CN110554188A - 一种佐剂吸附组分疫苗含量的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，涉及一种佐剂吸附组分疫苗含量的检测方法。本发明解决现有的佐剂吸附组分疫苗含量检测方法灵敏度低的问题。该检测方法在佐剂吸附组分疫苗中加入吐温‑80溶液，经解吸附处理消除佐剂影响，通过标准曲线法，测定疫苗各组分含量。本方法具有检测灵敏度高、重复性好的特点。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种佐剂吸附组分疫苗含量的检测方法。
背景技术
在组分疫苗的质量控制中，对疫苗各组分的定量是重要质控项目之一。目前，组分疫苗中各组分的定量检测方法包括：
化学显色法：
疫苗中某些组分在特定波长范围内具有光吸收，或经化学处理后，形成具有光吸收的物质，其光吸收程度与含量有相关关系，可用于含量检测。例如，A群C群脑膜炎球菌多糖结合疫苗中的C群多糖，唾液酸是其有效成分之一，采用间苯二酚对C群脑膜炎球菌多糖中唾液酸抽提后，在585nm处有最大吸光值。该法的局限性在于，大部分多价疫苗中的各组分化学性质相近，寻找针对其中一个组分的化学处理方法比较困难。
色谱分析法：
阴离子色谱法用于多种单糖、双糖、寡糖、多糖的分析。例如，A群C群脑膜炎球菌多糖疫苗中的A群多糖，经酸水解处理后，产生6-磷酸甘露糖胺单体，采用高效阴离子交换色谱-脉冲安培检测法测定其含量。该法的局限性在于，实现多价疫苗中各组分的基线分离困难，色谱条件复杂，对试剂和环境要求高。
酶联免疫吸附法：
双抗体夹心ELISA法常用于抗原的定量检测。A、C、W135和Y群四价脑膜炎球菌多糖疫苗中各血清群多糖蛋白结合物含量检测采用双抗体夹心定量ELISA法。此方法需要制备各群多糖特异性单抗作为捕获抗体。单抗制备成本较高，产量较低，很难适应规模化检测需要。
免疫火箭电泳法：
免疫火箭电泳通过参照已知浓度的多糖在相同凝胶中的迁移率,对待测的不同浓度的多糖的迁移速率进行线性回归分析,可以初步计算多糖含量。该法操作过程复杂，是粗略测定多糖含量的一种方法。
速率比浊法：
速率比浊法是一种免疫化学方法，用于组分疫苗各组分含量的检测。该方法在抗体过量存在的条件下，抗原抗体形成复合物聚集体的速率与体系中存在的抗原量成一定的比例关系。利用该原理可检测混合物中某一抗原的含量。速率比浊法操作简便快捷，自动化程度高，不同的抗原可采用相同参数设置进行检测，可适应规模化检测的需要。
采用速率比浊法检测佐剂吸附组分疫苗含量，目前通用的方法是直接经解吸附处理，然后测定各组分含量。由于佐剂吸附疫苗抗原量较少，对检验方法的灵敏度要求较高。
因此，为了解决现有方法中存在的技术问题，本发明提供一种全新的检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种佐剂吸附组分疫苗含量的检测方法。
本发明的方法可以有效的解决现有佐剂吸附组分疫苗含量检测方法灵敏度低、检测结果波动大的问题。
为了实现上述目的，本发明采取的策略为：在佐剂吸附组分疫苗中加入吐温-80溶液，经解吸附处理消除佐剂影响，通过标准曲线法，测定疫苗各组分含量。
本发明所述的检测方法，包括以下步骤：
步骤一：佐剂吸附疫苗中加入吐温-80溶液；
步骤二：用碱将疫苗组分与佐剂解吸附，再用酸中和；
步骤三：疫苗中各组分单独配制定标工作液；
步骤四：定标工作液经步骤一和步骤二相同处理；
步骤五：经处理的定标工作液稀释成一系列浓度梯度，作为标准曲线；
步骤六：标准曲线与检验试剂反应，以各组分含量为横坐标，以响应值为纵坐标，绘制标准曲线；
步骤七：疫苗与检验试剂反应，通过标准曲线测定疫苗各组分的含量。
优选的是，所述步骤一中，疫苗中加入吐温-80溶液的体积不超过总体积的1％。
优选的是，所述步骤一中，疫苗中加入吐温-80的终浓度不超过1％，优选0.01％。
优选的是，所述步骤四中，定标工作液中加入吐温-80溶液的体积不超过总体积的1％。
优选的是，所述步骤四中，定标工作液中加入吐温-80的终浓度不超过1％，优选0.01％。
其中，步骤一中，佐剂吸附疫苗为：磷酸铝、氢氧化铝或硫酸铝钾吸附的DNA疫苗、组份疫苗、结合疫苗、联合疫苗、重组疫苗、病毒载体疫苗等。
其中，步骤二中，碱为氢氧化钠溶液；
酸为：柠檬酸；
其中，步骤六中，检验试剂为：与疫苗组分匹配的血清或抗体；
最优选的，本发明的检测方法，包括以下步骤：
(1)取肺炎球菌结合物495μl，依次加入1％吐温-80溶液5μl、1mol/L氢氧化钠溶液15μl、1mol/L柠檬酸溶液6μl，每一步都充分混匀，多糖浓度为20μg/ml，以此作为定标品工作液；
(2)用稀释液将定标品工作液稀释成多糖浓度为5.5μg/ml、4.5μg/ml、3.5μg/ml、2.5μg/ml的系列浓度梯度溶液，作为标准曲线；
(3)标准曲线与结合物匹配的血清反应，以多糖含量为横坐标，以响应值为纵坐标，绘制标准曲线；
(4)
取肺炎球菌结合疫苗500μl，依次加入1％吐温-80溶液5μl、1mol/L氢氧化钠溶液15μl、1mol/L柠檬酸溶液6μl，每一步都充分混匀，随后与血清反应，通过标准曲线测定疫苗各组分的含量。
最优选的，本发明的检测方法，包括以下步骤：
(1)取肺炎球菌结合物495μl，依次加入1％吐温-80溶液5μl、1mol/L氢氧化钠溶液15μl、1mol/L柠檬酸溶液6μl，每一步都充分混匀，多糖浓度为20μg/ml；
(2)用稀释液将上述结合物稀释至多糖浓度为4.2μg/ml；
(3)取肺炎球菌结合疫苗500μl，依次加入1％吐温-80溶液5μl、1mol/L氢氧化钠溶液15μl、1mol/L柠檬酸溶液6μl，每一步都充分混匀，疫苗中各型结合物多糖浓度为4.2μg/ml；
(4)结合物和疫苗同时与血清反应，比较两者的响应值(疫苗响应值与结合物响应值的比值)。
本发明的方法可以有效的解决现有方法中存在的问题，有效的改善佐剂吸附组分疫苗含量检测方法灵敏度低、检测结果波动大的问题。本发明提高检测结果的准确度，稳定性，精密度，缩短检测的时间，降低成本。
附图说明
图1为本发明实施例1中肺炎球菌结合疫苗中1型肺炎球菌结合物标准曲线对比图；
图2为本发明实施例2中肺炎球菌结合疫苗中6B型肺炎球菌结合物标准曲线对比图；
图3为本发明实施例3中肺炎球菌结合疫苗中12F型肺炎球菌结合物标准曲线对比图。
具体实施方式
通过以下具体实施例对本发明作进一步的说明，但不作为本发明的限制使用。
实施例1、肺炎球菌结合疫苗中1型肺炎球菌多糖含量的检测
1.取1型肺炎球菌结合物495μl，依次加入1％吐温-80溶液5μl、1mol/L氢氧化钠溶液15μl、1mol/L柠檬酸溶液6μl，每一步都充分混匀。多糖浓度为20μg/ml，以此作为定标品工作液1。
2.用稀释液将定标品工作液1稀释成多糖浓度为5.5μg/ml、4.5μg/ml、3.5μg/ml、2.5μg/ml的系列浓度梯度溶液，作为标准曲线1。
3.取1型肺炎球菌结合物500μl，依次加入1mol/L氢氧化钠溶液15μl、1mol/L柠檬酸溶液6μl，每一步都充分混匀。多糖浓度为20μg/ml，以此作为定标品工作液2。
4.用稀释液将定标品工作液2稀释成多糖浓度为5.5μg/ml、4.5μg/ml、3.5μg/ml、2.5μg/ml的系列浓度梯度溶液，作为标准曲线2。
5.取肺炎球菌结合疫苗500μl，依次加入1％吐温-80溶液5μl、1mol/L氢氧化钠溶液15μl、1mol/L柠檬酸溶液6μl，每一步都充分混匀。
6.图1为1型肺炎球菌结合物标准曲线对比图。
7.从图中可知，标准曲线1：R＝0.9986，线性回归方程为y＝7.174x-4.1335；标准曲线2：R＝0.9976，线性回归方程为y＝2.6745x+5.4007。
8.表1为两条标准曲线斜率比较，以及疫苗中多糖含量检测结果比较。
9.从表中可知，标准曲线1的斜率明显高于标准曲线2的斜率，表明标准曲线1的灵敏度更高。两条标准曲线检测疫苗中多糖含量的结果均符合检定标准。
表1
实施例2、肺炎球菌结合疫苗中6B型肺炎球菌多糖含量的检测
1.取6B型肺炎球菌结合物495μl，依次加入1％吐温-80溶液5μl、1mol/L氢氧化钠溶液15μl、1mol/L柠檬酸溶液6μl，每一步都充分混匀。多糖浓度为40μg/ml，以此作为定标品工作液1。
2.用稀释液将定标品工作液1稀释成多糖浓度为11μg/ml、9μg/ml、7μg/ml、5μg/ml的系列浓度梯度溶液，作为标准曲线1。
3.取6B型肺炎球菌结合物500μl，依次加入1mol/L氢氧化钠溶液15μl、1mol/L柠檬酸溶液6μl，每一步都充分混匀。多糖浓度为40μg/ml，以此作为定标品工作液2。
4.用稀释液将定标品工作液2稀释成多糖浓度为11μg/ml、9μg/ml、7μg/ml、5μg/ml的系列浓度梯度溶液，作为标准曲线2。
5.实验步骤同实施例1中步骤5-6。
6.图2为6B型肺炎球菌结合物标准曲线对比图。
7.从图中可知，标准曲线1：R＝0.9968，线性回归方程为y＝7.5788x-24.164；标准曲线2：R＝0.9861，线性回归方程为y＝1.0305x-3.5215。
8.表1为两条标准曲线斜率比较，以及疫苗中多糖含量检测结果比较。
9.从表中可知，标准曲线1的斜率明显高于标准曲线2的斜率，表明标准曲线1的灵敏度更高。两条标准曲线检测疫苗中多糖含量的结果均符合检定标准。
实施例3、肺炎球菌结合疫苗中12F型肺炎球菌多糖含量的检测
1.实验步骤同实施例1中步骤1-6。
2.图2为12F型肺炎球菌结合物标准曲线对比图。
3.从图中可知，标准曲线1：R＝0.9979，线性回归方程为y＝4.4405x-0.0833；标准曲线2：R＝0.9832，线性回归方程为y＝2.9325x+2.7837。
4.表1为两条标准曲线斜率比较，以及疫苗中多糖含量检测结果比较。
从表中可知，标准曲线1的斜率明显高于标准曲线2的斜率，表明标准曲线1的灵敏度更高。两条标准曲线检测疫苗中多糖含量的结果均符合检定标准。
实施例4、筛选实验
本发明的核心点在于，在佐剂吸附组分疫苗中加入吐温-80溶液。
1、在筛选过程中，试图将吐温溶液加入缓冲体系中，发现，吐温在缓冲体系中发挥的作用不明显。改变方案后，在疫苗中加入吐温溶液，并显示出实施例1-3中的明显优化效果。最终优选在佐剂吸附组分疫苗中加入吐温-80溶液。
2、在筛选过程中，将吐温-80与琥珀酸混合后作为稳定剂加入疫苗中，发现添加琥珀酸对检验方法没有进一步优化作用。本着简化反应体系的原则，最终优选吐温-80溶液。
3、在筛选过程中，还对吐温-80的终浓度进行筛选。
(1)取肺炎球菌结合物495μl，依次加入1％吐温-80溶液5μl、1mol/L氢氧化钠溶液15μl、1mol/L柠檬酸溶液6μl，每一步都充分混匀，多糖浓度为20μg/ml；
(2)用稀释液将上述结合物稀释至多糖浓度为4.2μg/ml；
(3)取肺炎球菌结合疫苗500μl，依次加入1％吐温-80溶液5μl、1mol/L氢氧化钠溶液15μl、1mol/L柠檬酸溶液6μl，每一步都充分混匀，疫苗中各型结合物多糖浓度为4.2μg/ml；
(4)结合物和疫苗同时与血清反应，比较两者的响应值(疫苗响应值与结合物响应值的比值)。
表2为疫苗中加入不同浓度吐温-80溶液后，相同浓度疫苗与结合物响应值比较结果。
表2
通过比较，最终优选终浓度最低的0.01％吐温-80溶液。
Claims (7)
1.一种佐剂吸附组分疫苗含量的检测方法，其特征在于，在疫苗中加入吐温-80作为稳定剂，经解吸附处理消除佐剂影响，通过标准曲线法，测定疫苗各组分的含量。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一：佐剂吸附疫苗中加入吐温-80溶液；
步骤二：用碱将疫苗组分与佐剂解吸附，再用酸中和；
步骤三：疫苗中各组分单独配制定标工作液；
步骤四：定标工作液经步骤一和步骤二相同处理；
步骤五：经处理的定标工作液稀释成一系列浓度梯度，作为标准曲线；
步骤六：标准曲线与检验试剂反应，以各组分含量为横坐标，以响应值为纵坐标，绘制标准曲线；
步骤七：疫苗与检验试剂反应，通过标准曲线测定疫苗各组分的含量。
3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，检验方法适用对象为佐剂吸附组分疫苗。
4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，检测方法使用的是标准曲线法。
5.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述步骤一、步骤四中，疫苗中加入吐温-80溶液的体积不超过总体积的1％。
6.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述步骤一、步骤四中，疫苗中加入吐温-80的终浓度不超过1％。
7.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，
(1)取肺炎球菌结合物495μl，依次加入1％吐温-80溶液5μl、1mol/L氢氧化钠溶液15μl、1mol/L柠檬酸溶液6μl，每一步都充分混匀，多糖浓度为20μg/ml，以此作为定标品工作液；
(2)用稀释液将定标品工作液稀释成多糖浓度为5.5μg/ml、4.5μg/ml、3.5μg/ml、2.5μg/ml的系列浓度梯度溶液，作为标准曲线；
(3)标准曲线与结合物匹配的血清反应，以多糖含量为横坐标，以响应值为纵坐标，绘制标准曲线；
(4)取肺炎球菌结合疫苗500μl，依次加入1％吐温-80溶液5μl、1mol/L氢氧化钠溶液15μl、1mol/L柠檬酸溶液6μl，每一步都充分混匀，随后与血清反应，通过标准曲线测定疫苗各组分的含量。
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