CN105669862A - 抗人pd-l1/kir双特异性抗体及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种抗人PD-L1/KIR双特异性抗体及其制备方法和应用，所述双特异性抗体的轻链氨基酸序列为SEQ？ID？NO:1；重链氨基酸序列为SEQ？ID？NO:2。所述双特异性抗体能同时阻断两种肿瘤免疫逃逸的方式，并同时激活T细胞及NK细胞的杀伤肿瘤细胞的功能，其抑制肿瘤的效果明显优于单独使用抗PDL1或抗KIR抗体。
Description
技术领域
本发明涉及双特异性抗体及其制备方法和应用，特别涉及能同时抗人PD-L1(Programmeddeath-ligand1)和抗人KIR(killercellimmunoglobulin-likereceptor)的双特异性抗体及其制备方法和应用。
背景技术
癌症是全球导致死亡的主要原因之一。2012年全世界有1400万新增癌症病例，癌症死亡人数达820万。中国新癌症病例为307万，占全球总数的21.8％。癌症死亡人数约220万，占全球总数的21.8％。癌症死亡人数约220万，占全球癌症死亡人数的26.9％。而且癌症发病率在我国仍呈上升趋势。
抗体药物是以细胞工程技术和基因工程技术为主体的抗体工程技术制备的药物，具有特异性高，机制明确，疗效显著，毒副作用少等优点。在各种疾病治疗、特别是对肿瘤治疗有非常广阔的前景。双特异抗体(BispecificAntibody)是含有两个不同配体结合位点的免疫球蛋白分子，因此它可以同时结合两个不同的靶点，从而起到增加疗效，减少用药量及降低毒副作用。
PD-L1(B7-H1)属于B7家族，具有IgV和IgC样区、跨膜区及胞浆区尾部，PD-L1与其T细胞上的受体PD1相互作用，在免疫应答的负性调控方面发挥着重要作用(RileyJL.ImmunolRev.2009May；229(1):114-25.)。表达于肿瘤细胞表面的Programmeddeath-ligand1(PD-L1)能与Programmeddeath1(PD-1)结合从而抑制T细胞的激活，使其不能够发现肿瘤和向免疫***发出攻击肿瘤的信号。肿瘤细胞免疫逃逸是肿瘤不能被人体的免疫***清除的重要原因之一。研究发现，很多种肿瘤细胞系高表达PD-L1而且PD-L1的表达水平与肿瘤恶性程度及术后复发率密切相关。抗PD-L1单抗能有效结合癌细胞表面的PD-L1并激活T细胞，杀死肿瘤细胞。
KIR(killercellimmnoglobulin-likereceptor,KIR杀伤细胞免疫球蛋白样受体)表达于NK细胞(NaturalKillerCell，自然杀伤细胞)和部分T细胞亚群表面(BensonDMJr,CaligiuriMA.CancerImmunolRes.2014Feb；2(2):99-104)。KIR属于Ig超家族成员，为I型膜蛋白，有膜外区、跨膜区和胞质区。KIR可以分为两类：KIR2D和KIR3D。NK细胞表面的KIR,能识别并结合自体细胞表面的MHCclassI分子(MajorHistocompatibilityComplexI,I型组织相容性复合物)，传递抑制性信号至胞内从而阻止NK细胞激活，防止对正常表达MHCclassI分子的细胞的杀伤。肿瘤细胞和病毒感染的细胞表面MHCclassI分子缺失或只有极少量让NK细胞能识别并杀死它们。一些肿瘤细胞会异常表达非经典的MHCclassI分子,如HLA-E(HumanLeucocyteAntigen-E，人白细胞抗原-E),HLA-G(HumanLeucocyteAntigen-G，人白细胞抗原-G).它们能与NK细胞表面KIR结合，启动抑制性信号,从而逃避NK细胞的攻击。抗KIR单抗能有效结合NK细胞表面KIR,激活NK细胞。
