ser,Thr,Phe,Arg,His,Asp,Asn,Glu,Gln,Pro,Trp,Tyr或Cys并且第二CH3区具有

(i)位置368处的除Phe,Leu和Met以外的氨基酸，例如Gly,Ala,Val,Ile,Ser,Thr,Lys,Arg,His,Asp,Asn,Glu,Gln,Pro,Trp,Tyr或Cys，或

(ii)位置370处的Trp，或

(iii)位置399处的除Asp,Cys,Pro,Glu或Gln以外的氨基酸，例如Phe,Leu,Met,Gly,Ala,Val,Ile,Ser,Thr,Lys,Arg,His,Asn,Trp,Tyr或Cys，或

(iv)位置366处的除Lys,Arg,Ser,Thr或Trp以外的氨基酸，例如Phe,Leu,Met,Ala,Val,Gly,Ile,Asn,His,Asp,Glu,Gln,Pro,Tyr或Cys。

在一个实施方案中，第一CH3区具有位置409处的Arg,Ala,His或Gly并且第二CH3区具有

(i)位置368处的Lys,Gln,Ala,Asp,Glu,Gly,His,Ile,Asn,Arg,Ser,Thr,Val,或Trp，或

(ii)位置370处的Trp，或

(iii)位置399处的Ala,Gly,Ile,Leu,Met,Asn,Ser,Thr,Trp,Phe,His,Lys,Arg或Tyr，或

(iv)位置366处的Ala,Asp,Glu,His,Asn,Val,Gln,Phe,Gly,Ile,Leu,Met或Tyr。

在一个实施方案中，第一CH3区具有位置409处的Arg，并且第二CH3区具有

(i)位置368处的Asp,Glu,Gly,Asn,Arg,Ser,Thr,Val,或Trp，或

(ii)位置370处的Trp，或

(iii)位置399处的Phe,His,Lys,Arg或Tyr，或

(iv)位置366处的Ala,Asp,Glu,His,Asn,Val,Gln。

在一个优选的实施方案中，双特异性抗体包含第一和第二重链，其中所述第一和第二重链各自至少包含铰链区、CH2和CH3区，其中(i)所述第一重链中对应于F405(根据EU编号)的位置中的氨基酸是L，并且所述第二重链中对应于K409(根据EU编号)的位置中的氨基酸是R，或(ii)所述第一重链中对应于K409(根据EU编号)的位置中的氨基酸R，并且所述第二重链中对应于F405(根据EU编号)的位置中的氨基酸是L。

在上文规定的氨基酸取代外，所述第一和第二重链可以含有相对于野生型重链序列的进一步的氨基酸取代、缺失或***。

在进一步的实施方案中，所述第一和第二Fab臂(或重链恒定域)除了规定的突变外包含CH3序列，其独立选自下组：(IgG1m(a))(SEQ ID NO:96),(IgG1m(f))(SEQ ID NO:97),和(IgG1m(ax)(SEQ ID NO:98)。

在一个实施方案中，所述第一和所述第二Fc序列都不包含(核心)铰链区中的Cys-Pro-Ser-Cys序列。

在进一步的实施方案中，所述第一和所述第二Fc序列两者包含(核心)铰链区中的Cys-Pro-Pro-Cys序列。

制备双特异性抗体的方法

传统方法诸如杂交杂交瘤和化学缀合方法(Marvin and Zhu(2005)ActaPharmacol Sin 26:649)可以用于制备本发明的双特异性抗体。除了期望的双特异性抗体外，在宿主细胞中共表达两种抗体(它们由不同的重链和轻链组成)导致可能的抗体产物的混合物，其然后可以通过例如亲和层析或类似方法分离。

当共表达不同抗体构建体时，也可以使用有利于形成功能性双特异性产物的策略，例如，Lindhofer et al.(1995 J Immunol 155:219)所述的方法。产生不同抗体的大鼠和小鼠杂交瘤的融合导致有限数量的异二聚体蛋白，这是由于优先的物种限制的重/轻链配对。相对于同二聚体促进异二聚体形成的另一种策略是“突出-入-空穴”策略，其中在第一重链多肽中引入突出，并且在第二重链多肽中引入相应的腔，使得该突出可以位于这两个重链的界面处的腔中，从而促进异二聚体的形成并阻碍同二聚体的形成。通过用较大的侧链替换来自第一多肽的界面的小的氨基酸侧链来构建“突出”。通过用较小的氨基酸侧链替换大的氨基酸侧链在第二多肽的界面中创建与突出相同或相似大小的补偿“腔”(美国专利5,731,168)。EP1870459(Chugai)和WO2009089004(Amgen)描述了有利于在宿主细胞中不同抗体域共表达后异二聚体形成的其他策略。在这些方法中，构成这两个CH3域中CH3-CH3界面的一个或多个残基替换为带电荷的氨基酸，使得同二聚体的形成在静电上是不利的，而异二聚化在静电上是有利的。WO2007110205(Merck)描述了另一种策略，其中利用IgA和IgG CH3域之间的差异来促进异二聚化。

WO2008119353(Genmab)中已经描述了另一种产生双特异性抗体的体外方法，其中双特异性抗体通过还原条件下温育后两个单特异性抗体IgG4-或IgG4-样抗体之间的“Fab臂”或“半分子”交换(交换重链和连接的轻链)形成。所得的产物是具有两个可以包含不同序列的Fab臂的双特异性抗体。

本发明的制备双特异性抗体，例如双特异性CD3xPD-L1抗体的优选方法包括WO2011131746和WO2013060867(Genmab)中描述的方法，包括以下步骤：

a)提供包含Fc区的第一抗体，所述Fc区包含第一CH3区；

b)提供包含第二Fc区的第二抗体，所述Fc区包含第二CH3区，

其中第一抗体是根据本发明的PD-L1抗体，并且第二抗体是能够结合不同的PD-L1表位或不同的抗原，例如人CD3的抗体，或反之亦然；和

其中所述第一和第二CH3区域的序列是不同的，并且使得所述第一和第二CH3区域之间的异二聚体相互作用强于所述第一和第二CH3区域的每个同二聚体相互作用；

c)在还原条件下将所述第一抗体与所述第二抗体一起温育；和

d)获得所述双特异性抗体，例如双特异性PD-L1xCD3抗体。

类似地，提供了用于产生根据本发明的抗体的方法，该方法包括以下步骤：

a)培养产生包含如本文定义的能够结合人PD-L1的抗原结合区的第一抗体的宿主细胞，并从培养物中纯化所述第一抗体；

b)培养产生包含能够结合不同PD-L1表位或不同抗原的抗原结合区，例如如本文定义的人CD3ε结合区的第二抗体的宿主细胞，从培养物中纯化所述第二抗体；

c)在足以使铰链区中的半胱氨酸经历二硫键异构化的还原条件下将所述第一抗体与所述第二抗体一起温育。

d)获得所述双特异性抗体。

在一个实施方案中，在足以使铰链区中的半胱氨酸经历二硫键异构化的还原条件下将所述第一抗体与所述第二抗体一起温育，其中在所得异二聚体抗体中所述第一抗体和第二抗体之间的异二聚体相互作用使得在37℃的24小时后在0.5mM GSH未发生Fab臂交换。

不受理论的限制，在步骤c)中，亲本抗体的铰链区中的重链二硫键被还原，然后所得的半胱氨酸能够与另一个亲本抗体分子(最初具有不同的特异性)的半胱氨酸残基形成重链间的二硫键。在此方法的一个实施方案中，步骤c)中的还原条件包括添加还原剂，例如选自下组的还原剂：2-巯基乙胺(2-MEA)、二硫苏糖醇(DTT)、二硫丁四醇(DTE)、谷胱甘肽、三(2-羧乙基)膦(TCEP)、L-半胱氨酸和β-巯基-乙醇，优选选自下组的还原剂：2-巯基乙胺、二硫苏糖醇和三(2-羧乙基)膦。在另一个实施方案中，步骤c)包括恢复条件以变为非还原性的或还原性较小的，例如通过除去还原剂，例如通过脱盐。

对于此方法，可以使用任何抗体，例如上述的CD3和PD-L1抗体，包括分别包含第一和/或第二Fc区的第一和第二CD3和PD-L1抗体。此类第一和第二Fc区域(包括此类第一和第二Fc区域的组合)的例子可以包括上述的任何一个。在一个特定的实施方案中，可以分别选择第一抗体和第二抗体，例如CD3和PD-L1抗体，以获得如本文所述的双特异性抗体。

在此方法的一个实施方案中，所述第一和/或第二抗体是全长抗体。

第一和第二抗体的Fc区可以是任何同种型，包括但不限于IgG1，IgG2，IgG3或IgG4。在此方法的一个实施方案中，所述第一和第二抗体的Fc区均为IgG1同种型。在另一个实施方案中，所述抗体的Fc区之一是IgG1同种型，并且另一个是IgG4同种型。在后一个实施方案中，所得的双特异性抗体包含IgG1的Fc序列和IgG4的Fc序列，因此就效应器功能的激活而言可具有令人感兴趣的中间性质。

在另一个实施方案中，已经将抗体起始蛋白之一工程化改造为不结合蛋白A，从而允许通过使产物通过蛋白A柱而将异二聚体蛋白与所述同二聚体起始蛋白分离。

如上所述，同二聚体起始抗体的第一和第二CH3区的序列是不同的，并且使得所述第一和第二CH3区之间的异二聚体相互作用强于所述第一和第二CH3区的每个同二聚体相互作用。在WO2011131746和WO2013060867(Genmab)(其在此通过引用完整并入)中已经提供了关于这些相互作用以及如何可以实现它们的更多细节。

特别地，在分别结合PD-L1和不同抗原或PD-L1的不同表位，例如CD3的两种同二聚体起始抗体的基础上，可以使用本发明的上述方法以高产率获得稳定的双特异性抗体，例如双特异性CD3xPD-L1抗体，并且在CH3区中仅含有几个保守的不对称突变。不对称突变是指所述第一和第二CH3区的序列在不同位置处含有氨基酸取代。

本发明的双特异性抗体也可以通过在单一细胞中共表达编码第一和第二多肽的构建体来获得。因此，在另一方面，本发明涉及生产双特异性抗体的方法，所述方法包括以下步骤：

a)提供编码第一多肽的第一核酸构建体，所述第一多肽包含第一抗体重链的第一Fc序列和第一抗原结合区，所述第一Fc序列包含第一CH3区，

b)提供编码第二多肽的第二核酸构建体，所述第二多肽包含第二抗体重链的第二Fc序列和第二抗原结合区，所述第二Fc序列包含第二CH3区，

其中所述第一和第二CH3区域的序列是不同的，并且使得所述第一和第二CH3区域之间的异二聚体相互作用强于所述第一和第二CH3区域的每个同二聚体相互作用，并且其中所述第一同二聚体蛋白质具有位置409处的Lys，Leu或Met以外的氨基酸，并且所述第二同二聚体蛋白在选自下组的位置处具有氨基酸取代：366、368、370、399、405和407，

任选地，其中所述第一和第二核酸构建体编码所述第一和第二抗体的轻链序列

c)在宿主细胞中共表达所述第一和第二核酸构建体，和

d)从细胞培养物中获得所述异二聚体蛋白。

用于产生本发明抗体的材料和方法

在其他方面，本发明涉及用于重组产生根据本发明的抗体的材料和方法。合适的表达载体(包括启动子，增强子等)以及合适的用于产生抗体的宿主细胞是本领域公知的。

因此，一方面，提供了核酸构建体，其包含：

(i)编码抗体的重链序列的核酸序列，所述抗体包含如本文所定义的能够结合人PD-L1的抗原结合区，和/或

(ii)编码抗体的轻链序列的核酸序列，所述抗体包含如本文定义的能够结合人PD-L1的抗原结合区。

在一实施方案中，核酸构建体进一步包含：

(i)编码抗体的重链序列的核酸序列，所述抗体包含如本文所定义的能够结合不同PD-L1表位或不同抗原，例如人CD3ε的抗原结合区，和

(ii)编码抗体的轻链序列的核酸序列，所述抗体包含如本文所定义的能够结合不同PD-L1表位或不同抗原，例如人CD3ε的抗原结合区。

在另一方面，本发明涉及表达载体，其包含如本文上文所定义的核酸构建体。

在本发明的上下文中，表达载体可以是任何合适的载体，包括染色体，非染色体和合成核酸载体(包含合适的表达控制元件组的核酸序列)。此类载体的实例包括SV40的衍生物，细菌质粒，噬菌体DNA，杆状病毒，酵母质粒，源自质粒和噬菌体DNA的组合的载体，以及病毒核酸(RNA或DNA)载体。在一个实施方案中，编码抗体的核酸，例如PD-L1或CD3抗体编码核酸包含在裸露的DNA或RNA载体中，包括例如线性表达元件(例如由Sykes and Johnston,Nat Biotech 17,355-59(1997)所述)，紧密的核酸载体(例如在US 6,077,835和/或WO 00/70087中所述)，质粒载体，例如pBR322，pUC 19/18或pUC 118/119，“蚊”最小程度尺寸的核酸载体(如Schakowski et al.,Mol Ther3,793-800(2001)中所述)，或作为沉淀的核酸载体构建体，如Ca3(PO4)2沉淀的构建体(如例如WO200046147,Benvenisty and Reshef,PNASUSA 83,9551-55(1986),Wigler et al.,Cell 14,725(1978)和Coraro and Pearson,Somatic Cell Genetics 7,603(1981)中所述)。此类核酸载体及其用途是本领域公知的(参见例如US 5,589,466和US 5,973,972)。

在一个实施方案中，载体适合在细菌细胞中表达抗体，例如PD-L1抗体和/或CD3抗体。此类载体的实例包括表达载体，例如BlueScript(Stratagene)，pIN载体(Van Heeke&Schuster,J Biol Chem 264,5503-5509(1989)，pET载体(Novagen，Madison WI)等。

此外/或者，表达载体可以是适合在酵母***中表达的载体。可以采用适合在酵母***中表达的任何载体。合适的载体包括例如包含组成型或诱导型启动子，例如α因子，醇氧化酶和PGH的载体(综述于：F.Ausubel et al.编Current Protocols in MolecularBiology,Greene Publishing and Wiley InterScience New York(1987)和Grant etal.,Methods in Enzymol 153,516-544(1987))。

此外/或者，表达载体可以是适合在哺乳动物细胞中表达的载体，例如包含谷氨酰胺合成酶作为选择标志物的载体，例如Bebbington(1992)Biotechnology(NY)10:169-175中描述的载体。

核酸和/或载体也可以包含编码分泌/定位序列的核酸序列，所述分泌/定位序列可以将诸如新生多肽链的多肽靶向到周质空间或进入细胞培养基中。此类序列是本领域已知的，并且包括分泌前导序列或信号肽。

表达载体可以包含任何合适的启动子，增强子和其他表达促进元件或与之相关。此类元件的例子包括强表达启动子(例如人CMV IE启动子/增强子以及RSV，SV40，SL3-3，MMTV和HIV LTR启动子)，有效的多聚(A)终止序列，大肠杆菌中质粒产物的复制起点，作为选择标志物的抗生素抗性基因和/或便利的克隆位点(例如，多接头)。与组成型启动子例如CMV IE相反，核酸还可以包含诱导型启动子。

在一个实施方案中，编码抗体的表达载体，例如编码PD-L1和/或CD3抗体的表达载体可以位于病毒载体中和/或通过病毒载体递送至宿主细胞或宿主动物。

在另一个方面，本发明涉及宿主细胞，其包含上文规定的核酸构建体或表达载体中的一种或多种。

因此，本发明还涉及产生本发明的抗体的重组真核或原核宿主细胞，如转染瘤。

宿主细胞的实例包括酵母，细菌，植物和哺乳动物细胞，例如CHO，CHO-S，HEK，HEK293，HEK-293F，Expi293F，PER.C6或NS0细胞或淋巴细胞。优选的宿主细胞是CHO-K1细胞。

例如，在一个实施方案中，宿主细胞可包含稳定整合到细胞基因组中的第一和第二核酸构建体。在另一个实施方案中，本发明提供了细胞，其包含非整合的核酸，例如质粒，粘粒，噬菌粒或线性表达元件，其包含如上规定的第一和第二核酸构建体。

在另一方面，本发明涉及产生如本文所定义的PD-L1抗体的杂交瘤。

Fc区

在一些实施方案中，根据本发明的抗体除抗原结合区以外还包括由两条重链的Fc序列组成的Fc区。

第一和第二Fc序列可以各自具有任何同种型，包括但不限于IgG1，IgG2，IgG3和IgG4，并且可以包含一个或多个突变或修饰。在一个实施方案中，第一和第二Fc序列中的每个是IgG4同种型或自其衍生的，任选地具有一个或多个突变或修饰。在另一个实施方案中，第一和第二Fc序列中的每个是IgG1同种型或自其衍生的，任选地具有一个或多个突变或修饰。在另一个实施方案中，Fc序列之一是IgG1同种型的并且另一个是IgG4同种型的，或源自此类相应的同种型，任选地具有一个或多个突变或修饰。

在一个实施方案中，一个或两个Fc序列是效应器功能缺陷的。例如，一个或多个Fc序列可以是IgG4同种型，或非IgG4类型，例如，IgG1，IgG2或IgG3，其已经经过突变以降低或甚至消除介导效应器功能(如ADCC)的能力。此类突变已经记载于例如Dall'Acqua WF etal.,J Immunol.177(2):1129-1138(2006)和Hezareh M,J Virol.；75(24):12161-12168(2001)。在另一个实施方案中，一个或两个Fc序列包含IgG1野生型序列。

根据本发明的抗体可以在Fc区中包含修饰。当抗体包含此类修饰时，它可能成为惰性或非活化抗体。如本文所用，术语“惰性”、“惰性的”或“非活化的”是指至少不能结合任何Fcγ受体，不能诱导Fc介导的FcR交联或不能通过个别抗体的两个Fc区诱导FcR介导的靶抗原交联，或无法结合C1q的Fc区。抗体(例如人源化或嵌合CD3抗体)Fc区的惰性使用单特异性形式的抗体有利地测试。

