CN110554081A - 一种重组蛋白的等电聚焦电泳等电点检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种重组蛋白的等电聚焦电泳等电点检测方法，包括如下步骤：S1、材料准备；将实验所用的各类材料准备妥当，以保证试验顺利进行；S2、试剂准备；实验所需试剂，待检样品与对照品，需及时备好，以供实验使用；S3、仪器准备；实验仪器提前清洗完毕后备好；S4、配制试剂；将实验无法直接使用的试剂，进行人工配制，以供使用，保证实验的顺利进行；S5、检验方法；主要以电泳作为方法对其检验；S6、分析判断结果；通过对比对照品分析判断出结果；本发明涵盖了材料、试剂、仪器的准备，试剂的合理配制，科学的检验方法，严谨的分析判定，做到了将重组蛋白进行等电聚焦电泳等电点检测，结果科学合理，具有说服力。
Description
技术领域
本发明属于重组蛋白的等电聚焦电泳等电点检测技术领域，具体为一种重组蛋白的等电聚焦电泳等电点检测方法。
背景技术
等电聚焦(Isoelectric focμsing，简称IEF)是六十年代中期出现的新技术。近年来等电聚焦技术有了新的进展，已迅速发展成为一门成熟的近代生化实验技术。由于其分辨力高，重复性好，样品容量大，操作简便迅速，在生物化学、分子生物学及临床医学研究中得到广泛的应用。
因此，我们在2015年版《中国药典》三部等电聚焦电泳法第2法基础上开发了SΜBS-4的等电聚焦电泳法，为改善该方法的分离度和重复性，现对原有等电聚焦电泳方法进行优化和验证，拟确立一种更稳定可靠的分析方法，用于后期重组人红细胞生成素(Fc)融合蛋白原液(rhEPO-Fc)等电点的质控。
虽然已经建立聚丙烯酰胺等电聚焦电泳分析方法对该蛋白进行等电点检测，但该方法的分辨率还有待进一步提高，中国药典2015年版中收录的“重组人促红素注射液(CHO细胞)”等电聚焦检验中凝胶配方含有尿素，所以在重组人红细胞生成素质量控制体系研究中亦比较了等电聚焦配方采用添加尿素和不添加尿素进行等电聚焦电泳，结果添加尿素各条带分辨率明显改善，故我们拟采用等电聚焦配方添加尿素，并对该方法进行优化及验证，以期建立一种分辨率更好的聚丙烯酰胺等电聚焦电泳(IEF)方法用于SΜBS-4原液等电点的质控。
发明内容
本发明的目的在于：为了解决重组蛋白的等电聚焦电泳等电点检测的问题，提供一种重组蛋白的等电聚焦电泳等电点检测方法。
本发明采用的技术方案如下：
一种重组蛋白的等电聚焦电泳等电点检测方法，包括如下步骤：
S1、材料准备：将实验所用的各类材料准备妥当，以保证试验顺利进行；
S2、试剂准备：实验所需试剂，待检样品与对照品，需及时备好，以供实验使用；
S3、仪器准备：实验仪器提前清洗完毕后备好；
S4、配制试剂：将实验无法直接使用的试剂，进行人工配制，以供使用，保证实验的顺利进行；
S5、检验方法：主要以电泳作为方法对其检验；
S6、分析判断结果：通过对比对照品分析判断出结果；
其中，所述S1材料准备，其具体步骤如下：
S101、准备聚丙烯薄膜：即PAG fim(聚丙烯薄膜，GE Healthare)；
S102、手动裁剪电极条：电极条采用手动裁剪，可以按照自己的需要裁剪；
S103、手动裁剪上样纸：上样纸需要手动裁剪，来确保上样的顺利进行；
S104、手动裁剪干胶膜：手动裁剪干胶膜以备后用。
其中，所述S2试剂准备，其具体步骤如下：
S201、准备待检样品及对照品：先将待检样品与工作对照品准备好，以备实验；
S202、准备各类实验试剂：准备丙烯酰胺(电泳级)；甲叉双丙烯酰胺(电泳级)；过硫酸氨；三氯乙酸；硫酸铵；磷酸(85％)；氢氧化钠；甲醇；无水乙醇；考马斯亮蓝G250；甘油；冰醋酸；疏水硅烷；TEMED；两性载体Ampholytes(pH3.0～10.0、pH4.0～6.5)；Marker(3-10)；超纯水等。
其中所述S3仪器准备，其具体步骤如下：
S301、准备等电聚焦装置：等电聚焦装置(Mμltiphor II多功能电泳***，GE；小型冷却水循环装置，EYELA)；
S302、准备激光扫描光密度计：Bio-Rad激光扫描光密度计(GS800)；
S303、准备水平震荡仪；
其中所述S4配制试剂，其具体步骤如下：
S401、配制30％丙烯酰胺溶液：称取58.2g丙烯酰胺，1.8g甲叉双丙烯酰胺，用150ml纯水溶解，然后定容至200ml，0.22μm膜过滤后置5±3℃避光保存；
S402、配制固定液：三氯乙酸母液：称取100g的三氯乙酸加100mL的水混合，使用前混匀；20％三氯乙酸：取20mL母液与80mL的水混合(现用现配)；
S403、配制染色液：染色储备液：称取125g硫酸铵，用400ml纯水溶解，作为溶液1；称取1.0g考马斯亮蓝G250，加纯水20ml搅拌，加入20g磷酸，溶解后与溶液1混合，定容至1000ml，使用前充分摇匀；工作染色液：取60ml染色储备液，与30ml甲醇混匀，临用新配；
S404、配制10％APS：取0.1g分装好的过硫酸氨一支，1ml超纯水溶解，现用现配(或5±3℃保存1周内使用)；
S405、配制电极液：正极液：0.5mol/L磷酸溶液，量取57.6mL磷酸溶于500mL水，定容至1000mL，0.22μm膜过滤，常温保存；负极液：0.2mol/L氢氧化钠溶液，称取8g氢氧化钠，溶于500mL水，定容至1000mL，0.22μm膜过滤，常温保存；