PDL1及KIR是肿瘤免疫逃逸的两个机理。抗PD-L1和KIR双特异性抗体同时阻断这两个肿瘤免疫逃逸的方式。同时激活T细胞及NK细胞的杀伤肿瘤细胞的功能。另外PDL1过表达于许多肿瘤细胞表面，使该双特异性抗体更特异地靶向于肿瘤细胞。本发明将识别PD-L1和识别KIR的抗体片段构建在同一抗体分子中，其抑制肿瘤的效果明显优于单独使用抗PD-L1或抗KIR抗体。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗PD-L1/KIR的双特异性抗体及其制备方法和应用，本发明运用基因工程等技术手段，将识别PD-L1和识别KIR的抗体片段构建在同一抗体分子中从而制得能同时抗PD-L1/KIR的双特异性抗体，该双特异性抗体能同时阻断两种肿瘤免疫逃逸的方式，并同时激活T细胞及NK细胞的杀伤肿瘤细胞的功能，其抑制肿瘤的效果明显优于单独使用抗PDL1或抗KIR抗体。
本发明第一方面提供了一种抗PD-L1/KIR的双特异性抗体，其轻链氨基酸序列为SEQIDNO:1；重链氨基酸序列为SEQIDNO:2。
本发明的第二方面，提供了编码本发明第一方面所述抗PD-L1/KIR的双特异性抗体的核苷酸序列，具体为：
编码所述轻链的核苷酸序列为SEQIDNO:3；编码所述重链的核苷酸序列为SEQIDNO:4。
本发明第三方面，提供了一种表达载体，所述表达载体含有本发明第二方面所述的核苷酸序列，并表达本发明第一方面所述的双特异性抗体。
本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，其含有本发明第三方面所述的表达载体，或其基因组中整合了本发明第二方面所述的核苷酸序列。
本发明的第五方面，提供了一种药物组合物，其包含本发明第一方面所述的双特异性抗体，和药学上可接受的载体或辅料。
本发明的第六方面，提供了一种制备本发明第一方面所述双特异性抗体的方法，包括：在合适的表达条件下，培养本发明第四方面所述的宿主细胞，并表达所述双特异性抗体。
本发明的第七方面，提供了本发明第一方面所述双特异性抗体在制备抗肿瘤药物中的用途。
本发明所述表达载体为商业化表达载体或自行构建的表达载体。
本发明所述宿主细胞为哺乳动物细胞，植物细胞，昆虫细胞，酵母细胞等常见表达细胞。
本发明中，scFv为单链抗体(single—chainantibodyfragment，scFv)，由抗体重链可变区和轻链可变区通过15～20个氨基酸的短肽(linker)连接而成。
本发明中，抗体分子C端表示抗体分子羧基端。
本发明有以下优点：本发明双特异性抗体能同时特异性结合PD-L1和KIR，并同时阻断PD-L1介导的T细胞激活抑制及KIR介导的NK细胞激活抑制从而使T细胞及NK细胞得到激活并更有效地杀死癌细胞。PDL1及KIR是肿瘤免疫逃逸的两个机理。抗PD-L1和KIR双特异抗体同时阻断这两个肿瘤免疫逃逸的方式。同时激活T细胞及NK细胞的杀伤肿瘤细胞的功能。另外PDL1过表达于许多肿瘤细胞表面，使该双特异抗体更特异的靶向于肿瘤细胞。本发明将识别PD-L1和识别KIR的抗体片段构建在同一抗体分子中，其抑制肿瘤的效果明显优于单独使用抗PD-L1或抗KIR抗体。
附图说明
图1是具体实施方式中抗PD-L1/KIR双特异性抗体的结构图。
具体实施方式
以下实施例、实验例对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制。
实施例1构建抗PD-L1和KIR双特异抗体的表达载体
见图1，本实施例的抗PD-L1/KIR双特异抗体，至少包含结合人PD-L1的抗原结合域和结合人KIR的抗原结合域。该双特异抗体结构特征为一完整的抗体分子(抗PD-L1或抗KIR)C端通过一段亲水性肽片段(连接肽1)连接另一抗体的scFv(single-chainvariablefragment,单链抗体)(抗KIR或抗PD-L1)。scFv为抗体轻链可变区通过连接肽2连接抗体重链可变区。
首先合成编码抗PD-L1和KIR的抗体的核苷酸序列，编码抗体轻链的核苷酸序列为SEQIDNO:3，编码抗体重链的核苷酸序列为SEQIDNO:4。然后将上述核苷酸序列依次连接到pCHO1.0表达载体中。得到含有表达抗PD-L1和KIR双特异抗体的表达载体。
实施例2抗PD-L1和KIR双特异抗体的表达载体的转化及稳定细胞株的筛选
利用PEI转染试剂将表达载体导入CHO-S细胞中。具体步骤如下:
1.转染前一天上午，用培养基(CDFortiCHO培养基)将CHO-S细胞稀释到1X105细胞/毫升。
2.转染当天，将3瓶细胞(30毫升/瓶)转移至50ml离心管，300g离心5分钟。以50ml培养基(6mM谷氨酰胺inCDFortiCHO培养基)重悬细胞并记数(活细胞数>95％)。取3X107细胞，并用培养基补至30ml放37℃摇床待用。
3.50ug质粒DNA与35ulPEI(Polyethylenimine，聚乙醇胺)(1毫克/毫升)分别用OptiPRO-SFM稀释至1.5毫升。混匀后，将PEI溶解液加至DNA溶液中(用枪头缓慢吹出)，混合好后，静置20分钟(室温)。
4.将细胞从摇床中取出取出，用胶头滴管吸含有PEI及质粒DNA的混合液，缓慢滴入细胞悬液中，边滴边沿同一方向摇细胞。
将上述转染后细胞置37℃，80％湿度,8％二氧化碳，150转/分钟悬浮培养。48小时后添加嘌呤霉素(Puromycin)及MTX(Methotrexate，甲氨蝶呤)加压筛选。
具体方法如下：
1.将细胞800转/分钟离心5分钟。取少量培养基(60mM谷氨酰胺+CDFortiCHO培养基+1％抗结团剂)重悬细胞并记数(活细胞数>95％)。
2.将细胞稀释成5X105细胞/毫升，加入两个T150瓶中，每个瓶中加入40ml上述细胞。
3.嘌呤霉素及MTX加压筛选,一个瓶中加入10P/100M(10ug/ml嘌呤霉素/100nMMTX),另一瓶中加入20P/200M(20ug/ml嘌呤霉素/200nMMTX)。
4.将上述加压后细胞置37℃，80％humidity,8％CO2静置7天。
5.当细胞活率达到30％-50％时，置换新鲜的培养基同时加入相应浓度的嘌呤霉素，MTX及抗结团剂，将细胞转入摇瓶中37℃，8％二氧化碳，80％湿度,150转/分钟悬浮培养。
6.每3-4天传一次细胞，每次接种量为3X105细胞/毫升。
7.当活细胞超过85％并且细胞密度大于1X106细胞/毫升，第一阶段的筛选结束。每个筛选的Pool冻存三管细胞。(注：如果第一阶段的筛选的第25天还没达到上述细胞活率及密度，则应视为第一阶段的筛选失败)。
8.第一阶段的筛选后的细胞以4X105细胞/毫升的密度接种于两个125ml摇瓶中，一个瓶中加入30P/500M(30ug/ml嘌呤霉素/500nMMTX),另一瓶中加入50P/1000M(50ug/ml嘌呤霉素/1000nMMTX)。
9.37℃，8％二氧化碳，80％湿度,150转/分钟悬浮培养。每3-4天检测一次，每周换一次培养基直到活细胞密度开始上升，并大于加压前的细胞密度。
10.每3-4天传代一次，每次接种3X105细胞/毫升并维持筛选压力。(注：如果稀释因子小于2则无需离心沉淀细胞，无需换全部的培养基。)
11.当活细胞达到或超过90％，第二阶段的筛选结束。每个筛选的Pool冻存五管细胞。
通过有限稀释方法分离稳定表达株并用ELISA(enzyme-linkedimmunosorbentassay，酶联免疫吸附试验)方法筛选产量较高的细胞株(大于50mg/L)，具体方法如下：
1.选在第二阶段的筛选结束时细胞密度处于1.5-2X106活细胞/毫升，细胞活率在90％以上。
2.在5个50毫升离心管上分别标记1，2，3，4，5。
3.从摇瓶中取出至少5-10毫升需进行单克隆化的细胞，装入标记1的管中，如果细胞抱成团，可先用滤网获得单细胞悬液。对1号管中的单细胞悬液进行精确计数。
4.利用克隆培养基(含6mM谷氨酰胺的CDFortiCHO培养基)通过倍比稀释将细胞稀释至1000活细胞/毫升(第五管)。铺板密度为1细胞/孔。
5.从标记5的管中吸取0.2毫升细胞悬液加入预热的39.8毫升克隆培养基中，此时的细胞密度为5个活细胞/毫升，铺板时每孔的加样量为200微升，即每孔中1个活细胞。
6.将上述细胞悬液上下颠倒5-6次，使之充分混匀，然后将细胞悬液移入灭菌的加样槽中。
7.利用8道排式移液器将细胞悬液铺入上述准备的96孔板中，每块板60孔，每孔200微升。