可以构建几种变体以使抗体的Fc区对于与Fcγ(gamma)受体和C1q的相互作用变得无活性以用于治疗性抗体开发。此类变体的例子在本文中描述。

因此，在本发明的抗体的一个实施方案中，所述抗体包含第一和第二重链，其中一个或两个重链被修饰，使得相对于除包含未修饰的第一重链和第二重链以外相同的抗体，该抗体在较小程度上诱导Fc介导的效应器功能。此类Fc介导的效应器功能可通过测定Fc介导的CD69表达，通过结合Fcγ受体，通过结合C1q或通过诱导Fc介导的FcR交联来测量。

在一个此类实施方案中，重链恒定序列已被修饰，使得与野生型(未修饰的)抗体相比时，所述抗体将Fc介导的CD69表达降低至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少99％或100％，其中所述Fc介导的CD69表达是在基于PBMC的功能测定中确定的，例如如WO2015001085的实施例3中所述。

在另一个此类实施方案中，重链和轻链恒定序列已经被修饰，使得与未修饰的抗体相比，C1q与所述抗体的结合降低至少70％，至少80％，至少90％，至少95％，至少97％或100％，其中C1q结合是通过ELISA确定的。

在另一个实施方案中，抗体包含已被修饰的Fc区，使得与未修饰的抗体相比，所述抗体介导降低至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少99％或100％的Fc介导的T细胞增殖，其中所述T细胞增殖在基于外周血单个核细胞(PBMC)的功能测定中测量。

因此，可以修饰在与C1q和Fcγ受体的相互作用中起主要作用的Fc区中的氨基酸。

可以被修饰(例如IgG1同种型抗体中)的氨基酸位置的实例包括位置L234，L235和P331。它们的组合，例如L234F/L235E/P331S，可导致与人CD64，CD32，CD16和C1q的结合大大降低。

因此，在一个实施方案中，在对应于L234，L235和P331的至少一个位置中的氨基酸可以分别是A，A和S(Xu et al.,2000,Cell Immunol.200(1):16-26；Oganesyan et al.,2008,Acta Cryst.(D64):700-4)。此外，L234F和L235E氨基酸取代可导致与Fcγ受体和C1q具有消除的相互作用的Fc区(Canfield et al.,1991,J.Exp.Med.(173):1483-91；Duncanet al.,1988,Nature(332):738-40)。因此，在一个实施方案中，对应于L234和L235的位置中的氨基酸可以分别是F和E。D265A氨基酸取代可以降低与所有Fcγ受体的结合并防止ADCC(Shields et al.,2001,J.Biol.Chem.(276):6591-604)。因此，在一个实施方案中，对应于D265的位置中的氨基酸可以是A。可以通过将位置D270，K322，P329和P331突变来消除与C1q的结合。将这些位置突变为D270A或K322A或P329A或P331A可以使抗体缺乏CDC活性Idusogie EE,et al.,2000,J Immunol.164:4178-84)。因此，在一个实施方案中，在对应于D270，K322，P329和P331的至少一个位置上的氨基酸可以分别是A，A，A和A。

使Fc区与Fcγ受体和C1q的相互作用最小化的替代方法是通过除去抗体的糖基化位点。将位置N297突变为例如Q，A或E除去糖基化位点，该位点对于IgG-Fc gamma受体相互作用至关重要。因此，在一个实施方案中，在对应于N297的位置中的氨基酸可以是G，Q，A或ELeabman et al.,2013,MAbs；5(6):896-903)。可以通过以下突变获得使Fc区与Fcγ受体的相互作用最小化的另一种替代方法；P238A,A327Q,P329A或E233P/L234V/L235A/G236del(Shields et al.,2001,J.Biol.Chem.(276):6591-604)。

或者，尽管报告了与Fcγ受体的相互作用(Parren et al.,1992,J.ClinInvest.90:1537-1546；Bruhns et al.,2009,Blood 113:3716-3725)，但认为人IgG2和IgG4亚类在其与C1q和Fc gamma受体的相互作用中自然受到损害。可以在这两种同种型中进行消除这些残留相互作用的突变，从而降低与FcR结合相关的不利副作用。对于IgG2，这些包括L234A和G237A，并且对于IgG4，包括L235E。因此，在一个实施方案中，对应于人IgG2重链中的L234和G237的位置的氨基酸可以分别是A和A。在一个实施方案中，对应于人IgG4重链中L235的位置中的氨基酸可以是E。

进一步使IgG2抗体中与Fcγ受体和C1q的相互作用最小化的其他方法包括在WO2011066501和Lightle,S.,et al.,2010,Protein Science(19):753-62中描述的那些方法。

抗体的铰链区在与Fcγ受体和补体的相互作用方面也可以是重要的(Brekke etal.,2006,J Immunol 177:1129-1138；Dall’Acqua WF,et al.,2006,J Immunol 177:1129-1138)。因此，铰链区中的突变或其缺失可影响抗体的效应器功能。

因此，在一个实施方案中，抗体包含第一和第二免疫球蛋白重链，其中在所述第一和第二免疫球蛋白重链的至少一个中，对应于人IgG1重链中位置L234，L235，D265，N297，和P331的位置中的一个或多个氨基酸分别不是L，L，D，N和P。

在一个实施方案中，在第一和第二重链两者中，在与人IgG1重链中的位置L234，L235，D265，N297和P331对应的位置中的一个或多个氨基酸分别不是L，L，D，N，和P。

在一个实施方案中，在所述第一重链和第二重链两者中，与人IgG1重链中的位置D265对应的位置中的氨基酸不是D。

因此，在一个实施方案中，在所述第一重链和第二重链两者中，与人IgG1重链中位置D265对应的位置中的氨基酸选自下组：A和E。

在另一个实施方案中，在所述第一和第二重链中的至少一个中，对应于人IgG1重链中的位置L234和L235的位置中的氨基酸分别不是L和L。

在一个特定的实施方案中，在所述第一和第二重链的至少一个中，对应于人IgG1重链中的位置L234和L235的位置中的氨基酸分别为F和E。

在一个实施方案中，在所述第一重链和第二重链两者中，与人IgG1重链中的位置L234和L235对应的位置中的氨基酸分别为F和E。

在一个特定的实施方案中，在所述第一和第二重链的至少一个中，与人IgG1重链中的位置L234，L235和D265对应的位置中的氨基酸分别为F，E和A。

在一个特别优选的实施方案中，在所述第一和第二重链两者中，与人IgG1重链中的位置L234，L235和D265对应的位置中的氨基酸分别为F，E和A。

在另一个特别优选的实施方案中，抗体是包含第一和第二重链的双特异性抗体，其中根据第一重链和第二重链两者的EU编号，对应于人IgG1重链中位置L234和L235的位置分别是F和E，并且(i)根据第一重链的EU编号对应于人IgG1重链中F405的位置为L，并且根据第二重链的EU编号对应于人IgG1重链中K409的位置为R，或(ii)根据第一重链的EU编号对应于人IgG1重链中K409的位置为R，并且根据第二重链的EU编号对应于人IgG1重链中F405的位置为L。

在另一个特别优选的实施方案中，抗体是包含第一和第二重链的双特异性抗体，其中根据第一重链和第二重链两者的EU编号，对应于人IgG1重链中的位置L234，L235和D265的位置分别为F，E和A，其中(i)根据第一重链的EU编号与人IgG1重链中F405对应的位置为L，并且根据第二重链的EU编号与人IgG1重链中K409对应的位置为R，或(ii)根据第一重链的EU编号与人IgG1重链中K409对应的位置为R，并且根据第二重链的EU编号与人IgG1重链中F405对应的位置为L。

具有三个氨基酸取代L234F，L235E和D265A以及另外的K409R或F405L突变的组合的抗体变体在本文中分别以后缀“FEAR”或“FEAL”命名。

本文中，huCD3-H1L1是指具有如SEQ ID NO:25和29所示的VH和VL序列的人源化SP34抗CD3抗体。

在一个优选的实施方案中，本发明的双特异性抗体包含：

(i)源自IgG1-huCD3-H1L1-FEAL的半分子抗体和源自IgG1-PDL1-338-FEAR,IgG1-PDL1-511-FEAR或IgG1-PDL1-547-FEAR的半分子抗体，或

(ii)源自IgG1-huCD3-H1L1-FEAR的半分子抗体和源自IgG1-PDL1-338-FEAL,IgG1-PDL1-511-FEAL或IgG1-PDL1-547-FEAL的半分子抗体。

在另一个实施方案中，第一重链或半分子包含以SEQ ID NO:90所示的序列，并且第二重链包含以SEQ ID NO:89所示的序列。

在本发明的另一个实施方案中，已经对构成双特异性抗体的一部分的一种或两种抗体进行了工程化改造，以减少或增加与新生儿Fc受体(FcRn)的结合，从而操作双特异性抗体的血清半衰期。增加或减少血清半衰期的技术是本领域公知的。参见例如Dall’Acquaet al.2006,J.Biol.Chem.,281:23514-24；Hinton et al.2006,J.Immunol.,176:346-56；和Zalevsky et al.2010 Nat.Biotechnol.,28:157-9。

缀合物

在另一方面，本发明提供与一个或多个治疗部分，例如细胞因子，免疫抑制剂，免疫刺激分子和/或放射性同位素连接或缀合的抗体。此类缀合物在本文中称为“免疫缀合物”或“药物缀合物”。包括一种或多种细胞毒素的免疫缀合物称为“免疫毒素”。

在一个实施方案中，第一和/或第二Fc序列与药物或前药缀合或包含用于所述药物或前药的受体基团。此类受体基团可以例如为非天然氨基酸。

组合物

在另一方面，本发明涉及药物组合物，其包含根据本文公开的任何实施方案的抗体和药学可接受的载体。

本发明的药物组合物可以包含本发明的一种抗体或本发明的不同抗体的组合。

可以根据常规技术配制药物组合物，例如Remington:The Science and Practiceof Pharmacy,第19版,Gennaro,Ed.,Mack Publishing Co.,Easton,PA,1995中公开的那些。本发明的药物组合物可以例如包括稀释剂，填充剂，盐，缓冲剂，去污剂(例如非离子去污剂，例如Tween-20或Tween-80)，稳定剂(例如糖或不含蛋白质的氨基酸)，防腐剂，组织固定剂，增溶剂和/或适合包含在药物组合物中的其他材料。

药学上可接受的载体包括与本发明的抗体在生理上相容的任何和所有合适的溶剂，分散介质，涂层材料，抗菌和抗真菌剂，等张剂，抗氧化剂和吸收延迟剂等。可以在本发明的药物组合物中使用的合适的水性和非水性载体的实例包括水，盐水，磷酸盐缓冲盐水，乙醇，右旋糖，多元醇(例如甘油，丙二醇，聚乙二醇等)，和它们的合适的混合物，植物油，羧甲基纤维素胶体溶液，黄蓍胶和可注射的有机酯，例如油酸乙酯，和/或各种缓冲剂。药学上可接受的载体包括无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌注射溶液或分散液的无菌粉末。可以例如通过使用诸如卵磷脂的涂层材料，在分散液的情况下通过维持需要的粒径，以及使用表面活性剂来维持来适当的流动性。

本发明的药物组合物还可包含药学可接受的的抗氧化剂，例如(1)水溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸，盐酸半胱氨酸，硫酸氢钠，焦亚硫酸钠，亚硫酸钠等；(2)油溶性抗氧化剂，例如抗坏血酸棕榈酸酯，丁基化羟基茴香醚，丁基化羟基甲苯，卵磷脂，没食子酸丙酯，α-生育酚等；和(3)金属螯合剂，诸如柠檬酸，乙二胺四乙酸(EDTA)，山梨糖醇，酒石酸，磷酸。

本发明的药物组合物还可在组合物中包含等张剂，例如糖，多元醇，例如甘露醇，山梨糖醇，甘油或氯化钠。

本发明的药物组合物还可包含一种或多种适合所选施用途径的佐剂，例如防腐剂，湿润剂，乳化剂，分散剂，防腐剂或缓冲剂，它们可以增强药物组合物的货架期或有效性。本发明的抗体可以与保护抗体免于快速释放的载体一起制备，例如控释制剂，包括植入物，透皮贴剂和微囊化递送***。此类载体可以包括明胶，单硬脂酸甘油酯，二硬脂酸甘油酯，可生物降解的生物相容性聚合物，例如单独或与蜡一起使用的乙烯乙酸乙烯酯，聚酸酐，聚乙醇酸，胶原蛋白，聚原酸酯和聚乳酸，或本领域公知的其他材料。制备此类制剂的方法是本领域技术人员通常已知的。

无菌注射溶液可通过将所需量的活性化合物在根据需要具有一种成分或多种成分的组合(例如，如上文列举)的适当的溶剂中掺入，随后进行灭菌微滤来制备。通常，通过将活性化合物掺入含有基本分散介质和所需要的其他成分(例如，来自从上文列举的那些)的无菌媒介物中制备分散体。在用于制备无菌注射溶液的无菌粉末的情况下，制备方法的实例是真空干燥和冷冻干燥(冻干)，其从其先前无菌过滤的溶液中产生活性成分和任何其他期望成分的粉末。

可以改变药物组合物中活性成分的实际剂量水平，以便获得一定量的活性成分，所述量对于特定患者，组合物和施用模式有效实现期望的治疗响应，而对患者没有毒性。选择的剂量水平将取决于多种药代动力学因素，包括所采用的本发明的特定组合物或其酰胺的活性，施用途径，施用时间，所用特定化合物的排出速率，治疗持续时间，与所用特定组合物结合使用的其他药物，化合物和/或材料，所治疗患者的年龄，性别，体重，状况，一般健康状况和既往病史，以及医学领域中公知的类似因素。

药物组合物可以通过任何合适的途径和方式施用。在一个实施方案中，胃肠外施用本发明的药物组合物。如本文所用，“胃肠外施用”是指除肠和局部施用以外的施用方式，通常通过注射，并且包括表皮，静脉内，肌内，动脉内，鞘内，囊内，眶内，心内，皮内，腹膜内，腱内，经气管，皮下，表皮下，关节内，囊下，蛛网膜下，脊柱内，颅内，胸腔内，硬膜外和胸骨内注射和输注。

在一个实施方案中，通过静脉内或皮下注射或输注施用所述药物组合物。

用途

一方面，本发明涉及根据本文公开的任一项实施方案的抗体或如本文公开的药物组合物，用作药物。

在另一方面，本发明涉及根据本文公开的任一项实施方案中的抗体，或如本文公开的药物组合物，用于治疗疾病，例如癌症。

在另一方面，本发明涉及治疗疾病的方法，该方法包括向有此需要的受试者施用有效量的根据本文公开的任一项实施方案的抗体或如本文公开的药物组合物。

特别地，根据本发明的双特异性抗体可用于治疗环境中，在该治疗环境中期望表达PD-L1的细胞的特异性靶向和T细胞介导的杀伤，并且在某些此类适应症和环境中它们与常规抗PD-L1相比可以更有效。

本发明的抗体在治疗和诊断多种PD-L1相关疾病中也具有额外的效用。例如，抗体可用于在体内或体外引发以下一种或多种生物学活性：抑制表达PD-L1的细胞的生长和/或分化；杀死表达PD-L1的细胞；在存在人效应细胞的情况下介导表达PD-L1的细胞的吞噬作用或ADCC；在补体存在下介导表达PD-L1的细胞的CDC；介导表达PD-L1的细胞的凋亡；和/或在与PD-L1结合后诱导转位进入脂筏中。

一方面，本发明涉及根据本文公开的任一项实施方案的抗体，或如本文公开的药物组合物，用于治疗癌症。

在另一方面，本发明涉及根据本文公开的任一项实施方案的抗体，或如本文公开的药物组合物，其用于治疗选自下组的癌症疾病：黑素瘤，卵巢癌，肺癌，结直肠癌，头颈癌，胃癌，乳腺癌，肾癌，膀胱癌，食道癌，胰腺癌，肝癌，胸腺瘤和胸腺癌，脑癌，胶质瘤，肾上腺皮质癌，甲状腺癌，其他皮肤癌，肉瘤，多发性骨髓瘤，白血病，淋巴瘤，脊髓发育不良综合征，卵巢癌，子宫内膜异位癌，***癌，***癌，霍奇金淋巴瘤，非霍奇金淋巴瘤，Merkel细胞癌和间皮瘤。

在另一方面，本发明涉及根据本文公开的任一项实施方案的抗体在制备药物，例如用于治疗癌症的药物中的用途，例如以实体瘤的存在为特征的癌症疾病或选自黑素瘤，卵巢癌，肺癌，结肠癌和头颈癌的癌症疾病。

本发明还涉及抑制表达PD-L1的一种或多种肿瘤细胞的生长和/或增殖的方法，该方法包括向有此需要的个体施用本发明的抗体。

本发明还涉及用于治疗癌症的方法，包括

a)选择患有包含表达PD-L1的肿瘤细胞的癌症的受试者，和

b)向受试者施用本发明的抗体或本发明的药物组合物。

调整上述治疗方法和用途中的剂量方案以提供最佳的期望响应(例如治疗响应)。例如，可以施用单次推注，可以随时间施用数个分开的剂量，或者可以根据治疗情况的紧急程度指示按比例减少或增加剂量。胃肠外组合物可以配制成剂量单位形式，以易于施用和剂量均匀。

抗体的有效剂量和剂量方案取决于要治疗的疾病或状况，并且可以由本领域技术人员确定。本发明化合物的治疗有效量的示例性非限制性范围是约0.001-10mg/kg，诸如约0.001-5mg/kg，例如约0.001-2mg/kg，诸如约0.001-1mg/kg，例如约0.001、约0.01、约0.1、约1或约10mg/kg。本发明抗体的治疗有效量的另一个示例性的非限制性范围是约0.1-100mg/kg，诸如约0.1-50mg/kg，例如约0.1-20mg/kg，例如约0.1-10mg/kg，例如约0.5，例如约0.3、约1、约3、约5、或约8mg/kg。

具有本领域普通技术的医师或兽医可以容易地确定并开出所需要的药物组合物的有效量。例如，医师或兽医可以以比实现期望治疗效果所需要的水平更低的水平开始在药物组合物中使用的抗体剂量，并逐渐增加剂量直至实现期望的效果。通常，本发明的抗体的合适的日剂量将是有效产生治疗效果的最低剂量的化合物的量。施用可以例如是胃肠外的，例如静脉内，肌肉内或皮下的。在一个实施方案中，可以通过以mg/m²计算的每周剂量通过输注来施用抗体。此类剂量可以例如基于上文根据以下提供的mg/kg剂量：剂量(mg/kg)x70:1.8。此类施用可以重复例如1至8次，例如3至5次。可以通过2至24小时，例如2至12小时的时段内持续输注进行施用。在一个实施方案中，可以通过长时间(例如超过24小时)内缓慢连续输注来施用抗体，以减少毒性副作用。

