CN110567924A - 一种石墨烯-稀土复合材料的制备方法及其在苯并咪唑类农残联合毒性效应的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物传感技术领域，具体涉及一种石墨烯‑稀土复合材料的制备方法及其在苯并咪唑类农残联合毒性效应的应用，其制备方法包括以下步骤：称取柠檬酸、组氨酸、乙二胺和叶酸并混合均匀，加入去离子水后进行超声溶解并在烘箱中反应；利用石墨烯量子点为稳定剂水热合成稀土上转换纳米材料；依次加入石墨烯量子点溶液和氟化钠溶液，搅拌、高压反应釜反应后离心洗涤，最后干燥制得石墨烯量子点‑稀土复合上转换纳米材料。本发明生物相容性好，安全性高，检测的灵敏度高。

Description

一种石墨烯-稀土复合材料的制备方法及其在苯并咪唑类农 残联合毒性效应的应用
技术领域
本发明属于生物传感技术领域，具体涉及一种石墨烯-稀土复合材料的制备方法及其在苯并咪唑类农残联合毒性效应的应用。
背景技术
石墨烯量子点（graphene quantum dots,GQDs）是横向尺寸小于100 nm，厚度小于10层的零维荧光碳纳米材料。GQDs具有水分散性好、生物相容性高、细胞毒性低、光致发光稳定等特点，具有显著的量子局限效应和独特的光电性能，在荧光传感、生物成像等领域具有潜在应用前景。对GQDs进行杂原子掺杂，可以改变结构及电子特性，进而提高其荧光量子产率、增加了活性位点等，是调控GQDs结构和性质的有效手段。传统的半导体量子点虽具有良好的发光性，但因其大多含有重金属，在制备生产以及使用过程中容易对环境造成严重的破坏，进而限制了其在传感检测领域的实际应用。石墨烯量子点不仅具有很好的生物兼容性、还具有良好的光稳定性、易于实现表面改性、成本低易于大规模制备等特点，在生物传感检测领域具有很大的应用潜力。制备石墨烯量子点的常见方法有自上而下和自下而上两种。自上而下是将石墨烯片、碳纳米管、碳纤维等切割成石墨烯量子点。常见的方法有纳米光刻技术、酸性氧化、超声辅助、微波辅助、电化学方法等。而自下而上是通过催化或热处理将小的有机前体转化为石墨烯量子点，常见的制备方法有水热或溶剂热法，有机前体碳化等。
稀土元素包括元素周期表中第ⅢB 中 21 号的钪(Sc)，39 号的钇(Y)以及同族的原子序数从 57 到 71 的 15 种镧系(Ln)元素：镧(La)、铈(Ce)、镨(Pr)、钕(Nd)、钷(Pm)、钐(Sm)、铕(Eu)、钆(Gd)、铽(Tb)、镝(Dy)、钬(Ho)、铒(Er)、铥(Tm)、镱(Yb)、镥(Lu)，共 17种。稀土离子电子层结构相似：除 Sc3+、Y3+无 4f 亚层、La3+的 4f 全空，Lu3+的 4f 全满之外，其它稀土离子的 4f 层电子在 7 个 4f 轨道间分布且未填满，并且受到相同外层 5s2和 5p6电子层的屏蔽。这样的特殊的电子层结构可产生丰富的能级结构，呈现丰富的荧光特性，可观察到的谱线多达 3万余条，几乎覆盖红外至紫外区的吸收和发射。此外，稀土离子多以 3 价正离子的形式出现，化学性质十分活泼，能组成品种繁多，功能各样的新型材料，被称为“新材料宝库”和“现代工业的维生素”。稀土离子发光主要是由掺杂稀土粒子 4f能级的电子跃迁产生的，多为 f-f 及f-d 跃迁。稀土元素特殊的电子层排布赋予了其独特的光学性能：
1)4f 壳层结构被外填满的 5s2和 5p6层屏蔽，外部环境(基质)对其干扰小，而f-f 能级差小，故在此能级间跃迁发光时发光带窄，呈尖锐的线状发射；
2)f-f 的自发跃迁是禁戒跃迁，跃迁概率小，故稀土离子处于激发态的时间长(为 10-2-10-6s，长于一般离子的 10-8-10-10s)，即荧光寿命长；
3)吸收激发光的能力强，上转换发光效率高，发光强；
4)物理、化学性质稳定，能承受高能辐射，强紫外光以及大功率电子束的作用。
一般采用简单、环保的水热合成法和采用油酸作为溶剂的溶剂热法来制备稀土上转换纳米材料。