S406、配制80％甘油：量取甘油160ml，加纯水稀释至200ml，0.45μm膜过滤，常温保存；
S407、配制脱色液：准备250ml 95％乙醇，80ml冰醋酸，670ml超纯水；
S408、配制干胶脱水液：准备无水乙醇200ml，冰醋酸50ml，甘油50ml，100ml超纯水混匀，定容至500ml。
其中所述S5检验方法，其具体步骤如下:
S501、制胶架组装：取洁净制胶玻璃板放在干净的擦拭布上，取0.5mL疏水硅烷均匀涂抹在带Μ型胶条玻璃板正面上，室温晾干；在平面玻璃板一面加0.5ml水湿润，取制胶胶片，疏水面贴玻璃板，用手动滚压器使疏水面与润湿玻璃板紧贴并除尽气泡，用吸水纸清理多余的水份；用制胶夹左右各一个，下面两个对称固定两块玻璃板(室温过高时置于5±3℃预冷)；
S502、胶溶液配制及灌装：尿素母液：称取10.8g尿素，直接加17.5mL超纯水溶解至24.6ml，0.22μm膜过滤，待用；配胶及灌装：3.3ml 30％聚丙烯酰胺溶液、12.3ml尿素母液、1.2ml 80％甘油、0.275ml pH4.0～6.5电解质、0.825ml pH3.0～10.0电解质和100μl 10％APS混匀后再加20μl TEMED混匀，用5ml移液枪吸取混合液灌入组装好的制胶模具缝隙之间，小心避免气泡产生(若有气泡产生，用手轻轻敲打玻璃板，排出气泡)，室温放置1.5h凝固完全后(温度过低时，置于25℃环境凝固2.5小时)，可立即使用或用保鲜膜包好置于5±3℃保存，2～3天内使用；
S503、预电泳：打开小型冷却水循环装置开关至温度冷却为16℃后，取1mL超纯水置于电泳板上，取胶对称贴在电泳版3-13处，排除气泡；取电极条(比胶短)置于3和13的横线处，在负极方向加适量(1mL左右)负极液至电极条湿润即可，在正级方向加适量(1mL左右)正级液至电极条湿润即可。盖上电泳槽盖，打开电泳电源装置的开关设置700V，24mA，8W，预电泳60min；
S504、样品处理：取一支对照品用250ml超纯水溶解即浓度为2mg/ml的对照品；样品稀释至2mg/ml；
S505、点样：在凝胶上离阴极6cm处摆放上样纸片(用擦镜纸裁剪成约0.5X1.0cm方块)，点样Marker；在凝胶上离阴极1cm处摆放上样纸片，点样样品及工作对照品，点样量20μg(体积10μl)；
S506、电泳：上样电泳：设置500V，8mA，8W，温度10～20℃(一般16℃)，电泳20min。结束后去掉上样纸片；正式电泳：设置2200V，14mA，18W，180min+2500V，14mA，20W，10min，温度10～20℃(一般16℃)；
S507、染色脱色：电泳完毕后，取胶片，胶面朝上，置固定液中，室温10rpm振荡固定20min，完毕后用清水振荡清洗2min，然后在染色液中振荡染色1小时至条带清晰显现(冬天温度过低时，适当延长染色时间直至条带清晰显现)，终止染色时应先用清水漂洗多余染色液，将胶片置于清水中，用普通纸巾轻轻擦拭去除浮色(擦拭时应保持胶片泡在水中保持湿润以免擦破胶面)，置脱色液中去除背景；
S508、扫胶：GS800扫描分析等电点；
S509、制干胶：将胶片置于少量的干胶脱水液振荡5min后放在玻璃板上，贴上干胶膜，四周用透明胶封住，置于通风橱内自然晾干。
其中，所述S502胶溶液配制及灌装中，若有气泡产生，用手轻轻敲打玻璃板，排出气泡；温度过低时，置于25℃环境凝固2.5小时。
其中，所述S503预电泳中，设置700V，24mA，8W；电泳过程中应关注电压等相关参数的变化情况，电泳结束时，电压应该达到设定的上限电压。
其中，所述S506电泳中，上样电泳设置为500V，8mA，8W；正式电泳一般整块胶设置为2200V，14mA，18W，180min+2500V，14mA，20W，10min。
其中，所述S507染色脱色中，冬天温度过低时，适当延长染色时间直至条带清晰显现；擦拭时应保持胶片泡在水中保持湿润以免擦破胶面。
其中，所述S6分析判定结果中，每个样品组必须含有至少一个对照品，各泳道应垂直不扩散且分离较好；对照品各条带应分布在pI4.6～6.8范围内，样品主成分迁移距离应与对照品一致。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
1、本发明提供一种重组蛋白的等电聚焦电泳等电点检测方法，涵盖了材料、试剂、仪器的准备，试剂的合理配制，科学的检验方法，严谨的分析判定，做到了将重组蛋白进行等电聚焦电泳等电点检测，结果科学合理，具有说服力。
2、本发明所述所述材料准备：准备聚丙烯薄膜；即PAG fim(聚丙烯薄膜，GEHealthare)；手动裁剪电极条、上样纸、干胶膜，以确保所需材料按照自己的需要裁剪，可以更有效的完成实验。
3、本发明进一步所述仪器准备：准备等电聚焦装置(Mμltiphor II多功能电泳***，GE；小型冷却水循环装置，EYELA)；准备激光扫描光密度计；Bio-Rad激光扫描光密度计(GS800)；准备水平震荡仪，仪器提前清洗检查完毕，为实验做好准备。