在一个实施方案中，当一周一次给予时，抗体可以以以固定剂量计算的每周剂量施用直至8次，例如4至6次。此类方案可以根据需要重复一次或多次，例如在6个月或12个月后。此类固定剂量可以例如基于以上提供的mg/kg剂量，体重估计为70kg。可以通过例如取出生物样品并使用靶向本发明抗体的PD-L1抗原抗原结合区的抗独特型抗体，测量施用后血液中本发明的抗体量确定或调节剂量。

在一个实施方案中，可以将抗体作为维持疗法施用，诸如例如每周一次，持续6个月或更长时间。

还可以预防性地施用抗体，以降低发生癌症的风险，延迟癌症进展中事件的发生和/或降低癌症缓解时复发的风险。

本发明的抗体也可以在联合疗法中施用，即与对于要治疗的疾病或病状相关的其他治疗剂组合。因此，在一个实施方案中，含有抗体的药物用于与一种或多种其他治疗剂组合，例如细胞毒剂，化学治疗剂或抗血管生成剂。

在另一方面，本发明涉及与如本文公开的任何一个实施方案中所定义的PD-L1结合区结合的抗独特型抗体。

本公开的其他项：

1.抗体，其包含能够结合人PD-L1的抗原结合区，其中所述抗体抑制人PD-L1与人PD-1的结合，并且

(i)与包含以SEQ ID NO:8所示的VH序列和以SEQ ID NO:15所示的VL序列的抗体[511]竞争与人PD-L1的结合，但不与包含以SEQ ID NO:18所示的VH序列和SEQ ID NO:22所示的VL序列的抗体[547]竞争与人PD-L1的结合，或

(ii)与包含以SEQ ID NO:18所示的VH序列和以SEQ ID NO:22所示的VL序列的抗体[547]竞争与人PD-L1的结合，但不与包含以SEQ ID NO:8所示的VH序列和SEQ ID NO:15所示的VL序列的抗体[511]竞争与人PD-L1的结合。

2.根据项1所述的抗体，其中所述抗体与包含以SEQ ID NO:1所示的VH序列和SEQID NO:5所示的VL序列的抗体[338]竞争与人PD-L1的结合。

3.根据前述项中任一项所述的抗体，其中所述抗体与人PD-L1的结合不被包含以SEQ ID NO:53所示的VH序列和以SEQ ID NO:57所示的VL序列的抗体[476]置换。

4.根据前述项中任一项所述的抗体，其中所述抗体与人PD-L1的结合不被包含以SEQ ID NO:106所示的VH序列和以SEQ ID NO:110所示的VL序列的抗体[625]的结合阻断。

5.根据前述项中任一项所述的抗体，其中所述抗体与人PD-L1的结合被包含以SEQID NO:18所示的VH序列和以SEQ ID NO:22所示的VL序列的抗体[547]阻断。

6.根据项1所述的抗体，其中所述抗体：

(i)能够与包含以SEQ ID NO:1所示的VH序列和SEQ ID NO:5所示的VL序列的抗体[338]结合人PD-L1的相同表位，或

(ii)能够与包含以SEQ ID NO:8所示的VH序列和以SEQ ID NO:15所示的VL序列的抗体[511]结合人PD-L1的相同表位，或

(iii)能够与包含以SEQ ID NO:18所示的VH序列和SEQ ID NO:22所示的VL序列的抗体[547]结合人PD-L1的相同表位。

7.根据项1-4和6中任一项所述的抗体，其中所述抗体与突变体PD-L1的结合与具有以SEQ ID NO:94所示的氨基酸序列的野生型PD-L1的结合相比降低，在所述突变体PD-L1中对应于SEQ ID NO:94中位置113(R113)、123(Y123)和125(R125)的位置处的任何一个或多个氨基酸残基已经用丙氨酸取代；降低的结合以所述抗体结合的倍数变化小于所有丙氨酸突变体的结合的平均倍数变化-1.5xSD确定，其中SD是所述抗体与所述突变体PDL1的所有计算的倍数变化的标准偏差并且结合的倍数变化如实施例13所述计算[338]。

8.根据项1-2和6中任一项所述的抗体，其中所述抗体结合PD-L1(SEQ ID NO:94)上的表位，所述表位包含SEQ ID NO:94的位置113处的氨基酸残基(R113)、位置123处的氨基酸残基(Y123)和/或位置125处的氨基酸残基(R125)。

9.根据项1、3、4和6中任一项所述的抗体，其中所述抗体与突变体PD-L1的结合与具有以SEQ ID NO:94所示的氨基酸序列的野生型PD-L1的结合相比降低，在所述突变体PD-L1中对应于SEQ ID NO:94中位置19(F19),42(F42),45(E45),46(K46),94(L94)和116(I116)的位置处的任何一个或多个氨基酸残基已经用丙氨酸取代；降低的结合以所述抗体结合的倍数变化小于所有丙氨酸突变体的结合的平均倍数变化-1.5xSD确定，其中SD是所述抗体与所述突变体PDL1的所有计算的倍数变化的标准偏差并且结合的倍数变化如实施例13所述计算[511]。

10.根据项1、3、4和6中任一项所述的抗体，其中所述抗体结合PD-L1(SEQ ID NO:94)上的表位，所述表位包含一个或多个选自下组的氨基酸残基：SEQ ID NO:94的位置45处的氨基酸残基(E45)、位置46处的氨基酸残基(K46)和/或位置94处的氨基酸残基(L94)。

11.根据项1、5和6中任一项所述的抗体，其中所述抗体与突变体PD-L1的结合与具有以SEQ ID NO:94所示的氨基酸序列的野生型PD-L1的结合相比降低，在所述突变体PD-L1中对应于SEQ ID NO:94中位置58(E58)和113(R113)的位置处的任何一个或多个氨基酸残基已经用丙氨酸取代；降低的结合以所述抗体结合的倍数变化小于所有丙氨酸突变体的结合的平均倍数变化-1.5xSD确定，其中SD是所述抗体与所述突变体PDL1的所有计算的倍数变化的标准偏差并且结合的倍数变化如实施例13所述计算[547]。

12.根据项1、5和6中任一项所述的抗体，其中所述抗体结合PD-L1(SEQ ID NO:94)上的表位，所述表位包含SEQ ID NO:94的位置58处的氨基酸残基(E58)和/或位置113处的氨基酸残基(R113)。

13.根据前述项中任一项所述的抗体，其中所述能够结合人PD-L1的抗原结合区包含含有CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区(VH)和含有CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区(VL)，其中VH CDR3序列选自下组：以SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:21所示的序列。

14.根据前述项中任一项所述的抗体，其中所述能够结合人PD-L1的抗原结合区包含：

(i)包含分别以SEQ ID NO:2、3和4所示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区(VH)和包含分别具有以SEQ ID NO:6所示的序列、序列KAS和以SEQ ID NO:7所示的序列的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区(VL)[338]，或

(ii)包含分别以SEQ ID NO:9、10和11所示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区(VH)和包含分别具有以SEQ ID NO:16所示的序列、序列EDS和以SEQ ID NO:17所示的序列的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区(VL)[511]，或

(iii)包含分别以SEQ ID NO:19、20和21所示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区(VH)和包含分别具有以SEQ ID NO:23所示的序列、序列DDN和以SEQ ID NO:24所示的序列的CDR1、CDR2和CDR3[547]。

15.根据前述项中任一项所述的抗体，其中所述能够结合人PD-L1的抗原结合区包含与选自下组的VH序列具有至少90％，至少95％，至少97％，至少99％或100％的氨基酸序列同一性的VH序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:18所示的序列。

16.根据前述项中任一项所述的抗体，其中所述能够结合人PD-L1的抗原结合区包含与选自下组的VL序列具有至少90％，至少95％，至少97％，至少99％或100％的氨基酸序列同一性的VL序列：SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:22所示的序列。

17.根据前述项中任一项所述的抗体，其中所述能够结合人PD-L1的抗原结合区包含：

(i)与以SEQ ID NO:1所示的VH序列具有至少90％，至少95％，至少97％，至少99％或100％的氨基酸序列同一性的VH序列和与SEQ ID NO:5所示的VL序列具有至少90％，至少95％，至少97％，至少99％或100％的氨基酸序列同一性的VL序列[338]，或

(ii)与以SEQ ID NO:8所示的VH序列具有至少90％，至少95％，至少97％，至少99％或100％的氨基酸序列同一性的VH序列和与SEQ ID NO:15所示的VL序列具有至少90％，至少95％，至少97％，至少99％或100％的氨基酸序列同一性的VL序列[511]，或

(iii)与以SEQ ID NO:18所示的VH序列具有至少90％，至少95％，至少97％，至少99％或100％的氨基酸序列同一性的VH序列和与SEQ ID NO:22所示的VL序列具有至少90％，至少95％，至少97％，至少99％或100％的氨基酸序列同一性的VL序列[547]。

18.根据项17所述的抗体，其中所述VH和VL序列各自包含三个CDR序列，分别为CDR1、CDR2和CDR3，和四个框架序列，分别为FR1、FR2、FR3和FR4，并且其中VH的相应组合的FR1、FR2、FR3和FR4框架序列与所述VH序列的相应组合的的FR1、FR2、FR3和FR4框架序列具有至少90％，至少95％，至少97％或至少99％的氨基酸序列同一性，并且其中VH CDR序列未突变，和其中VL的相应组合的FR1、FR2、FR3和FR4框架序列与所述VL序列的相应组合的FR1、FR2、FR3和FR4框架序列具有至少90％，至少95％，至少97％或至少99％的氨基酸序列同一性，并且其中所述VL CDR序列未突变。

19.根据前述项中任一项所述的抗体，其中所述抗体能够通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)来诱导腺癌例如MDA-MB-231的上皮细胞的剂量依赖性裂解。

20.根据项19所述的抗体，其中所述抗体能够由于细胞裂解而使所述上皮细胞培养物中的细胞数目减少至少5％，例如至少6％，7％，8％，9％或10％。

21.根据项19或20所述的抗体，其中在⁵¹Cr释放测定法，例如实施例14中公开的测定法中体外测定ADCC。

22.根据项19至20中任一项所述的抗体，其中通过于37℃,5％CO₂将所述上皮细胞与包含所述抗体和效应细胞，例如外周血单个核细胞(PBMC)的组合物一起温育4小时在体外测定ADCC，所述组合物中抗体的量在0.1-1μg/mL的范围内，并且效应细胞与上皮细胞的比率为100:1。

23.根据项19或20所述的抗体，其中在作为ADCC替代的萤光素酶报告物测定法，例如实施例14中公开的发光ADCC报告物生物测定法中体外测定所述上皮细胞的裂解。

24.根据项23所述的抗体，其中如下体外测定ADCC：

ii)将所述上皮细胞和效应细胞的培养物调节至室温15分钟，

iv)测定所述细胞培养物中的萤光素酶产生；

25.根据项19、20、23和24中任一项所述的抗体，其中当通过萤光素酶报告物测定法，例如项23或24中定义的报告物测定法来测定所述上皮细胞的ADCC时，则在所述上皮细胞培养物与包含所述抗体的测试组合物的温育后观察到的ADCC是在所述上皮细胞培养物与包含参考抗体的组合物温育后观察到的ADCC的至少1.5倍；ADCC以相对发光单位(RLU)测定，所述测试组合物中和包含参考抗体的所述组合物中的抗体浓度相同并且在20至250ng/ml的范围内，并且所述参考抗体选自：

26.根据前述项中任一项所述的抗体，其中所述能够结合人PD-L1的抗原结合区包含：

(i)以SEQ ID NO:1所示的VH序列和以SEQ ID NO:5所示的VL序列[338]，或

(ii)以SEQ ID NO:8所示的VH序列和以SEQ ID NO:15所示的VL序列[511]，或

(iii)以SEQ ID NO:18所示的VH序列和以SEQ ID NO:22所示的VL序列[547]。

27.包含能够结合人PD-L1的抗原结合区的抗体，其中所述抗体包含：

(i)包含分别以SEQ ID NO:33、34和35所示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区(VH)和包含分别具有以SEQ ID NO:37所示的序列、序列KAS和以SEQ ID NO:38所示的序列的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区(VL)[321]，或

(ii)包含分别以SEQ ID NO:47、48和49所示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区(VH)和包含分别具有以SEQ ID NO:51所示的序列、序列DVI和以SEQ ID NO:52所示的序列的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区(VL)[421]，或

(iii)包含分别以SEQ ID NO:54、55和56所示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区(VH)和包含分别具有以SEQ ID NO:58所示的序列、序列RDS和以SEQ ID NO:59所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区(VL)[476]，或

(iv)包含分别以SEQ ID NO:61、62和63所示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区(VH)和包含分别具有以SEQ ID NO:65所示的序列，序列DDS和以SEQ ID NO:66所示的序列的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区(VL)[516]，或

(v)包含分别以SEQ ID NO:107、108和109所示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区(VH)和包含分别具有以SEQ ID NO:111所示的序列、序列EDS和以SEQ ID NO:113所示的序列的CDR1，CDR2和CDR的轻链可变区(VL)[625]，或

(vi)包含分别以SEQ ID NO:68、69和70所示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区(VH)和包含分别具有以SEQ ID NO:72所示的序列、序列EDS和以SEQ ID NO:73所示的序列的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区(VL)[632]。

28.根据项27所述的抗体，其中所述抗体包含：

(i)以SEQ ID NO:32所示的VH序列和以SEQ ID NO:36所示的VL序列[321]，或

(ii)以SEQ ID NO:46所示的VH序列和以SEQ ID NO:50所示的VL序列[421]，或

(iii)以SEQ ID NO:53所示的VH序列和以SEQ ID NO:57所示的VL序列[476]，或

(iv)以SEQ ID NO:60所示的VH序列和以SEQ ID NO:64所示的VL序列[516]，或

(v)以SEQ ID NO:106所示的VH序列和以SEQ ID NO:110所示的VL序列[625]，或

(vi)以SEQ ID NO:67所示的VH序列和以SEQ ID NO:71所示的VL序列[632]。

29.根据前述项中任一项所述的抗体，其中所述抗体是单价的。

30.根据前述项中任一项所述的抗体，其中所述抗体是具有能够结合人PD-L1的两个抗原结合区的二价抗体，并且其中所述两个抗原结合区具有相同的可变区序列。

31.根据前述项中任一项所述的抗体，其中所述抗体是二价双特异性抗体，其除了能够结合人PD-L1的所述(第一)抗原结合区之外，还包含能够结合第二抗原或人PD-L1的不同表位的(第二)抗原结合区，其中所述第二抗原不是人CD3ε。

32.双特异性抗体，其包含能够结合人PD-L1的抗原结合区和能够结合人CD3ε(epsilon)的抗原结合区，其中所述能够结合人PD-L1的抗原结合区具有前述项中任一项所述的特征。

33.根据项32所述的双特异性抗体，其中所述能够结合人CD3ε的抗原结合区包含(a)包含分别具有以SEQ ID NO:26、27和28所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区(VH)和包含分别具有以SEQ ID NO:30所示的序列，序列GTN和以SEQ ID NO:31所示的序列的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区(VL)。

34.根据项32或33所述的双特异性抗体，其包含：

(i)能够结合人PD-L1的抗原结合区，其包含分别以SEQ ID NO:2、3和4所示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区(VH)和包含分别具有以SEQ ID NO:6所示的序列，KAS序列和以SEQ ID NO:7所示的序列的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区(VL)[338]，和能够结合人CD3ε的抗原结合区，其包含：(a)包含分别具有以SEQ ID NO:26、27和28所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区(VH)和包含分别具有以SEQ ID NO:30所示序列、序列GTN和以SEQ ID NO:31所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区(VL)，

或

(ii)能够结合人PD-L1的抗原结合区，其包含分别以SEQ ID NO:9、10和11所示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区(VH)和包含分别具有以SEQ ID NO:16所示序列、序列EDS和以SEQ ID NO:17所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区(VL)[338]，和能够结合人CD3ε的抗原结合区，其包含(a)包含分别具有以SEQ ID NO:26、27和28所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区(VH)和包含分别具有以SEQ ID NO:30所示的序列、序列GTN和以SEQ ID NO:31所示的序列的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区(VL)，

或

(iii)能够结合人PD-L1的抗原结合区，其包含分别以SEQ ID NO:19、20和21所示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区(VH)和包含分别具有以SEQ ID NO:23所示序列、序列DDN和以SEQ ID NO:24所示序列的CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区(VL)[547]，和能够结合人CD3ε的抗原结合区，其包括(a)包含分别具有以SEQ ID NO:26、27和28所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区(VH)和包含分别具有以SEQ ID NO:30所示序列、序列GTN和以SEQ ID NO:31所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区(VL)。

35.根据项32至34中任一项所述的双特异性抗体，其中所述能够结合人CD3ε的抗原结合区包含以SEQ ID NO:25所示的VH序列和以SEQ ID NO:29所示的VL序列。

36.根据项32所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体：

(ii)当使用PBMC或纯化的T细胞作为效应细胞时，能够介导MDA-MB-231细胞、PC-3细胞和/或HELA细胞的浓度依赖性细胞毒性，例如如本文实施例11所述测定时。

37.根据项36所述的双特异性抗体，其中所述能够结合人CD3ε的抗原结合区包含：

38.根据项36或37所述的双特异性抗体，其中所述能够结合人CD3ε的抗原结合区包含：

(i)以SEQ ID NO:39所示的VH序列和以SEQ ID NO:29所示的VL序列，或

(ii)以SEQ ID NO:40所示的VH序列和以SEQ ID NO:29所示的VL序列，或

(iii)以SEQ ID NO:41所示的VH序列和以SEQ ID NO:29所示的VL序列，或

(iv)以SEQ ID NO:42所示的VH序列和以SEQ ID NO:29所示的VL序列，或

(v)以SEQ ID NO:43所示的VH序列和以SEQ ID NO:29所示的VL序列，或

(vi)以SEQ ID NO:44所示的VH序列和以SEQ ID NO:29所示的VL序列，或

(vii)以SEQ ID NO:45所示的VH序列和以SEQ ID NO:29所示的VL序列。

39.多特异性抗体，其包含能够结合人PD-L1的第一抗原结合区和能够结合第二抗原或人PD-L1的不同表位的第二抗原结合区，其中所述能够结合人PD-L1的抗原结合区具有项1-31中任一项所述的特征。