8.将铺好的96孔板放入37℃，80％湿度，8％二氧化碳培养箱中静置培养12-14天，其间尽量不要移动培养板。96孔板需叠放时，每摞不要超过5块，以免影响通气及散热。
9.96孔板中细胞培养12天后，取出观察克隆形成情况。
10.在培养的第13-14天，每个孔中不充50ul含有8mM谷氨酰胺的CDFortiCHO培养基(可加入终浓度为1：1000的抗结团剂)。
11.待克隆长至孔底的10-100％时即可用ELISA方法筛选到产量较高的细胞株(大于50mg/L)。
实施例3抗PD-L1和KIR双特异抗体的的分离与纯化
收集培养液上清。依次用蛋白A(ProteinA)柱及聚丙烯酰胺葡聚糖(Sephacryl)S-200HR进行亲和层析及凝胶过滤层析。
具体步骤如下
1.用0.02MPBS缓冲液(PH7.4)平衡蛋白A(ProteinA)柱，直至流出液的pH为7.4，
2.对处理的样品进行过滤后，缓慢上样让抗体与介质充分结合，
3.用0.02MPBS(PhosphateBufferedSaline，磷酸盐缓冲液)缓冲液(PH8.0)过柱，清洗没有结合到层析柱上的杂蛋白，至直至吸光值恢复到基线或接近于基线水平，
4.用50mMpH3.0柠檬酸洗脱，从目的蛋白出峰时开始用离心管接收蛋白样品至UV峰值在50mAu以下。
5.收集的蛋白样品用1/10体积的pH8.8Tris调节pH值至PH＝7.0左右。
6.蛋白样品经氨基酸测序为抗PD-L1/KIR的双特异性抗体，轻链氨基酸序列为SEQIDNO:1，重链氨基酸序列为SEQIDNO:2。
实施例4抗PD-L1和KIR双特异抗体对肿瘤的抑制作用。
抗PD-L1/KIR双特异性抗体对肿瘤的抑制作用是通过研究其对人胰腺癌(HPAC)NOD(Non-ObeseDiabetic，非肥胖性糖尿病)鼠异种移植肿瘤生长抑制试验。人CD4+，CD8+T，NK细胞从外周血单核细胞中分离并培养，富集同种异体反应性效应T细胞。将人胰腺癌(HPAC)细胞(2.5X106)，效应T细胞(2.5X107)，NK细胞(8X106)移植与NOD鼠皮下，该人胰腺癌(HPAC)细胞表达人PD-L1。在上述的模型鼠静脉注射抗PD-L1和KIR双特异抗体或抗PD-L1抗体。小鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径的方法，动态观察被试小鼠的肿瘤抑制效应。
共分十个组，每组六只小鼠。重复3次。第一组移植人胰腺癌(HPAC)细胞，效应T细胞，NK细胞并在一小时后给予生理盐水，在第3，5，8，10天继续用生理盐水注射。第二组移植人胰腺癌(HPAC)细胞，效应T细胞，NK细胞并在一小时后给予0.1mg/kg,抗PD-L1和KIR双特异抗体，在第3，5，8，10天继续用相同剂量给药。第三组移植人胰腺癌(HPAC)细胞，效应T细胞，NK细胞，并在一小时后给予1mg/kg,抗PD-L1和KIR双特异抗体，在第3，5，8，10天继续用相同剂量给药。第四组移植人胰腺癌(HPAC)细胞，效应T细胞，NK细胞，并在一小时后给予10mg/kg,抗PD-L1和KIR双特异抗体，在第3，5，8，10天继续用相同剂量给药。第五组移植人胰腺癌(HPAC)细胞，效应T细胞，NK细胞并在一小时后给予0.1mg/kg,抗PD-L1抗体，在第3，5，8，10天继续用相同剂量给药。第六组移植人胰腺癌(HPAC)细胞，效应T细胞，NK细胞并在一小时后给予1mg/kg,抗PD-L1抗体，在第3，5，8，10天继续用相同剂量给药。第七组移植人胰腺癌(HPAC)细胞，效应T细胞，NK细胞并在一小时后给予10mg/kg,抗PD-L1抗体，在第3，5，8，10天继续用相同剂量给药。第八组移植人胰腺癌(HPAC)细胞，效应T细胞，NK细胞并在一小时后给予0.1mg/kg,抗KIR抗体，在第3，5，8，10天继续用相同剂量给药。第九组移植人胰腺癌(HPAC)细胞，效应T细胞，NK细胞并在一小时后给予1mg/kg,抗KIR抗体，在第3，5，8，10天继续用相同剂量给药。第十组移植人胰腺癌(HPAC)细胞，效应T细胞，NK细胞并在一小时后给予10mg/kg,抗KIR抗体，在第3，5，8，10天继续用相同剂量给药。