我国是农药生产和使用大国，农药品种多，其中，多菌灵和噻菌灵是应用广泛的苯并咪唑类杀菌剂，具有长期保护水果、蔬菜、谷类等植物免受病原菌侵害的作用。复配农药占很大比例，使用者大往往对发生复杂的农作物病虫害往往采取单一的化学防治。多种农药混合使用、盲目使用或者滥用农药致使农产品中多农药残留现象比较突出。绿色和平组织连续对中国市场的不同农产品抽样检测。在近年的农产品质量安全监测中，同一批次样品含 1 种以上的农药残留现象普遍，甚至少数样品中多达 10余种农药残留。近年来，单个样品含有多种农药残留的现象在食品安全风险监测结果中较为普遍，引起公众的普遍担忧。但国内目前尚无有效的农药多残留评估方法，为加强农产品质量***提供科学依据，本发明开展了农产品中农药多残留联合暴露的风险评估方法研究。
发明内容
本发明涉及一种石墨烯-稀土复合材料的制备方法，用于评估苯并咪唑类如多菌灵、噻菌灵等农残对细胞的联合毒性效应，安全性和灵敏度高。
按照本发明的技术方案，所述石墨烯-稀土复合材料的制备方法，包括以下步骤，
（1）称取原料柠檬酸、组氨酸、乙二胺和叶酸混合均匀，加入去离子水后进行超声溶解得到反应液，将反应液放入烘箱内，在烘箱温度为150-250℃条件下反应0.5-10h，反应结束后直接得到组氨酸量子点固体产物，将组氨酸量子点固体产物配制成25-200mg/ml的水溶液；
（2）将5-50µL浓度为0.01-1mol /L的YCl3溶液、5-50µL浓度为0.01-1mol /L的YbCl3溶液、5-50µL浓度为0.01-1mol /L的ErCl3溶液混合， 添加0.1-10.0 mL步骤（1）中所得组氨酸量子点水溶液，并在室温下搅拌半个小时；
（3）将步骤（2）所得溶液在搅拌状态下逐滴加入1-10mL浓度为0.01-1mol/L的NaF溶液，继续室温搅拌一个小时；
（4）将步骤（3）所得溶液转移至聚四氟乙烯高压反应釜中，在烘箱中加热进行反应，反应温度为150-300℃，反应时间为1-10h。
（5）反应结束之后，将反应釜中的溶液自然冷却至室温后移出至烧杯，静置12个小时后，取上清液进行多次离心洗涤，最后冷冻干燥制得固体石墨烯量子点-稀土复合上转换纳米材料。
进一步的，所述步骤（1）中柠檬酸、组氨酸、乙二胺和叶酸的摩尔比为1：0.1-1：0.01-0.2：0.01-0.2。
进一步的，所述步骤（2）中YCl3、YbCl3和ErCl3的混合溶液中YCl3、YbCl3和ErCl3的摩尔比为0.78:0.2:0.02。
本发明的另一方面提供了一种石墨烯-稀土复合材料的应用，用于检测多菌灵残余浓度，所述石墨烯-稀土复合材料为采用如权利要求1-3任一所述制备方法制得的石墨烯量子点-稀土复合上转换纳米材料，包括以下步骤，
（1）石墨烯量子点-稀土复合上转换纳米材料上通过EDC/NHS连接带有金纳米的发夹DNA，发夹DNA连接的金纳米粒子猝灭石墨烯量子点-稀土复合上转换纳米材料的荧光发射；
（2）加入多菌灵适体，多菌灵适体与发夹DNA碱基互补配对，发射石墨烯量子点-稀土复合上转换纳米材料荧光；
（3）引入多菌灵，随着多菌灵浓度的增加，石墨烯量子点-稀土复合上转换纳米材料荧光猝灭，根据多菌灵浓度和荧光猝灭的线性关系，检测多菌灵残余浓度。
本发明的还提供了一种石墨烯-稀土复合材料在苯并咪唑类农残联合毒性效应的应用，所述石墨烯-稀土复合材料为采用如权利要求1-3任一所述制备方法制得的石墨烯量子点-稀土复合上转换纳米材料，包括以下步骤，
（1）Hep G2 肝脏癌细胞株的培养：用含有 10%（v/v）胎牛血清的 MEM 培养基，在 37°C，5% CO2饱和湿度恒温细胞培养箱中培养；
（2）取消化后完全培养基稀释的 Hep G2 细胞悬液，调整密度为 3.5×105 cells/mL，按100 µL/孔接种于 96 孔透明细胞培养板中，于 5% CO2、37°C 环境下贴壁孵育 24 h；
