CN110564718B - 高通量诱变筛选高产两性霉素b结节链霉菌的方法及菌株 - Google Patents

高通量诱变筛选高产两性霉素b结节链霉菌的方法及菌株 Download PDF

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Abstract

本发明涉及本发明涉及一种高通量诱变筛选高产两性霉素B结节链霉菌的方法，以及筛选到的诱变株，由诱变株获得的重组工程菌及应用。本发明筛选获得的一株高产两性霉素B结节链霉菌菌株——结节链霉菌(Streptomyces nodosus)ZJB2016050。本发明的有益效果主要体现在：1、通过高通量筛选高产两性霉素B菌种的方法，能够方便快速高效地检测两性霉素B的产量，提高了诱变育种和基因工程菌株的筛选或验证效率。2、诱变育种获得的结节链霉菌N5，相对原始菌株N3，两性霉素B产量提高了20％，能够作为基因工程菌的原始菌株。3、通过过表达功能基因分别提高两性霉素B的产量，其中乙酰辅酶A羧化酶1(acc1)提高两性霉素B产量20％。4、卡那霉素价格优廉、抗菌谱广、杀菌作用强，适用于工业中使用，对于企业总体收益率有较强提高作用，以实验室5L罐为计算，能降低成本约2000元/罐。

Description

高通量诱变筛选高产两性霉素B结节链霉菌的方法及菌株
(一)技术领域
本发明涉及一种高通量诱变筛选高产两性霉素B结节链霉菌的方法，以及筛选到的诱变株，由诱变株获得的重组工程菌及应用。
(二)背景技术
多烯大环内酯类抗生素是一类主要由链霉菌次级代谢产物组成的抗生素。该类抗生素具有广谱的抗真菌活性及很小的耐受性，成为目前为止最有效的抗真菌药物，广泛应用于治疗各类由真菌引起的感染性疾病。两性霉素B(Amphotericin B，AmB)首次发现于1955年，从委内瑞拉奥里诺科河水土样中的结节链霉菌(Streptomyces nodosus)中人们首次分离得到了两性霉素B。两性霉素B于1959年在结节链霉菌发酵液中提取获得，于1966年开始上市。两性霉素B是首个在临床上被应用于深部真菌感染的药物，至今仍然是不可代替的抗真菌药物。AmB具有广谱性的对真菌抗性，特别是对于具有生命威胁性的全身性真菌感染例如白色念珠菌，曲霉属真菌等，同时还具有有效的抗病毒、寄生虫药性，例如阮病毒、利什曼原虫等。AmB多用于免疫***损伤或免疫力较差患者，如器官移植接受者，HIV患者，以及使用抑制免疫力药物的肿瘤患者等。
研究表明两性霉素B最初在真菌细胞膜上聚集并***细胞膜形成一个V型的孔道，两性霉素B分子倾斜使得多烯内酯环上的末端OH基团朝向脂双层中心，但这个过程并没有固醇参与，且V型孔道不贯穿细胞膜，如图1。在这种构象中，V型孔道可以加载离子或小分子非电解质(如尿素)，但是直到短暂的“开放”状态(两性霉素B分子垂直于膜平面,允许溶质的扩散)才会发生离子穿膜。在两性霉素B浓度高于阈值时，脂双层的厚度进一步降低，固醇分子和两性霉素B分子共同形成跨膜孔道。值得注意的是固醇分子直接参与形成跨膜孔道，而不是协助V型孔道穿膜。细胞内的离子和小分子物质通过这些跨膜孔道大量流失造成细胞死亡。
随着环境和生活水平的变化及耐药性的增强，真菌感染问题日益严峻，而近年来两性霉素B局部用药的提出和各类两性霉素B衍生药物的上市，降低了两性霉素B对人体的毒副作用，扩大了两性霉素B的应用范围。广阔的市场前景使研究两性霉素B提产仍有巨大的意义和经济价值。两性霉素B的化学结构复杂，目前多采用微生物发酵法生产，因此筛选优秀的两性霉素B高产菌株是比较重要的前体。目前对于获得高产菌株的方法一般为两大类：传统诱变育种和基因工程改造菌种。传统育种分为物理诱变、化学诱变、混合诱变及其他方法；基因工程改造菌种一般通过改变菌种内前体代谢的路径，能量代谢，切断竞争支路等方法来提高产量。同时两大类方法都需要一种高效便捷快速的高通量筛选方法来初步筛选，以提高育种或构建菌种的效率。
抑菌圈法又叫扩散法，是利用待测药物在琼脂平板中扩散使其周围的细菌生长受到抑制而形成透明圈，即抑菌圈，根据抑菌圈大小判定待测药物抑菌效价的一种方法。抑菌圈法操作便捷、简单易行、成本低廉、结果准确可靠，被广泛用于抗生素等代谢产物菌种筛选的初筛。工具菌一般采用抗生素的敏感菌。若被检菌能分泌某些抑制工具菌生长的物质，如抗生素等，便会在该菌落周围形成工具菌不能生长的抑菌圈，很容易被鉴别出来。
(三)发明内容
本发明目的本发明目的是一种高通量诱变筛选高产两性霉素B结节链霉菌的方法，以及筛选到的高产两性霉素B诱变株，由诱变株获得的重组工程菌及应用。
本发明采用的技术方案是：
高通量诱变筛选高产两性霉素B结节链霉菌的方法，所述方法包括：
(1)将结节链霉菌接种至GYM平板25～26℃培养5～7天，取颜色发灰黑色的孢子，使用棉花棒将表面孢子洗脱至无菌水中，将洗下的孢子悬液用含有棉花的注射器过滤，过滤后的孢子离心后去上清液，加入无菌水重悬后，离心、重新洗脱一次，用无菌水重悬作为孢子悬液；
(2)取稀释后的孢子悬液置于紫外灯管下20～30cm处照射1～2min后，接种于GYM培养基中，25～26℃避光培养24～32h，收集诱变后菌体，使用NTG处理，处理方式：每1mL菌体悬液使用50mM含5mg/mL NTG的PBS缓冲液处理0.5h，离心，收集菌体使用无菌水清洗3次，重悬后涂布在GYM固体培养基中，26℃避光培养直至获得突变株；
(3)突变株涂布于GMY固体培养基上，26℃培养4～7天至能观测到单菌落，将单菌落用无菌牙签棒戳刺，并且在新的GYM固体培养基，按照顺序重新划单菌落用于培养，保藏；
(4)将酵母菌X33作为敏感菌株，接种于GYM液体培养基，28℃，200rpm培养24小时，涂布于GYM固体培养基；将结节链霉菌单菌落利用无菌打孔器或无菌200μL的枪头，打孔分离整个培养基琼脂块，菌落朝下倒置于已涂布酵母X33的固体培养基，26℃培养20小时后，观测抑菌圈大小，筛选获得高产两性霉素B结节链霉菌。
步骤(4)所获得的高产两性霉素B结节链霉菌，可重新作为初始菌株重复步骤(1)～(4)进行下一轮筛选。
本发明利用抑菌圈方法，由酵母菌作为敏感菌株，在琼脂平板上进行初步筛选，对于透明圈大于对照的菌种进行发酵，也可以利用高效液相色谱(HPLC)进行精确检测。
本发明还涉及一株筛选获得的高产两性霉素B结节链霉菌菌株——结节链霉菌ZJB2016050(Streptomyces nodosus ZJB2016050)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期2017年07月17日，保藏编号CCTCC NO：M 2017426，保藏地址为中国武汉，武汉大学，邮编430072。
本发明还涉及一种产两性霉素B的重组结节链霉菌，由下列之一的外源基因导入前述结节链霉菌ZJB2016050(Streptomyces nodosus ZJB2016050)获得：
(1)SEQ ID NO.1所示乙酰辅酶A羧化酶1基因；
(2)SEQ ID NO.2所示乙酰辅酶A羧化酶2基因；
(3)SEQ ID NO.3所示聚酮合酶PKS amphA基因；
(4)SEQ ID NO.4所示甲基丙二酰辅酶A变位酶基因；
(5)SEQ ID NO.5所示甲基丙二酰辅酶A异构酶基因。
优选的，所述外源基因为SEQ ID NO.1所示乙酰辅酶A羧化酶1基因。
更为优选的，所述重组结节链霉菌为结节链霉菌ZJB2016050-ACC1(Streptomycesnodosus ZJB2016050-ACC1)，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，邮编430072，保藏编号：CCTCC NO：M 2019343，保藏日期2019年05月09日。
本发明还涉及所述结节链霉菌在微生物发酵制备两性霉素B中的应用。
具体的，所述应用为：将所述产两性霉素B的结节链霉菌接种至发酵培养基，25～30℃、200～500rpm发酵培养，获得含两性霉素B的发酵液，将发酵液分离纯化，得到所述两性霉素B；所述发酵培养基终浓度组成为：葡萄糖60～80g/L，牛肉膏5～10g/L，大豆蛋白粉5～10g/L，棉子粉8～12g/L，CaCO3 5～10g/L，KH2PO4 0.1～0.4g/L，溶剂为水，pH 7.0。
优选的，发酵培养基组成如下：葡萄糖70g/L，大豆蛋白粉8g/L，棉子粉10g/L，CaCO3 10g/L，KH2PO4 0.2g/L，溶剂为蒸馏水或自来水，pH 7.0。
所述发酵培养通常在发酵罐中进行，发酵罐压力0.05MPa，通气比0.08～1.5vvm。