肿瘤体积计算公式：TV(TumorVolume,肿瘤体积)＝0.5XaXb2,其中a,b分别表示长宽。根据测量的结果计算出相对肿瘤体积。抗肿瘤活性的评价指标为相对肿瘤生长抑制率(TumorGrowthInhibition,TGI)。TGI(％)＝[1-(给药组平均肿瘤体积)÷(对照组平均肿瘤体积)]X100。
表1抗PD-L1和KIR的双特异性抗体对人胰腺癌模型鼠异种移植肿瘤生长抑制试验
第30天时的结果：见表1，抗PD-L1/KIR双特异抗体10mg/kg组，对人胰腺癌(HPAC)NOD鼠异种移植肿瘤的抑瘤率为54％。抗PD-L1/KIR双特异抗体1mg/kg组，对人胰腺癌(HPAC)NOD鼠异种移植肿瘤的抑瘤率为70％。抗PD-L1/KIR双特异抗体0.1mg/kg组,对人胰腺癌(HPAC)NOD鼠异种移植肿瘤的抑瘤率为68％。抗PD-L1抗体10mg/kg组，对人胰腺癌(HPAC)NOD鼠异种移植肿瘤的抑瘤率为35％。抗PD-L1抗体1mg/kg组，对人胰腺癌(HPAC)NOD鼠异种移植肿瘤的抑瘤率为44％。抗PD-L1抗体0.1mg/kg组,对人胰腺癌(HPAC)NOD鼠异种移植肿瘤的抑瘤率为38％。抗KIR抗体10mg/kg组，对人胰腺癌(HPAC)NOD鼠异种移植肿瘤的抑瘤率为30％。抗KIR抗体1mg/kg组，对人胰腺癌(HPAC)NOD鼠异种移植肿瘤的抑瘤率为36％。抗KIR抗体0.1mg/kg组,对人胰腺癌(HPAC)NOD鼠异种移植肿瘤的抑瘤率为34％。
Claims (7)
1.一种抗PD-L1/KIR的双特异性抗体，其特征在于，所述双特异性抗体的轻链氨基酸序列为SEQIDNO:1；重链氨基酸序列为SEQIDNO:2。
2.一种编码权利要求1所述双特异性抗体的核苷酸序列，其特征在于：编码所述轻链的核苷酸序列为SEQIDNO:3；编码所述重链的核苷酸序列为SEQIDNO:4。
3.一种表达权利要求1所述双特异性抗体的表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求2所述的核苷酸序列。
4.一种表达权利要求1所述双特异性抗体的宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞含有权利要求3所述的表达载体，或其基因组中整合了权利要求2所述的核苷酸序列。
5.一种药物组合物，其特征在于：所述药物组合物含有权利要求1所述的双特异性抗体，和药学上可接受的载体或辅料。
6.一种制备权利要求1所述双特异性抗体的方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤，在合适的表达条件下，培养权利要求4所述的宿主细胞，并表达权利要求1所述的双特异性抗体。
7.权利要求1所述双特异性抗体在制备抗肿瘤药物中的应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: Shanghai city 201203 libing road Pudong New Area Zhangjiang hi tech Park No. 399 Applicant after: Three country Kin Pharmaceutical (Shanghai) Limited by Share Ltd Address before: Shanghai city 201203 libing road Pudong New Area Zhangjiang hi tech Park No. 399 Applicant before: Shanghai CP Guojian Pharmaceutical Co., Ltd. |
|
| COR | Change of bibliographic data | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20160615 |
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |