CN110551705A - 肺炎链球菌蛋白PepN在抗过敏性哮喘中的应用 - Google Patents

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张雪梅
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Abstract

本发明提供了一种抗过敏性哮喘的肺炎链球菌蛋白PepN及其应用，属于微生物技术领域以及医药技术领域。本发明要解决的技术问题是为过敏性哮喘的防治提供一种新的选择。本发明的技术方案是肺炎链球菌蛋白PepN，其序列如SEQ ID NO.1所示。肺炎链球菌蛋白PepN具有抗过敏性哮喘的作用，具体体现在：(1)显著降低过敏性哮喘小鼠支气管肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞的产生；(2)显著减轻过敏性哮喘小鼠肺部炎症反应；(3)显著降低过敏性哮喘小鼠血清中IgE的产生；(4)显著降低过敏性哮喘小鼠支气管肺泡灌洗液中IL‑5和IL‑13的水平。因此，肺炎链球菌蛋白PepN在制备抗过敏性哮喘的药品中，具有良好的应用前景。

Description

肺炎链球菌蛋白PepN在抗过敏性哮喘中的应用
技术领域
本发明涉及一种抗过敏性哮喘的肺炎链球菌蛋白及其应用，属于微生物技术领域以及医药技术领域。
背景技术
过敏性哮喘是一种由过敏原引起的以嗜酸性粒细胞浸润、过度的Th2型免疫反应、过敏原特异性IgE增加为主要特征的慢性气道炎症疾病，通常表现为反复发作性咳嗽、胸闷、喘息等症状，多发生在婴幼儿时期且伴随终身。
近年来，全球过敏性哮喘患者约1亿人，且在发达国家过敏性哮喘患病率不断上升；全中国过敏性哮喘患者约有1000万，过敏性哮喘患病率约为1.3％。过敏性哮喘已成为全球最常见的慢性疾病之一，给公众的健康和经济均造成了巨大的困扰。
目前哮喘的治疗方法主要包括避免接触过敏源、药物疗法、过敏原特异性免疫疗法，但存在只能缓解哮喘、疗效有限且需要时间长等不足，因此亟待研发能预防或治疗哮喘的新型疗法。流行病学研究表明早年生活于微生物暴露较多的环境会减少之后发生过敏和哮喘的风险。越来越多的研究表明早年细菌感染可抑制哮喘的发生，如幽门螺杆菌、李糖乳杆菌、双歧杆菌等。然而，由于目前发现的具有缓解过敏性哮喘症状的鼠李糖乳杆菌和动物双歧杆菌等预防过敏性疾病的临床研究效果较差或作用效果不明确。而细菌成分具有生物利用度高、剂量-反应关系易评估、临床反应变异性低、理化性质明确等优势。因此，研发可抑制过敏性哮喘的细菌成分，在过敏性哮喘的预防中具有良好的应用前景，同时也为过敏性哮喘的预防提供一种新方法。
研究表明，哮喘的发生与肺炎链球菌感染相关。儿童免疫肺炎链球菌疫苗后哮喘相关的住院率下降，实验研究中小鼠模型证明活的和灭活的肺炎链球菌均能抑制哮喘的发生。因此，肺炎链球菌具有某些特殊的成分能抑制哮喘发生。肺炎链球菌氨肽酶N(S.pnaminopeptidase N,PepN)是一类能从蛋白质和多肽N端选择性切除氨基酸残基产生游离氨基酸的外切蛋白酶，研究报道其为一种不依赖于其肽酶活性的具有免疫抑制性的肺炎链球菌成分。本发明首次验证了PepN抗过敏性哮喘的作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种肺炎链球菌蛋白及其在抗过敏性哮喘中的应用，为过敏性哮喘的预防提供一种新方法。
本发明提供的技术方案是肺炎链球菌蛋白PepN或多肽，其特征在于：(1)如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列；(2)任何含有(1)中连续50个氨基酸序列。
本发明提供了肺炎链球菌蛋白PepN的制备方法。
本发明提供了肺炎链球菌蛋白PepN在抗过敏性哮喘中的应用。
本发明的有益效果是：首次验证了肺炎链球菌蛋白PepN具有抗过敏性哮喘的作用，具体体现在：显著降低过敏性哮喘小鼠支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavagefluid,BALF)中嗜酸性粒细胞的产生；显著减轻过敏性哮喘小鼠肺部炎症反应；显著降低过敏性哮喘小鼠血清中IgE的产生；显著降低过敏性哮喘小鼠BALF中IL-5和IL-13的水平。因此，肺炎链球菌蛋白PepN作为一种细菌成分，在预防过敏性哮喘中具有良好的应用前景，本发明为过敏性哮喘的预防提供了一种新的选择。