（3）在空白细胞培养板中加入 90 µL 新鲜无血清培养基作为调零组；吸去步骤（2）中培养基，加入 90 µL 新鲜无血清培养基作为对照组；吸去步骤（2）中培养基，加入 90 µL新鲜无血清培养基以及10 µL 不同浓度、按1:1配比的两种苯并咪唑类农药作为处理组；将调零组、对照组和处理组于5% CO2，37℃恒温细胞培养箱中继续孵育24 h；
（4）除去调零组、对照组和处理组的培养基，每孔均加入 100 µL 石墨烯量子点-稀土复合上转换纳米材料的溶液，于 5% CO2、37°C 环境下继续孵育 3.5 h；
（5）继续在调零组、对照组和处理组中加入PBS缓冲溶液，并置于摇床上振荡，使细胞培养板上的细胞尽可能多的分散在溶液中；
（6）将调零组、对照组和处理组分散所得溶液经离心洗涤后，去除处理组未作用的石墨烯量子点-稀土复合上转换纳米材料，然后使用荧光光谱仪检测在980nm激发下，541nm处荧光发射强度；
（7）去除调零组和对照组未作用的石墨烯量子点-稀土复合上转换纳米材料，测定调零组和对照组在541nm处的荧光发射强度；
（8）按照：细胞存活率=（处理组荧光强度-调零组荧光强度）/（对照组荧光强度-调零组荧光强度）×100%，根据农药浓度及细胞存活率建立线性回归方程，根据所建立的线性回归方程求出细胞LC50。
本发明的有益效果在于：
（1）生物相容性好：与传统上转换材料相比，水热合成的石墨烯量子点-稀土复合上转换纳米材料生物相容性好，对生物传感和细胞成像有较大的优势；
（2）安全性更好：与无机纳米粒子和金属半导体量子点相比，纳米石墨烯不会发生迁移对人体造成伤害；
（3）检测的灵敏度高，通过DNA放大和多菌灵适体传感器，高度灵敏和选择性检测残留多菌灵浓度。
附图说明
图1为本发明中石墨烯量子点-稀土复合上转换纳米材料的荧光光谱。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
本发明中，发夹DNA的序列为：H2N-TCA ACA TCA CCA TCG GTT GTT GTG TGC CATCAG AAA CCG ATG GTT TTT -SH；多菌灵适体的序列为：GGGCACACAACAACCGATGGTCCAGCCACCCGAATGACCAGCCCACCCGCCACCCCGCG。
实施例一
1、一种石墨烯-稀土复合材料的制备方法，包括以下步骤，
（1）按摩尔比1:1:0.2:0.01称取原料柠檬酸、组氨酸、乙二胺和叶酸混合均匀，加入去离子水后进行超声溶解得到反应液，将反应液放入烘箱内，在烘箱温度为150℃条件下反应10h，反应结束后直接得到组氨酸量子点固体产物，将组氨酸量子点固体产物配制成25mg/ml的水溶液；
（2）将5µL浓度为0.78mol /L的YCl3溶液、5µL浓度为0.2mol /L的YbCl3溶液、5µL浓度为0.02mol /L的ErCl3溶液混合，添加10.0 mL步骤（1）中所得组氨酸量子点水溶液，并在室温下搅拌半个小时；
（3）将步骤（2）所得溶液在搅拌状态下逐滴加入1mL浓度为1mol/L的NaF溶液，继续室温搅拌一个小时；
（4）将步骤（3）所得溶液转移至聚四氟乙烯高压反应釜中，在烘箱中加热进行反应，反应温度为150℃，反应时间为10h。
（5）反应结束之后，将反应釜中的溶液自然冷却至室温后移出至烧杯，静置12个小时后，取上清液进行多次离心洗涤，最后冷冻干燥制得固体石墨烯量子点-稀土复合上转换纳米材料。
实施例二
1、一种石墨烯-稀土复合材料的制备方法，包括以下步骤，
（1）按摩尔比1:0.5:0.1:0.01称取原料柠檬酸、组氨酸、乙二胺和叶酸混合均匀，加入去离子水后进行超声溶解得到反应液，将反应液放入烘箱内，在烘箱温度为250℃条件下反应0.5h，反应结束后直接得到组氨酸量子点固体产物，将组氨酸量子点固体产物配制成200mg/ml的水溶液；