40.根据项39所述的多特异性抗体，其中所述能够结合人PD-L1的抗原结合区包括包含CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区(VH)和包含CDR1、CDR2和CDR3序列的轻链可变区(VL)，其中VH CDR3序列选自下组：以SEQ ID NO:4[338]，SEQ ID NO:11[511]和SEQ ID NO:21[547]所示的序列。

41.根据项40所述的多特异性抗体，其中所述能够结合人PD-L1的第一抗原结合区包含：

(i)包含分别以SEQ ID NO:2、3和4所示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区(VH)和包含分别具有以SEQID NO:6所示的序列、序列KAS和以SEQ ID NO:7所示的序列的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区(VL)[338]，或

(ii)包含分别以SEQ ID NO:9、10和11所示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区(VH)和包含分别具有以SEQID NO:16所示序列、序列EDS和以SEQ ID NO:17所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区(VL)[511]，或

(iii)包含分别以SEQ ID NO:19、20和21所示的CDR1、CDR2和CDR3序列的重链可变区(VH)和包含分别具有以SEQID NO:23所示的序列、序列DDN和以SEQ ID NO:24所示的序列的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区(VL)[547]。

42.根据项40或41所述的多特异性抗体，其中所述能够结合人PD-L1的第一抗原结合区包含与选自下组的VH序列具有至少90％，至少95％，至少97％，至少99％或100％的氨基酸序列同一性的VH序列：以SEQ ID NO:1[338]、SEQ ID NO:8[511]和SEQ ID NO:18[547]所示的序列。

43.根据项40至42中任一项所述的多特异性抗体，其中所述能够结合人PD-L1的第一抗原结合区包含与选自下组的VL序列具有至少90％，至少95％，至少97％，至少99％或100％的氨基酸序列同一性的VL序列：以SEQ ID NO:5[338]、SEQ ID NO:15[511]和SEQ IDNO:22[547]所示的序列。

44.根据项40至43中任一项所述的多特异性抗体，其中所述能够结合人PD-L1的第一抗原结合区包含：

45.根据项40至44中任一项的多特异性抗体，其中所述VH和VL序列各自包含三个CDR序列，分别为CDR1、CDR2和CDR3和四个框架序列，分别为FR1、FR2、FR3和FR4，并且其中VH的相应组合的FR1、FR2、FR3和FR4框架序列与所述VH序列的相应组合的FR1、FR2、FR3和FR4框架序列具有至少90％，至少95％，至少97％或至少99％的氨基酸序列同一性，并且其中VHCDR序列未突变，和其中VL的相应组合的FR1、FR2、FR3和FR4框架序列与所述VL序列的相应组合的FR1、FR2、FR3和FR4框架序列具有至少90％，至少95％，至少97％或至少99％的氨基酸序列同一性，并且其中所述VL CDR序列未突变。

46.根据项40至45中任一项所述的多特异性抗体，其中所述能够结合人PD-L1的第一抗原结合区包括：

(i)以SEQ ID NO:1所示的VH序列和以SEQ ID NO:5所示的VL序列[338]，或

47.多特异性抗体，其包含能够结合人PD-L1的第一抗原结合区和能够结合第二抗原或人PD-L1的不同表位的第二抗原结合区，其中所述抗体：

48.根据项47所述的多特异性抗体，其中所述抗体与包含以SEQ ID NO:1所示的VH序列和以SEQ ID NO:5所示的VL序列的抗体竞争与人PD-L1的结合。

49.多特异性抗体，其包含能够结合人PD-L1的第一抗原结合区和能够结合第二抗原或人PD-L1的不同表位的第二抗原结合区，其中所述抗体与人PD-L1的结合不被包含以SEQ ID NO:53所示的VH序列和SEQ ID NO:57所示的VL序列的抗体置换。

50.根据项49所述的多特异性抗体，其中所述抗体抑制人PD-L1与人PD-1的结合。

51.根据项49或50所述的多特异性抗体，其中所述抗体与包含以SEQ ID NO:18所示的VH序列和以SEQ ID NO:22所示的VL序列的抗体竞争与人PD-L1的结合。

52.根据项49至51中任一项所述的多特异性抗体，其中所述抗体与人PD-L1的结合被包含以SEQ ID NO:18所示的VH序列和以SEQ ID NO:22所示的VL序列的抗体阻断。

53.多特异性抗体，其包含能够结合人PD-L1的第一抗原结合区和能够结合第二抗原或人PD-L1的不同表位的第二抗原结合区，其中所述第一抗原结合区：

(i)能够与包含以SEQ ID NO:1所示的VH序列和以SEQ ID NO:5所示的VL序列的抗体[338]结合人PD-L1的相同表位，或

54.根据项40至53中任一项所述的多特异性抗体，其中所述抗体是双特异性的。

55.根据项54所述的多特异性抗体，其中所述抗体是二价的。

56.根据项40至55中任一项所述的多特异性抗体，其中所述抗体能够结合第二抗原，并且所述第二抗原不是人CD3ε。

57.根据前述项中任一项所述的抗体，其中所述抗体是全长抗体。

58.根据项57所述的抗体，其中所述抗体是全长IgG1抗体。

59.根据前述项中任一项所述的抗体，其中所述抗体是抗体片段。

60.根据项32至59中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含两个各包含抗原结合区的半分子，其中

(i)包含所述能够结合人PD-L1的抗原结合区的半分子是嵌合的，和/或

(ii)若有的话，包含能够结合人CD3ε(epsilon)的抗原结合区的半分子是嵌合的。

61.根据前述项中任一项所述的抗体，其中

(i)所述能够结合人PD-L1的抗原结合区是人源化的，和/或

(ii)若有的话，所述能够结合人CD3ε(epsilon)的抗原结合区是人源化的。

62.根据前述项中任一项所述的抗体，其中

(i)所述能够结合人PD-L1的抗原结合区是人的和/或

(ii)若有的话，能够结合人CD3ε(epsilon)的抗原结合区是人的。

63.根据前述项中任一项所述的抗体，其中每个所述抗原结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，并且其中所述可变区各自包含三个CDR序列，分别为CDR1、CDR2和CDR3，以及四个框架序列，分别为FR1、FR2、FR3和FR4。

64.根据项63所述的抗体，其中所述抗体包含两个重链恒定区(CH)和两个链恒定区(CL)。

65.根据前述项中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含第一和第二重链，其中所述第一和第二重链中的每个至少包含铰链区、CH2和CH3区，其中在所述第一重链中对应于选自T366,L368,K370,D399,F405,Y407,和K409(根据EU编号)的位置的位置中的至少一个氨基酸已被取代，并且在所述第二重链中在对应于选自T366,L368,K370,D399,F405,Y407和K409(根据EU编号)的位置的位置中的至少一个氨基酸已被取代，其中所述第一重链和所述第二重链不在相同位置中取代。

66.根据项65所述的抗体，其中(i)在所述第一重链中对应于F405(根据EU编号)的位置中的氨基酸是L，并且在所述第二重链中对应于K409(根据EU编号)的位置中的氨基酸是R，或(ii)在所述第一重链中对应于K409(根据EU编号)的位置中的氨基酸是R，并且在所述第二重链中对应于F405(根据EU编号)的位置中的氨基酸是L。

67.根据前述项中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含第一和第二重链，并且其中一个或两个重链经修饰而使得所述抗体相对于除包含未修饰的第一和第二重链以外相同的抗体以更小程度诱导Fc介导的效应器功能。

68.根据项67所述的抗体，其中通过测定Fc介导的CD69表达，通过结合Fcγ受体，通过结合C1q或通过诱导Fc介导的FcR交联来测量所述Fc介导的效应器功能。

69.根据项67或68所述的抗体，其中所述重链和轻链恒定序列已经经过修饰而使得与野生型抗体相比，所述抗体将Fc介导的CD69表达降低至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％，至少90％，至少99％或100％，其中在基于PBMC的功能测定法中测定所述Fc介导的CD69表达。

70.根据前述项中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含第一和第二重链，其中在所述第一和第二重链的至少一个中，根据EU编号对应于人IgG1重链中的位置L234,L235,D265,N297和P331的位置中的一个或多个氨基酸分别不是L，L，D，N和P。

71.根据项70所述的抗体，其中在所述第一重链和第二重链中根据EU编号对应于人IgG1重链中的位置L234和L235的位置分别是F和E。

72.根据项71所述的抗体，其中所述抗体是包含第一和第二重链的双特异性抗体，并且其中根据第一重链和第二重链两者的EU编号，对应于人IgG1重链中位置L234和L235的位置分别为F和E，其中(i)根据第一重链的EU编号对应于人IgG1重链中F405的位置为L，并且根据第二重链的EU编号对应于人IgG1重链中K409的位置为R，或(ii)根据第一重链的EU编号对应于人IgG1重链中K409的位置为R，并且根据第二重链的EU编号对应于人IgG1重链中F405的位置为L。

73.根据项70所述的抗体，其中在所述第一和第二重链中根据EU编号对应于人IgG1重链中L234，L235和D265位置的位置分别为F，E和A。

74.根据项73所述的抗体，其中所述抗体是包含第一和第二重链的双特异性抗体，并且其中根据第一重链和第二重链两者的EU编号，对应于人IgG1重链中位置L234,L235,和D265的位置分别为F,E和A，其中(i)根据第一重链的EU编号对应于人IgG1重链中F405的位置为L，并且根据第二重链的EU编号对应于人IgG1重链中K409的位置为R，或(ii)根据第一重链的EU编号对应于人IgG1重链中K409的位置为R，并且根据第二重链的EU编号对应于人IgG1重链中F405的位置为L。

75.根据前述项中任一项所述的抗体，其中所述抗体不结合人PD-L2。

76.根据前述项中任一项所述的抗体，其中当如本文实施例8所述测定时，所述抗体以约10^-8M或更低，例如约10^-9M或更低，例如约10^-10或更低的K_D结合人PD-L1。

77.根据前述项中任一项所述的抗体，其中当在本文的实施例11所述测定时，当使用纯化的T细胞作为效应细胞时，所述抗体介导MDA-MB-231细胞、PC-3细胞和/或HELA细胞的浓度依赖性细胞毒性。

78.核酸构建体，其包含：

(i)编码如项1至31中任一项所述的包含能够结合人PD-L1的抗原结合区的抗体的重链序列的核酸序列，和/或

(ii)编码如项1至31中任一项所述的包含能够结合人PD-L1的抗原结合区的抗体的轻链序列的核酸序列。

79.根据项73所述的核酸构建体，其进一步包含

(i)编码如项33至38中任一项所述的包含能够结合人CD3ε的抗原结合区的抗体的重链序列的核酸序列，和

(ii)编码如项33至38中任一项所述的包含能够结合人CD3ε的抗原结合区的抗体的轻链序列的核酸序列。

80.表达载体，其包含如项78或79所述的核酸构建体。

81.宿主细胞，其包含如项78或79所述的核酸构建体或如项80所述的表达载体。

82.根据项81所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢细胞。

83.药物组合物，其包含根据项1至77中任一项所述的抗体和药学上可接受的载体。

84.根据项1至77中任一项所述的抗体或根据项83所述的药物组合物，其用作药物。

85.根据项1至80中任一项所述的抗体或根据项70所述的药物组合物，其用于治疗癌症。

86.根据项1至77中任一项所述的抗体或根据项70所述的药物组合物，其用于治疗以实体瘤的存在为特征的癌症疾病。

87.根据项1至78中任一项所述的抗体或根据项70所述的药物组合物，其用于治疗选自下组的癌症疾病：黑素瘤、卵巢癌、肺癌、结肠癌和头颈癌。

88.治疗疾病的方法，其包括向有此需要的受试者施用根据项1至75中任一项所述的抗体或根据项83所述的药物组合物。

89.根据项1至77中任一项所述的抗体在制备药物中的用途，如用于治疗癌症的药物，例如以实体瘤的存在为特征的癌症疾病或选自黑素瘤、卵巢癌、肺癌、结肠癌和头颈癌的癌症疾病。

90.根据项83至89中任一项所述的方法或用途，其中所述方法或用途包括与一种或多种其他治疗剂如化学治疗剂的组合。

91.用于产生根据项1至77中任一项所述的抗体的方法，其包括以下步骤：

a)培养产生如项1至13中任一项所述的包含能够结合人PD-L1的抗原结合区的第一抗体的宿主细胞，并从所述培养物中纯化所述第一抗体；

b)培养产生如14至19中任一项所述的包含能够结合PD-L1的不同表位或不同抗原的抗原结合区的第二抗体的宿主细胞，并从所述培养物中纯化所述第二抗体；

c)在足以使铰链区中的半胱氨酸经历二硫键异构化的还原条件下温育所述第一抗体与所述第二抗体。

d)获得所述双特异性抗体。

92.抗独特型抗体，其与如项1至77中任一项所述的能够结合人PD-L1的抗原结合区结合。

通过以下实施例进一步说明本发明，这些实施例不应解释为限制本发明的范围。

实施例

实施例1：PD-L1抗体的产生

OmniRat动物的免疫接种和杂交瘤的产生

在Aldevron GmbH(Freiburg,Germany)进行免疫和杂交瘤的产生。将编码人PD-L1氨基酸19-238的cDNA克隆到Aldevron专有表达质粒中。使用用于颗粒轰击的手持式装置(“基因枪”)，通过皮内应用涂有DNA的金颗粒，对多组OmniRat动物(表达具有完全人独特型的抗体的多样化全集的转基因大鼠；Ligand Pharmaceuticals Inc.,San Diego,USA)进行免疫。用基于Genentech的MPDL3280A的抗PD-L1抗体确认瞬时转染的HEK细胞上的细胞表面表达。一系列免疫后收集血清样品，并在流式细胞仪中对用上述表达质粒瞬时转染的HEK细胞进行测试。分离产生抗体的细胞，并根据标准程序与小鼠骨髓瘤细胞(Ag8)融合。通过在如上所述的相同测定中进行筛选，鉴定出产生对PD-L1具有特异性的抗体的杂交瘤。使用RNA保护剂(RNAlater，ThermoFisher Scientific，目录号AM7020)制备阳性杂交瘤细胞的细胞团粒，并进一步加工以用于抗体可变域的测序。

PD-L1抗体可变区的序列分析和表达载体中的克隆

从0.2至5x10⁶个杂交瘤细胞中制备总RNA，并且使用SMART RACE cDNA扩增试剂盒(Clontech)根据制造商的说明从总RNA中制备5’-RACE互补DNA(cDNA)。通过PCR扩增VH和VL编码区，并通过不依赖于连接的克隆在pOMTG1f-FEAR-LIC(人IgG1)和pEFC33D-Kappa(人Kappa)或pOMTL-LIC(人Lambda)表达载体中直接框内克隆(Aslanidis,C.and P.J.deJong,Nucleic Acids Res 1990；18(20):6069-74)。在这些质粒中，使用CMV启动子表达抗体序列。对于每种抗体，对8个VL克隆和8个VH克隆进行了测序。CDR序列是根据IMGT定义[Lefranc MP.et al.,Nucleic Acids Research,27,209-212,1999；BrochetX.Nucl.Acids Res.36,W503-508(2008)]来定义。选择具有正确开放阅读框(ORF)的克隆用于进一步研究和表达。使用ExpiFectamine在Expi293F细胞中瞬时共表达每种杂交瘤培养物中发现的重链和轻链的所有组合的LEE PCR产物。每个杂交瘤，选择在同质剂量响应筛查中显示最佳结合的HC/LC对作为前导候选物。

选择了三种PD-L1抗体，分别编号为338、511和547，以进行进一步的实验。它们的可变区序列在本文的序列表中显示。

对于抗体IgG1-PDL1-511-FEAR，产生了在可变域中具有点突变的变体，以除去可潜在产生不希望的二硫键的半胱氨酸残基：IgG1-PDL1-511-FEAR-LC33S。通过基因合成(Geneart)产生此突变体。

LEE PCR

通过从表达质粒扩增包含CMV启动子、HC或LC编码区和包含多聚A信号的元件的片段产生线性表达元件(LEE)。为此，使用Accuprime Taq DNA聚合酶(Life Technologies)和引物CMVPf(BsaI)2和TkpA(BsaI)r扩增区域，进行在94℃的45秒，55℃的30秒和68℃的2(LC)或3(HC)分钟的35个循环，使用50x稀释的质粒微量制备材料作为DNA模板。

在Expi293F细胞中LEE片段的瞬时表达

对于抗体的LEE表达，使用ExpirFectamin 293作为转染试剂根据制造商(ThermoFisher Scientific,USA)的说明，使用96孔板作为容器，将1.11μl的HC LEE PCR反应混合物和1.11μl的LC PCR反应混合物混合并以125μl的总体积在Expi293F细胞中进行转染。

抗体表达

将抗体以IgG1,Kappa(对于338)或IgG1,Lambda(对于511和547)表达。使用Expi293F表达平台(Thermo Fisher Scientific,USA)基本上按照制造商的描述瞬时表达编码抗体的重链和轻链两者的质粒DNA混合物。

同质结合测定法

在使用用PDL1，PDL1mm或PDL1Mf转染的CHO细胞的同质剂量响应筛选(还参见实施例2)中测试抗体的结合。未转染的CHO细胞用作阴性对照。

将细胞(2.5x 10⁵个细胞/ml)与山羊抗人IgG Alexa 647,Fcγ特异性片段(0.2μg/ml；Jackson ImmunoResearch Laboratories，109-605-098)混合。制备测试抗体和对照抗体的系列稀释液(2倍稀释步骤，范围为0.001至3μg/mL)，并将2μl抗体稀释液添加到1536孔板(Greiner，789866)中的5μl细胞/缀合物混合物。将板在室温温育9小时，然后使用ImageXpress Velos激光扫描细胞仪(Molecular Devices)测定荧光强度。