4、本发明进一步所述试剂准备，准备待检样品及对照品：先将待检样品与工作对照品准备好，以备实验；再准备各类实验试剂；准备丙烯酰胺(电泳级)；甲叉双丙烯酰胺(电泳级)；过硫酸氨；三氯乙酸；硫酸铵；磷酸(85％)；氢氧化钠；甲醇；无水乙醇；考马斯亮蓝G250；甘油；冰醋酸；疏水硅烷；TEMED；两性载体Ampholytes(pH3.0～10.0、pH4.0～6.5)；Marker(3-10)；超纯水等，种类备齐，以确保实验能顺利进行。
5、本发明进一步所述配制试剂，配制30％丙烯酰胺溶液：称取58.2g丙烯酰胺，1.8g甲叉双丙烯酰胺，用150ml纯水溶解，然后定容至200ml，0.22μm膜过滤后置5±3℃避光保存；配制固定液；三氯乙酸母液：称取100g的三氯乙酸加100mL的水混合，使用前混匀；20％三氯乙酸：取20mL母液与80mL的水混合(现用现配)；配制染色液；染色储备液：称取125g硫酸铵，用400ml纯水溶解，作为溶液1；称取1.0g考马斯亮蓝G250，加纯水20ml搅拌，加入20g磷酸，溶解后与溶液1混合，定容至1000ml，使用前充分摇匀；工作染色液：取60ml染色储备液，与30ml甲醇混匀，临用新配；配制10％APS；取0.1g分装好的过硫酸氨一支，1ml超纯水溶解，现用现配(或5±3℃保存1周内使用)；配制电极液；正极液：0.5mol/L磷酸溶液，量取57.6mL磷酸溶于500mL水，定容至1000mL，0.22μm膜过滤，常温保存；负极液：0.2mol/L氢氧化钠溶液，称取8g氢氧化钠，溶于500mL水，定容至1000mL，0.22μm膜过滤，常温保存；配制80％甘油；量取甘油160ml，加纯水稀释至200ml，0.45μm膜过滤，常温保存；配制脱色液；准备250ml 95％乙醇，80ml冰醋酸，670ml超纯水；配制干胶脱水液；准备无水乙醇200ml，冰醋酸50ml，甘油50ml，100ml超纯水混匀，定容至500ml，试剂配制有严格的比例和取量，科学合理的配制出实验所需试剂。
6、本发明进一步所述检验方法，制胶架组装：取洁净制胶玻璃板放在干净的擦拭布上，取0.5mL疏水硅烷均匀涂抹在带Μ型胶条玻璃板正面上，室温晾干；在平面玻璃板一面加0.5ml水湿润，取制胶胶片，疏水面贴玻璃板，用手动滚压器使疏水面与润湿玻璃板紧贴并除尽气泡，用吸水纸清理多余的水份；用制胶夹左右各一个，下面两个对称固定两块玻璃板(室温过高时置于5±3℃预冷)；胶溶液配制及灌装：尿素母液：称取10.8g尿素，直接加17.5mL超纯水溶解至24.6ml，0.22μm膜过滤，待用；配胶及灌装：3.3ml 30％聚丙烯酰胺溶液、12.3ml尿素母液、1.2ml 80％甘油、0.275ml pH4.0～6.5电解质、0.825ml pH3.0～10.0电解质和100μl 10％APS混匀后再加20μl TEMED混匀，用5ml移液枪吸取混合液灌入组装好的制胶模具缝隙之间，小心避免气泡产生(若有气泡产生，用手轻轻敲打玻璃板，排出气泡)，室温放置1.5h凝固完全后(温度过低时，置于25℃环境凝固2.5小时)，可立即使用或用保鲜膜包好置于5±3℃保存，2～3天内使用；预电泳：打开小型冷却水循环装置开关至温度冷却为16℃后，取1mL超纯水置于电泳板上，取胶对称贴在电泳版3-13处，排除气泡；取电极条(比胶短)置于3和13的横线处，在负极方向加适量(1mL左右)负极液至电极条湿润即可，在正级方向加适量(1mL左右)正级液至电极条湿润即可。盖上电泳槽盖，打开电泳电源装置的开关设置700V，24mA，8W，预电泳60min；样品处理；取一支对照品用250ml超纯水溶解即浓度为2mg/ml的对照品；样品稀释至2mg/ml；点样：在凝胶上离阴极6cm处摆放上样纸片(用擦镜纸裁剪成约0.5X1.0cm方块)，点样Marker；在凝胶上离阴极1cm处摆放上样纸片，点样样品及工作对照品，点样量20μg(体积10μl)；电泳：上样电泳：设置500V，8mA，8W，温度10～20℃(一般16℃)，电泳20min。结束后去掉上样纸片；正式电泳：设置2200V，14mA，18W，180min+2500V，14mA，20W，10min)，温度10～20℃(一般16℃)；染色脱色：电泳完毕后，取胶片，胶面朝上，置固定液中，室温10rpm振荡固定20min，完毕后用清水振荡清洗2min，然后在染色液中振荡染色1小时至条带清晰显现(冬天温度过低时，适当延长染色时间直至条带清晰显现)，终止染色时应先用清水漂洗多余染色液，将胶片置于清水中，用普通纸巾轻轻擦拭去除浮色(擦拭时应保持胶片泡在水中保持湿润以免擦破胶面)，置脱色液中去除背景；扫胶：GS800扫描分析等电点；制干胶：将胶片置于少量的干胶脱水液振荡5min后放在玻璃板上，贴上干胶膜，四周用透明胶封住，置于通风橱内自然晾干；主要通过电泳来检验，以达到实验目的。
7、本发明进一步所述分析判定结果，每个样品组必须含有至少一个对照品，各泳道应垂直不扩散且分离较好；对照品各条带应分布在pI4.6～6.8范围内，样品主成分迁移距离应与对照品一致，对样品与对照品的限制条件有利于更好的进行对比。
附图说明
图1为本发明的流程示意简图；
图2为本发明中材料准备流程示意简图；
图3为本发明中试剂准备流程示意简图；
图4为本发明中仪器准备流程示意简图；
图5为本发明中配制试剂流程示意简图；
图6为本发明中检验方法流程示意简图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例一，参照图1～2，一种重组蛋白的等电聚焦电泳等电点检测方法，包括如下步骤：