优选的，所述产两性霉素B的重组结节链霉菌在发酵培养前先进行种子培养，再将种子液以体积浓度2～10％的接种量接种至发酵培养基，所述种子培养为：将产两性霉素B的重组结节链霉菌接种至GYM平板，28℃培养7天，取颜色发灰黑色的孢子，使用棉花棒将表面孢子洗脱至无菌水中，将洗下的孢子悬液用含有棉花的注射器过滤，12000rpm离心5min后去上清液，沉淀加入无菌水重悬后，12000rpm离心5min重新洗脱一次，用无菌水重悬作为孢子悬液，将孢子悬液接种至种子培养基中，28℃，220rpm培养46h，获得种子液；所述GYM平板终浓度组成为：葡萄糖4g/L，酵母粉4g/L，麦芽提取物10g/L，碳酸钙2g/L，琼脂18g/L，溶剂为水，pH7.2；所述种子液培养基终浓度组成为：蛋白胨10～20g/L，NaCl 5～10g/L，葡萄糖10～15g/L，酵母粉5～10g/L，CaCO3 0.5～1g/L，溶剂为水，pH 7.0。
本发明的有益效果主要体现在：
1、通过高通量筛选高产两性霉素B菌种的方法，能够方便快速高效地检测两性霉素B的产量，提高了诱变育种和基因工程菌株的筛选或验证效率。
2、诱变育种获得的结节链霉菌N5(即CCTCC NO：M 2017426)，相对原始菌株N3，两性霉素B产量提高了20％，能够作为基因工程菌的原始菌株。
3、通过过表达功能基因分别提高两性霉素B的产量，其中乙酰辅酶A羧化酶1(acc1)提高两性霉素B产量20％。
4、卡那霉素价格优廉、抗菌谱广、杀菌作用强，适用于工业中使用，对于企业总体收益率有较强提高作用，以实验室5L罐为计算，能降低成本约2000元/罐。
(四)附图说明
图1为两性霉素B抑真菌原理。
图2为本发明施例1中两性霉素B抑菌圈。
图3为AmB结构式；
图4为本发明实施例4构建的重组载体pJTU1278-acc1图谱；
图5为本发明实施例5构建的重组载体pJTU1278-acc2图谱；
图6为本发明实施例6构建的重组载体pJTU1278-amphA图谱；
图7为本发明实施例12两性霉素B标准曲线；
图8为实施例13中摇瓶发酵过程中不同pH对摇瓶发酵的影响；
图9为实施例14中摇瓶发酵过程中不同温度的影响；
图10为实施例15中摇瓶发酵过程中不同转速的影响。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂。
实施例1：高通量筛选方法构建
(1)将诱变后的孢子及对照菌株结节链霉菌N3(ATCC14899)，于GYM固体培养基上进行涂布或划线，于26℃培养7天，至可观测到单菌落。利用无菌牙签或枪头，戳刺单菌落并于一块新的GYM固体培养基平板进行划线。编号后于26℃培养4-7天用于保藏。进行保留处理后的平板用于抑菌圈实验。
(2)以酵母菌X33(实验室保存)作为敏感菌株，于GYM固体培养基上挑取单菌落，于GYM液体培养基培养24小时，取100μL涂布于GYM固体培养基上。于(1)中已进行保藏处理的平板上，利用无菌打孔器或枪头，挑取含单菌落的琼脂块，倒置于已涂布酵母的GYM固体培养基上，编号。将处理好的平板，于28℃培养24小时。根据对照菌株，观测量取抑菌圈直径大小，如图3。
实施例2：高产AmB的诱变菌株
(1)将结节链霉菌(Streptomyces nodosus)N3(ATCC14899)接种至GYM平板26℃培养7天，取颜色发灰黑色的孢子，使用棉花棒将表面孢子洗脱至10mL无菌水中，将洗下的孢子悬液用含有棉花的注射器过滤，过滤后的孢子12000rpm离心5min后去上清液，加入10mL无菌水重悬后，12000rpm离心5min重新洗脱一次，用5mL无菌水重悬作为孢子悬液。
(2)NTG-UV诱变方法：取10mL稀释后的孢子悬液置于紫外灯管(15W，254nm)下20cm处照射1min后，接种于GYM培养基中，26℃避光培养24-32h，收集诱变后菌体，使用NTG处理，处理方式：每1mL菌体悬液使用50mM含5mg/mL NTG的PBS缓冲液处理0.5h，8000rpm离心5min，收集菌体使用无菌水清洗3次，重悬后涂布在GYM固体培养基中，26℃避光培养直至获得突变株。每次实验均采用3组平行。对于每轮诱变所获得的高产菌株，重新作为初始菌株按相同步骤进行下一轮筛选。突变次数、突变率和致死率如表1所示。
表1：亚硝基胍-紫外复合诱变过程
Figure BDA0002074887810000061
对于每轮诱变获得的高产菌株，重新作为初始菌株按照上述方法进行复合诱变。最终筛选获得摇瓶发酵AmB产量达8～12g/L的突变株N5，命名为结节链霉菌ZJB2016050(Streptomyces nodosus ZJB2016050)，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期2017年07月17日，保藏编号CCTCC NO：M 2017426，保藏地址为中国武汉，武汉大学，邮编430072。
本发明不仅限于上述诱变方式。
其中GYM固体培养基的配制：葡萄糖4g/L，酵母粉4g/L，麦芽提取物10g/L，碳酸钙2g/L，琼脂18g/L，溶剂为蒸馏水，pH7.2，121度灭菌20min。
GYM液体培养基的配制：葡萄糖4g/L，酵母粉4g/L，麦芽提取物10g/L，溶剂为蒸馏水，pH7.2，121度灭菌20min。
实施例3：摇瓶发酵产AmB
(1)种子液的制备：将实施例2制备的高产两性霉素B的结节链霉菌诱变菌(即CCTCC NO：M 2017426)划线至GYM平板，26℃培养4天，挑选单菌落，接种至种子培养基中，26℃，220rpm培养48h，获得种子液。
种子培养基按以下方法制得：蛋白胨20g，NaCl 8g，葡萄糖15g，酵母粉10g，CaCO31g，加水定容至1L，pH 7.0，121度灭菌20min。
(2)发酵培养
500mL规格摇瓶装样100mL发酵培养基，发酵时按体积浓度4％接种种子液，26℃，220rpm发酵培养144小时，发酵液中AmB产量可达12g/L。
发酵培养基组成：葡萄糖70g/L，牛肉膏8g/L，大豆蛋白粉8g/L，棉子粉10g/L，CaCO3 10g/L，KH2PO4 0.2g/L，溶剂为蒸馏水，pH 7.0，121度灭菌20min。
实施例4：携带acc1基因工程菌构建
一、重组载体的构建
1、重组载体pJTU1278-acc1的构建
以结节链霉菌ATCC14899全基因组为模板，设计引物acc1-F和acc1-R，acc1-F为针对acc1基因的正向引物，acc1-R为针对acc1基因的反向引物，从模板中克隆扩增出acc1基因，片段大小1776bp左右，与目的片段相符，经测序分析，结果表明扩增得到的序列与目的基因序列相同，acc1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。将此片段用核酸内切酶BamHI和HindIII酶切后，clean-up此片段备用，将载体pJTU1278也用同样的BamHI和HindIII核酸内切酶酶切胶回收，将回收后的基因片段与酶切后的pJTU1278载体连接，得到重组质粒载体命名为pJTU1278-Acc1，示意图见图4。
其中克隆PCR体系：加入结节链霉菌ATCC14899全基因组模板1μL，加入2×PhantaMax Buffer 25μL，dNTP(2.5mM)5μL，acc1正反引物各1μL，Phanta Max DNA聚合酶1μL，补足去离子水至50μL。
其中克隆PCR程序：98℃变性10s，55-60℃退火15s，72℃延伸2min，共30个循环。最后72℃延伸10min。
其中连接过程：将T4 DNA连接酶buffer 1μL加入灭菌的PCR管中，加入回收的DNA片段4μl和载体DNA 1μl，加入T4 DNA连接酶1μl，加入ddH2O 3μl，16℃反应20小时。将连接产物转化入JM109大肠杆菌感受态，利用氨苄青霉素抗性筛选，挑选转化子进行验证。
所用引物如下：
acc1-F TCCAGCTTCACGCTGCCGCGTAGA
acc1-R CTTCGAACGCTCCCAGAGTCCCGC
二、重组载体pJTU1278-acc1接合转移转化受体菌结节链霉菌
A)含重组载体pJTU1278-acc1的E.coil ET12567/puz8002供体菌的准备：