附图说明
图1为重组质粒pET28a(+)-PepN的PCR鉴定及该蛋白的表达纯化。其中A图为pET28a(+)-PepN鉴定结果：M为DNAMarker，条带1为pET28a(+)-PepN核苷酸序列鉴定(2544bp)。B图为PepN的纯化表达结果：M为蛋白marker，条带1为重组PepN(分子量为95KDa)。
图2为PepN对过敏性哮喘小鼠BALF中炎症细胞总数和炎症细胞分类计数的影响。
图3为HE染色和PAS染色观察PepN对过敏性哮喘小鼠肺组织炎症细胞浸润以及粘液产生的影响。
图4为PepN对过敏性哮喘小鼠血清中总IgE的影响。
图5为PepN对过敏性哮喘小鼠BALF中IL-5和IL-13水平的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步的阐述。
一、肺炎链球菌氨肽酶N(PepN)的制备
1实验材料
质粒pET28a(+)购自Novagen公司，PCR使用的PrimeStar高保真酶、dNTPs、Buffer、MgCl2购自宝生物工程(大连)有限公司，PTC－200PCR仪为Perkin Elmer产品。
2实验方法
2.1重组表达质粒pET28a(+)-PepN的构建。
2.1.1引物的设计合成：
以肺炎链球菌D39基因组DNA为模板，参照其全序列(GeneBank编号CP000410.2)，使用premier5.0设计引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
PepN上游引物：5’-GGAATTCCATATGATGCAAGCAGTTGAACATT-3’，含NdeI位点；PepN下游引物：5’-CCCTCGAGTTATGCATTTCCGTATTGA-3’，含XhoI位点。
2.1.2 PCR扩增目的基因：
扩增体系：
其中，“P1(5pM)2μl”是指：取浓度为5pM的引物F-PepN，加入量为2μl。“P2(5pM)2μl”是指：取浓度为5pM的引物R-PepN，加入量为2μl。
扩增条件：95℃10min、95℃30s、55℃30s、72℃3min30s、35cycle；72℃10min，1次。利用上述条件，扩增得到相应目的基因。
2.1.3原核表达载体的构建
PCR产物回收按Roche公司(即罗氏公司)提供的试剂盒说明进行，质粒pET28a(+)按Omega小量质粒DNA抽提试剂盒说明进行，然后对载体DNA和外源DNA进行双酶切及回收，最后连接回收产物，连接反应体系如下表2所示：
连接条件：加样完成后，充分混匀，瞬时离心，然后在PCR仪中22℃连接20min。
将连接产物转化至大肠杆菌E.coliDH5α感受态细胞：
取E.coliDH5α菌划线接种LB平板，37℃孵育过夜(12-14h)；
挑取单菌落，接种于3mlLB中；
37℃200rpm过夜(12-14h)，取100μl加入2mlLB，37℃，300rpm3h；
取1.5ml菌液加入冰预冷EP管中，冰浴10min后4000rpm5min收集菌体；
加入预冷的0.1mMCaCl2150μl，重悬后9000rpm2min收集菌体；
再加入预冷的0.1mMCaCl2150μl，重悬；
加入10μl连接反应产物，混匀后，冰水浴30min；
42℃热击30s，冰水浴2min；
加入800μlLB培养基，37℃，100rpm1h复苏；
取200μl菌液涂布于LK平板；
37℃孵育，13h。
2.1.4pET28a(+)-PepN重组子的筛选及鉴定
挑取8个卡纳霉素抗性菌落，分别置2mlLK(含50ug/mlKana的LB)培养基中，180rpm3h增菌，菌液PCR鉴定；选取1个可疑阳性菌落增菌，送往北京擎科新业生物技术有限公司作双向测序。
2.2原核表达质粒pET28a(+)-PepN在大肠杆菌中的表达、鉴定及纯化。
2.2.1重组质粒pET28a(+)-PepN转化至宿主菌BL21(DE3)中。
2.2.2 IPTG诱导PepN的大量表达。
2.2.3重组蛋白的纯化：超声破菌后，取细菌破碎液上清用于纯化；4℃，12000rpm30min，上清用0.45μm滤膜过滤，收集滤液待用。
亲合层析纯化：吸取2ml50％的Ni2+-NTA树脂混悬液于层析柱内，以20ml超声破碎缓冲液平衡；吸出平衡后的Ni2+-NTA树脂混悬液，与上述滤液充分混匀，冰浴1h，其间每间隔5min轻轻混匀一次；将悬液转入层析柱内，让液体自然流出，平衡柱床；不同咪唑浓度进行梯度洗脱，分别收集洗脱液。
2.2.4 PBS超滤除去咪唑。
2.2.5重组蛋白的定量(Bradford检测法)
(1)吸取20mg/ml的标准品牛血清白蛋白溶液6μl，以0.15mmo1/LNaCl稀释40倍至0.5mg/ml，分别在两组各4支试管中加入10μl、20μl、30μl、40μlBSA溶液，然后以0.15mmol/LNaCl将总体积定容为200μl，同时取一支试管仅加200μl0.15mmol/LNaCl作为调零用；
(2)取纯化产物20μl，也以0.15mmol/LNaCl补足至总体积200μl；
(3)每管加入考马斯亮蓝G-250染液2ml，振荡混匀后室温静置30min；
(4)于DU-Series600全波长分光光度计中读取A590值，由仪器自动绘制标准曲线及计算样品蛋白含量。经Bradford法测得纯化透析后PepN蛋白浓度为2mg/ml。
2.2.6重组蛋白内毒素的去除和检测
参照《中国药典》(2015年6月5日由中国医药科技出版社出版)，终点显色细菌内毒素检查法。各蛋白内毒素含量低于0.1EU/μg。
3.实验结果与分析
3.1重组表达质粒pET28a(+)-PepN的构建
3.1重组表达质粒pET28a(+)-PepN的构建
图1A显示了重组表达质粒pET28a(+)-PepN的PCR鉴定结果，条带1为DNA marker，条带2为单一的PCR条带，与2544bp的目的DNA片段相符；此外，PCR产物测序结果与预期序列比对完全吻合。以上结果证实目的基因片段正确***表达载体中。
3.2 PepN在大肠杆菌中的表达、鉴定及纯化
图1B显示了重组PepN的SDS-PAGE分析结果，条带1为蛋白marker，条带2为重组PepN，与95KD左右的目的蛋白大小相符，且蛋白纯度为90％以上。以上结果证实目的蛋白被成功的表达和纯化。
二、PepN对小鼠过敏性哮喘的预防作用
1实验材料
实验动物为6-8周龄雌性BABL/c小鼠，购自重庆医科大学动物实验中心。饲养于室温25±2℃、相对湿度50±5％、12h光照/12h黑暗的标准化实验室中。
2实验方法
2.1实验动物分组及处理
将30只BABL/c小鼠随机分成PBS正常组、OVA哮喘模型组、(OVA+50μgPepN)处理组，每组10只，实验周期为22天。动物实验造模方法为：第0、7天对除正常组以外的两组小鼠通过腹腔注射100μg卵清蛋白(OVA)致敏液进行致敏，正常组小鼠腹腔注射PBS；第14-21天对除正常组以外的两组小鼠每天以5％OVA溶液进行雾化激发，正常组小鼠以PBS进行雾化实验。处理组小鼠分别在小鼠致敏期间的第2、6、10天,以1.5％戊巴比妥钠腹腔麻醉后，经鼻腔滴入50μgPepN进行处理。
2.2 BALF中炎症细胞的计数
末次激发24h后，将小鼠麻醉，使用留置针进行气管插管，以1ml预冷的PBS，将肺灌洗5次，回收量≥90％，收集灌洗液于干净的Eppendorf管中。于离心机上，4℃，800g，5min，收集细胞，使用1mlPBS将细胞沉淀重悬，在显微镜下计数炎症细胞总数。使用细胞离心涂片器将细胞涂片，瑞氏染色后，在显微镜下分类计数各类炎症细胞的比例，并计算其绝对值。
2.3肺组织切片观察
末次激发24h后，将小鼠麻醉，解剖胸腔，将肺组织摘离，置于4％多聚甲醛溶液中固定，经脱水、透明、浸蜡、包埋、切片后进行HE染色和PAS染色，最后在光学显微镜下观察组织形态变化。
2.4血清中IgE的检测
末次激发24h后，将小鼠麻醉，解剖胸腔，使用1ml注射器采取小鼠心脏血，静止2h后，于离心机3000rpm离心15分钟，收集血清于干净的离心管中，冻存于-80℃。按照ELISA试剂盒说明书对小鼠血清中IgE含量进行测定。
2.5BALF中细胞因子的检测