S1、材料准备：将实验所用的各类材料准备妥当，以保证试验顺利进行；
S2、试剂准备：实验所需试剂，待检样品与对照品，需及时备好，以供实验使用；
S3、仪器准备：实验仪器提前清洗完毕后备好；
S4、配制试剂：将实验无法直接使用的试剂，进行人工配制，以供使用，保证实验的顺利进行；
S5、检验方法：主要以电泳作为方法对其检验；
S6、分析判断结果：通过对比对照品分析判断出结果；
其中，所述S1材料准备，其具体步骤如下：
S101、准备聚丙烯薄膜：即PAG fim(聚丙烯薄膜，GE Healthare)；
S102、手动裁剪电极条：电极条采用手动裁剪，可以按照自己的需要裁剪；
S103、手动裁剪上样纸：上样纸需要手动裁剪，来确保上样的顺利进行；
S104、手动裁剪干胶膜：手动裁剪干胶膜以备后用。
实施例二，参照图1～3，一种重组蛋白的等电聚焦电泳等电点检测方法，包括如下步骤：
S1、材料准备：将实验所用的各类材料准备妥当，以保证试验顺利进行；
S2、试剂准备：实验所需试剂，待检样品与对照品，需及时备好，以供实验使用；
S3、仪器准备：实验仪器提前清洗完毕后备好；
S4、配制试剂：将实验无法直接使用的试剂，进行人工配制，以供使用，保证实验的顺利进行；
S5、检验方法：主要以电泳作为方法对其检验；
S6、分析判断结果：通过对比对照品分析判断出结果；
其中，所述S1材料准备，其具体步骤如下：
S101、准备聚丙烯薄膜：即PAG fim(聚丙烯薄膜，GE Healthare)；
S102、手动裁剪电极条：电极条采用手动裁剪，可以按照自己的需要裁剪；
S103、手动裁剪上样纸：上样纸需要手动裁剪，来确保上样的顺利进行；
S104、手动裁剪干胶膜：手动裁剪干胶膜以备后用；
其中，所述S2试剂准备，其具体步骤如下：
S201、准备待检样品及对照品：先将待检样品与工作对照品准备好，以备实验；
S202、准备各类实验试剂：准备丙烯酰胺(电泳级)；甲叉双丙烯酰胺(电泳级)；过硫酸氨；三氯乙酸；硫酸铵；磷酸(85％)；氢氧化钠；甲醇；无水乙醇；考马斯亮蓝G250；甘油；冰醋酸；疏水硅烷；TEMED；两性载体Ampholytes(pH3.0～10.0、pH4.0～6.5)；Marker(3-10)；超纯水。
实施例三，参照图1～4，一种重组蛋白的等电聚焦电泳等电点检测方法，包括如下步骤：
S1、材料准备：将实验所用的各类材料准备妥当，以保证试验顺利进行；
S2、试剂准备：实验所需试剂，待检样品与对照品，需及时备好，以供实验使用；
S3、仪器准备：实验仪器提前清洗完毕后备好；
S4、配制试剂：将实验无法直接使用的试剂，进行人工配制，以供使用，保证实验的顺利进行；
S5、检验方法：主要以电泳作为方法对其检验；
S6、分析判断结果：通过对比对照品分析判断出结果；
其中，所述S1材料准备，其具体步骤如下：
S101、准备聚丙烯薄膜：即PAG fim(聚丙烯薄膜，GE Healthare)；
S102、手动裁剪电极条：电极条采用手动裁剪，可以按照自己的需要裁剪；
S103、手动裁剪上样纸：上样纸需要手动裁剪，来确保上样的顺利进行；
S104、手动裁剪干胶膜：手动裁剪干胶膜以备后用；
其中，所述S2试剂准备，其具体步骤如下：
S201、准备待检样品及对照品：先将待检样品与工作对照品准备好，以备实验；
S202、准备各类实验试剂：准备丙烯酰胺(电泳级)；甲叉双丙烯酰胺(电泳级)；过硫酸氨；三氯乙酸；硫酸铵；磷酸(85％)；氢氧化钠；甲醇；无水乙醇；考马斯亮蓝G250；甘油；冰醋酸；疏水硅烷；TEMED；两性载体Ampholytes(pH3.0～10.0、pH4.0～6.5)；Marker(3-10)；超纯水；
其中S3仪器准备，其具体步骤如下：
S301、准备等电聚焦装置：等电聚焦装置(Mμltiphor II多功能电泳***，GE；小型冷却水循环装置，EYELA)；
S302、准备激光扫描光密度计：Bio-Rad激光扫描光密度计(GS800)；
S303、准备水平震荡仪。
实施例四，参照图1～5，一种重组蛋白的等电聚焦电泳等电点检测方法，包括如下步骤：
S1、材料准备：将实验所用的各类材料准备妥当，以保证试验顺利进行；
S2、试剂准备：实验所需试剂，待检样品与对照品，需及时备好，以供实验使用；
S3、仪器准备：实验仪器提前清洗完毕后备好；
S4、配制试剂：将实验无法直接使用的试剂，进行人工配制，以供使用，保证实验的顺利进行；
S5、检验方法：主要以电泳作为方法对其检验；
S6、分析判断结果：通过对比对照品分析判断出结果；
其中，所述S1材料准备，其具体步骤如下：
S101、准备聚丙烯薄膜：即PAG fim(聚丙烯薄膜，GE Healthare)；
S102、手动裁剪电极条：电极条采用手动裁剪，可以按照自己的需要裁剪；
S103、手动裁剪上样纸：上样纸需要手动裁剪，来确保上样的顺利进行；
S104、手动裁剪干胶膜：手动裁剪干胶膜以备后用；
其中，所述S2试剂准备，其具体步骤如下：
S201、准备待检样品及对照品：先将待检样品与工作对照品准备好，以备实验；
S202、准备各类实验试剂：准备丙烯酰胺(电泳级)；甲叉双丙烯酰胺(电泳级)；过硫酸氨；三氯乙酸；硫酸铵；磷酸(85％)；氢氧化钠；甲醇；无水乙醇；考马斯亮蓝G250；甘油；冰醋酸；疏水硅烷；TEMED；两性载体Ampholytes(pH3.0～10.0、pH4.0～6.5)；Marker(3-10)；超纯水；