将构建好的重组载体pJTU1278-acc1，导入E.coil ET12567/puz8002大肠杆菌感受态中，利用氨苄青霉素(Amp+，50μg/mL)、氯霉素(Cm+，50μg/mL)、卡那霉素(Kan+，50μg/mL)抗性筛选，挑取阳性转化子，通过M13上下游引物菌落PCR验证，结果证明重组载体pJTU1278-acc1成功转化入E.coil ET12567/puz8002。具体操作如下：
E.coil ET12567/puz8002大肠杆菌感受态制备方法如下：
从菌种的甘油冻存管中取E.coil ET12567/puz8002大肠杆菌菌液在LB平板上分区划线，37℃培养至单菌落长出。挑取平板上的单菌落转移到2～5mL的LB培养基中37℃，200rpm过夜培养。取过夜培养的菌液200μL加入到20mL的LB培养基中37℃，200rpm培养至OD600为0.4～0.7。培养好的菌液转移至预冷的50mL离心管中，冰上静置10min。离心4℃，2500×g，5min。弃上清液，加入4mL 0.1mol/L CaCl2，冰上重悬后静置10min。离心4℃，2500×g，5min。弃上清，加入2mL 0.1mol/L CaCl2(溶液中含终浓度为15％的甘油)，重悬沉淀，冰上静置30min，获得E.coil ET12567/puz8002大肠杆菌感受态细胞。分装100μL/tube，-80℃保藏。
含重组载体pJTU1278-acc1的E.coil ET12567/puz8002供体菌的制备：
取1支上述的E.coil ET12567/puz8002大肠杆菌感受态细胞，冰浴5min，加入5μL浓度为200ng/μL的pJTU1278-Kan载体质粒，冰浴30min，于42℃水浴，热激90s，放回冰浴1min，加入600μL LB液体培养基，37℃，200rpm，培养1h。吸取200μL，均匀涂布于Kan+(终浓度50μg/mL)、Cm+(终浓度50μg/mL)、Amp+(终浓度50μg/mL)抗性的LB固体平板，于37℃培养箱培养14h。至长出含重组载体pJTU1278-acc1的E.coil ET12567/puz8002单菌落。
M13验证PCR体系：挑取单菌落，加入20μL无菌水，沸水浴5～10min，12000rpm离心1min。取1μL上清液作为模板，加入10×pfu Buffer 1μL，dNTP(2.5mM)0.1μL，M13正反引物各0.1μL，pfu DNA聚合酶0.1μL，补足去离子水至10μL。
M13验证PCR程序：98℃变性10s，55～60℃退火15s，72℃延伸2min，共30个循环。最后72℃延伸10min。
M13引物如下：
M13(-21)F TGTAAAACGACGGCCAGT
M13R CAGGAAACAGCTATGAC
将已导入pJTU1278-acc1质粒的ET12567/puz8002大肠杆菌，划线分离单菌落，37℃培养，挑单菌落于装有5mL LB培养基试管，并同时加入Kan+(终浓度50μg/mL)、Cm+(终浓度50μg/mL)、Amp+(终浓度50μg/mL)抗生素，37℃培养14h。转接500μL于50mL LB摇瓶中，同时加入Kan+(终浓度50μg/mL)、Cm+(终浓度50μg/mL)、Amp+(终浓度50μg/mL)抗性，37℃培养至OD600为0.35。用50mL离心管将供体菌离心，4000rpm，5min，再用50mL LB培养基洗两次，用5mL LB培养基重悬，4℃保存备用。
其中LB培养基由以下方法制得：蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠5g，自来水定容至1L，pH自然，121度灭菌20min。
B)受体菌Streptomyces nodosus的制备
将实验室菌种的Streptomyces nodosus ZJB2016050(CCTCC NO：M 2017426)接种在GYM平板或斜面培养物上，28℃生长10d，获得灰黑色的孢子，使用棉花棒将表面孢子洗脱至10mL 2×YT培养基中，将洗下的孢子悬液用含有棉花的注射器过滤，过滤后的孢子12000rpm，离心5min后去上清，加入10mL 2×YT培养基重悬，12000rpm离心5min重新洗脱一次，最后用500μL 2×YT培养基重悬。将重悬好的孢子在50℃热激15～20min后，常温下备用。
其中2×YT培养基由以下方法制得：蛋白胨16g，酵母粉10g，氯化钠5g，自来水定容至1L，pH自然，121度灭菌20min。
GYM固体培养基配制方法：葡萄糖4g，酵母粉4g，麦芽提取物10g，碳酸钙2g，琼脂18g，自来水定容至1L，pH7.2，121度灭菌20min。
C)供、受体菌接合过程：
将步骤B)500μL热激完的孢子悬液与步骤A)500μL供体大肠杆菌悬液混合重悬后，6000rpm离心2min，去掉800μL上清液，剩余上清将沉淀重悬涂布在含有10mM氯化镁的MS固体培养基平板上。28℃培养20h后，涂布1mL含0.5mg萘碇酸和0.5mg硫链丝菌素抗生素的水溶液，继续28℃培养10天，至出现转化子。
将转化子在含有终浓度50μg/mL萘碇酸和终浓度50μg/mL卡那霉抗性的GYM固体平板上连续纯化3次，直至获得单一菌落，使用16S RNA上下游引物(16S-8和16S-1541)以及M13上下游引物(M13(-21)F、M13R)对转化子菌落PCR验证后，测序对比分析，证实质粒(pJTU1278-acc1)已导入受体菌Streptomyces nodosus ZJB2016050中，最终获得产AmB的基因工程菌，即重组结节链霉菌ZJB2016050-acc1。
其中MS固体培养基由以下方法制得：黄豆粉20g，甘露醇20g，琼脂20g，自来水定容至1L，用氢氧化钠调至pH 7.2，121度灭菌20min。使用前加入终浓度10mM无菌氯化镁。
其中M13验证PCR操作如步骤A)所述。
其中16sRNA验证PCR体系：挑取单菌落，加入20μL无菌水，沸水浴30min，12000rpm离心1min。取3μL上清液作为模板，加入2×Phanta Max Buffer 5μL，dNTP(2.5mM)0.1μL，16S正反引物各0.1μL，Phanta Max DNA聚合酶0.1μL，补足去离子水至10μL。
其中16S RNA验证PCR程序：98℃变性10s，55～60℃退火15s，72℃延伸1min 30s，共30个循环。最后72℃延伸10min。
其中所用引物如下：
16S-8 AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
16S-1541 AAGGAGGTGATCCAGCCGCA
M13(-21)F TGTAAAACGACGGCCAGT
M13R CAGGAAACAGCTATGAC
实施例5：携带acc2基因的结节链霉菌基因工程菌构建
以结节链霉菌ATCC14899全基因组为模板，设计引物acc2-F和acc2-R，acc2-F为针对acc2基因的正向引物，acc2-R为针对acc2基因的反向引物，从模板中克隆扩增出acc2基因，片段大小1941bp左右，与目的片段相符，经测序分析，结果表明扩增得到的序列与目的基因序列相同，acc2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。将此片段用核酸内切酶BamHI和HindIII酶切后，clean-up此片段备用，将载体pJTU1278也用同样的BamHI和HindIII核酸内切酶酶切胶回收，将回收后的基因片段与酶切后的pJTU1278载体连接，得到重组质粒载体命名为pJTU1278-Acc2，示意图见图5。
其中克隆PCR体系：加入结节链霉菌ATCC14899全基因组模板1μL，加入2×PhantaMax Buffer 25μL，dNTP(2.5mM)5μL，acc2正反引物各1μL，Phanta Max DNA聚合酶1μL，补足去离子水至50μL。
其中克隆PCR程序：98℃变性10s，55～60℃退火15s，72℃延伸30s，共30个循环。最后72℃延伸10min。
其中连接过程：将T4 DNA连接酶buffer 1μL加入灭菌的PCR管中，加入回收的DNA片段4μL和载体DNA 1μL，加入T4 DNA连接酶1μL，加入ddH2O 3μL，16℃反应20小时。将连接产物转化入大肠杆菌JM109感受态，利用氨苄青霉素抗性筛选，挑选转化子进行验证。
所用引物如下：
acc2-F ATGAAGAGTTCGAAATCTCCTAGGAC
acc2-R GACACTCGCATGGACGTCTCAGTCC