（2）将50µL浓度为0.36mol /L的YCl3溶液、50µL浓度为0.1mol /L的YbCl3溶液、50µL浓度为0.01mol /L的ErCl3溶液混合， 添加0.1 mL步骤（1）中所得组氨酸量子点水溶液，并在室温下搅拌半个小时；
（3）将步骤（2）所得溶液在搅拌状态下逐滴加入10mL浓度为0.01mol/L的NaF溶液，继续室温搅拌一个小时；
（4）将步骤（3）所得溶液转移至聚四氟乙烯高压反应釜中，在烘箱中加热进行反应，反应温度为250℃，反应时间为2h。
（5）反应结束之后，将反应釜中的溶液自然冷却至室温后移出至烧杯，静置12个小时后，取上清液进行多次离心洗涤，最后冷冻干燥制得固体石墨烯量子点-稀土复合上转换纳米材料。
实施例三
1、一种石墨烯-稀土复合材料的制备方法，包括以下步骤，
（1）按摩尔比1:1:0.01:0.2称取原料柠檬酸、组氨酸、乙二胺和叶酸混合均匀，加入去离子水后进行超声溶解得到反应液，将反应液放入烘箱内，在烘箱温度为180℃条件下反应3h，反应结束后直接得到组氨酸量子点固体产物，将组氨酸量子点固体产物配制成110mg/ml的水溶液；
（2）将10µL浓度为0.78mol /L的YCl3溶液、10µL浓度为0.2mol /L的YbCl3溶液、5µL浓度为0.04mol /L的ErCl3溶液混合，添加5 mL步骤（1）中所得组氨酸量子点水溶液，并在室温下搅拌半个小时；
（3）将步骤（2）所得溶液在搅拌状态下逐滴加入3mL浓度为1mol/L的NaF溶液，继续室温搅拌一个小时；
（4）将步骤（3）所得溶液转移至聚四氟乙烯高压反应釜中，在烘箱中加热进行反应，反应温度为180℃，反应时间为4h。
（5）反应结束之后，将反应釜中的溶液自然冷却至室温后移出至烧杯，静置12个小时后，取上清液进行多次离心洗涤，最后冷冻干燥制得固体石墨烯量子点-稀土复合上转换纳米材料。
实施例四
1、一种石墨烯-稀土复合材料的制备方法，包括以下步骤，
（1）按摩尔比1:0.1:0.1:0.01称取原料柠檬酸、组氨酸、乙二胺和叶酸混合均匀，加入去离子水后进行超声溶解得到反应液，将反应液放入烘箱内，在烘箱温度为300℃条件下反应1h，反应结束后直接得到组氨酸量子点固体产物，将组氨酸量子点固体产物配制成25mg/ml的水溶液；
（2）将25µL浓度为0.78mol /L的YCl3溶液、50µL浓度为0.01mol /L的YbCl3溶液、5µL浓度为0.01mol /L的ErCl3溶液混合， 添加10.0 mL步骤（1）中所得组氨酸量子点水溶液，并在室温下搅拌半个小时；
（3）将步骤（2）所得溶液在搅拌状态下逐滴加入1mL浓度为1mol/L的NaF溶液，继续室温搅拌一个小时；
（4）将步骤（3）所得溶液转移至聚四氟乙烯高压反应釜中，在烘箱中加热进行反应，反应温度为300℃，反应时间为1h。
（5）反应结束之后，将反应釜中的溶液自然冷却至室温后移出至烧杯，静置12个小时后，取上清液进行多次离心洗涤，最后冷冻干燥制得固体石墨烯量子点-稀土复合上转换纳米材料。
应用实施例一
一种石墨烯-稀土复合材料的应用，用于检测多菌灵残余浓度，所述石墨烯-稀土复合材料为采用如权利要求1-3任一所述制备方法制得的石墨烯量子点-稀土复合上转换纳米材料，包括以下步骤，
（1）石墨烯量子点-稀土复合上转换纳米材料上通过EDC/NHS连接带有金纳米的发夹DNA，连接有金纳米离子的DNA发夹与石墨烯量子点-稀土复合上转换纳米材料连接时，金纳米粒子与上转换纳米材料相互靠近，两者通过荧光共振能量转移，金纳米粒子猝灭石墨烯量子点-稀土复合上转换纳米材料的荧光发射；
（2）加入多菌灵适体，多菌灵适体与发夹DNA碱基互补配对，带有金纳米离子的DNA发夹打开，与多菌灵适体形成DNA双链，DNA发夹被打开，金纳米粒子远离上转换材料，破坏荧光共振能量转移，荧光得到恢复（发射石墨烯量子点-稀土复合上转换纳米材料荧光）；