抗体纯化

将培养上清液用0.2μm死端滤器过滤，加载在5mL MabSelect SuRe柱(GEHealthcare)上，并用pH 3的0.1M柠檬酸钠-NaOH洗脱。立即用2M Tris-HCl(pH 9)中和，并且过夜透析至8.7mM Na₂HPO₄,1.8mM NaH₂PO₄140.3mM NaCl,pH 7.4(B.Braun或GEHealthcare)。或者，纯化后，将洗脱液加载至HiPrep脱盐柱，并将抗体交换到8.7mMNa₂HPO₄,1.8mM NaH₂PO₄140.3mM NaCl,pH 7.4(B.Braun or GE Healthcare)缓冲液中。透析或更换缓冲液后，将样品通过0.2μm死端滤器进行无菌过滤。使用LabChip GXII(CaliperLife Sciences,MA)通过CE-SDS确定纯度，并使用Nanodrop ND-1000分光光度计(IsogenLife Science,Maarssen,The Netherlands)测量IgG浓度。纯化的抗体储存在4℃。

实施例2：筛选材料的生成

PD-L1的表达构建体

产生以下用于全长PD-L1表达的密码子优化的构建体：人(智人)PD-L1(Genbank登录号NP_054862)、食蟹猴(成束猴(Macaca fascicularis))PD-L1(Genbank登录号XP_005581836)、小鼠(小家鼠(Mus musculus))PD-L1(Genbank登录号NP_068693)。

此外，还生成了以下针对PD-L1 ECD的密码子优化构建体：具有C端His-标签和C-标签的人PD-L1(aa 1-238)的胞外域(ECD)(PDLoneECDHisCtag)。

构建体含有适合于克隆的限制性位点和最佳Kozak(GCCGCCACC)序列[Kozak etal.(1999)Gene 234:187-208]。将构建体克隆到哺乳动物表达载体pMA(Geneart)中。

PD-L2的表达构建体

类似地，产生了用于全长人PD-L2表达的密码子优化构建体：人(智人)PD-L2(Genbank登录号NP_079515)

在CHO-S细胞中表达

用pMA载体瞬时转染CHO-S细胞，该载体分别包含完全人PD-L1、完全食蟹猴和完全小鼠抗体的编码序列。

带有His标签的PD-L1的纯化

在HEK-293F细胞中表达PDLoneECDHisCtag。His标签实现用固定化的金属亲和层析的纯化。在此过程中，固定到层析树脂上的螯合剂充满Co²⁺阳离子。将含有带组氨酸标签的蛋白质的上清液与树脂以分批模式(即溶液)温育。带有His标签的蛋白质强烈结合树脂珠，而与带His标签的蛋白质相比，培养上清液中存在的其他蛋白质不结合或弱结合。温育后，从上清液中回收珠，并装入柱中。洗涤柱以除去弱结合的蛋白质。然后用含咪唑的缓冲液洗脱强烈结合的带有His标签的蛋白质，所述咪唑与His与Co²⁺的结合竞争。通过在脱盐柱上交换缓冲液从蛋白质中除去洗脱液。

实施例3：用于产生CD3xPDL1双特异性抗体的人源化CD3抗体

人源化抗体IgG1-huCD3-H1L1的产生在WO2015001085的实施例1中描述。抗体huCD3-H1L1-FEAL是其具有以下取代的变体：L234F，L235E，D265A和F405L，如上所述。

实施例4：通过2-MEA诱导的Fab臂交换产生双特异性抗体

通过在受控的还原条件下进行Fab臂交换产生双特异性IgG1抗体。该方法的基础是使用互补的CH3域，该CH3域在特定的测定条件下促进异二聚体的形成，如WO2011/131746中所述。将F405L和K409R(EU编号)突变引入相关抗体中，以创建具有互补CH3域的抗体对。

为了生成双特异性抗体，将两种亲本互补抗体(每种抗体的终浓度为0.5mg/mL)与75mM 2-巯基乙胺-HCl(2-MEA)在31℃下以100μL TE的总体积温育5小时。通过使用旋转柱(Microcon离心过滤器，30k，Millipore)根据制造商的方案除去还原剂2-MEA来终止还原反应。

在实施例中使用以下抗体：

CD3抗体

IgG1-huCD3-H1L1-FEAL(分别具有以SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:29列出的VH和VL序列)

bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALxb12-FEAR是一种双特异性抗体，其使用作为gp120特异性抗体的抗体b12作为第二臂(Barbas,CF.J Mol Biol.1993Apr5；230(3):812-23)。

PDL1抗体和CD3xPDL1双特异性抗体

IgG1-338-FEAR(分别具有以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:5列出的VH和VL序列)

IgG1-338-F405L

bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx338-FEAR

bsIgG1-b12-FEALx338-FEAR

IgG1-511-LC33S-FEAR(分别具有在SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:15中列出的VH和VL序列)

IgG1-511-F405L-LC33S

bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx511-LC33S-FEAR

bsIgG1-b12-FEALx511-LC33S-FEAR

IgG1-547-FEAR(分别具有以SEQ ID NO:18和SEQ ID NO:22列出的VH和VL序列)

IgG1-547-F405L

bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx547-FEAR

bsIgG1-b12-FEALx547-FEAR

IgG1-321-FEAR(分别具有以SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:36列出的VH和VL序列)

IgG1-421-LC91S-FEAR(分别具有以SEQ ID NO:46和SEQ ID NO:50列出的VH和VL序列)

IgG1-476-N101Q-LC33S-FEAR(分别具有在SEQ ID NO:53和SEQ ID NO:57中列出的VH和VL序列)

IgG1-625-FEAR(分别具有以SEQ ID NO:106和SEQ ID NO:110列出的VH和VL序列)

IgG1-632-FEAR(分别具有以SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:71列出的VH和VL序列)

IgG1-516-FEAR(分别具有以SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:64列出的VH和VL序列)

IgG1-MPDL3280A-FEAR(基于Genentech的PDL1抗体MPDL3280A；分别具有在SEQ IDNO:74和SEQ ID NO:78中列出的VH和VL序列)

IgG1-MPDL3280A-K409R

IgG1-MEDI4736-FEAR(基于MedImmune的PDL1抗体MEDI4736；分别具有在SEQ IDNO:81和SEQ ID NO:85中列出的VH和VL序列)

IgG1-MEDI4736-F405L

实施例5：PD-L1抗体或CD3xPD-L1或b12xPD-L1双特异性抗体与肿瘤细胞的结合

PD-L1抗体和CD3xPD-L1和b12xPD-L1双特异性抗体与人肿瘤细胞系SK-MES-1(肺鳞状细胞癌；ATCC；目录号HTB-58)，MDA-MB-231(乳腺癌；ATCC；目录号HTB-26)，PC-3(***腺癌；ATCC；目录号CRL-1435)和HELA(***；ATCC；目录号CCL-2)的结合通过流式细胞术分析。

将细胞(3-5x10⁴个细胞/孔)在聚苯乙烯96孔圆底板(Greiner bio-one，目录号650101)中与50μL PBS/0.1％BSA/0.02％叠氮化物(染色缓冲液)中抗体的连续稀释液(5倍稀释步骤，范围为0.0001至10μg/mL)于4℃温育30分钟。

在染色缓冲液中洗涤两次后，将细胞在50μL二抗中于4℃温育30分钟。作为二抗，对于所有实验使用染色缓冲液中以1:500稀释的缀合有R-藻红蛋白(PE)的山羊抗人IgG F(ab’)₂(目录号109-116-098,Jackson ImmunoResearch Laboratories,Inc.,West Grove,PA)。接下来，将细胞在染色缓冲液中洗涤两次，重悬于20μL染色缓冲液中，并在iQue筛选器(Intellicyt Corporation,USA)上进行分析。使用非线性回归(具有可变斜率的S形剂量响应)，使用GraphPad Prism V75.04软件(GraphPad Software，San Diego，CA，USA)分析结合曲线。

如所描述的(Poncelet and Carayon,1985,J.Immunol.Meth.85:65-74)进行定量流式细胞术(Dako；目录号K0078)，以定量MDA-MB-231,PC-3和HELA细胞的质膜上的靶物表达，并确定结合的PDL1分子的数量。确定细胞系具有以下PD-L1抗原密度(ABC，抗体结合能力)：

·SK-MES-1：约30,000个ABC/细胞

·MDA-MB-231：约21,000个ABC/细胞

·PC-3：约6,000个ABC/细胞

·HELA细胞：约2,000个ABC/细胞。

与MDA-MB-231细胞的结合

图1显示bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx338-FEAR(A),bsIgG1-b12-FEALx338-FEAR(D),bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx547-FEAR(B)和bsIgG1-b12-FEALx547-FEAR(E)显示与MDA-MB-231细胞的剂量依赖性结合，具有比单特异性二价PD-L1抗体IgG1-338-FEAR和IgG1-547-FEAR更高的最大结合。bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx511-LC33S-FEAR(C)和bsIgG1-b12-FEALx511-LC33S-FEAR(F)的最大结合低于二价单特异性PD-L1抗体IgG1-511-LC33S-FEAR。

与PC-3细胞的结合

图2显示bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx338-FEAR(A),bsIgG1-b12-FEALx338-FEAR(D),bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx547-FEAR(B)和bsIgG1-b12-FEALx547-FEAR(E)显示与PC3细胞的剂量依赖性结合。bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx511-LC33S-FEAR(C)和bsIgG1-b12-FEALx511-LC33S-FEAR(F)的最大结合低于二价单特异性PD-L1抗体IgG1-511-LC33S-FEAR。

与HELA细胞的结合

图3显示bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx338-FEAR(A)和bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx547-FEAR(B)显示与HELA细胞的剂量依赖性结合。在使用的浓度范围内无法确定单特异性二价PD-L1抗体IgG1-338-FEAR和IgG1-547-FEAR的最大结合。(C)bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx511-LC33S-FEAR和IgG1-511-LC33S-FEAR不与HELA细胞结合。

与SK-MES-1细胞的结合

图4显示bsIgG1-b12-FEALx338-FEAR(A)和bsIgG1-b12-FEALx547-FEAR(B)显示与SK-MES-1细胞的剂量依赖性结合，具有比单特异性二价PD-L1抗体IgG1-338-FEAR和IgG1-547-FEAR更高的最大结合。bsIgG1-b12-FEALx511-LC33S-FEAR(C)的最大结合低于二价单特异性PD-L1抗体IgG1-511-LC33S-FEAR。

实施例6：与人PD-L2的结合

为了显示与PD-L1而非与人PD-L2的特异性结合，使用如上所述的方法通过流式细胞术确定bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx338-FEAR和IgG1-338-FEAR,bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx547-FEAR和IgG1-547-FEAR以及bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx511-LC33S-FEAR和IgG1-511-LC33S-FEAR与表达人PD-L2的CHO细胞的结合。将缀合有PE的PD-L2特异性抗体(Mylteni，克隆MIH18；目录号130-098-651)用作阳性对照。测试的抗体均未结合CHO-PD-L2细胞。

实施例7：PD-L1抗体或CD3xPD-L1或b12xPD-L1双特异性抗体与食蟹猴PD-L1的结合

使用如上所述的方法通过流式细胞术确定与表达食蟹猴PD-L1的CHO细胞的结合。图5显示bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx338-FEAR(A),bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx547-FEAR(B),bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx511-LC33S-FEAR(C),bsIgG1-b12-FEALx338-FEAR(D),bsIgG1-b12-FEALx547-FEAR(E)和bsIgG1-b12-FEALx511-LC33S-FEAR(F)，显示与表达食蟹猴PD-L1的CHO细胞的剂量依赖性结合，其中最大结合高于单特异性二价PD-L1抗体IgG1-338-FEAR,IgG1-547-FEAR和IgG1-511-LC33S-FEAR。

实施例8：使用Bio-layer干扰量度法测定人和食蟹猴PD-L1亲和力

在第一组实验中，使用Octet HTX仪器(ForteBio)上的Bio-layer干扰量度法(BLI)确定对重组表达的人PD-L1蛋白的亲和力。将抗人IgG Fc捕获(AHC)生物传感器(ForteBio)加载抗体(1μg/ml)达900s。在基线(100s)后，以2倍稀释步骤使用2.67μg/ml-0.14μg/ml(100nM-1.56nM)的浓度范围，确定样品稀释液(ForteBio)中PDLoneECDHisCtag的缔合(1000s)和解离(2000s)。在30℃在以1000rpm摇动的情况下进行实验。使用1:1模型和1000s缔合时间和200或1000s解离时间的全局完全拟合，使用数据分析软件v9.0.0.12(ForteBio)对数据进行分析。通过减去缓冲液参考值校正数据迹线，将Y轴与基线的最后10s对齐，并应用步间校正以及Savitzky-Golay过滤。具有响应<0.05nm的数据迹线从分析中排除。作为默认，使用用1000s解离时间的拟合。基于R²值和拟合的目视检查，IgG1-511-FEAR-LC33S的解离时间为200s。

表1显示了结果。

表1：通过Bio-layer干涉量度法测定的单特异性二价PD-L1抗体对人PD-L1的结合亲和力。

在第二组实验(n＝3)中，比较了使用BLI测定的PD-L1抗体对人和食蟹猴PD-L1的亲和力。实验设置如上所述，只是

·AHC生物传感器的抗体加载时间为600s；

·基线为300s；

·除PDLoneECD-HisCtag(人PD-L1，理论分子量29kDa)外，来自(AcroBiosystems，目录号PD1-C52H4-100，理论分子量27.1kDa)的食蟹猴PD-L1/B7-H1蛋白用作抗原；

·抗原的浓度范围是0.156-10nM(在第一个实验中)或0.39-25nM(在第二和第三个实验中)。

表2显示了结果(3个实验的平均值)IgG1-338-FEAR,IgG1-547-FEAR和IgG1-511-LC33S-FEAR对人PD-L1的结合亲和力在与表1所示的相同范围内，具有可能由于测定条件的变化而产生的偏差。这些抗体对食蟹猴PD-L1的结合亲和力与人PD-L1的结合亲和力非常相似。还确定了IgG1-MEDI4738-FEAR和IgG1-MPDL3280A-FEAR的结合亲和力。IgG1-MEDI4738-FEAR对人和食蟹猴PD-L1表现出相似的结合亲和力。IgG1-MEDI4738-FEAR在结合亲和力上显示出大的差异，对食蟹猴PD-L1的亲和力平均比对人PD-L1的亲和力低19.7(K_D更高)。

表2：如通过Bio-layer干涉量度法测定的单特异性二价PD-L1抗体对人和食蟹猴PD-L1的结合亲和力(3个独立实验的平均值)。

实施例9：PD-L1经典夹心交叉阻断测定法

在Octet HTX仪器(ForteBio)上使用Bio-layer干涉量度法(BLI)进行抗体交叉阻断测试。根据制造商的说明，将抗体(在10mM乙酸钠缓冲液pH 6.0中为20μg/ml(ForteBio))固定在胺反应性第二代(AR2G)生物传感器(ForteBio)上。在样品稀释液(ForteBio)中基线(50s)后，将含有固定抗体的生物传感器加载PDLoneECDHisCtag(100nM或2.7μg/ml)500s，此后将二抗(10μg/ml)的缔合响应追踪500s。通过将3次5s交替暴露于10mM甘氨酸pH 2.5和样品稀释液来再生生物传感器。从基线步骤开始，用一组新的二抗重复该实验。每个生物传感器使用6次。实验在30℃使用1000rpm的振荡器速度进行。使用数据分析软件v9.0.0.12(ForteBio)分析数据。Y轴与缔合步骤对齐，并应用Savitzky-Golay过滤。从二抗的缔合响应中减去平均缓冲液响应，以校正PDLoneECDHisCtag从固定化抗体的解离。经校正的缔合响应以矩阵格式绘制。≥0.1nm的响应视为非阻断抗体对(结果在图6中的表中以纯数字表示)，低于0.1nm的响应视为阻断抗体对(结果在图6中的表中以粗体数字表示)。一些抗体对显示置换行为(在图6中的表中以星号(*)表示)。显示了代表性的图，在图(A)中代表置换，在图(B)中阻断和(C)非阻断抗体对。

对抗体IgG1-338-FEAR,IgG1-547-FEAR,IgG1-511-LC33S-FEAR,IgG1-321-FEAR,IgG1-421-LC91S-FEAR,IgG1-476-N101Q-LC33S-FEAR,IgG1-632-FEAR,IgG1-516-FEAR,IgG1-MPDL3280A-FEAR和IgG1-MEDI4736-FEAR进行交叉阻断实验。结果总结在图6中。

数据显示了抗体IgG1-511-LC33S-FEAR限定独特的交叉阻断组，因为它阻断IgG1-321-FEAR,IgG1-338-FEAR,IgG1-476-N101Q-LC33S-FEAR,IgG1-632-FEAR,IgG1-MPDL3280A-FEAR和IgG1-MEDI4736-FEAR，但它不阻断IgG1-547-FEAR,IgG1-421-LC91S-FEAR或IgG1-516-FEAR与人PDL1的结合。

此外，抗体IgG1-547-FEAR限定独特的交叉阻断基团，因为它阻断IgG1-321-FEAR,IgG1-338-FEAR,IgG1-421-LC91S-FEAR,IgG1-MPDL3280A-FEAR和IgG1-MEDI4736-FEAR，但它不阻止IgG1-511-LC33S-FEAR,IgG1-476-N101Q-LC33S-FEAR,IgG1-632-FEAR,IgG1-516-FEAR与人PD1结合。

此外，抗体IgG1-476-N101Q-LC33S-FEAR与IgG1-321-FEAR,IgG1-338-FEAR,IgG1-MPDL3280A-FEAR和IgG1-MEDI4736-FEAR组合显示出置换行为，指示与IgG1-421-LC19S-FEAR,IgG1-547-FEAR,IgG1-LC33S-FEAR,IgG1-632-FEAR和IgG1-516-FEAR相比，抗体IgG1-321-FEAR,IgG1-338-FEAR,IgG1-MEDI4736-FEAR和IgG1-MPDL3280A-FEAR差异结合人PD-L1。

实施例10：PD-L1抗体对PD-1/PD-L1相互作用的影响

在Promega(Madison,USA)开发的PD-1/PD-L1阻断生物测定法中测定二价和单价PD-L1抗体对PD-1和PD-L1相互作用的影响。这是一种基于生物发光细胞的测定法，其由两种遗传工程化细胞系组成：PD-1效应细胞，其是表达由NFAT响应元件(NFAT-RE)驱动的人PD-1和萤光素酶报告物的Jurkat T细胞，以及PD-L1 aAPC/CHO-K1细胞，其是表达人PD-L1和工程化细胞表面蛋白的CHO-K1细胞，所述工程化细胞表面蛋白经设计以不依赖于抗原的方式激活关联TCR。当将两种细胞类型共培养时，PD-1/PD-L1相互作用抑制TCR信号传导和NFAT-RE介导的发光。添加阻断PD-1/PD-L1相互作用的抗体释放抑制信号，并导致TCR活化和NFAT-RE介导的发光。

根据制造商的方案融化PD-L1 aAPC/CHO-K1细胞(Promega，目录号J109A)，重悬于含有10％胎牛血清(FBS；Promega，目录号：J121A)，的Ham’s F12培养基(Promega,目录号J123A)中，并接种在96孔平底培养板(CulturPlate-96，Perkin Elmer，目录号6005680)中。将板在37℃,5％CO₂温育16小时。除去上清液，并且添加抗体的连续稀释(最终浓度范围为5至0.001μg/mL；在含1％胎牛血清[FBS；Promega,目录号J121A]的RPMI 1640[Lonza,目录号BE12-115F]中的4倍稀释)。添加PD-1效应细胞(Promega，目录号J115A；根据制造商的方案融化并重悬于RPMI/1％FBS)。将板在37℃,5％CO₂温育6小时。平衡至室温后，将40μl Bio-Glo试剂(Bio-Glo萤光素酶测定缓冲液[Promega,目录号G7198]中根据制造商的方案重建的Bio-Glo萤光素酶测定底物[Promega目录号G720B])添加到每孔。将板在室温温育5-10分钟，并使用EnVision Multilabel Reader(PerkinElmer)测量发光。相对于对照(未添加抗体)，对PD1-PD-L1相互作用的影响如下计算：

诱导倍数＝RLU(诱导-背景)/RLU(无抗体对照-背景)，RLU是相对光单位

图7显示二价单特异性抗体IgG1-338-FEAR,IgG1-547-FEAR和IgG1-511-LC33S-FEAR以剂量依赖性方式有效地阻断PD1和PD-L1之间的相互作用。单价抗体bsIgG1-b12-FEALx338-FEAR和bsIgG1-b12-FEALx547-FEAR也有效阻断PD1-PD-L1的相互作用。bsIgG1-b12-FEALx511-LC33S-FEAR也阻断此相互作用，尽管以较低效率。

实施例11：CD3xPD-L1双特异性抗体的体外细胞毒性

CD3xPD-L1双特异性抗体在体外细胞毒性测定法中进行了测试，使用肿瘤细胞系为靶细胞以及纯化的T细胞或外周血单个核细胞(PBMC)作为效应细胞。来自供体血沉棕黄层(Sanquin,Amsterdam,The Netherlands)的T细胞使用RosetteSep人T细胞富集混合物(目录号：15021C.1，Stemcell Technologies，France)根据制造商的说明分离。使用Ficoll梯度色谱仪(Lonza；淋巴细胞分离介质，目录号17-829E)根据制造商的说明从40mL血沉棕黄层(Sanquin)中分离PBMC。

将MDA-MB-231细胞(16,000个细胞/孔)，PC-3细胞(16,000个细胞/孔)或HELA细胞(10,000个细胞/孔)接种到平底96孔板中(目录号：655180，Greiner-bio-one,TheNetherlands)，并在37℃培养过夜。对于MDA-MB-231或PC-3细胞，将T细胞以E:T比率＝4:1添加到肿瘤细胞，而对于HELA细胞以E:T＝8:1添加到肿瘤细胞。PBMC以E:T比率＝10:1添加到肿瘤细胞。添加抗体的连续稀释液(最终浓度范围为1000至0.06ng/mL；4倍稀释)，并将板在37℃温育48小时。接下来，弃去上清液，并将粘附的细胞用PBS洗涤两次。将150μL10％的alamar blue(目录号：DAL1100，Life Technologies，The Netherlands)溶液(在含有10％的供体牛血清和铁(目录号：10371-029,Life Technologies,The Netherlands)的RPMI-1640(目录：BE12-115F,Lonza,Switzerland)培养基中制备)添加到孔，并在37℃温育5h。用Envision多标记读板仪(PerkinElmer,US)测量吸光度。将星状孢子素(目录号：S6942，Sigma-Aldrich，US)处理的细胞设为0％存活力，并且将未处理的细胞设为100％存活力。“百分比活细胞”如下计算：

％活细胞＝(吸光度样品-经星状孢子素处理的靶细胞的吸光度)/(未处理的靶细胞的吸光度-经星状孢子素处理的靶细胞的吸光度)x 100。

MDA-MB-231细胞中CD3xPD-L1双特异性抗体的细胞毒性

图8显示在使用纯化的T细胞(A)和PBMC(B)作为效应细胞时，bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx338-FEAR,bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx547-FEAR和bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx511-LC33S-FEAR在MDA-MB-231细胞(表达相对较高水平的PD-L1)中诱导浓度依赖性细胞毒性。

PC-3细胞中CD3xPD-L1双特异性抗体的细胞毒性

图9显示当使用纯化的T细胞(A)和PBMC(B)作为效应细胞时，bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx338-FEAR,bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx547-FEAR和bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx511-LC33S-FEAR在PC-3细胞中诱导浓度依赖性细胞毒性。bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx511-LC33S-FEAR在诱导表达中等的PD-L1水平的PC-3细胞中的细胞毒性方面效率最低。

HELA细胞中CD3xPD-L1双特异性抗体的细胞毒性

图10显示，当使用T细胞作为效应细胞时，并且对于一个供体也当使用PBMC时，bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx547-FEAR能够诱导表达低PD-L1水平的HELA细胞的细胞毒性。bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx338-FEAR不太能够诱导HELA细胞中的细胞毒性，而bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx511-LC33S-FEAR不诱导HELA细胞中的细胞毒性。

实施例12：通过CD3xPD-L1双特异性抗体的T细胞活化和增殖

使用MDA-MB-231细胞作为靶细胞和纯化的T细胞作为效应细胞，在体外测定法中测试CD3xPD-L1双特异性抗体，以测量T细胞的活化和增殖。IgG1-b12(具有能够与Fcγ受体和C1q相互作用的Fc区)用作阴性对照。使用Ficoll梯度(Lonza；淋巴细胞分离介质，目录号17-829E)根据制造商的说明从40mL血沉棕黄层(Sanquin)中分离PBMC。使用RosetteSep人T细胞富集混合物(Stemcell Technologies,France；目录号15021C.1)根据制造商的说明从纯化的PBMC中分离T细胞。用0.07μM CellTrace CFSE(ThermoFisher Scientific，目录号C34554)根据制造商的说明标记MDA-MB-231细胞，并接种(5,000个细胞/孔)到平底96孔板(Greiner-bio-one,The Netherlands,目录号655180)，并在37℃粘附于孔4小时。将T细胞以E:T比率＝8:1添加到肿瘤细胞，因此40,000个细胞/孔。添加抗体的连续稀释液(最终浓度范围为10000至1.5ng/mL；3倍稀释)，并将板在37℃温育4天。

接下来，将上清液(包含非粘附细胞)转移到96孔U底板(Greiner-bio-one)中，通过胰蛋白酶-EDTA(Lonza)处理收获剩余的细胞，并与96-孔U底板中的细胞上清液组合。将细胞用PBS(B.Braun)洗涤，并在4℃用抗体混合物染色30分钟：1:200抗huCD4-pacificblue(Biolegend，目录号300521)，1:50抗huCD8-FITC(BD，目录号345772)，1:100抗huCD25-PE-Cy7(eBiosciences，目录号25-0259-42)和抗huCD69-PE(BD，目录号555531)。用冰冷的FACS缓冲液洗涤细胞一次，然后重悬于80μL FACS缓冲液中，该缓冲液中补充有1:6000稀释To pro-3-碘(ThermoFisher Scientific，目录号T3605)。

通过在流式细胞仪上以固定体积50μL计数CD4^pos和CD8^pos T细胞的总数来确定T细胞增殖。通过在流式细胞仪上以固定体积50μL计数CD69^pos(早期T细胞活化标志物)和CD25^pos(晚期T细胞活化)细胞的数量来测量T细胞活化。图11显示所有CD3xPD-L1双特异性抗体诱导T细胞增殖(通过T细胞总数的增加指示)。然而，在不同的CD3xPD-L1双特异性抗体之间观察到活化T细胞和总T细胞的量的差异，其中bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx511-LC33S-FEAR效率较低，而bsIgG1-huCD3-H1L1-FEALx547-FEAR最有效。

实施例13.使用丙氨酸扫描确定抗体结合中PD-L1氨基酸残基的贡献。

文库设计

合成了PD-L1(Uniprot Q9NZQ7)单残基丙氨酸文库(Geneart)，其中人PD-L1胞外域中的所有氨基酸残基都个别突变为丙氨酸，除了已经含有丙氨酸或半胱氨酸的位置外。未将半胱氨酸突变以使抗原的结构破坏的机会最小化。在含有CMV/TK-polyA盒、Amp抗性基因和pBR322复制起点的pMAC表达载体中克隆文库。

文库产生和筛选

根据制造商的说明(Thermo Scientific)在FreeStyle HEK293细胞中个别表达野生型PD-L1和丙氨酸突变体。转染后一天，收获细胞。将约100,000个细胞与FACS缓冲液中20μL缀合有Alexa488的目标抗体一起温育(表3)。将细胞在室温温育1小时。随后，添加150μLFACS缓冲液，并通过离心洗涤细胞。将细胞悬浮于20μL新鲜FACS缓冲液(PBS[不含Ca⁺⁺,Mg⁺⁺和酚红]/1％BSA级分V/0.02％NaN₃)中，并在4℃贮存，直到使用iQue筛选器通过流式细胞仪进行分析。

整个实验进行了4次。

表3：用于使用丙氨酸扫描确定PD-L1氨基酸残基在抗体结合中的贡献的抗体。

数据分析

对于每个样品，将每个细胞的平均抗体结合率以未门控细胞群体的荧光强度的几何平均值(gMFI)确定。抗体对PD-L1突变体的亲和力和每个细胞PD-L1突变体表达水平影响gMFI。由于特定的丙氨酸突变可以影响突变体PD-L1的表面表达水平，并且通常为了校正每种PD-L1突变体的表达差异，因此相对于非交叉阻断PD-L1特异性对照(IgG1-625-FEAR-A488；包含以SEQ ID NO:106中所示的重链可变区(VH)和以SEQ ID NO:110所示的轻链可变区(VL))的结合强度使用以下公式将数据标准化：

其中的“aa位置”是指PD-L1的特定ala突变体或野生型(wt)PD-L1。

为了在线性倍数变化量表上表示抗体结合的丧失或获得，使用以下计算：

在大多数情况下，结合获得将由参考抗体与特定ala突变体结合的丧失引起。

根据这些计算，通过丙氨酸替代氨基酸后，没有特定抗体的结合丧失或获得的氨基酸位置将给出为“0”的结果，结合获得会导致“>0”并且结合丧失将导致“<0”。为了校正样品变化，仅如下PD-L1氨基酸残基认为是“结合突变体的丧失”，其中结合倍数变化低于平均倍数变化–1.5x SD(图12中的虚线所示)，其中SD是来自特定测试抗体的四个独立实验的计算倍数变化的标准偏差。

若对照抗体对特定PD-L1突变体的gMFI低于平均gMFI-平均gMFI_对照抗体的2.5x SD，则将数据从分析中排除(对于那些PD-L1突变体，假定表达水平是不足够的)。

图12显示了PD-L1抗体与在位置42至131(根据SEQ ID No 94)具有ala突变的PD-L1变体的结合的倍数变化。结果指示

·抗体338的结合至少依赖于人PD-L1的aa R113，Y123和R125，

·抗体511的结合至少依赖于人PD-L1的aa F19，F42，E45，K46，L94和I116；氨基酸E45，K46和L94直接参与抗体的结合，而F19，F42和I116由于其掩埋的侧链而间接参与抗体的结合，

·抗体547的结合至少依赖于人PD-L1的aa E58和R113，

·抗体MEDI4736的结合至少依赖于人PD-L1的aa R113和R125，

·抗体MPDL3280A的结合至少依赖于人PD-L1的aa R125和I126，其中I126由于其掩埋的侧链而可以间接参与抗体的结合。

实施例14：抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)

⁵¹Cr释放测定法中确定的ADCC

收获MDA-MB-231细胞(ATCC，目录号HTB-26)(以获得7x10⁶个细胞)，洗涤(在PBS中两次，1500rpm，5分钟)，并收集在补充有10％加强型小牛血清(CCS)(HyClone,Logan,UT,USA))的2mL RPMI 1640培养基中，对该培养基添加200μCi ⁵¹Cr(铬-51；AmershamBiosciences Europe GmbH,Roosendaal,The Netherlands)。将混合物在37℃在摇动的情况下温育1小时。洗涤后(在PBS中两次，1500rpm，5分钟)，将细胞重悬于RPMI 1640培养基/10％CCS中，并用锥虫蓝排除法计数。将细胞调整至1x10⁵细胞/mL的浓度。

同时，使用标准的Ficoll密度离心根据制造商的说明(淋巴细胞分离培养基；Lonza，Verviers，France)从新鲜的血沉棕黄层(Sanquin,Amsterdam,The Netherlands)中分离出外周血单个核细胞(PBMC)。将细胞重悬于RPMI 1640培养基/10％CCS中后，通过锥虫蓝排除法对细胞计数，并调整至1x10⁷个细胞/mL。

将50μL ⁵¹Cr标记的靶细胞转移至微量滴定孔，并添加50μL 30μg/mL PD-L1抗体(在RPMI/10％CCS中稀释)。作为阳性对照，使用针对在MDA-MB-231细胞上表达的无关靶标的抗体。将细胞在室温温育15分钟，然后添加50μL效应细胞(PBMC)，导致效应器与靶标比率为100:1。为了确定最大的细胞裂解量，添加100μL 5％Triton-X100代替效应细胞。添加100μL RPMI 1640/10％CCS代替效应细胞和抗体，以测定自发裂解量。另外，为了确定不依赖于抗体的细胞裂解的水平，添加50μL效应细胞和50μL培养基(代替抗体)。将样品在37℃,5％CO₂温育4小时。为了确定靶细胞的裂解量，将样品离心(1200rpm，3分钟)，然后将75μL上清液转移至微管中，然后使用gamma数器对释放的⁵¹Cr进行计数。抗体介导的裂解百分比如下计算：

图13显示IgG1-547-F405L诱导通过ADCC对MDA-MB-231细胞的约10％剂量依赖性裂解。阳性对照抗体仅诱导20％的最大裂解，表明该实验中的总裂解相当低。IgG1-511-F405L-LC33S和IgG1-338-F405L不诱导MDA-MB-231裂解。

发光ADCC报告物生物测定法中测定的ADCC

还使用MDA-MB-231细胞上的发光ADCC报告物生物测定法(Promega，目录号G7018)根据制造商的建议确定了PD-L1抗体诱导Fc ADCRIIIa(CD16)交联的能力，作为ADCC的替代。作为效应细胞，试剂盒包含Jurkat人T细胞，其经过工程化改造以稳定表达高亲和力FcγRIIIa(V158)和驱动萤火虫萤光素酶表达的活化T细胞核因子(NFAT)响应元件。简言之，将MDA-MB-231细胞(12,500个细胞/孔)接种在的Culture OptiPlates(Perkin Elmer)中的ADCC测定缓冲液[RPMI-1640培养基[(Lonza，目录号BE12-115F)，补充有3.5％低IgG血清)中，并在37℃/5％CO₂中以75μL的含抗体浓度系列(3.5-倍稀释，最终浓度为0.5-250ng/mL)的总体积温育6小时，并融化ADCC生物测定效应细胞。将板调节至室温(RT)15分钟后，添加75μL Bio Glo Assay萤光素酶试剂，并将板在RT下温育5分钟。通过在EnVision多标记阅读器(Perkin Elmer)上的发光读出来定量萤光素酶的产生。从仅添加靶细胞和抗体(无效应细胞)的孔中确定背景水平。作为阴性对照，使用仅包含靶细胞和效应细胞(无抗体)的孔。

图14显示了IgG1-547-F405L在诱导ADCC中是高度有效的，如报告物测定法中所确定。IgG1-MEDI4736-F405L和IgG1-MPDL3280A-K409R也诱导ADCC，但程度上与IgG1-547-F405L不同。IgG1-511-F405L-LC33S和IgG1-338-F405L不诱导ADCC。

序列表

/>

序列表

<110> 健玛保

<120> 针对PD-L1的抗体

<130> P/0115-WO-PCT

<160> 115

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 119

<212> PRT

<213> 智人

<400> 1

Glu Val Gln Val Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Phe

20 25 30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Gly Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Gly Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Asp Asn Trp Asn Gly His Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 2

<211> 8

<212> PRT

<213> 智人

<400> 2

Gly Phe Thr Phe Ser Arg Phe Trp

1 5

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> 智人

<400> 3

Ile Lys Gln Asp Gly Gly Glu Lys

1 5

<210> 4

<211> 12

<212> PRT

<213> 智人

<400> 4

Ala Arg Asp Asp Asn Trp Asn Gly His Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 5

<211> 107

<212> PRT

<213> 智人

<400> 5

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Asn Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Gly Ser Tyr Ile

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 6

<211> 6

<212> PRT

<213> 智人

<400> 6

Gln Ser Ile Ser Ser Trp

1 5

<210> 7

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人

<400> 7

Gln Gln Tyr Tyr Gly Ser Tyr Ile Thr

1 5

<210> 8

<211> 121

<212> PRT

<213> 智人

<400> 8

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Met Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Val Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Ser Tyr Thr Gly Asn Pro Thr Ser Ala Gln Gly Phe

50 55 60

Thr Gly Arg Phe Val Phe Ser Phe Asp Thr Ser Val Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Tyr Cys Thr Ser Thr Ser Cys Tyr Leu Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 9

<211> 8

<212> PRT

<213> 智人

<400> 9

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Val

1 5

<210> 10

<211> 8

<212> PRT

<213> 智人

<400> 10

Ile Asn Ser Tyr Thr Gly Asn Pro

1 5

<210> 11

<211> 14

<212> PRT

<213> 智人

<400> 11

Ala Arg Gly Tyr Cys Thr Ser Thr Ser Cys Tyr Leu Asp Tyr

1 5 10

<210> 12

<211> 108

<212> PRT

<213> 智人

<400> 12

Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly His

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys Lys Tyr Ala

20 25 30

Cys Trp Phe Gln Gln Lys Ser Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr

35 40 45

Glu Asp Ser Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Thr Ser Gly Thr Met Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Gln Val Glu

65 70 75 80

Asp Glu Thr Asp Tyr Tyr Cys Tyr Ser Ala Asp Thr Ser Gly Thr His

85 90 95

Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 13

<211> 6

<212> PRT

<213> 智人

<400> 13

Ala Leu Pro Lys Lys Tyr

1 5

<210> 14

<211> 11

<212> PRT

<213> 智人

<400> 14

Tyr Ser Ala Asp Thr Ser Gly Thr His Arg Val

1 5 10

<210> 15

<211> 108

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N/A

<400> 15

Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly His

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys Lys Tyr Ala

20 25 30

Ser Trp Phe Gln Gln Lys Ser Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr

35 40 45

Glu Asp Ser Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Thr Ser Gly Thr Met Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Gln Val Glu

65 70 75 80

Asp Glu Thr Asp Tyr Tyr Cys Tyr Ser Ala Asp Thr Ser Gly Thr His

85 90 95

Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 16

<211> 6

<212> PRT

<213> 智人

<400> 16

Ala Leu Pro Lys Lys Tyr

1 5

<210> 17

<211> 11

<212> PRT

<213> 智人

<400> 17

Tyr Ser Ala Asp Thr Ser Gly Thr His Arg Val

1 5 10

<210> 18

<211> 121

<212> PRT

<213> 智人

<400> 18

Glu Val Gln Leu Leu Glu Pro Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Ser Thr Phe Ser Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Phe Ser Gly Ser Gly Gly Phe Thr Phe Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Ser Ser Lys Asn Thr Leu Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Ser Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Ile Pro Ala Arg Gly Tyr Asn Tyr Gly Ser Phe Gln His Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 19

<211> 8

<212> PRT

<213> 智人

<400> 19

Gly Ser Thr Phe Ser Thr Tyr Ala

1 5

<210> 20

<211> 8

<212> PRT

<213> 智人

<400> 20

Phe Ser Gly Ser Gly Gly Phe Thr

1 5

<210> 21

<211> 14

<212> PRT

<213> 智人

<400> 21

Ala Ile Pro Ala Arg Gly Tyr Asn Tyr Gly Ser Phe Gln His

1 5 10

<210> 22

<211> 108

<212> PRT

<213> 智人

<400> 22

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr

35 40 45

Asp Asp Asn Asp Arg Pro Ser Gly Leu Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His

85 90 95

Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 23

<211> 6

<212> PRT

<213> 智人

<400> 23

Asn Ile Gly Ser Lys Ser

1 5

<210> 24

<211> 11

<212> PRT

<213> 智人

<400> 24

Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His Val Val

1 5 10

<210> 25

<211> 125

<212> PRT

<213> 智人

<400> 25

Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr

85 90 95

Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe

100 105 110

Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 26

<211> 8

<212> PRT

<213> 智人

<400> 26

Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr Ala

1 5

<210> 27

<211> 10

<212> PRT

<213> 智人

<400> 27

Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr

1 5 10

<210> 28

<211> 16

<212> PRT

<213> 智人

<400> 28

Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr

1 5 10 15

<210> 29

<211> 109

<212> PRT

<213> 智人

<400> 29

Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Phe Ser Val Ser Pro Gly Gly

1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser

20 25 30

Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Thr Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly

35 40 45

Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala

65 70 75 80

Gln Ala Asp Asp Glu Ser Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn

85 90 95

Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 30

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人

<400> 30

Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr

1 5

<210> 31

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人

<400> 31

Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val

1 5

<210> 32

<211> 123

<212> PRT

<213> 智人

<400> 32

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Asn Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Val Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Leu Tyr Tyr Gly Ser Gly Thr Tyr Pro Pro Phe Asp Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 33

<211> 8

<212> PRT

<213> 智人

<400> 33

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Trp

1 5

<210> 34

<211> 8

<212> PRT

<213> 智人

<400> 34

Ile Lys Gln Asp Gly Asn Glu Lys

1 5

<210> 35

<211> 16

<212> PRT

<213> 智人

<400> 35

Ala Arg Asp Leu Tyr Tyr Gly Ser Gly Thr Tyr Pro Pro Phe Asp Tyr

1 5 10 15

<210> 36

<211> 107

<212> PRT

<213> 智人

<400> 36

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Ser Ser Ser Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 37

<211> 6

<212> PRT

<213> 智人

<400> 37

Gln Ser Ile Ser Ser Trp

1 5

<210> 38

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人

<400> 38

Gln Gln Tyr His Ser Ser Ser Tyr Thr

1 5

<210> 39

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N/A

<400> 39

Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Pro Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr

85 90 95

Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe

100 105 110

Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 40

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 40

Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Met Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr

85 90 95

Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe

100 105 110

Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 41

<211> 126

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N/A

<400> 41

Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr

85 90 95

Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe

100 105 110

Ala Tyr Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 42

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N/A

<400> 42

Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr

85 90 95

Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe

100 105 110

Ala Met Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 43

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N/A

<400> 43

Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr

85 90 95

Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe

100 105 110

Ala Arg Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 44

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N/A

<400> 44

Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr

85 90 95

Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ala Trp Phe

100 105 110

Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 45

<211> 125

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N/A

<400> 45

Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Asn Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr

85 90 95

Tyr Cys Val Arg Gly Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe

100 105 110

Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 46

<211> 121

<212> PRT

<213> 智人

<400> 46

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Gly Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Arg Trp Asn Ser Gly Ser Met His Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ala Pro Trp Tyr Ser Gly Ala Trp His Pro Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 47

<211> 8

<212> PRT

<213> 智人

<400> 47

Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala

1 5

<210> 48

<211> 8

<212> PRT

<213> 智人

<400> 48

Ile Arg Trp Asn Ser Gly Ser Met

1 5

<210> 49

<211> 14

<212> PRT

<213> 智人

<400> 49

Ala Arg Ala Pro Trp Tyr Ser Gly Ala Trp His Pro Asp Tyr

1 5 10

<210> 50

<211> 110

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N/A

<400> 50

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Arg Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Thr Tyr

20 25 30

Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Met Ile Tyr Asp Val Ile Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Leu Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Ala Gly Thr

85 90 95

Tyr Thr Leu Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105 110

<210> 51

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人

<400> 51

Ser Ser Asp Val Gly Thr Tyr Asn Tyr

1 5

<210> 52

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N/A

<400> 52

Ser Ser Tyr Ala Gly Thr Tyr Thr Leu Leu

1 5 10

<210> 53

<211> 127

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N/A

<400> 53

Glu Val Gln Met Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Gly Ile Gly Asp Ser Gly Gly Ser Thr Tyr His Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Leu Gly Gln Ser Ser Gly Trp Tyr Asp His Tyr Tyr Tyr Tyr

100 105 110

Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 54

<211> 8

<212> PRT

<213> 智人

<400> 54

Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr Ala

1 5

<210> 55

<211> 8

<212> PRT

<213> 智人

<400> 55

Ile Gly Asp Ser Gly Gly Ser Thr

1 5

<210> 56

<211> 20

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N/A

<400> 56

Ala Lys Leu Gly Gln Ser Ser Gly Trp Tyr Asp His Tyr Tyr Tyr Tyr

1 5 10 15

Gly Met Asp Val

20

<210> 57

<211> 106

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N/A

<400> 57

Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Ser Ile Thr Cys Ser Gly Asp Lys Leu Gly Asn Lys Tyr Val

20 25 30

Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Val Leu Val Ile Tyr

35 40 45

Arg Asp Ser Glu Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Thr Gln Ala Val

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Phe Tyr Cys Gln Ala Trp Asp Ser Ser Thr Val Val

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 58

<211> 6

<212> PRT

<213> 智人

<400> 58

Lys Leu Gly Asn Lys Tyr

1 5

<210> 59

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人

<400> 59

Gln Ala Trp Asp Ser Ser Thr Val Val

1 5

<210> 60

<211> 120

<212> PRT

<213> 智人

<400> 60

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Asp

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Asp Tyr Ser Ile Ser Ser Asn

20 25 30

Asp Trp Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

35 40 45

Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Thr Gly Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser

65 70 75 80

Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Ala Val Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Thr Arg Val Gly Ala Arg Arg Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 61

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人

<400> 61

Asp Tyr Ser Ile Ser Ser Asn Asp Trp

1 5

<210> 62

<211> 7

<212> PRT

<213> 智人

<400> 62

Ile Tyr Tyr Ser Gly Thr Gly

1 5

<210> 63

<211> 13

<212> PRT

<213> 智人

<400> 63

Ala Arg Thr Arg Val Gly Ala Arg Arg Ala Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 64

<211> 108

<212> PRT

<213> 智人

<400> 64

Ser Tyr Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Val Tyr

35 40 45

Asp Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His

85 90 95

Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 65

<211> 6

<212> PRT

<213> 智人

<400> 65

Asn Ile Gly Ser Lys Ser

1 5

<210> 66

<211> 11

<212> PRT

<213> 智人

<400> 66

Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp His Val Val

1 5 10

<210> 67

<211> 123

<212> PRT

<213> 智人

<400> 67

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Tyr Ile Gly Ser Ser Ser Asn Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Ser Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Arg Val Lys Tyr Gly Ser Pro Gly Ser Leu Phe Asp Tyr

100 105 110

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 68

<211> 8

<212> PRT

<213> 智人

<400> 68

Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr Tyr

1 5

<210> 69

<211> 8

<212> PRT

<213> 智人

<400> 69

Ile Gly Ser Ser Ser Asn Thr Ile

1 5

<210> 70

<211> 16

<212> PRT

<213> 智人

<400> 70

Ala Arg Asp Arg Val Lys Tyr Gly Ser Pro Gly Ser Leu Phe Asp Tyr

1 5 10 15

<210> 71

<211> 108

<212> PRT

<213> 智人

<400> 71

Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys Lys Tyr Ala

20 25 30

Phe Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr

35 40 45

Glu Asp Ser Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Ser Ser Gly Thr Met Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Gln Val Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Tyr Ser Thr Ala Ser Ser Gly Asp His

85 90 95

Arg Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 72

<211> 6

<212> PRT

<213> 智人

<400> 72

Ala Leu Pro Lys Lys Tyr

1 5

<210> 73

<211> 11

<212> PRT

<213> 智人

<400> 73

Tyr Ser Thr Ala Ser Ser Gly Asp His Arg Val

1 5 10

<210> 74

<211> 118

<212> PRT

<213> 智人

<400> 74

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser

20 25 30

Trp Ile His Trp Tyr Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Tyr

35 40 45

Ala Trp Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 75

<211> 8

<212> PRT

<213> 智人

<400> 75

Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ser Trp

1 5

<210> 76

<211> 8

<212> PRT

<213> 智人

<400> 76

Ile Ser Pro Tyr Gly Gly Ser Thr

1 5

<210> 77

<211> 11

<212> PRT

<213> 智人

<400> 77

Ala Arg Arg His Trp Pro Gly Gly Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 78

<211> 107

<212> PRT

<213> 智人

<400> 78

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Ser Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 79

<211> 6

<212> PRT

<213> 智人

<400> 79

Gln Asp Val Ser Thr Ala

1 5

<210> 80

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人

<400> 80

Gln Gln Tyr Leu Tyr His Pro Ala Thr

1 5

<210> 81

<211> 121

<212> PRT

<213> 智人

<400> 81

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

Trp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Asn Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Gly Gly Trp Phe Gly Glu Leu Ala Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 82

<211> 8

<212> PRT

<213> 智人

<400> 82

Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr Trp

1 5

<210> 83

<211> 8

<212> PRT

<213> 智人

<400> 83

Ile Lys Gln Asp Gly Ser Glu Lys

1 5

<210> 84

<211> 14

<212> PRT

<213> 智人

<400> 84

Ala Arg Glu Gly Gly Trp Phe Gly Glu Leu Ala Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 85

<211> 108

<212> PRT

<213> 智人

<400> 85

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Arg Val Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Asp Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Leu Pro

85 90 95

Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 86

<211> 7

<212> PRT

<213> 智人

<400> 86

Gln Arg Val Ser Ser Ser Tyr

1 5

<210> 87

<211> 3

<212> PRT

<213> 智人

<400> 87

Asp Ala Ser

1

<210> 88

<211> 9

<212> PRT

<213> 智人

<400> 88

Gln Gln Tyr Gly Ser Leu Pro Trp Thr

1 5

<210> 89

<211> 330

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N/A

<400> 89

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Ala Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 90

<211> 330

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N/A

<400> 90

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Ala Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Leu

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 91

<211> 107

<212> PRT

<213> 智人

<400> 91

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 92

<211> 106

<212> PRT

<213> 智人

<400> 92

Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser

1 5 10 15

Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp

20 25 30

Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro

35 40 45

Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn

50 55 60

Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys

65 70 75 80

Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val

85 90 95

Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

100 105

<210> 93

<211> 330

<212> PRT

<213> 智人

<400> 93

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 94

<211> 290

<212> PRT

<213> 智人

<400> 94

Met Arg Ile Phe Ala Val Phe Ile Phe Met Thr Tyr Trp His Leu Leu

1 5 10 15

Asn Ala Phe Thr Val Thr Val Pro Lys Asp Leu Tyr Val Val Glu Tyr

20 25 30

Gly Ser Asn Met Thr Ile Glu Cys Lys Phe Pro Val Glu Lys Gln Leu

35 40 45

Asp Leu Ala Ala Leu Ile Val Tyr Trp Glu Met Glu Asp Lys Asn Ile

50 55 60

Ile Gln Phe Val His Gly Glu Glu Asp Leu Lys Val Gln His Ser Ser

65 70 75 80

Tyr Arg Gln Arg Ala Arg Leu Leu Lys Asp Gln Leu Ser Leu Gly Asn

85 90 95

Ala Ala Leu Gln Ile Thr Asp Val Lys Leu Gln Asp Ala Gly Val Tyr

100 105 110

Arg Cys Met Ile Ser Tyr Gly Gly Ala Asp Tyr Lys Arg Ile Thr Val

115 120 125

Lys Val Asn Ala Pro Tyr Asn Lys Ile Asn Gln Arg Ile Leu Val Val

130 135 140

Asp Pro Val Thr Ser Glu His Glu Leu Thr Cys Gln Ala Glu Gly Tyr

145 150 155 160

Pro Lys Ala Glu Val Ile Trp Thr Ser Ser Asp His Gln Val Leu Ser

165 170 175

Gly Lys Thr Thr Thr Thr Asn Ser Lys Arg Glu Glu Lys Leu Phe Asn

180 185 190

Val Thr Ser Thr Leu Arg Ile Asn Thr Thr Thr Asn Glu Ile Phe Tyr

195 200 205

Cys Thr Phe Arg Arg Leu Asp Pro Glu Glu Asn His Thr Ala Glu Leu

210 215 220

Val Ile Pro Glu Leu Pro Leu Ala His Pro Pro Asn Glu Arg Thr His

225 230 235 240

Leu Val Ile Leu Gly Ala Ile Leu Leu Cys Leu Gly Val Ala Leu Thr

245 250 255

Phe Ile Phe Arg Leu Arg Lys Gly Arg Met Met Asp Val Lys Lys Cys

260 265 270

Gly Ile Gln Asp Thr Asn Ser Lys Lys Gln Ser Asp Thr His Leu Glu

275 280 285

Glu Thr

290

<210> 95

<211> 186

<212> PRT

<213> 智人

<400> 95

Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr Gln Thr Pro Tyr Lys

1 5 10 15

Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr Cys Pro Gln Tyr Pro

20 25 30

Gly Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys Asn Ile Gly Gly Asp

35 40 45

Glu Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp His Leu Ser Leu Lys

50 55 60

Glu Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg

65 70 75 80

Gly Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu Tyr Leu Arg Ala Arg

85 90 95

Val Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp Val Met Ser Val Ala Thr Ile

100 105 110

Val Ile Val Asp Ile Cys Ile Thr Gly Gly Leu Leu Leu Leu Val Tyr

115 120 125

Tyr Trp Ser Lys Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys Pro Val Thr Arg Gly

130 135 140

Ala Gly Ala Gly Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn Lys Glu Arg Pro Pro

145 150 155 160

Pro Val Pro Asn Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg Lys Gly Gln Arg Asp

165 170 175

Leu Tyr Ser Gly Leu Asn Gln Arg Arg Ile

180 185

<210> 96

<211> 107

<212> PRT

<213> 智人

<400> 96

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp

1 5 10 15

Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

20 25 30

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

35 40 45

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

50 55 60

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

65 70 75 80

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

85 90 95

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

100 105

<210> 97

<211> 107

<212> PRT

<213> 智人

<400> 97

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu

1 5 10 15

Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

20 25 30

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

35 40 45

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

50 55 60

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

65 70 75 80

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

85 90 95

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

100 105

<210> 98

<211> 107

<212> PRT

<213> 智人

<400> 98

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp

1 5 10 15

Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

20 25 30

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

35 40 45

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

50 55 60

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

65 70 75 80

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Gly Leu His Asn His Tyr

85 90 95

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

100 105

<210> 99

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N/A

<400> 99

Gly Phe Thr Phe Asn Pro Tyr Ala

1 5

<210> 100

<211> 8

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N/A

<400> 100

Gly Phe Thr Phe Asn Met Tyr Ala

1 5

<210> 101

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N/A

<400> 101

Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Val

1 5 10 15

<210> 102

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N/A

<400> 102

Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Met

1 5 10 15

<210> 103

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N/A

<400> 103

Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Arg

1 5 10 15

<210> 104

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N/A

<400> 104

Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ala Trp Phe Ala Tyr

1 5 10 15

<210> 105

<211> 16

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N/A

<400> 105

Val Arg Gly Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr

1 5 10 15

<210> 106

<211> 124

<212> PRT

<213> 智人

<400> 106

His Met Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Ala Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Ala Val Met Ser Tyr Asp Gly Glu Thr Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Glu Asn Thr Leu Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Asp Thr Ser Asn Gly Trp Asn Tyr Tyr Phe Tyr Gly Met Asp