其中S3仪器准备，其具体步骤如下：
S301、准备等电聚焦装置：等电聚焦装置(Mμltiphor II多功能电泳***，GE；小型冷却水循环装置，EYELA)；
S302、准备激光扫描光密度计：Bio-Rad激光扫描光密度计(GS800)；
S303、准备水平震荡仪；
其中S4配制试剂，其具体步骤如下：
S401、配制30％丙烯酰胺溶液：称取58.2g丙烯酰胺，1.8g甲叉双丙烯酰胺，用150ml纯水溶解，然后定容至200ml，0.22μm膜过滤后置5±3℃避光保存；
S402、配制固定液：三氯乙酸母液：称取100g的三氯乙酸加100mL的水混合，使用前混匀；20％三氯乙酸：取20mL母液与80mL的水混合(现用现配)；
S403、配制染色液：染色储备液：称取125g硫酸铵，用400ml纯水溶解，作为溶液1；称取1.0g考马斯亮蓝G250，加纯水20ml搅拌，加入20g磷酸，溶解后与溶液1混合，定容至1000ml，使用前充分摇匀；工作染色液：取60ml染色储备液，与30ml甲醇混匀，临用新配；
S404、配制10％APS：取0.1g分装好的过硫酸氨一支，1ml超纯水溶解，现用现配(或5±3℃保存1周内使用)；
S405、配制电极液：正极液：0.5mol/L磷酸溶液，量取57.6mL磷酸溶于500mL水，定容至1000mL，0.22μm膜过滤，常温保存；负极液：0.2mol/L氢氧化钠溶液，称取8g氢氧化钠，溶于500mL水，定容至1000mL，0.22μm膜过滤，常温保存；
S406、配制80％甘油：量取甘油160ml，加纯水稀释至200ml，0.45μm膜过滤，常温保存；
S407、配制脱色液：准备250ml 95％乙醇，80ml冰醋酸，670ml超纯水；
S408、配制干胶脱水液：准备无水乙醇200ml，冰醋酸50ml，甘油50ml，100ml超纯水混匀，定容至500ml。
实施例五，参照图1～6，一种重组蛋白的等电聚焦电泳等电点检测方法，包括如下步骤：
S1、材料准备：将实验所用的各类材料准备妥当，以保证试验顺利进行；
S2、试剂准备：实验所需试剂，待检样品与对照品，需及时备好，以供实验使用；
S3、仪器准备：实验仪器提前清洗完毕后备好；
S4、配制试剂：将实验无法直接使用的试剂，进行人工配制，以供使用，保证实验的顺利进行；
S5、检验方法：主要以电泳作为方法对其检验；
S6、分析判断结果：通过对比对照品分析判断出结果；
其中，所述S1材料准备，其具体步骤如下：
S101、准备聚丙烯薄膜：即PAG fim(聚丙烯薄膜，GE Healthare)；
S102、手动裁剪电极条：电极条采用手动裁剪，可以按照自己的需要裁剪；
S103、手动裁剪上样纸：上样纸需要手动裁剪，来确保上样的顺利进行；
S104、手动裁剪干胶膜：手动裁剪干胶膜以备后用；
其中，所述S2试剂准备，其具体步骤如下：
S201、准备待检样品及对照品：先将待检样品与工作对照品准备好，以备实验；
S202、准备各类实验试剂：准备丙烯酰胺(电泳级)；甲叉双丙烯酰胺(电泳级)；过硫酸氨；三氯乙酸；硫酸铵；磷酸(85％)；氢氧化钠；甲醇；无水乙醇；考马斯亮蓝G250；甘油；冰醋酸；疏水硅烷；TEMED；两性载体Ampholytes(pH3.0～10.0、pH4.0～6.5)；Marker(3-10)；超纯水；
其中S3仪器准备，其具体步骤如下：
S301、准备等电聚焦装置：等电聚焦装置(Mμltiphor II多功能电泳***，GE；小型冷却水循环装置，EYELA)；
S302、准备激光扫描光密度计：Bio-Rad激光扫描光密度计(GS800)；
S303、准备水平震荡仪；
其中S4配制试剂，其具体步骤如下：
S401、配制30％丙烯酰胺溶液：称取58.2g丙烯酰胺，1.8g甲叉双丙烯酰胺，用150ml纯水溶解，然后定容至200ml，0.22μm膜过滤后置5±3℃避光保存；
S402、配制固定液；三氯乙酸母液：称取100g的三氯乙酸加100mL的水混合，使用前混匀；20％三氯乙酸：取20mL母液与80mL的水混合(现用现配)；
S403、配制染色液：染色储备液：称取125g硫酸铵，用400ml纯水溶解，作为溶液1；称取1.0g考马斯亮蓝G250，加纯水20ml搅拌，加入20g磷酸，溶解后与溶液1混合，定容至1000ml，使用前充分摇匀；工作染色液：取60ml染色储备液，与30ml甲醇混匀，临用新配；
S404、配制10％APS：取0.1g分装好的过硫酸氨一支，1ml超纯水溶解，现用现配(或5±3℃保存1周内使用)；
S405、配制电极液：正极液：0.5mol/L磷酸溶液，量取57.6mL磷酸溶于500mL水，定容至1000mL，0.22μm膜过滤，常温保存；负极液：0.2mol/L氢氧化钠溶液，称取8g氢氧化钠，溶于500mL水，定容至1000mL，0.22μm膜过滤，常温保存；
S406、配制80％甘油：量取甘油160ml，加纯水稀释至200ml，0.45μm膜过滤，常温保存；
S407、配制脱色液：准备250ml 95％乙醇，80ml冰醋酸，670ml超纯水；
S408、配制干胶脱水液：准备无水乙醇200ml，冰醋酸50ml，甘油50ml，100ml超纯水混匀，定容至500ml；