末次激发24h后，将小鼠麻醉，使用留置针进行气管插管，以1ml预冷的PBS，将肺灌洗5次，回收量≥90％，收集灌洗液于干净的Eppendorf管中。于离心机上，4℃，800g，5min，收集上清，冻存于-80℃。按照ELISA试剂盒说明书对小鼠BALF中细胞因子进行测定。
3实验结果与分析
3.1 PepN对过敏性哮喘小鼠BALF中炎症细胞的影响
图2A显示了小鼠BALF中炎症细胞总数的计数结果，由图可见，与PBS正常组小鼠相比，OVA哮喘模型组BALF中炎症细胞总数显著增多，经PepN处理后，过敏性哮喘小鼠BALF中炎症细胞总数减少。嗜酸性粒细胞增多是过敏性哮喘的典型特征之一，图2B和2C显示出与PBS正常组小鼠相比，OVA哮喘模型组BALF中嗜酸性粒细胞的比例和总数显著增多，经PepN处理后，过敏性哮喘小鼠BALF中嗜酸性粒细胞的比例和总数显著减少。
3.2 PepN对过敏性哮喘小鼠肺部组织形态的影响
图3A显示了小鼠肺部组织切片HE染色观察结果(放大倍数×400)，由图可见，与正常组小鼠肺部组织相比，OVA模型组小鼠肺部组织病理改变明显，肺泡正常结构消失，支气管周围有大量的炎性细胞浸润，且出现气道管腔狭窄，管壁变形等现象，经PepN处理后，小鼠肺部组织炎症浸润现象明显改善，肺泡间隔完整。图3B显示了小鼠肺部组织切片糖原染色观察结果(放大倍数×400)，由图可见，与正常组小鼠肺部组织相比，OVA模型组小鼠肺部组织杯状细胞和粘液的产生明显增多，经PepN处理后，过敏性哮喘小鼠肺部组织杯状细胞和粘液的产生减少。
3.3 PepN对过敏性哮喘小鼠血清IgE的影响
普遍认为过敏性哮喘发病机制是由IgE介导的超敏反应，即接触特异性抗原后的IgE抗体与肥大细胞、嗜碱性粒细胞表面的IgE受体结合，通过桥联作用引起快速脱粒和释放可引起局部炎症的介质，产生胸闷、喘息、咳嗽、气促等症状。
图4显示了小鼠血清总IgE含量的测定结果，由图可见，与正常组相比，OVA模型组小鼠血清中总IgE含量显著性增加，而PepN处理组小鼠血清中总IgE含量较模型组下降。
3.4 PepN对过敏性哮喘小鼠BALF中细胞因子的影响
过敏性哮喘是由于过度的Th2型免疫导致Th1/Th2免疫失衡的疾病。在Th2细胞调控中，IL-5和IL-13起着重要作用。IL-5可引起气道嗜酸性粒细胞聚集，IL-13可促进粘液的产生和平滑肌的收缩，从而引发炎症。
图5A和5B分别显示了小鼠BALF中IL-5和IL-13的水平，由图可见，与正常组小鼠肺部组织相比，OVA模型组小鼠BALF中IL-5和IL-13的水平显著上升，而经PepN处理后，过敏性哮喘小鼠BALF中IL-5和IL-13的水平下降。
上述实施例仅例示性说明本发明的原理及其功效，而非用于限制本发明。任何熟悉此技术的人士皆可在不违背本发明的精神及范畴下，对上述实施例进行修饰或改变。因此，凡所属技术领域中具有通常知识者在未脱离本发明所揭示的精神与技术思想下所完成的一切等效修饰或改变，仍应由本发明的权利要求所涵盖。
序列表
<110> 重庆医科大学
<120> 肺炎链球菌蛋白PepN在抗过敏性哮喘中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 848
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Gln Ala Val Glu His Phe Ile Lys Gln Phe Val Pro Glu His Tyr
1 5 10 15
Asp Leu Phe Leu Asp Leu Ser Arg Glu Thr Lys Thr Phe Ser Gly Lys
20 25 30
Val Thr Ile Thr Gly Gln Ala Gln Ser Asp Arg Ile Ser Leu His Gln
35 40 45
Lys Asp Leu Glu Ile Thr Ser Val Glu Val Ala Gly Gln Ala Arg Pro
50 55 60
Phe Thr Val Asp His Asp Asn Glu Ala Leu His Ile Glu Leu Ala Glu
65 70 75 80
Ala Gly Gln Val Glu Leu Val Leu Ala Phe Ser Gly Lys Ile Thr Asp
85 90 95
Asn Met Thr Gly Ile Tyr Pro Ser Tyr Tyr Thr Val Asp Gly Val Lys
100 105 110
Lys Glu Val Leu Ser Thr Gln Phe Glu Ser His Phe Ala Arg Glu Ala
115 120 125
Phe Pro Cys Val Asp Glu Pro Glu Ala Lys Ala Thr Phe Asp Leu Ser
130 135 140
Leu Arg Phe Asp Gln Ala Glu Gly Glu Leu Ala Leu Ser Asn Met Pro
145 150 155 160
Glu Ile Asp Val Glu Asn Arg Lys Glu Thr Gly Ile Trp Lys Phe Glu
165 170 175
Thr Thr Pro Arg Met Ser Ser Tyr Leu Leu Ala Phe Val Ala Gly Asp
180 185 190
Leu Gln Gly Val Thr Ala Lys Thr Lys Asn Gly Thr Leu Val Gly Val
195 200 205
Tyr Ser Thr Lys Ala His Pro Leu Ser Asn Leu Asp Phe Ser Leu Asp
210 215 220
Ile Ala Val Arg Ser Ile Glu Phe Tyr Glu Asp Tyr Tyr Gly Val Lys
225 230 235 240
Tyr Pro Ile Pro Gln Ser Leu His Ile Ala Leu Pro Asp Phe Ser Ala
245 250 255
Gly Ala Met Glu Asn Trp Gly Leu Val Thr Tyr Arg Glu Val Tyr Leu
260 265 270
Val Val Asp Glu Asn Ser Thr Phe Ala Ser Arg Gln Gln Val Ala Leu
275 280 285
Val Val Ala His Glu Leu Ala His Gln Trp Phe Gly Asn Leu Val Thr
290 295 300
Met Lys Trp Trp Asp Asp Leu Trp Leu Asn Glu Ser Phe Ala Asn Met
305 310 315 320
Met Glu Tyr Val Cys Val Asp Thr Ile Glu Pro Ser Trp Asn Ile Phe
325 330 335
Glu Asp Phe Gln Thr Gly Gly Val Pro Leu Ala Leu Glu Arg Asp Ala
340 345 350
Thr Asp Gly Val Gln Ser Val His Val Glu Val Lys His Pro Asp Glu
355 360 365
Ile Asn Thr Leu Phe Asp Gly Ala Ile Val Tyr Ala Lys Gly Ser Arg
370 375 380
Leu Met His Met Leu Arg Arg Trp Leu Gly Asp Ala Asp Phe Ala Lys
385 390 395 400
Gly Leu His Ala Tyr Phe Glu Lys His Gln Tyr Ser Asn Thr Ile Gly
405 410 415
Ser Asp Leu Trp Asp Ala Leu Gly Gln Ala Ser Gly Arg Asp Val Ala
420 425 430
Ala Phe Met Asp Ser Trp Leu Glu Gln Pro Gly Tyr Pro Val Leu Thr
435 440 445
Val Lys Val Glu Asn Asp Val Leu Lys Ile Ser Gln Lys Gln Phe Phe
450 455 460
Ile Gly Glu Asn Glu Asp Lys Asn Arg Leu Trp Val Val Pro Leu Asn