100 105 110

Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 107

<211> 8

<212> PRT

<213> 智人

<400> 107

Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Gly

1 5

<210> 108

<211> 8

<212> PRT

<213> 智人

<400> 108

Met Ser Tyr Asp Gly Glu Thr Lys

1 5

<210> 109

<211> 17

<212> PRT

<213> 智人

<400> 109

Ala Lys Asp Thr Ser Asn Gly Trp Asn Tyr Tyr Phe Tyr Gly Met Asp

1 5 10 15

Val

<210> 110

<211> 108

<212> PRT

<213> 智人

<400> 110

Ser Tyr Glu Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Val Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Thr Ala Arg Ile Thr Cys Ser Gly Asp Ala Leu Pro Lys Lys Phe Ala

20 25 30

Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr

35 40 45

Glu Asp Ser Lys Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Val Ser Gly Ser

50 55 60

Ser Ser Gly Thr Met Ala Thr Leu Thr Ile Ser Gly Ala Gln Thr Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Tyr Ser Thr Asp Arg Ser Gly Tyr His

85 90 95

Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 111

<211> 6

<212> PRT

<213> 智人

<400> 111

Ala Leu Pro Lys Lys Phe

1 5

<210> 112

<211> 11

<212> PRT

<213> 智人

<400> 112

Tyr Ser Thr Asp Arg Ser Gly Tyr His Trp Val

1 5 10

<210> 113

<211> 330

<212> PRT

<213> 智人

<400> 113

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 114

<211> 330

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N/A

<400> 114

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 115

<211> 330

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> N/A

<400> 115

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Leu

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

Claims

1.抗体，其包含能够结合人PD-L1的抗原结合区，其中所述抗体抑制人PD-L1与人PD-1的结合，并且所述能够结合人PD-L1的抗原结合区包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，所述重链可变区包含分别以SEQ ID NO: 19, 20和21所示的CDR1、CDR2和CDR3序列，所述轻链可变区包含分别为以SEQ ID NO:23所示的序列、序列DDN和以SEQ ID NO:24所示的序列的CDR1、CDR2和CDR3。

2. 根据权利要求1所述的抗体，其中所述能够结合人PD-L1的抗原结合区包含具有以SEQ ID NO: 18所示序列的VH序列。

3.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中所述能够结合人PD-L1的抗原结合区包含具有以SEQ ID NO: 22所示序列的VL序列。

4.根据权利要求1或2所述的抗体，其中所述能够结合人PD-L1的抗原结合区包含具有SEQ ID NO: 18序列的VH序列和具有以SEQ ID NO: 22所示的序列的VL序列。

5.根据权利要求4所述的抗体，其中所述VH和VL序列各自包含三个CDR序列，分别为CDR1、CDR2和CDR3，和四个框架序列，分别为FR1、FR2、FR3和FR4。

6.根据权利要求1或2所述的抗体，其中所述抗体能够通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)来诱导腺癌的上皮细胞的剂量依赖性裂解。

7.根据权利要求6所述的抗体，其中所述抗体能够由于细胞裂解而使所述上皮细胞培养物中的细胞数目减少至少5%。

8.根据权利要求6所述的抗体，其中在⁵¹Cr释放测定法体外测定ADCC。

9.根据权利要求6所述的抗体，其中通过于37°C, 5% CO₂将所述上皮细胞与包含所述抗体和效应细胞的组合物一起温育4小时在体外测定ADCC，所述组合物中抗体的量在0.1-1μg/ mL的范围内，并且效应细胞与上皮细胞的比率为100:1。

10.根据权利要求9所述的抗体，其中所述效应细胞是外周血单个核细胞(PBMC)。

11.根据权利要求6所述的抗体，其中在作为ADCC替代的萤光素酶报告物测定法中体外测定所述上皮细胞的裂解。

12.根据权利要求11所述的抗体，其中如下体外测定ADCC：

i) 以效应细胞:上皮细胞比率为1:1使所述上皮细胞的培养物与包含抗体的组合物和稳定表达FcγRIIIa (CD16)和萤火虫萤光素酶的Jurkat人T细胞作为效应细胞接触，

ii) 将所述上皮细胞和效应细胞的培养物调节至室温15分钟，

iii) 将所述上皮细胞和效应细胞的培养物与萤光素酶底物一起温育，以及

iv) 测定所述细胞培养物中的萤光素酶产生；

13.根据权利要求6所述的抗体，其中当在萤光素酶报告物测定法中测定所述上皮细胞的ADCC时，则在所述上皮细胞培养物与包含所述抗体的测试组合物的温育后观察到的ADCC是在所述上皮细胞培养物与包含参考抗体的组合物温育后观察到的ADCC的至少1.5倍；ADCC以相对发光单位(RLU)测定，所述测试组合物中和包含参考抗体的所述组合物中的抗体浓度相同并且在20至250ng/ml的范围内，并且所述参考抗体选自：

a) 包含以SEQ ID NO: 74所示的VH序列和以SEQ ID NO: 78所示的VL序列的抗体；和

b) 包含以SEQ ID NO: 81所示的VH序列和以SEQ ID NO: 85所示的VL序列的抗体。

14.根据权利要求1或2所述的抗体，其中所述抗体是单价的。

15.根据权利要求1或2所述的抗体，其中所述抗体是具有能够结合人PD-L1的两个抗原结合区的二价抗体，并且其中所述两个抗原结合区具有相同的可变区序列。

16.根据权利要求1或2所述的抗体，其中所述抗体是二价双特异性抗体，其除了能够结合人PD-L1的第一抗原结合区之外，还包含能够结合第二抗原或人PD-L1的不同表位的第二抗原结合区，其中所述第二抗原不是人CD3ε。

17.双特异性抗体，其包含能够结合人PD-L1的抗原结合区和能够结合人CD3ε(epsilon)的抗原结合区，其中所述能够结合人PD-L1的抗原结合区如权利要求1-16中任一项中限定。

18.根据权利要求17所述的双特异性抗体，其中所述能够结合人CD3ε的抗原结合区包含(a) 包含分别以SEQ ID NO: 26、27和28所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区(VH)和包含分别为以SEQ ID NO: 30所示的序列，序列GTN和以SEQ ID NO: 31所示的序列的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区(VL)。

19.根据权利要求17至18中任一项所述的双特异性抗体，其中所述能够结合人CD3ε的抗原结合区包含以SEQ ID NO: 25所示的VH序列和以SEQ ID NO: 29所示的VL序列。

20.根据权利要求17所述的双特异性抗体，其中所述双特异性抗体：

(i) 与具有能够包含以SEQ ID NO: 25所示的VH序列和以SEQ ID NO: 29所示的VL序列的抗原结合区的抗体相比具有更低的人CD3ε结合亲和力，并且

21.根据权利要求20所述的双特异性抗体，其中所述亲和力低至少2倍。

22.根据权利要求20所述的双特异性抗体，其中所述亲和力低至少5倍。

23.根据权利要求20所述的双特异性抗体，其中所述亲和力低至少10倍。

24.根据权利要求20所述的双特异性抗体，其中所述亲和力低至少25倍。

25.根据权利要求20所述的双特异性抗体，其中所述亲和力低至少50倍。

26.根据权利要求17所述的双特异性抗体，其中所述能够结合人CD3ε的抗原结合区包含：

(i) 包含分别以SEQ ID NO: 99、27和28所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区(VH)和包含分别为以SEQ ID NO: 30所示序列、序列GTN和SEQ ID NO: 31所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区(VL)，或

(ii) 包含分别以SEQ ID NO: 100、27和28所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区(VH)和包含分别为以SEQ ID NO: 30所示序列，序列GTN和SEQ ID NO: 31所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区(VL)，或

(iii) 包含分别以SEQ ID NO: 26、27和101所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区(VH)和包含分别为以SEQ ID NO: 30所示的序列，序列GTN和SEQ ID NO: 31所示的序列的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区(VL)，或

(iv) 包含分别以SEQ ID NO: 26、27和102所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区(VH)和包含分别为以SEQ ID NO: 30所示的序列，序列GTN和SEQ ID NO: 31所示的序列CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区(VL)，或

(v) 包含分别以SEQ ID NO: 26、27和103所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区(VH)和包含分别为以SEQ ID NO: 30所示序列、序列GTN和SEQ ID NO: 31所示序列的CDR1CDR2和CDR3的轻链可变区(VL)，或

(vi) 包含分别以SEQ ID NO: 26、27和104所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区(VH)和包含分别为以SEQID NO: 30所示序列，序列GTN和SEQ ID NO: 31所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区(VL)，或

(vii) 包含分别以SEQ ID NO: 26、27和105所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的重链可变区(VH)和包含分别为以SEQID NO: 30所示的序列，序列GTN和SEQ ID NO: 31所示序列的CDR1、CDR2和CDR3的轻链可变区(VL)。

27.根据权利要求17所述的双特异性抗体，其中所述能够结合人CD3ε的抗原结合区包含：

(i) 以SEQ ID NO: 39所示的VH序列和以SEQ ID NO: 29所示的VL序列，或

(ii) 以SEQ ID NO: 40所示的VH序列和以SEQ ID NO: 29所示的VL序列，或

(iii) 以SEQ ID NO: 41所示的VH序列和以SEQ ID NO: 29所示的VL序列，或

(iv) 以SEQ ID NO: 42所示的VH序列和以SEQ ID NO: 29所示的VL序列，或

(v) 以SEQ ID NO: 43所示的VH序列和以SEQ ID NO: 29所示的VL序列，或

(vi) 以SEQ ID NO: 44所示的VH序列和以SEQ ID NO: 29所示的VL序列，或

(vii) 以SEQ ID NO: 45所示的VH序列和以SEQ ID NO: 29所示的VL序列。

28.多特异性抗体，其包含能够结合人PD-L1的第一抗原结合区和能够结合第二抗原或人PD-L1的不同表位的第二抗原结合区，其中所述能够结合人PD-L1的抗原结合区如权利要求1-16中任一项中限定。

29.根据权利要求28所述的多特异性抗体，其中所述抗体是二价的。

30.根据权利要求28至29中任一项所述的多特异性抗体，其中所述抗体能够结合第二抗原，并且所述第二抗原不是人CD3ε。

31.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体是全长抗体。

32.根据权利要求31所述的抗体，其中所述抗体是全长IgG1抗体。

33.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体是抗体片段。

34.根据权利要求17所述的抗体，其中所述抗体包含两个各自包含抗原结合区的半分子，其中

(i) 包含所述能够结合人PD-L1的抗原结合区的半分子是嵌合的，和/或

(ii)包含能够结合人CD3ε (epsilon)的抗原结合区的半分子是嵌合的。

35.根据权利要求17所述的抗体，其中

(i) 所述能够结合人PD-L1的抗原结合区是人源化的，和/或

(ii)所述能够结合人CD3ε (epsilon)的抗原结合区是人源化的。

36.根据权利要求17所述的抗体，其中

(i) 所述能够结合人PD-L1的抗原结合区是人的，和/或

(ii)能够结合人CD3ε (epsilon)的抗原结合区是人的。

37.根据权利要求1所述的抗体，其中所述抗体包含两个重链恒定区(CH)和两个链恒定区(CL)。

38.根据权利要求1、17和28中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含第一和第二重链，其中所述第一和第二重链中的每个至少包含铰链区、CH2和CH3区，其中在所述第一重链中与选自根据EU编号的T366, L368, K370, D399, F405, Y407, 和K409的位置对应的位置中的至少一个氨基酸已被取代，并且在所述第二重链中在与选自根据EU编号的T366,L368, K370, D399, F405, Y407和K409的位置对应的位置中的至少一个氨基酸已被取代，其中所述第一重链和所述第二重链不在相同位置中取代。

39.根据权利要求38所述的抗体，其中(i)在所述第一重链中对应于根据EU编号的F405的位置中的氨基酸是L，并且在所述第二重链中根据EU编号的对应于K409的位置中的氨基酸是R，或(ii) 在所述第一重链中对应于根据EU编号的K409的位置中的氨基酸是R，并且在所述第二重链中对应于根据EU编号的F405的位置中的氨基酸是L。

40.根据权利要求1、17和28中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含第一和第二重链，并且其中一个或两个重链经修饰而使得所述抗体相对于除包含未修饰的第一和第二重链以外相同的抗体以更小程度诱导Fc介导的效应器功能。

41.根据权利要求40所述的抗体，其中通过测定Fc介导的CD69表达，通过结合Fcγ受体，通过结合C1q或通过诱导Fc介导的FcR交联来测量所述Fc介导的效应器功能。

42.根据权利要求40所述的抗体，其中所述重链和轻链恒定序列已经经过修饰而使得与野生型抗体相比，所述抗体将Fc介导的CD69表达降低至少50%，至少60%，至少70%，至少80%，至少90%，至少90%，至少99%或100%，其中在基于PBMC的功能测定法中测定所述Fc介导的CD69表达。

43.根据权利要求1、17和28中任一项所述的抗体，其中所述抗体包含第一和第二重链，其中在所述第一和第二重链的至少一个中，根据EU编号对应于人IgG1重链中的位置L234,L235, D265, N297和P331的位置中的一个或多个氨基酸分别不是L，L，D，N和P。

44.根据权利要求43所述的抗体，其中在所述第一和第二重链中根据EU编号对应于人IgG1重链中的位置L234和L235的位置分别是F和E。

45.根据权利要求44所述的抗体，其中所述抗体是包含第一和第二重链的双特异性抗体，并且其中根据第一重链和第二重链两者的EU编号，对应于人IgG1重链中位置L234和L235的位置分别为F和E，其中(i) 根据第一重链的EU编号对应于人IgG1重链中F405的位置为L，并且根据第二重链的EU编号对应于人IgG1重链中K409的位置为R，或(ii) 根据第一重链的EU编号对应于人IgG1重链中K409的位置为R，并且根据第二重链的EU编号对应于人IgG1重链中F405的位置为L。

46.根据权利要求43所述的抗体，其中在所述第一和第二重链中根据EU编号对应于人IgG1重链中L234，L235和D265位置的位置分别为F，E和A。

47.根据权利要求46所述的抗体，其中所述抗体是包含第一和第二重链的双特异性抗体，并且其中根据第一重链和第二重链两者的EU编号，对应于人IgG1重链中位置L234,L235, 和D265的位置分别为F, E和A，其中(i) 根据第一重链的EU编号对应于人IgG1重链中F405的位置为L，并且根据第二重链的EU编号对应于人IgG1重链中K409的位置为R，或(ii) 根据第一重链的EU编号对应于人IgG1重链中K409的位置为R，并且根据第二重链的EU编号对应于人IgG1重链中F405的位置为L。

48.根据权利要求1、17和28中任一项所述的抗体，其中所述抗体不结合人PD-L2。

49.根据权利要求1、17和28中任一项所述的抗体，其中所述抗体以10^-8M或更低的K_D结合人PD-L1。

50.根据权利要求1、17和28中任一项所述的抗体，当使用纯化的T细胞作为效应细胞时，所述抗体介导MDA-MB-231细胞、PC-3细胞和/或HELA细胞的浓度依赖性细胞毒性。

51.核酸构建体，其包含：

(i) 编码如权利要求1至16中任一项所述的包含能够结合人PD-L1的抗原结合区的抗体的重链序列的核酸序列，和

(ii) 编码如权利要求1至16中任一项所述的包含能够结合人PD-L1的抗原结合区的抗体的轻链序列的核酸序列。

52.核酸构建体，其包含

编码如权利要求18至27中任一项所述的包含能够结合人PD-L1的抗原结合区的抗体的重链序列的核酸序列；

编码如权利要求18至27中任一项所述的包含能够结合人PD-L1的抗原结合区的抗体的轻链序列的核酸序列；

编码如权利要求18至27中任一项所述的包含能够结合人CD3ε的抗原结合区的抗体的重链序列的核酸序列，和

编码如权利要求18至27中任一项所述的包含能够结合人CD3ε的抗原结合区的抗体的轻链序列的核酸序列。

53.表达载体，其包含如权利要求51或52所述的核酸构建体。

54.宿主细胞，其包含如权利要求51或52所述的核酸构建体或如权利要求53所述的表达载体。

55.根据权利要求54所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。

56.根据权利要求55所述的宿主细胞，其中所述哺乳动物细胞是中国仓鼠卵巢细胞。

57.药物组合物，其包含根据权利要求1至50中任一项所述的抗体和药学上可接受的载体。

58.根据权利要求1、17和28中任一项所述的抗体，其用作药物。

59.根据权利要求1、17和28中任一项所述的抗体，其用于治疗癌症。

60.根据权利要求1、17和28中任一项所述的抗体，其用于治疗以实体瘤的存在为特征的癌症疾病。

61.根据权利要求1、17和28中任一项所述的抗体，其用于治疗选自下组的癌症疾病：黑素瘤、卵巢癌、肺癌、结肠癌和头颈癌。

62.根据权利要求57所述的药物组合物，其用作药物。

63.根据权利要求57所述的药物组合物，其用于治疗癌症。

64.根据权利要求57所述的药物组合物，其用于治疗以实体瘤的存在为特征的癌症疾病。

65.根据权利要求57所述的药物组合物，其用于治疗选自下组的癌症疾病：黑素瘤、卵巢癌、肺癌、结肠癌和头颈癌。

66.根据权利要求1至50中任一项所述的抗体在制备用于治疗癌症的药物中的用途，

其中所述癌症是以实体瘤的存在为特征的癌症疾病。

67.根据权利要求66所述的用途，其中所述癌症是选自黑素瘤、卵巢癌、肺癌、结肠癌和头颈癌的癌症疾病。

68.根据权利要求66至67中任一项所述的用途，其中所述用途包括与一种或多种其他治疗剂的组合。

69.根据权利要求68所述的用途，其中所述治疗剂是化学治疗剂。

70.用于产生根据权利要求17至27中任一项所述的双特异性抗体的方法，其包括以下步骤：

a) 培养产生包含如权利要求1至13中任一项中所述的能够结合人PD-L1的抗原结合区的第一抗体的宿主细胞，并从所述培养物中纯化所述第一抗体；

b) 培养产生包含如权利要求17至27中任一项中所述的能够结合人CD3ε (epsilon)的抗原结合区的第二抗体的宿主细胞，并从所述培养物中纯化所述第二抗体；

c) 在足以使铰链区中的半胱氨酸经历二硫键异构化的还原条件下温育所述第一抗体与所述第二抗体；

d) 获得所述双特异性抗体。

71.用于产生根据权利要求16所述的抗体的方法，其包括以下步骤：

b) 培养产生包含能够结合所述第二抗原结合区的第二抗体的宿主细胞，并从所述培养物中纯化所述第二抗体；

d) 获得所述二价双特异性抗体。