其中S5检验方法，其具体步骤如下:
S501、制胶架组装：取洁净制胶玻璃板放在干净的擦拭布上，取0.5mL疏水硅烷均匀涂抹在带Μ型胶条玻璃板正面上，室温晾干；在平面玻璃板一面加0.5ml水湿润，取制胶胶片，疏水面贴玻璃板，用手动滚压器使疏水面与润湿玻璃板紧贴并除尽气泡，用吸水纸清理多余的水份；用制胶夹左右各一个，下面两个对称固定两块玻璃板(室温过高时置于5±3℃预冷)；
S502、胶溶液配制及灌装：尿素母液：称取10.8g尿素，直接加17.5mL超纯水溶解至24.6ml，0.22μm膜过滤，待用；配胶及灌装：3.3ml 30％聚丙烯酰胺溶液、12.3ml尿素母液、1.2ml 80％甘油、0.275ml pH4.0～6.5电解质、0.825ml pH3.0～10.0电解质和100μl 10％APS混匀后再加20μl TEMED混匀，用5ml移液枪吸取混合液灌入组装好的制胶模具缝隙之间，小心避免气泡产生(若有气泡产生，用手轻轻敲打玻璃板，排出气泡)，室温放置1.5h凝固完全后(温度过低时，置于25℃环境凝固2.5小时)，可立即使用或用保鲜膜包好置于5±3℃保存，2～3天内使用；
S503、预电泳：打开小型冷却水循环装置开关至温度冷却为16℃后，取1mL超纯水置于电泳板上，取胶对称贴在电泳版3-13处，排除气泡；取电极条(比胶短)置于3和13的横线处，在负极方向加适量(1mL左右)负极液至电极条湿润即可，在正级方向加适量(1mL左右)正级液至电极条湿润即可。盖上电泳槽盖，打开电泳电源装置的开关设置700V，24mA，8W，预电泳60min；
S504、样品处理：取一支对照品用250ml超纯水溶解即浓度为2mg/ml的对照品；样品稀释至2mg/ml；
S505、点样：在凝胶上离阴极6cm处摆放上样纸片(用擦镜纸裁剪成约0.5X1.0cm方块)，点样Marker；在凝胶上离阴极1cm处摆放上样纸片，点样样品及工作对照品，点样量20μg(体积10μl)；
S506、电泳：上样电泳：设置500V，8mA，8W，温度10～20℃(一般16℃)，电泳20min。结束后去掉上样纸片；正式电泳：设置2200V，14mA，18W，180min+2500V，14mA，20W，10min，温度10～20℃(一般16℃)；
S507、染色脱色：电泳完毕后，取胶片，胶面朝上，置固定液中，室温10rpm振荡固定20min，完毕后用清水振荡清洗2min，然后在染色液中振荡染色1小时至条带清晰显现(冬天温度过低时，适当延长染色时间直至条带清晰显现)，终止染色时应先用清水漂洗多余染色液，将胶片置于清水中，用普通纸巾轻轻擦拭去除浮色(擦拭时应保持胶片泡在水中保持湿润以免擦破胶面)，置脱色液中去除背景；
S508、扫胶：GS800扫描分析等电点；
S509、制干胶：将胶片置于少量的干胶脱水液振荡5min后放在玻璃板上，贴上干胶膜，四周用透明胶封住，置于通风橱内自然晾干。
工作原理：本发明提供一种重组蛋白的等电聚焦电泳等电点检测方法，涵盖了材料、试剂、仪器的准备，试剂的合理配制，科学的检验方法，严谨的分析判定，做到了将重组蛋白进行等电聚焦电泳等电点检测，结果科学合理，具有说服力；本发明所述所述材料准备，准备聚丙烯薄膜；即PAG fim(聚丙烯薄膜，GE Healthare)；手动裁剪电极条、上样纸、干胶膜，以确保所需材料按照自己的需要裁剪，可以更有效的完成实验；本发明进一步所述仪器准备，准备等电聚焦装置(Mμltiphor II多功能电泳***，GE；小型冷却水循环装置，EYELA)；准备激光扫描光密度计；Bio-Rad激光扫描光密度计(GS800)；准备水平震荡仪，仪器提前清洗检查完毕，为实验做好准备；本发明进一步所述试剂准备，准备待检样品及对照品；先将待检样品与工作对照品准备好，以备实验；再准备各类实验试剂；准备丙烯酰胺(电泳级)；甲叉双丙烯酰胺(电泳级)；过硫酸氨；三氯乙酸；硫酸铵；磷酸(85％)；氢氧化钠；甲醇；无水乙醇；考马斯亮蓝G250；甘油；冰醋酸；疏水硅烷；TEMED；两性载体Ampholytes(pH3.0～10.0、pH4.0～6.5)；Marker(3-10)；超纯水等，种类备齐，以确保实验能顺利进行；
本发明进一步所述配制试剂，配制30％丙烯酰胺溶液；称取58.2g丙烯酰胺，1.8g甲叉双丙烯酰胺，用150ml纯水溶解，然后定容至200ml，0.22μm膜过滤后置5±3℃避光保存；配制固定液；三氯乙酸母液：称取100g的三氯乙酸加100mL的水混合，使用前混匀；20％三氯乙酸：取20mL母液与80mL的水混合(现用现配)；配制染色液；染色储备液：称取125g硫酸铵，用400ml纯水溶解，作为溶液1；称取1.0g考马斯亮蓝G250，加纯水20ml搅拌，加入20g磷酸，溶解后与溶液1混合，定容至1000ml，使用前充分摇匀；工作染色液：取60ml染色储备液，与30ml甲醇混匀，临用新配；配制10％APS；取0.1g分装好的过硫酸氨一支，1ml超纯水溶解，现用现配(或5±3℃保存1周内使用)；配制电极液；正极液：0.5mol/L磷酸溶液，量取57.6mL磷酸溶于500mL水，定容至1000mL，0.22μm膜过滤，常温保存；负极液：0.2mol/L氢氧化钠溶液，称取8g氢氧化钠，溶于500mL水，定容至1000mL，0.22μm膜过滤，常温保存；配制80％甘油；量取甘油160ml，加纯水稀释至200ml，0.45μm膜过滤，常温保存；配制脱色液；准备250ml 95％乙醇，80ml冰醋酸，670ml超纯水；配制干胶脱水液；准备无水乙醇200ml，冰醋酸50ml，甘油50ml，100ml超纯水混匀，定容至500ml，试剂配制有严格的比例和取量，科学合理的配制出实验所需试剂；
本发明进一步所述检验方法，制胶架组装：取洁净制胶玻璃板放在干净的擦拭布上，取0.5mL疏水硅烷均匀涂抹在带Μ型胶条玻璃板正面上，室温晾干；在平面玻璃板一面加0.5ml水湿润，取制胶胶片，疏水面贴玻璃板，用手动滚压器使疏水面与润湿玻璃板紧贴并除尽气泡，用吸水纸清理多余的水份；用制胶夹左右各一个，下面两个对称固定两块玻璃板(室温过高时置于5±3℃预冷)；胶溶液配制及灌装：尿素母液：称取10.8g尿素，直接加17.5mL超纯水溶解至24.6ml，0.22μm膜过滤，待用；配胶及灌装：3.3ml 30％聚丙烯酰胺溶液、12.3ml尿素母液、1.2ml 80％甘油、0.275ml pH4.0～6.5电解质、0.825ml pH3.0～10.0电解质和100μl 10％APS混匀后再加20μlTEMED混匀，用5ml移液枪吸取混合液灌入组装好的制胶模具缝隙之间，小心避免气泡产生(若有气泡产生，用手轻轻敲打玻璃板，排出气泡)，室温放置1.5h凝固完全后(温度过低时，置于25℃环境凝固2.5小时)，可立即使用或用保鲜膜包好置于5±3℃保存，2～3天内使用；预电泳：打开小型冷却水循环装置开关至温度冷却为16℃后，取1mL超纯水置于电泳板上，取胶对称贴在电泳版3-13处，排除气泡；取电极条(比胶短)置于3和13的横线处，在负极方向加适量(1mL左右)负极液至电极条湿润即可，在正级方向加适量(1mL左右)正级液至电极条湿润即可。盖上电泳槽盖，打开电泳电源装置的开关设置700V，24mA，8W，预电泳60min；样品处理；取一支对照品用250ml超纯水溶解即浓度为2mg/ml的对照品；样品稀释至2mg/ml；点样：在凝胶上离阴极6cm处摆放上样纸片(用擦镜纸裁剪成约0.5X1.0cm方块)，点样Marker：在凝胶上离阴极1cm处摆放上样纸片，点样样品及工作对照品，点样量20μg(体积10μl)；电泳：上样电泳：设置500V，8mA，8W，温度10～20℃(一般16℃)，电泳20min。结束后去掉上样纸片；正式电泳：设置2200V，14mA，18W，180min+2500V，14mA，20W，10min，温度10～20℃(一般16℃)；染色脱色：电泳完毕后，取胶片，胶面朝上，置固定液中，室温10rpm振荡固定20min，完毕后用清水振荡清洗2min，然后在染色液中振荡染色1小时至条带清晰显现(冬天温度过低时，适当延长染色时间直至条带清晰显现)，终止染色时应先用清水漂洗多余染色液，将胶片置于清水中，用普通纸巾轻轻擦拭去除浮色(擦拭时应保持胶片泡在水中保持湿润以免擦破胶面)，置脱色液中去除背景；扫胶：GS800扫描分析等电点；制干胶：将胶片置于少量的干胶脱水液振荡5min后放在玻璃板上，贴上干胶膜，四周用透明胶封住，置于通风橱内自然晾干；主要通过电泳来检验，以达到实验目的；
本发明进一步所述分析判定结果，每个样品组必须含有至少一个对照品，各泳道应垂直不扩散且分离较好；对照品各条带应分布在pI4.6～6.8范围内，样品主成分迁移距离应与对照品一致，对样品与对照品的限制条件有利于更好的进行对比。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种重组蛋白的等电聚焦电泳等电点检测方法，其特征在于：包括如下步骤：
S1、材料准备：将实验所用的各类材料准备妥当，以保证试验顺利进行；
S2、试剂准备：实验所需试剂，待检样品与对照品，需及时备好，以供实验使用；
S3、仪器准备：实验仪器提前清洗完毕后备好；
S4、配制试剂：将实验无法直接使用的试剂，进行人工配制，以供使用，保证实验的顺利进行；
S5、检验方法：主要以电泳作为方法对其检验；
S6、分析判断结果：通过对比对照品分析判断出结果。
2.如权利要求1所述的一种重组蛋白的等电聚焦电泳等电点检测方法，其特征在于：所述S1材料准备，其具体步骤如下：
S101、准备聚丙烯薄膜聚；
S102、手动裁剪电极条：电极条采用手动裁剪，可以按照自己的需要裁剪；
S103、手动裁剪上样纸：上样纸需要手动裁剪，来确保上样的顺利进行；
S104、手动裁剪干胶膜：手动裁剪干胶膜以备后用。
3.如权利要求2所述的一种重组蛋白的等电聚焦电泳等电点检测方法，其特征在于：所述S2试剂准备，其具体步骤如下：
S201、准备待检样品及对照品；先将待检样品与工作对照品准备好，以备实验；
S202、准备各类实验试剂：准备丙烯酰胺；甲叉双丙烯酰胺；过硫酸氨；三氯乙酸；硫酸铵；85％磷酸；氢氧化钠；甲醇；无水乙醇；考马斯亮蓝G250；甘油；冰醋酸；疏水硅烷；TEMED；两性载体Ampholytes(pH3.0～10.0、pH4.0～6.5)；Marker(3-10)；Marker；超纯水。
4.如权利要求3所述的一种重组蛋白的等电聚焦电泳等电点检测方法，其特征在于：所述S3仪器准备，其具体步骤如下：
S301、准备等电聚焦装置；