（3）引入多菌灵，多菌灵适体特异性识别多菌灵，随着多菌灵浓度的增加，石墨烯量子点-稀土复合上转换纳米材料荧光猝灭，根据多菌灵浓度和荧光猝灭的线性关系，检测苹果的多菌灵残余浓度。
应用实施例二
一种石墨烯-稀土复合材料在苯并咪唑类农残联合毒性效应的应用，所述石墨烯-稀土复合材料为采用如权利要求1-3任一所述制备方法制得的石墨烯量子点-稀土复合上转换纳米材料，包括以下步骤，
（1）Hep G2 肝脏癌细胞株的培养：用含有 10%（v/v）胎牛血清的 MEM 培养基，在 37°C，5% CO2饱和湿度恒温细胞培养箱中培养；
（2）取消化后完全培养基稀释的 Hep G2 细胞悬液，调整密度为 3.5×105 cells/mL，按100 µL/孔接种于 96 孔透明细胞培养板中，于 5% CO2、37°C 环境下贴壁孵育 24 h；
（3）在空白细胞培养板中加入 90 µL 新鲜无血清培养基作为调零组；吸去步骤（2）中培养基，加入 90 µL 新鲜无血清培养基作为对照组；吸去步骤（2）中培养基，加入 90 µL新鲜无血清培养基以及10 µL 不同浓度、按1:1浓度配比的噻菌灵和多菌灵作为处理组；将调零组、对照组和处理组于5% CO2，37℃恒温细胞培养箱中继续孵育24 h；
（4）除去调零组、对照组和处理组的培养基，每孔均加入 100 µL 石墨烯量子点-稀土复合上转换纳米材料的溶液，于 5% CO2、37°C 环境下继续孵育 3.5 h；
（5）继续在调零组、对照组和处理组中加入PBS缓冲溶液，并置于摇床上振荡，使细胞培养板上的细胞尽可能多的分散在溶液中；
（6）将调零组、对照组和处理组分散所得溶液经离心洗涤后，去除处理组未作用的石墨烯量子点-稀土复合上转换纳米材料，然后使用荧光光谱仪检测在980nm激发下，541nm处荧光发射强度；
（7）去除调零组和对照组未作用的石墨烯量子点-稀土复合上转换纳米材料，测定调零组和对照组在541nm处的荧光发射强度；
（8）按照：细胞存活率=（处理组荧光强度-调零组荧光强度）/（对照组荧光强度-调零组荧光强度）×100%，根据农药浓度及细胞存活率建立线性回归方程，根据所建立的线性回归方程求出细胞LC50。
本发明设计合成石墨烯量子点-稀土复合上转换纳米材料。称取原料柠檬酸、组氨酸、乙二胺和叶酸并混合均匀，加入去离子水后进行超声溶解得到反应液，将反应液放入烘箱内，在烘箱中反应直接得到石墨烯量子点GQD，由本法制得的石墨烯量子点拥有羧基、羟基、氨基等丰富的官能团；利用石墨烯量子点为稳定剂水热合成稀土上转换纳米材料，组氨酸功能化石墨烯量子点的咪唑环螯合稀土离子；在搅拌的条件下，逐滴加入一定量的石墨烯量子点溶液，室温搅拌半个小时后，向混合溶液中逐滴加入一定量的氟化钠溶液，室温搅拌一个小时以后，将混合溶液转移至聚四氟乙烯高压反应釜中，反应釜放入烘箱内，在烘箱温度中反应结束后溶液静置，取上清液进行多次的离心洗涤，最后干燥的石墨烯量子点-稀土复合上转换纳米材料。采用石墨烯量子点-稀土复合上转换纳米材料作为荧光探针，通过DNA放大和多菌灵适体传感器，高度灵敏和选择性检测残留多菌灵浓度。采用石墨烯量子点-稀土复合上转换纳米材料进行二元农药的联合毒性的评价。

Claims (5)

1.一种石墨烯-稀土复合材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤，
（1）称取原料柠檬酸、组氨酸、乙二胺和叶酸混合均匀，加入去离子水后进行超声溶解得到反应液，将反应液放入烘箱内，在烘箱温度为150-250℃条件下反应0.5-10h，反应结束后直接得到组氨酸量子点固体产物，将组氨酸量子点固体产物配制成25-200mg/ml的水溶液；
（2）将5-50µL浓度为0.01-1mol /L的YCl3溶液、5-50µL浓度为0.01-1mol /L的YbCl3溶液、5-50µL浓度为0.01-1mol /L的ErCl3溶液混合， 添加0.1-10.0 mL步骤（1）中所得组氨酸量子点水溶液，并在室温下搅拌半个小时；
