CN110563689A

CN110563689A - 一种特异性检测活细胞中的半胱氨酸的长波长发射荧光探针及其制备方法和应用

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Publication number: CN110563689A
Application number: CN201910796943.2A
Authority: CN
Inventors: 李亚平; 乔柳琪; 蔡建华; 吕鑫
Original assignee: Shanxi University
Current assignee: Shanxi University
Priority date: 2019-08-27
Filing date: 2019-08-27
Publication date: 2019-12-13
Anticipated expiration: 2039-08-27
Also published as: CN110563689B

Abstract

本发明属于荧光探针技术领域，提供了一种特异性检测活细胞中的半胱氨酸的长波长发射荧光探针及其制备方法和应用，荧光探针分子式为C₂₉H₂₆NO₅ ⁺，该探针化合物名称为2‑(4‑(丙烯酰氧基)苯基)‑4‑(2‑羧基苯基)‑7‑(二乙基氨基)苯并吡喃，简称PA‑A，以花色素衍生物为荧光团，以丙烯酸酯作为识别单元构建的特异性识别半胱氨酸的荧光探针。利用半胱氨酸与探针的迈克尔加成‑裂解反应进行高选择性检测。本发明属有机小分子荧光探针技术领域，探针颜色变化明显，水溶性好，能在水溶性环境、有机环境以及细胞环境中高效识别半胱氨酸。本发明方法操作简单、灵敏度高、选择性好，性质稳定，可以长期保存使用。

Description

一种特异性检测活细胞中的半胱氨酸的长波长发射荧光探针及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于荧光探针技术领域，具体涉及一种特异性检测活细胞中的半胱氨酸的长波长发射荧光探针及其制备方法和应用，能够对半胱氨酸高选择性较灵敏识别，在水溶性、有机环境以及细胞环境中都有响应。

背景技术

近年来，含有巯基的氨基酸因为在调节生理和病理过程中起着至关重要的作用而引起了很多关注，包括半胱氨酸（Cys），高半胱氨酸（Hcy）和谷胱甘肽（GSH）。其中，半胱氨酸参与蛋白质合成，解毒和代谢，是一种重要的生物硫醇，与许多疾病有关。例如，缺乏半胱氨酸会导致儿童生长缓慢，水肿，嗜睡，肝损伤，肌肉和脂肪损伤，皮肤病变。过量的半胱氨酸也是引起心血管疾病和阿尔茨海默病的重要原因。

电化学分析法，质谱和高效液相色谱（HPLC）等分析方法都可用于检测半胱氨酸。然而，这些方法操作复杂且需昂贵的仪器。相比之下，荧光检测方法具有操作简单，灵敏度高，选择性好，实时监测的优点。另外，荧光探针可以通过非侵入性共聚焦方法对活细胞中的半胱氨酸成像，为将来进一步应用荧光探针提供了可能性。但是，半胱氨酸，高半胱氨酸和谷胱甘肽有着相似的结构和反应特性，它们几乎存在于所有哺乳动物细胞中，因此，半胱氨酸，高半胱氨酸和谷胱甘肽的选择性区分仍然是该领域的重要挑战。

目前，许多用于选择性检测半胱氨酸的小分子荧光探针已经建立在特定的化学反应基础上，如迈克尔加成，与醛环化，二硫化物交换和裂解反应，等等。 2011年，Strongin等人第一次使用丙烯酰基作为反应位点构建苯并噻唑衍生物，用于特异性识别半胱氨酸。从那时起，基于这种设计理念的荧光探针就被广泛开发。丙烯酰基在与半胱氨酸反应后，探针的丙烯酸酯单元被半胱氨酸切割以释放荧光信号单元，并且通过荧光信号增强实现半胱氨酸的高选择性检测。

发明内容

本发明提供了一种特异性检测活细胞中的半胱氨酸的长波长发射荧光探针及其制备方法和应用，合成一种新的荧光染料，与识别位点丙烯酰基结合后生成的新型探针可特异性地识别半胱氨酸，合成方法简便，可操作性强，选择性好，灵敏度高，可裸眼识别。

本发明由如下技术方案实现的：一种特异性检测活细胞中的半胱氨酸的长波长发射荧光探针，所述荧光探针分子式为C₂₉H₂₆NO₅ ⁺,该探针化合物名称为2-（4-（丙烯酰氧基）苯基）-4-（2-羧基苯基）-7-（二乙基氨基）苯并吡喃，简称PA-A，该荧光探针的结构式为：。

制备所述的特异性检测活细胞中的半胱氨酸的长波长发射荧光探针的方法，步骤如下：

（1）将间N-二乙胺基氨基苯酚与邻苯二甲酸酐溶解于苯中，130 ℃反应12 h，得白色固体；

（2）将步骤(1)所得白色固体与对羟基苯乙酮加入到甲磺酸的溶液中，90 ℃反应8 h，得到的固体用冰水和高氯酸处理后经过二氯甲烷萃取，最后经过柱层析分离后得到化合物 1，其结构式如下：；

（3）将化合物1与丙烯酰氯在碱性环境三乙胺中，常温反应16 h后分离提纯得到荧光探针化合物PA-A。

步骤（1）中所述间N-二乙胺基氨基苯酚与邻苯二甲酸酐的摩尔比为1:1；每毫摩尔间N-二乙胺基氨基苯酚溶解于10-70 mL苯中。

步骤（2）中所述白色固体与对羟基苯乙酮的摩尔比为1:1-1.5；甲磺酸的用量为每毫摩尔对羟基苯乙酮加入5-10 mL甲磺酸；冰水的用量为每毫摩尔对羟基苯乙酮用50-100mL冰水；高氯酸的用量为每毫摩尔对羟基苯乙酮用3-5 mL高氯酸。

步骤(3)中化合物1与丙烯酰氯的摩尔比为1：1-4；碱性环境三乙胺与化合物1的摩尔比为1：1-4。

步骤(3)中分离提纯的具体方法为：将反应完成后的溶液用二氯甲烷稀释后，水洗三次，干燥后旋转蒸发除去溶剂，将固体用二氯甲烷溶解，用二氯甲烷与甲醇的混合溶剂柱层析分离，得到荧光探针化合物。

特异性检测活细胞中的半胱氨酸的长波长发射荧光探针的应用，所述荧光探针应用于水溶性环境、有机环境或细胞组织环境中半胱氨酸的检测。

本发明的荧光探针与半胱氨酸反应后溶液颜色由浅粉色变成浅紫色，颜色变化较为明显。

本发明还提供了半胱氨酸荧光探针制备方法，其是通过将对应于本发明探针的相应的花色素衍生物与丙烯酰氯在二氯甲烷溶液中室温搅拌16 h而合成制得。

本发明所述的半胱氨酸荧光探针的合成路线如图1所示。

本发明的荧光探针可与半胱氨酸进行作用，产生荧光光谱的变化，从而实现对半胱氨酸的定量检测。

本发明的半胱氨酸荧光探针分别与高半胱氨酸、谷胱甘肽、精氨酸、天冬氨酸、组氨酸、赖氨酸、谷氨酸、色氨酸、苏氨酸、丝氨酸、丙氨酸、酪氨酸、硫离子、次氯酸跟、硫氢根、亚硫酸根、氯离子、碳酸根、溴离子、醋酸根、硫代硫酸根、硫酸根、镁离子、铅离子、铜离子、钡离子、锰离子、锌离子等物质进行作用均不能使探针的荧光光谱发生明显改变；再向这些溶液中加入半胱氨酸后，溶液的荧光光谱变化明显，并且与直接加入半胱氨酸所产生的的变化接近，说明实验中的反应物对检测半胱氨酸没有影响。

本发明的荧光探针通过核磁氢谱滴定反应明确了反应机理，探针的丙烯酸酯与半胱氨酸反应后双键峰逐渐消失，证明的确发生了反应。

本发明的荧光探针成功影像了活细胞中的半胱氨酸。

附图说明

图1是本发明所述检测水溶性环境中生物硫醇的荧光探针的合成路线图；

图2为实施例3中pH = 7.4的PBS缓冲溶液环境下，不同浓度半胱氨酸条件下荧光探针的荧光强度变化；其中最下面的曲线为不加入生物硫醇时的荧光强度曲线，曲线从下往上生物硫醇的浓度依次增加，最上面的曲线浓度为500 μM (50当量) 时生物硫醇的荧光曲线；

图3为本发明实施例3中pH = 7.4时荧光探针在575 nm的荧光强度随着生物硫醇与探针的比值变化的荧光曲线，可以看出半胱氨酸与荧光探针反应的饱和当量数为15当量(150 μM )；

图4为本发明实施例3中pH = 7.4时半胱氨酸在0-36 μM的浓度范围内与荧光探针反应时的线性关系；

图5为本发明实施例3中pH = 7.4时荧光探针与半胱氨酸反应随时间变化的荧光强度变化曲线，可以看出荧光探针与半胱氨酸的最佳反应时间为30 min；

图6为本发明实施例3中pH = 2-12时荧光探针与半胱氨酸在575 nm处的荧光强度变化；

图7为荧光探针半胱氨酸、高半胱氨酸和谷胱甘肽不同当量条件下的反应；

图8(a), 8(b)分别为本发明实施例5中相同条件下，加入不同氨基酸和离子之后荧光探针的荧光强度变化的对比图；

图9为本发明实施例6中探针在氘代试剂中与半胱氨酸的核磁滴定反应氢谱图，反应后的双键氢逐渐消失，机理上说明本探针确实与半胱氨酸发生了反应；

图10为本发明实施例7中探针在细胞中对半胱氨酸的影像，分别为细胞中加入探针、加入硫醇消耗试剂马来酰亚胺( NEM )和探针、加入NEM和探针和外加半胱氨酸时的红光通道、白光通道以及叠加时的共聚焦图像，其中：A为加入探针的图像，B为加入NEM和探针的图像，C为NEM、探针和外加半胱氨酸时的图像，1为红光共聚焦图像，2为白光通道共聚焦图像，3为叠加时的共聚焦图像。

具体实施方式

实施例1：化合物1的制备：将N-二乙胺基苯酚(1.8 g, 10.9 mmol)与邻苯二甲酸酐(1.8 g, 12.2 mmol)在200 mL苯中130 ℃反应12小时抽滤得到白色固体，再将白色固体(0.626 g, 2 mmol)加入到10 mL含有对羟基苯乙酮(0.272 g, 2 mmol)的甲磺酸中，90 ℃反应8小时,冷却后加入至200 mL冰水，加入10 mL高氯酸，用二氯甲烷萃取(50 mL × 3)后干燥并旋转蒸发干溶剂，用二氯甲烷与冰乙酸混合溶剂（体积比为10:1）过柱层析分离得到化合物1，收率：33 %。合成路线如图1所示。

实施例2：本发明所述的检测水溶性环境中生物硫醇的荧光探针的制备：将化合物1(600 mg, 1.45 mmol)与丙烯酰氯(468 μL, 5.8 mmol)、三乙胺(804 μL, 5.8 mmol)在30mL重蒸二氯甲烷中，冰浴搅拌1小时后恢复至室温搅拌16小时。加二氯甲烷30 mL稀释，水洗(50 mL × 3)，干燥后旋转蒸干溶剂，用二氯甲烷与甲醇混合溶剂（体积比为30:1）过柱层析分离得到目标化合物PA-A，收率：50 %。

实施例3：pH=7.4荧光探针与半胱氨酸的滴定实验：在pH = 7.4的PBS缓冲液中，加入初始浓度为2 mM的荧光探针，使得溶液中荧光探针的浓度为10 μM。然后，依次加入不同量的初始浓度为20 mM的生物硫醇，使得溶液中生物硫醇的浓度分别为2 μM、4 μM、6 μM、8μM、10 μM、12 μM、14 μM、16 μM、18 μM、20 μM、24 μM、28 μM、32 μM、36 μM、40 μM、45 μM、50μM、60 μM、80 μM、100 μM、120 μM、140 μM、160 μM、180 μM、200 μM、250 μM、300 μM、500 μM，以不加入半胱氨酸作为对照，静置0.5小时使半胱氨酸与荧光探针充分反应。分别用吸收光谱仪和荧光光谱仪测试半胱氨酸不同浓度条件下吸收和荧光光谱，荧光光谱的激发波长为570 nm，发射波长为626 nm，检测波长为575 nm，结果如图2-5所示。

由图2可知，在一定浓度范围内，随着半胱氨酸的浓度增加，在626 nm波长下的荧光强度逐渐增加，说明荧光探针能够对半胱氨酸进行响应。半胱氨酸从150 μM (15当量)开始到500 μM (50当量)范围内荧光强度不再增加，说明半胱氨酸的浓度在150 μM (15当量)时达到饱和。最上面的曲线浓度为500 μM (50当量) 时半胱氨酸的荧光曲线。

图3为荧光光谱随半胱氨酸与荧光探针的比率变化的荧光变化曲线，从图中可看出半胱氨酸与荧光探针的饱和当量数为15当量 (150 μM )。

图4为荧光光谱随半胱氨酸与荧光探针的比率变化的荧光光谱线性变化关系。由曲线可以看出，半胱氨酸的浓度在0-36 μM范围内呈现良好线性关系。根据IUPAC定义的检出限计算公式(CDL=3Sb / m,式中Sb为标准偏差，m为斜率)，计算可得PA-A对半胱氨酸的检出限为 8.5×10^-8 mol / L。

pH = 7.4荧光探针与半胱氨酸反应随时间荧光强度变化如图5所示。由图可以看出探针能够随时间对半胱氨酸进行响应。

pH = 2-12条件下荧光探针与半胱氨酸的反应如图6所示。由图可知，探针在生理条件的pH = 7-11范围内对半胱氨酸有良好的反应，有望用于生物体内进行检测。

实施例4：荧光探针与生物体环境中同样具有巯基结构的半胱氨酸、高半胱氨酸和谷胱甘肽不同当量条件下的反应：

在实施例3所述的相同测试条件下，荧光探针分别与1、5、10、15、20、30、40、50 当量(即10 μM、50 μM、100 μM、150 μM、200 μM、300 μM、400 μM、500 μM)的半胱氨酸、高半胱氨酸、谷胱甘肽进行反应。反应30 min后测试荧光强度如图7。由图可知，相同浓度下，荧光探针与半胱氨酸反应发生的变化大于荧光探针与高半胱氨酸或谷胱甘肽发生的变化，说明此荧光探针对于硫醇中的半胱氨酸具有较好的选择性。

实施例5：荧光探针检测半胱氨酸的选择性测试：如实施例3所述，在同样测试条件下，向溶液中加入过量的其他生物活性小分子，测试加入不同生物活性小分子之后的荧光光谱，激发波长为570 nm，发射波长为626 nm，检测波长为575 nm。

测试的生物活性小分子有1、半胱氨酸(Cys, 150 μM)；2、高半胱氨酸(Hcy, 150 μM)；3、谷胱甘肽（GSH, 1 mM）；4、苏氨酸(Thr, 150 μM)；5、精氨酸(Arg, 150 μM)；6、天冬酰胺(Asp, 150 μM)；7、丝氨酸(Ser, 150 μM)、8、丙氨酸(Ala, 150 μM)；9、赖氨酸(Lys, 150μM)；10、色氨酸(Trp, 150 μM)；11、谷氨酸(Glu, 150 μM)；12、组氨酸(His, 150 μM)；13、次氯酸钠（10 μM）；14、过氧化氢（10 μM）；15、硫酸根离子（10 μM）；16、氯离子（10 μM）；17、碳酸氢根离子（10 μM）；18、溴离子（10 μM）；19、醋酸根离子（10 μM）；20、亚硫酸根离子（10μ M）；21、硫代硫酸根离子（10 μM）；22、硫酸根离子（10 μM）；23、缩二亚硫酸根离子（10 μM）；24、镁离子（10 μM）；25、铅离子（10 μM）；26、铜离子（10 μM）；27、钡离子（10 μM）；28、锰离子（10 μM）；29、锌离子（10 μM）。

结果表明荧光强度只有半胱氨酸变化明显，其他生物活性小分子不对检测结果产生干扰，可以证明该荧光探针对半胱氨酸具有较高的选择性。再向这些溶液中加入半胱氨酸(150 μM)后，溶液的荧光光谱变化明显，并且与直接加入半胱氨酸所产生的的变化接近，结果如图8(a), 8(b)所示，说明实验中的反应物对检测半胱氨酸没有影响。

实施例6：将探针（5 mg）溶解于氘代乙腈中，加入15当量溶于氘代重水的半胱氨酸，用600 Hz核磁共振波谱分析法分别记录了荧光探针与半胱氨酸反应前、反应30 min以及反应1 h后的核磁氢谱图，见图9。图中方框部分说明本探针的丙烯酸酯键与半胱氨酸反应后的双键氢峰逐渐消失，机理上说明本探针确实与半胱氨酸发生了反应。

实施例7：探针对细胞内半胱氨酸的影像实验：结果见如图10所示，用探针（5 μM）影像细胞后通过共聚焦成像发现细胞变亮，这是探针和细胞内本身存在的半胱氨酸反应后发出的荧光反应。给细胞加以NEM（一种硫醇消耗剂，200 μM）处理，清除细胞内的硫醇后加入探针（5 μM），发现荧光变暗。

给细胞加入NEM（200 μM）消耗细胞内源硫醇后，加入外加的半胱氨酸（400 μM），再加入探针（5 μM）发现细胞重新变亮，说明探针确实在细胞中可以与半胱氨酸发生反应产生荧光，说明探针可以在细胞内与半胱氨酸发生反应。

Claims

1.一种特异性检测活细胞中的半胱氨酸的长波长发射荧光探针，其特征在于：所述荧光探针分子式为C₂₉H₂₆NO₅ ⁺,该探针化合物名称为2-（4-（丙烯酰氧基）苯基）-4-（2-羧基苯基）-7-（二乙基氨基）苯并吡喃，简称PA-A，该荧光探针的结构式为：。

2.制备权利要求1所述的特异性检测活细胞中的半胱氨酸的长波长发射荧光探针的方法，其特征在于：步骤如下：

（2）将步骤(1)所得白色固体与对羟基苯乙酮加入到甲磺酸的溶液中，90 ℃反应8 h，得到的固体用冰水和高氯酸处理后经过二氯甲烷萃取，最后经过柱层析分离后得到化合物1，其结构式如下：；

3.根据权利要求2所述的制备特异性检测活细胞中的半胱氨酸的长波长发射荧光探针的方法，其特征在于：步骤（1）中所述间N-二乙胺基氨基苯酚与邻苯二甲酸酐的摩尔比为1:1；每毫摩尔间N-二乙胺基氨基苯酚溶解于10-70 mL苯中。

4.根据权利要求2所述的制备特异性检测活细胞中的半胱氨酸的长波长发射荧光探针的方法，其特征在于：步骤（2）中所述白色固体与对羟基苯乙酮的摩尔比为1:1-1.5；甲磺酸的用量为每毫摩尔对羟基苯乙酮加入5-10 mL甲磺酸；冰水的用量为每毫摩尔对羟基苯乙酮用50-100 mL冰水；高氯酸的用量为每毫摩尔对羟基苯乙酮用3-5 mL高氯酸。

5.根据权利要求2所述的制备特异性检测活细胞中的半胱氨酸的长波长发射荧光探针的方法，其特征在于：步骤(3)中化合物1与丙烯酰氯的摩尔比为1：1-4；碱性环境三乙胺与化合物1的摩尔比为1：1-4。

6.根据权利要求2所述的制备特异性检测活细胞中的半胱氨酸的长波长发射荧光探针的方法，其特征在于：步骤(3)中分离提纯的具体方法为：将反应完成后的溶液用二氯甲烷稀释后，水洗三次，干燥后旋转蒸发除去溶剂，将固体用二氯甲烷溶解，用二氯甲烷与甲醇的混合溶剂柱层析分离，得到荧光探针化合物。

7.权利要求1所述的特异性检测活细胞中的半胱氨酸的长波长发射荧光探针的应用，其特征在于：所述荧光探针应用于水溶性环境、有机环境或细胞组织环境中半胱氨酸的检测。