S302、准备激光扫描光密度计：Bio-Rad激光扫描光密度计；
S303、准备水平震荡仪。
5.如权利要求4所述的一种重组蛋白的等电聚焦电泳等电点检测方法，其特征在于所述S4配制试剂，其具体步骤如下：
S401、配制30％丙烯酰胺溶液：称取58.2g丙烯酰胺，1.8g甲叉双丙烯酰胺，用150ml纯水溶解，然后定容至200ml，0.22μm膜过滤后置5±3℃避光保存；
S402、配制固定液：三氯乙酸母液：称取100g的三氯乙酸加100mL的水混合，使用前混匀；20％三氯乙酸：取20mL母液与80mL的水混合；
S403、配制染色液：染色储备液：称取125g硫酸铵，用400ml纯水溶解，作为溶液1；称取1.0g考马斯亮蓝G250，加纯水20ml搅拌，加入20g磷酸，溶解后与溶液1混合，定容至1000ml，使用前充分摇匀；工作染色液：取60ml染色储备液，与30ml甲醇混匀，临用新配；
S404、配制10％APS；取0.1g分装好的过硫酸氨一支，1ml超纯水溶解，现用现配；
S405、配制电极液：正极液：0.5mol/L磷酸溶液，量取57.6mL磷酸溶于500mL水，定容至1000mL，0.22μm膜过滤，常温保存；负极液：0.2mol/L氢氧化钠溶液，称取8g氢氧化钠，溶于500mL水，定容至1000mL，0.22μm膜过滤，常温保存；
S406、配制80％甘油：量取甘油160ml，加纯水稀释至200ml，0.45μm膜过滤，常温保存；
S407、配制脱色液：准备250ml 95％乙醇，80ml冰醋酸，670ml超纯水；
S408、配制干胶脱水液：准备无水乙醇200ml，冰醋酸50ml，甘油50ml，100ml超纯水混匀，定容至500ml。
6.如权利要求5所述的一种重组蛋白的等电聚焦电泳等电点检测方法，其特征在于：所述S5检验方法，其具体步骤如下：
S501、制胶架组装：取洁净制胶玻璃板放在干净的擦拭布上，取0.5mL疏水硅烷均匀涂抹在带Μ型胶条玻璃板正面上，室温晾干；在平面玻璃板一面加0.5ml水湿润，取制胶胶片，疏水面贴玻璃板，用手动滚压器使疏水面与润湿玻璃板紧贴并除尽气泡，用吸水纸清理多余的水份；用制胶夹左右各一个，下面两个对称固定两块玻璃板；
S502、胶溶液配制及灌装：尿素母液：称取10.8g尿素，直接加17.5mL超纯水溶解至24.6ml，0.22μm膜过滤，待用；配胶及灌装：3.3ml 30％聚丙烯酰胺溶液、12.3ml尿素母液、1.2ml 80％甘油、0.275ml pH4.0～6.5电解质、0.825ml pH3.0～10.0电解质和100μl 10％APS混匀后再加20μl TEMED混匀，用5ml移液枪吸取混合液灌入组装好的制胶模具缝隙之间，保证无气泡产生，室温放置1.5h凝固完全后，可立即使用或用保鲜膜包好置于5±3℃保存，2～3天内使用；
S503、预电泳：打开小型冷却水循环装置开关至温度冷却为16℃后，取1mL超纯水置于电泳板上，取胶对称贴在电泳版3-13处，排除气泡；取电极条置于3和13的横线处，在负极方向加适量负极液至电极条湿润即可，在正级方向加适量正级液至电极条湿润即可。盖上电泳槽盖，打开电泳电源装置的开关设置700V，24mA，8W，预电泳60min；
S504、样品处理：取一支对照品用250ml超纯水溶解即浓度为2mg/ml的对照品；样品稀释至2mg/ml；
S505、点样：在凝胶上离阴极6cm处摆放上样纸片，点样Marker；在凝胶上离阴极1cm处摆放上样纸片，点样样品及工作对照品，点样量20μg；
S506、电泳；上样电泳：设置500V，8mA，8W，温度10～20℃，电泳20min。结束后去掉上样纸片；正式电泳：设置2200V，14mA，18W，180min+2500V，14mA，20W，10min，温度10～20℃；
S507、染色脱色：电泳完毕后，取胶片，胶面朝上，置固定液中，室温10rpm振荡固定20min，完毕后用清水振荡清洗2min，然后在染色液中振荡染色1小时至条带清晰显现，终止染色时应先用清水漂洗多余染色液，将胶片置于清水中，用普通纸巾轻轻擦拭去除浮色，置脱色液中去除背景；
S508、扫胶：GS800扫描分析等电点；
S509、制干胶：将胶片置于少量的干胶脱水液振荡5min后放在玻璃板上，贴上干胶膜，四周用透明胶封住，置于通风橱内自然晾干。
7.如权利要求1所述的一种重组蛋白的等电聚焦电泳等电点检测方法，其特征在于：所述S6分析判定结果中，每个样品组必须含有至少一个对照品，各泳道应垂直不扩散且分离较好；对照品各条带应分布在pI4.6～6.8范围内，样品主成分迁移距离应与对照品一致。
8.如权利要求6所述的一种重组蛋白的等电聚焦电泳等电点检测方法，其特征在于：所述S502胶溶液配制及灌装中，若有气泡产生，用手轻轻敲打玻璃板，排出气泡；温度过低时，置于25℃环境凝固2.5小时；所述S503预电泳中，设置700V，24mA，8W；电泳过程中应关注电压等相关参数的变化情况，电泳结束时，电压应该达到设定的上限电压。
9.如权利要求6所述的一种重组蛋白的等电聚焦电泳等电点检测方法，其特征在于：所述S507染色脱色中，冬天温度过低时，适当延长染色时间直至条带清晰显现；擦拭时应保持胶片泡在水中保持湿润以免擦破胶面。
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