按照实施例4的接合转移方法，将构建的pJTU1278-acc2质粒导入Streptomycesnodosus ZJB2016050(CCTCC NO：M 2017426)，获得重组结节链霉菌ZJB2016050-acc2。
实施例6：携带amphA基因的结节链霉菌基因工程菌构建
以结节链霉菌ATCC14899全基因组为模板，设计引物amphA-F和amphA-R，amphA-F为针对amphA基因的正向引物，amphA-R为针对amphA基因的反向引物，从模板中克隆扩增出amphA基因，片段大小4239bp左右，与目的片段相符，经测序分析，结果表明扩增得到的序列与目的基因序列相同，ampha基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。将此片段用核酸内切酶BamHI和HindIII酶切后，clean-up此片段备用，将载体pJTU1278也用同样的BamHI和HindIII核酸内切酶酶切胶回收，将回收后的基因片段与酶切后的pJTU1278载体连接，得到重组质粒载体命名为pJTU1278-amphA，示意图见图6。
其中克隆PCR体系：加入基因组模板1μL，加入2×Phanta Max Buffer 25μL，dNTP(2.5mM)5μL，amphA正反引物各1μL，Phanta Max DNA聚合酶1μL，补足去离子水至50μL。
其中克隆PCR程序：98℃变性10s，55～60℃退火15s，72℃延伸5min，共30个循环。最后72℃延伸10min。
其中连接过程：将T4 DNA连接酶buffer 1μL加入灭菌的PCR管中，加入回收的DNA片段4μL和载体DNA 1μL，加入T4 DNA连接酶1μL，加入ddH2O 3μL，16℃反应20小时。将连接产物转化入JM109大肠杆菌感受态，利用氨苄青霉素抗性筛选，挑选转化子进行验证。
所用引物如下：
amphA-F GGACGTCTCAGTCCTTGATCTCGCAGA
amphA-R GACGTCTCAGTCCTTGATCTCGCAGA
按照实施例4的接合转移方法，将构建的pJTU1278-amphA质粒导入Streptomycesnodosus ZJB16050(CCTCC NO：M 2017426)，获得重组结节链霉菌ZJB2016050-amphA。
实施例7：携带mcm基因的结节链霉菌基因工程菌构建
以结节链霉菌ATCC14899全基因组为模板，设计引物mcm-F和mcm-R，mcm-F为针对mcm基因的正向引物，mcm-R为针对mcm基因的反向引物，从模板中克隆扩增出mcm基因，片段大小1737bp左右，与目的片段相符，经测序分析，结果表明扩增得到的序列与目的基因序列相同，mcm基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。将此片段用核酸内切酶BamHI和HindIII酶切后，clean-up此片段备用，将载体pJTU1278也用同样的BamHI和HindIII核酸内切酶酶切胶回收，将回收后的基因片段与酶切后的pJTU1278载体连接，得到重组质粒载体命名为pJTU1278-mcm。
其中克隆PCR体系：加入基因组模板1μL，加入2×Phanta Max Buffer 25μL，dNTP(2.5mM)5μL，mcm正反引物各1μL，Phanta Max DNA聚合酶1μL，补足去离子水至50μL。
其中克隆PCR程序：98℃变性10s，55～60℃退火15s，72℃延伸2min，共30个循环。最后72℃延伸10min。
其中连接过程：将T4 DNA连接酶buffer 1μL加入灭菌的PCR管中，加入回收的DNA片段4μL和载体DNA 1μL，加入T4 DNA连接酶1μL，加入ddH2O 3μL，16℃反应20小时。将连接产物转化入JM109大肠杆菌感受态，利用氨苄青霉素抗性筛选，挑选转化子进行验证。
所用引物如下：
mcm-F CTCTAGACGGTGGGGGAAATGATT
mcm-R AGAACCGGCGGCGCGGTCCGGGG
按照实施例4的接合转移方法，将构建的pJTU1278-mcm质粒导入Streptomycesnodosus ZJB16050(CCTCC NO：M 2017426)，获得重组结节链霉菌ZJB2016050-mcm。
实施例8：携带mme基因的结节链霉菌基因工程菌构建
以结节链霉菌ATCC14899全基因组为模板，设计引物mme-F和mme-R，mme-F为针对mme基因的正向引物，mme-R为针对mme基因的反向引物，从模板中克隆扩增出mme基因，片段大小441bp左右，与目的片段相符，经测序分析，结果表明扩增得到的序列与目的基因序列相同，mcm基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。将此片段用核酸内切酶BamHI和HindIII酶切后，clean-up此片段备用，将载体pJTU1278也用同样的BamHI和HindIII核酸内切酶酶切胶回收，将回收后的基因片段与酶切后的pJTU1278载体连接，得到重组质粒载体命名为pJTU1278-mme。
其中克隆PCR体系：加入基因组模板1μL，加入2×Phanta Max Buffer 25μL，dNTP(2.5mM)5μL，mme正反引物各1μL，Phanta Max DNA聚合酶1μL，补足去离子水至50μL。
其中克隆PCR程序：98℃变性10s，55～60℃退火15s，72℃延伸2min，共30个循环。最后72℃延伸10min。
其中连接过程：将T4 DNA连接酶buffer 1μL加入灭菌的PCR管中，加入回收的DNA片段4μL和载体DNA 1μL，加入T4 DNA连接酶1μL，加入ddH2O 3μL，16℃反应20小时。将连接产物转化入JM109大肠杆菌感受态，利用氨苄青霉素抗性筛选，挑选转化子进行验证。
所用引物如下：
mcm-F TAGACGGTGGGGGAAATGATTCACGGATT
mcm-R GGCCGTGCGGTCCAGTGGTAGAAGCGCC
按照实施例4的接合转移方法，将构建的pJTU1278-mme质粒导入Streptomycesnodosus ZJB16050(CCTCC NO：M 2017426)，获得重组结节链霉菌ZJB2016050-mme。
实施例9：摇瓶发酵产AmB
(1)孢子悬液的制备：将实施例4～8制备的产AmB的重组结节链霉菌ZJB16050-acc1(即CCTCC NO：M 2019343)，ZJB16050-acc2，ZJB16050-amphA，ZJB16050-mcm，ZJB16050-mme，接种至GYM平板，28℃培养7天，取颜色发灰黑色的孢子，使用棉花棒将表面孢子洗脱至10mL无菌水中，将洗下的孢子悬液用含有棉花的注射器过滤，过滤后的孢子12000rpm离心5min后去上清液，加入10mL无菌水重悬后，12000rpm离心5min重新洗脱一次，用5mL无菌水重悬作为孢子悬液。
(2)种子液的制备：
将步骤(1)孢子悬液接种至种子培养基中，28℃，220rpm培养46h，获得种子液。
种子培养基按以下方法制得：蛋白胨20g，NaCl 8g，葡萄糖15g，酵母粉10g，CaCO31g，加水定容至1L，pH 7.0，121度灭菌20min。
(3)发酵培养
500mL规格摇瓶装样50mL发酵培养基，发酵时按体积浓度2％接种种子液，28℃，220rpm发酵培养168h。
发酵培养基组成：葡萄糖70g/L，牛肉膏8g/L，大豆蛋白粉8g/L，棉子粉10g/L，CaCO3 10g/L，KH2PO4 0.2g/L，溶剂为自来水，pH 7.0，121度灭菌20min。
上述基因工程菌通过摇瓶发酵生产，按照实施例11方法检测，其中ZJB2016050-acc1所得发酵液中AmB含量最高，为6.1g/L。
实施例10：5L发酵罐发酵生产AmB
将实施例4制备的产AmB基因工程菌(重组结节链霉菌ZJB2016050-acc1)孢子悬液或斜面培养物接种种子培养基中，28℃，220rpm培养48h获得种子液。
发酵条件：5L发酵罐中装发酵液量3L，接种量按体积浓度5％接种种子液，28℃，压力0.05MPa、通气比1.2vvm，转速400rpm，发酵培养100h，获得发酵液。
种子培养基按以下方法制得：蛋白胨20g，NaCl 8g，葡萄糖15g，酵母粉10g，CaCO31g，加水定容至1L，pH 7.0，121度灭菌20min。
5L发酵罐发酵培养基组成：葡萄糖70g/L，牛肉膏8g/L，大豆蛋白粉8g/L，棉子粉10g/L，CaCO3 10g/L，KH2PO4 0.2g/L，溶剂为自来水，pH 7.0，121度灭菌20min。
同样条件下，以实施例1筛选的重组结节链霉菌ZJB2016050为对照进行发酵培养。
比较实施例4制备的产AmB基因工程菌(重组结节链霉菌ZJB2016050-acc1)与对照菌(重组结节链霉菌ZJB2016050)在5L罐发酵情况。上述基因工程菌通过5L罐发酵生产，按照实施例12方法检测，基因工程菌所得发酵液中AmB含量为7.02g/L，而对照菌发酵液中AmB含量为5.04g/L。
实施例11：AmB成品的制备
取实施例7方法获得的发酵液500L。将发酵液经板框过滤得湿菌丝，烘干，得到8.1kg干菌重，把烘干的菌丝投入萃取罐中，加入70L甲醇，降温至4℃，用盐酸调至pH 3.0，稳定一小时，过滤得滤液。滤液进入结晶罐，加入纯化水10L，用碱液调pH至6.0，升温至25℃，保温一小时，结晶完成，静置分层。过滤得固体物(即AmB结晶粉)，不断加甲醇洗涤，除去杂质，最后烘干，粉碎，得AmB粗成品，粗成品通过实施例12所述液相色谱进行检测，产量为15.3g/L，产品纯度为94％以上。
实施例12：AmB的HPLC检测方法
取实施例9方法制备的发酵液，按发酵液：DMSO为1：9的体积比与DMSO混合，室温下萃取20～30分钟，12000rpm离心5min，取上清用0.45μm有机滤膜过膜后通过高效液相色谱(HPLC)检测。
检测方法：色谱柱为C18柱(150×4.6mm)，柱温25℃，流速1mL/min，进样量20μL，色谱保留时间30min，检测波长为405nm。AmB的出峰时间为26.9min。
其中流动相配制方法：1.1g EDTA-Na2和4.1g醋酸钠用蒸馏水定容至1L，取此溶液900mL与700mL乙腈、400mL甲醇混合，乙酸调至pH5.0；
AmB产量计算方法：从sigma公司购买AmB的标准品，用DMSO配制不同浓度(0mg/L、200mg/L、400mg/L、800mg/L、1000mg/L)的AmB标准溶液，分别将上述标准液用HPLC检测出峰面积，根据峰面积和AmB标准溶液的浓度计算出标准曲线为Y＝0.0123X+2539.9，R2＝0.999(其中Y为AmB的浓度，X为峰面积)。将未知浓度的AmB样品通过HPLC检测可以得到一个峰面积，带入上述标准曲线公式得出浓度，标准曲线结果如图7所示。
实施例13：摇瓶发酵体系pH优化
将实施例4发酵培养基pH分别调至6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，其它操作同实施例4，按照实施例12检测方法检测发酵液AmB，结果如图8所示。
发酵过程的pH在6.5-7.0之间较佳，其中在pH 6.5条件下，菌丝干重和AmB产量最高，菌丝干重和AmB产量相对于不调节pH对照组(pH 7.2)分别提高2％和15％。在pH高于8.5的发酵过程中，AmB产量下降大于30％。
实施例14：摇瓶发酵体系发酵温度优化
将实施例4中发酵温度分别改为25℃、28℃、30℃、32℃、37℃，其它操作同实施例4，按照实施例9检测方法检测发酵液AmB，结果如图9所示。
发酵温度在28℃最佳，于144小时达到最高产量约6.4g/L。当温度超过30℃时，AmB产量于120小时提前下降。
实施例15：摇瓶发酵体系转速优化
将实施例1中摇床转速分别改为50rpm、100rpm、150rpm、220rpm，其它操作同实施例4，按照实施例12检测方法检测发酵液AmB，结果如图10所示。
当转速在200rpm时，两性霉素B产量较大，在高于200rpm时，产量增幅不明显。在转速低于200rpm时，两性霉素B的产量有较明显的下降趋势，在低转速情况下，溶氧不足会降低两性霉素B合成。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 高通量诱变筛选高产两性霉素B结节链霉菌的方法及菌株
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1776
<212> DNA
<213> Streptomyces nodosus
<400> 1
tcagtccttg atctcgcaga tcgcggcgcc ggaggagagg gaggcgccga cctccgcggt 60
caggcccttg atcgtgccgg ctcggtgcgc gttgagcggc tgctccatct tcatggcctc 120
caggacgacg accaggtcgc cctcctggac ctcctggccc tcctcgaccg cgaccttcac 180
gatcgtgccc tgcatcgggg aggccagggt gtcgccggag accgagggac cggacttctt 240
cgccgcgcgc cgcttcggct tggcgcccgc cgccagaccc gtacgggcca gcgacatacc 300
gagcgacgcg ggcagcgaca cctcgagacg cttgccgccg acctcgacca cgaccgtctc 360
acggcccgcc gggtcctcct cggcctccgc gtccgcggcc gccgcgaacg gcttgatctc 420
gttgacgaac tcggtctcga tccagcgggt gtggaccgtg aaggggccct cggagccggt 480
cagttcgggc gcgaacgcgg tgtccctgac caccgcgcgg tggaacggga tcgccgtggc 540
catcccctcg acctggaact cgtccagggc gcgggcggcc cgctccagag cctccttgcg 600
ggtgcggccc gtcacgatca gcttggccag cagggagtcc cacgccgggc cgatgaccga 660
acccgactcc acacccgcgt ccagccgcac accggggccg gacggcggag cgaacgcggt 720
caccgtgccg ggggcgggca ggaagccccg gcccgggtcc tcgccgttga tccggaactc 780
gaaggaatgg ccgcgcagtt cggggtcgtc atagcccagt tcctcgccgt cggcgatacg 840
gaacatctca cggaccaggt cgatgccggc gacctcctcg gtgaccgggt gctcgacctg 900
gagccgggtg ttgacctcca ggaaggagat cgtcccgtcg ttgccgacca ggaactccac 960
cgtgcccgcg cccacatagc cggcctcctt gaggatggcc ttggacgccg agtacagctc 1020
ggcgacctgc ccgtccgaca ggaacggcgc gggggcctcc tcgaccagct tctggtggcg 1080
ccgctgcagc gagcagtcac gggtggagac caccacgacg ttgccgtgcc ggtcggccag 1140
gcactgtgtc tccacgtgcc ggggccggtc cagatagcgc tccacgaagc actcgccacg 1200
gccgaaggcg gcgaccgcct cacggaccgc cgactcgtac agctcgggga tctcctccag 1260
ggtgcgggcc accttcagac cgcgcccgcc accgccgaag gcggccttga tcgcgatcgg 1320
caggccgtgc tcctcggcga aggtgacgac ctcgtcggcg ccggacaccg ggtcgggcgt 1380
accggcgacc aggggggcac ccgcgcgctg cgcgatgtgc cgggccgcga ccttgtcacc 1440
gagatcgcgg atggcctgcg gcggcgggcc gatccagatc agaccggcgt ccaggacggc 1500
ctgggcgaag tcggcgttct cggagaggaa accgtagccg gggtggatgg cgtccgcgcc 1560
ggaatccttg gccgcctgaa ggaccttgtc gatgtccagg taactggtgg cgggcgtgtc 1620
tcctcccagg gcgaacgcct cgtccgcggc gcggacgtgc agggcgtccc ggtccgggtc 1680
ggcgtagacg gccacgctcg cgatcccggc gtcacgacag gcccgggcga cacggacagc 1740
gatttcgcca cggttggcga tcaacacctt gcgcac 1776
<210> 2
<211> 1941
<212> DNA
<213> Streptomyces nodosus
<400> 2
atgtttgaca cggtgctcgt ggccaaccgg ggcgagatcg cggtccgggt cgtccgcacc 60
ctgcgcgcgc tcggggtgcg ttcggtggcc gtcttctccg acgcggacgc cgacgcccgg 120
cacgtccggg aggccgacac ggcggtacgg atcggaccgg cgcccgcagc cgagagctat 180
ctgtccgtcg agcggctcct cgcggcggcg gcccgcaccg gcgcccaggc ggtgcacccg 240
ggatacggct tcctcgcgga gaacgccgcc ttcgcgaagg cgtgcgcgga ggcggggctg 300
gtcttcatcg ggccgcccgc cgaggcgatc tccctcatgg gcgacaagat ccgcgccaag 360
gagacggtgc gggcggccgg ggtgccggtc gtcccgggct ccgacggcag cgggctgacg 420
gacgagcagc tggccgaggc ggcccacacc atcggcatgc cggtgctgct gaagccgagc 480
gccggcgggg gcggcaaggg catgcggctg gtgcgggagc cggagcggct ggccgaggag 540
atcgccgcgg cccgccgtga ggcccgcgcc tccttcggcg acgacacgct cctggtcgag 600
cgctggatcg accggccccg gcatatcgag atccaggtcc tggccgactc ccacgggaac 660
gtggtgcatc tgggcgagcg cgagtgctcc ctccagcgcc gccaccagaa gctcatcgag 720
gaggcgccca gtgtgttcct cgacgaggcc acccgtgcgg cgatgggcga ggcggcggtc 780
caggcggccc gctcctgcgg ctaccggggc gcgggcacgg tggagttcat cgtcccgggc 840
aacgacccct ccgcctatta cttcatggag atgaacaccc gcctccaggt ggaacacccg 900
gtcaccgagc tggtcaccgg cctggacctg gtggaatggc agctgcgggt ggcggcgggc 960
gagccgctgt ccttcgggca ggacgacatc acgctcaccg ggcacgccgt ggaggcgcgg 1020
atctgcgccg aggaccccgc ccgcggcttc ctcccctccg gcggcacggt gctcgcgctg 1080
cacgaaccgg ggggcgacgg cctccgcacc gactcgggcc tgtccgaggg caccgaggtc 1140
ggcagcctct acgacccgat gctgtccaag gtcatcgccc acggccccga ccgggcgacc 1200
gcgctgcgca gactgcgcgc ggccctcggg gagaccgtca ccctgggcgt ggggaccaac 1260
gccggttttc tgcgccggct gctggcccat cccgcggtcg tggcgggcga actggacacc 1320
gggctggtgg aacgcgaggc ggacggcctc atcccggagg gggtgccgga ggaggtgtac 1380
gaggccgccg ccgccgtgcg cctggacgca ctgcggcccc ggggcgaggg ctggaccgac 1440
ccgttctcgg tgccggacgg ctggcgcctc ggcggcgagc ccgcgcccct gtccttcccc 1500
ctgcgggtgt ccgaaccggt ggagtactcc ccccggggca cccacacggt caccgaggac 1560
cgggtgtccg tggtgctgga cggggtgcgg cacaccttcc accgcgccgc cgactggctc 1620
ggccgggacg gcgacgcctg gcaggtgcgc gaccatgacc cggtcgccgc ctcgctcacc 1680
ggcgccgccc gagccggcac cgactcgctg accgcgccca tgcccggcac ggtcaccgtg 1740
gtgaaggtcg ccgtcgggga cgaggtggcc gcagggcaga gcctgctggt ggtcgaggcg 1800
atgaagatgg agcacgtcat ctccgcgccg cacgccggga ccgtcgccga actcgacgtc 1860
accccgggca ccacggtggt catggaccag gtgctggccg tgatcacccc gcacgaggag 1920
cacacggagg cggagcgatg a 1941
<210> 3
<211> 4239
<212> DNA
<213> Streptomyces nodosus
<400> 3
atgacgatcg gagccaacga cgatccggta gtggtcgtcg gaatggcctg ccgcttcccg 60
ggaggcgtcg aggggcccga ggacctgtgg gagctggtcc gcgacggccg cgacgccacc 120
gggccgttcc ccggcgaccg cggctgggac ctggccgccc tgaccggcga cgggccggac 180
cacagcgtga cccaccgagg cggattcctc gccgcggccg ccgacttcga cgccggcttc 240
ttcgggatgt cgccccgcga ggccgtctcc accgacccgc agcagcggct cgtcctggag 300
acctcctggg aggccctgga acacgccggc atcgacccgc acaccctgcg gggcacccgc 360
accggcgtct tcgtcggcac caacggccag gactacgcga ccgtcaccaa cgcctcccgc 420
gaggacctca ccgggcacgc cctcaccggt ctgtcgccga gcatcgcctc cgggaggctc 480
gcctacttcc tcggcctcga agggcccgcc gtcaccctcg acacggcgtc ctcctcgtcc 540
ctggtcgccc tccactacgc gctgcgctcg ctcaggtcgg gggagtgcac caccgcgctg 600
gccggcggcg tcaccgtgat gtccacaccg gtcgggttca tcgcctacac ccggcagggc 660
ggactcgccg ccgacggccg ctgcaaggtc ttctccgacg acgccgacgg caccacctgg 720
gcggagggcg ccggcatgat cgtgctggag cgcctgtcca ccgcccgcgc cgccgggcac 780
cgggtgctcg ccgtgctgcg cggctccgcc gtcaaccagg acggcgcctc cgacggtctc 840
accgccccca gcggaccggc ccaggaacga ctcgtccgcg aggccctcgc cgacgccgga 900
ctcggacccg ccgacatcga cctcgtcgag gcccacggca ccggcacccg gctcggcgac 960
cccatcgagg cccgggccct gctcgccacc tacggccagg accgcgacgg cggacagccg 1020
ctgcgcctcg gctccctgaa gtccaacatc gggcacgccc aggcagccgc cggcatcggc 1080
ggactcatca aggccgtcca ggcgctgcgc cacggcctga tgccggagac cctgaacctc 1140
tccacgccca cccggcacgt cgactggtcg gccggcgccg tcgaactcct caccgaggcc 1200
ctgccctggc ccggcaccgg ccgcccgcgc cgggccgccg tctcctcctt cggcatcagt 1260
ggcaccaacg cgcatgtcat cgtggaggaa gccccgacga ccgaccccgc cgccgcggtc 1320
cccgccgggc ccgcccaccg ggacgtggcc tcggccgccg actccgccgc gcggcccgct 1380
gccctcgccg gggagcccgc cgacacctct gctcccgccg ctgtcgacgc cggcccggcc 1440
gaccgcccgg tcacccccgc cgctcggctc gccgccctcg tgcccgcggc cgacgccgtc 1500
gcgtggccgg tgtccggggc ctccccggag gctctcgacg cgcaggtcga gcggctcacc 1560
tccttcgtcc gggaccaccc cggcgccgat ccgctggaca tcggtcactc gctggccacc 1620
gggcgggcgg cgttgcggca ccgtgcggtg ctggtgccgt ccggtgacgg tgtcgtggag 1680
atcgcccgcg gtgaggccgc cccccgcacc accgccgtcc tcttctccgg acagggctcc 1740
cagcggctcg gcatgggccg tgaactcgcc gcccgcttcc cggtcttcgc gaaggccctg 1800
gacaccgtcc tggccgccct cgacccccaa ctcgagcgtc cggtgcggtc cgtgatgtgg 1860
ggcgaggacc ccgccgaact cgaccgcacc gggtggaccc agcccgcgct gttcgccttc 1920
gaggtcgccc tgtaccggct cgccgagtcc ttcgggctgc gccccgacgc cgtcggcggc 1980
cactccgtcg gcgagatcgc cgccgcgcac atcgccggag tgctctcgct ggaggacgcc 2040
gcgcgtctgg tcgccgcccg cgccaccctg atgcaggccc tgcccgaggg cggcgccatg 2100
tccgccgtcg aggcctccga ggacgaggtg ctcccgctgc tcgacggcga tgtctcgctc 2160
gccgccgtca acggccccac cgcggtcgtc gtctccggcg ccgaggacgc cgtggagcgc 2220
gtctccgccc acttcgctgc ccaaggccgc cgcaccagcc gcctcgcggt ctcgcacgcc 2280
ttccactcgc cgctgatgga gccgatgctc gacgccttcc gggacgtcgt cgccggactc 2340
accttccatg agccgacgct gccggtgatg tccaacctca ccggtgaact tgccggtgcc 2400
gagatcgcca cccccgagta ctgggtgcgg catgtgcgcg gtaccgtccg cttcgccgac 2460
ggcgtgacgg ccctgcggga acacggcacc gacctgctgg tcgaactggg ccccggcagc 2520
gtcctgaccg ccctcgcccg caccgtcctc ggcccggaca ccccgggcgc ccctgtcgac 2580
gtggtgccca ccctccgcaa ggaccagccc gaggagaggg ctctcaccgc cgcgctcggc 2640
cggctccatg tcctcggcgc gaccgtcgac tggtccgccc tctacaccgg caccggagcc 2700
cgccgcaccg acctgccgac gtacgccttc cagcacgcgc ggtactggcc cgccccgggc 2760
cggcccggca ccggtaccgc gggcggcggg catccgctgc tcggcccggc cgtggaactc 2820
gccgacggcg gcacggtgtc gggcgccaca ctgtccgtcg ccacccaccc ctggctcgcc 2880
gaccatgtcg tcgccgggcg cgtcctgctg cccgccgccg tgctcgtgga actcgccgta 2940
cgcgcgggtg acgacaccgg atgcgacgtc ctgcacgaac tcgccctcgt cgaggcgccg 3000
gtcctggagg ccggcgacac cctggacctc caggtccggg tcggctccgc cgacgaggcc 3060
ggccggcgca ccctcaccgt ccactcccgt cccggcaact cccccgccga gccctggacc 3120
cagcgggccg gcggcctgct cggcaccgcg ccccgcaccg cggcggcccc cgacacctcc 3180
ttcgccgtcg cctggccccc gccgggcgcc gaacccctcg acctcgggga ccactacgag 3240
cggctcgtcg acgacggctt cgacctcggc cccgccttcc gcggtctgcg caccgcctgg 3300
cgccacgacg gcgcgttcct cgccgaggtc gaactcccgg ccggcaccac cgacgacccc 3360
ggcgcctacg gagtgcaccc cgcgctcctc gacgccgccc ggcacgccgc cctcaccacc 3420
accggcacac tcccggtcgc ctggcacggg gtgcggctgc acgccgtcgg cgccaccgcc 3480
ctgcgggtgc ggatccactc cgccgacgac ggtgccctga ccctgaccgc cgccgatgtc 3540
accggcgccc cggtgttcac cgccgaggcc gtcgtcgtac ggcagctcac cgagcaggag 3600
cgcaccgccc cccggccgct cacacgcgcc tggcaccagg acaccgcgac cccgcgccgc 3660
acccggcccg tcgccgcggc ccccggcgcc gccgccgagc cgtccgcctc ctcggcgccg 3720
gacagcttcg ccgccgaggc cgcggccctg gcccccgccg agcgtgaacg ccggctcatc 3780
ggcctggtac ggacccaggc ggcggcggtc ctcggccatc agggcccgga cgcggtcgga 3840
ccccgcgcgg tcttcaagga gctgggcttc gactcgctgg ccggcgtgga actcagtgac 3900
cgcctcaccg cgctcaccgg actgcggctg ccggccaccc tcgtcttcaa cttccccacc 3960