（3）将步骤（2）所得溶液在搅拌状态下逐滴加入1-10mL浓度为0.01-1mol/L的NaF溶液，继续室温搅拌一个小时；
（4）将步骤（3）所得溶液转移至聚四氟乙烯高压反应釜中，在烘箱中加热进行反应，反应温度为150-300℃，反应时间为1-10h。
（5）反应结束之后，将反应釜中的溶液自然冷却至室温后移出至烧杯，静置12个小时后，取上清液进行多次离心洗涤，最后冷冻干燥制得固体石墨烯量子点-稀土复合上转换纳米材料。
2.如权利要求1所述的石墨烯-稀土复合材料的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中柠檬酸、组氨酸、乙二胺和叶酸的摩尔比为1：0.1-1：0.01-0.2：0.01-0.2。
3.如权利要求1所述的石墨烯-稀土复合材料的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中YCl3、YbCl3和ErCl3的混合溶液中YCl3、YbCl3和ErCl3的摩尔比为0.78:0.2:0.02。
4.一种石墨烯-稀土复合材料的应用，用于检测多菌灵残余浓度，所述石墨烯-稀土复合材料为采用如权利要求1-3任一所述制备方法制得的石墨烯量子点-稀土复合上转换纳米材料，包括以下步骤，
（1）石墨烯量子点-稀土复合上转换纳米材料上通过EDC/NHS连接带有金纳米的发夹DNA，发夹DNA连接的金纳米粒子猝灭石墨烯量子点-稀土复合上转换纳米材料的荧光发射；
（2）加入多菌灵适体，多菌灵适体与发夹DNA碱基互补配对，发射石墨烯量子点-稀土复合上转换纳米材料荧光；
（3）引入多菌灵，随着多菌灵浓度的增加，石墨烯量子点-稀土复合上转换纳米材料荧光猝灭，根据多菌灵浓度和荧光猝灭的线性关系，检测多菌灵残余浓度。
5.一种石墨烯-稀土复合材料在苯并咪唑类农残联合毒性效应的应用，所述石墨烯-稀土复合材料为采用如权利要求1-3任一所述制备方法制得的石墨烯量子点-稀土复合上转换纳米材料，包括以下步骤，
（1）Hep G2 肝脏癌细胞株的培养：用含有 10%（v/v）胎牛血清的 MEM 培养基，在 37°C，5% CO2饱和湿度恒温细胞培养箱中培养；
（2）取消化后完全培养基稀释的 Hep G2 细胞悬液，调整密度为 3.5×105 cells/mL，按100 µL/孔接种于 96 孔透明细胞培养板中，于 5% CO2、37°C 环境下贴壁孵育 24 h；
（3）在空白细胞培养板中加入 90 µL 新鲜无血清培养基作为调零组；吸去步骤（2）中培养基，加入 90 µL 新鲜无血清培养基作为对照组；吸去步骤（2）中培养基，加入 90 µL新鲜无血清培养基以及10 µL 不同浓度、按1:1配比的两种苯并咪唑类农药作为处理组；将调零组、对照组和处理组于5% CO2，37℃恒温细胞培养箱中继续孵育24 h；
（4）除去调零组、对照组和处理组的培养基，每孔均加入 100 µL 石墨烯量子点-稀土复合上转换纳米材料的溶液，于 5% CO2、37°C 环境下继续孵育 3.5 h；
（5）继续在调零组、对照组和处理组中加入PBS缓冲溶液，并置于摇床上振荡，使细胞培养板上的细胞尽可能多的分散在溶液中；
（6）将调零组、对照组和处理组分散所得溶液经离心洗涤后，去除处理组未作用的石墨烯量子点-稀土复合上转换纳米材料，然后使用荧光光谱仪检测在980nm激发下，541nm处荧光发射强度；
（7）去除调零组和对照组未作用的石墨烯量子点-稀土复合上转换纳米材料，测定调零组和对照组在541nm处的荧光发射强度；
（8）按照：细胞存活率=（处理组荧光强度-调零组荧光强度）/（对照组荧光强度-调零组荧光强度）×100%，根据农药浓度及细胞存活率建立线性回归方程，根据所建立的线性回归方程求出细胞LC50。
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