cccgagctcg ccgcccggcg tatcggggaa ctcctcgtcg tatccggctc ctcaccgcag 4020
ggatcgtgcg acgacgaact caccaggttc gaggccgtcg tgcagaccct gtcggccgac 4080
gaccccggac gccaggccgt cgccgaccgc ctggacgcac tcgtcgcctc gctccggcgg 4140
aattccgccc cgcaggagaa cttctccgac gaggacatcg aatcggtgtc ggtcgacaga 4200
ctgctcgaca tcatcgatga agagttcgaa atctcctag 4239
<210> 4
<211> 1737
<212> DNA
<213> Streptomyces nodosus
<400> 4
atggacgctg acgccatcgc ggagggccgc cgacgctggc aggcccgtta tgacgccgca 60
cgcacgcgtg aggcggccgg gggctccgag gcgaaacccc cgaggagctg gacgcgcacc 120
acgctctccg gcgaccccgt ggagcccgtg tacgggcccc ggcccaccga cagctacgag 180
ggcttcgagc ggatcggctg gccgggcgag taccccttca cccgcggtct gtatccgacc 240
ggctaccggg gccggagctg gaccgtccgc cagttcgccg ggttcgggaa cgccgagcag 300
accaatgagc gcttcaaggc gatcctggag gccggcggcg gaggcctgag cgtcgccttc 360
gacatgccga cgctgatggg ccgcgactcc gacgatccgc gctccctggg cgaggtcggg 420
cactgcgggg tggcgatcga ctcggcggcc gacatggagg tcctgttcca ggacatccag 480
ctgggtgagg ttacgacctc gatgacgatc agcggtccgg ccgtccccgt cttctgcatg 540
tatctggtcg ccgccgagcg gcagggcgtc gacccggccg tgctcaacgg cacgctccag 600
accgacatct tcaaggagta catcgcccag aaggagtggc tcttccggcc cgagccgcat 660
ctgcgtctga tcggcgacct gatggagcac tgcacggccg gcatccccgc ctacaagccg 720
ctgtccgtct ccggctacca catccgtgag gcgggcgcga cggccgcaca ggagctggcg 780
tacaccctgg cggacggctt cggatatgtg gagctggggc tcagccgcgg gctcgacgtg 840
gatgtcttcg ccccggggct gtccttcttc ttcgacgcgc atgtcgactt cttcgaggag 900
atcgccaagt tccgggccgc gcgccgcatc tgggcgcgct ggatgcgcga ggtgtacggc 960
gcgcggagcg acaaggcgca gtggctgcgc ttccacaccc agaccgccgg ggtctcgctg 1020
accgcccagc agccgtacaa caacgtggtg cgtacggcgg tggaggcgct ggcggcggtg 1080
ctgggcggga ccaactcgct gcacaccaac gcactggacg agacgctggc gctgccgagc 1140
gaacaggcgg cggagatcgc gctgcgcacc cagcaggtgc tgatggagga gaccggggtc 1200
gcccatgtcg cggacccgct gggcggttcg tggtacgtcg agcagctgac ggaccggatc 1260
gaggcggacg cggagaagat cttcgagcag atcaaggagc ggggactgcg ggcgcatccg 1320
gacggtcggc acccgatcgg cccgatgacc tccggcattc tgcgggggat cgaggacggc 1380
tggttcacgg gcgagatcgc ggagtccgcc ttccgctatc agcaggccct ggagaagggc 1440
gacaagcacg tggtgggcgt caatgtccac accggatcgg tcaccgggga cctggagatc 1500
ctgcgggtcg gccacgaggt ggagcgggag caggtgcggg tgctcgcggc gcgccgggcg 1560
gcgcgggacg agaccgcggt gcgtacggcg ctcgacggca tgctggcggc ggcacgcgac 1620
ggcaccgaca tgatcggccc catgctggac gcggtgcgcg cggaggcgac gctcggcgag 1680
atctgcgggg cgctgcggga cgagtggggg atctacacgg agccgccggg cttctga 1737
<210> 5
<211> 441
<212> DNA
<213> Streptomyces nodosus
<400> 5
atgctgacgc gaatcgacca catcgggatc gcctgcttcg acctggagaa gaccgtcgag 60
ttctacacct cgacctacgg cttctccgtg ttccacaccg agatcaacga ggaacagggc 120
gtccgcgagg ccatgctgaa gatcaatgac acgggcgacg gcggggcctc ctacctccag 180
ctgctggaac ccgtccgcga ggactccgcc gtggcgaagt ggctcgccaa gaacggggag 240
ggcgtacatc acatcgcctt cggcacggcg gacgtcgacg gggacgcgga ggccgtccgg 300
gacaagggcg tgcgcgtgct gtacgacgag ccacgacggg gttccatggg gtcccggatc 360
acctttctgc accccaagga ttgtcacgga gttctcacag aactggtcac atccgcggcc 420
gttgagtcac ctgagcactg a 441

Claims (4)

1.一种产两性霉素B的重组结节链霉菌，由SEQ ID NO.1所示乙酰辅酶A羧化酶1基因导入结节链霉菌CCTCC NO：M 2017426(Streptomyces nodosus CCTCC NO：M 2017426)获得。
2.如权利要求1所述的重组结节链霉菌，其特征在于所述重组结节链霉菌为结节链霉菌ZJB2016050-ACC1(Streptomyces nodosus ZJB2016050-ACC1)，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，邮编430072，保藏编号：CCTCC NO：M 2019343，保藏日期2019年05月09日。
3.如权利要求1所述重组结节链霉菌在微生物发酵制备两性霉素B中的应用。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于所述应用为：将所述产两性霉素B的重组结节链霉菌接种至发酵培养基，25～30℃、200～500rpm发酵培养，获得含两性霉素B的发酵液，将发酵液分离纯化，得到所述两性霉素B；所述发酵培养基终浓度组成为：葡萄糖60～80g/L，牛肉膏5～10g/L，大豆蛋白粉5～10g/L，棉子粉8～12g/L，CaCO3 5～10g/L，KH2PO4 0.1～0.4g/L，溶剂为水，pH 7.0。
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