465 470 475 480
Ser Asn Trp Lys Gly Leu Pro Asp Thr Leu Glu Thr Glu Ser Ile Glu
485 490 495
Ile Pro Gly Tyr Ala Ala Leu Leu Ala Glu Asn Glu Gly Ala Leu Arg
500 505 510
Leu Asn Thr Glu Asn Thr Ala His Tyr Ile Thr Asp Tyr Gln Gly Asp
515 520 525
Leu Leu Glu Ala Val Leu Ala Glu Leu Glu Thr Leu Asp Asn Thr Ser
530 535 540
Lys Leu Gln Ile Val Gln Glu Arg Arg Leu Leu Ala Glu Ala Gly His
545 550 555 560
Ile Ser Tyr Ala Asp Leu Leu Pro Val Leu Asp Lys Leu Ala Lys Glu
565 570 575
Glu Ser Tyr Leu Val Val Ser Ala Val Ser Gln Val Ile Ser Ala Leu
580 585 590
Glu Arg Phe Ile Asp Glu Gly Thr Asp Ala Glu Thr Ala Phe Lys Gly
595 600 605
Leu Val Ala Lys Leu Ala Arg His Asn Tyr Asp Arg Leu Gly Phe Glu
610 615 620
Ala Lys Asp Gly Glu Ser Asp Glu Asp Glu Leu Val Arg Gln Leu Ala
625 630 635 640
Val Ser Met Met Ile Arg Ser Asn Asp Ala Glu Ala Ser Gln Val Ala
645 650 655
Ser Gln Ile Phe Ala Thr His Lys Glu Asn Leu Ala Gly Leu Pro Ala
660 665 670
Ala Ile Arg Ser Gln Val Leu Ile Asn Glu Met Lys His His Glu Thr
675 680 685
Lys Asp Leu Leu Ala Leu Tyr Leu Asp Thr Tyr Thr His Ala Thr Asp
690 695 700
Ala Val Phe Lys Arg Gln Leu Ala Ala Ala Leu Ala Tyr Ser Thr Asp
705 710 715 720
Ala Asp Asn Ile Gln Asn Leu Ile Thr Ser Trp Lys Asp Lys Phe Val
725 730 735
Val Lys Pro Gln Asp Leu Ser Ala Trp Tyr Tyr Gln Phe Leu Ala His
740 745 750
Gln Ala Thr Gln Lys Thr Ala Trp Ser Trp Ala Arg Glu Asn Trp Ala
755 760 765
Trp Ile Lys Ala Ala Leu Gly Gly Asp Met Ser Phe Asp Ser Phe Val
770 775 780
Ile Leu Pro Ala His Val Phe Lys Thr Gln Gln Arg Leu Ala Glu Tyr
785 790 795 800
Lys Glu Phe Phe Glu Pro Gln Leu Ser Asp Leu Ala Leu Ser Arg Asn
805 810 815
Ile Gly Met Gly Ile Lys Glu Ile Thr Ala Arg Val Asp Leu Ile Ser
820 825 830
Arg Glu Lys Ala Ala Val Glu Ala Val Val Leu Gln Tyr Gly Asn Ala
835 840 845

Claims (2)

1.肺炎链球菌蛋白质PepN或多肽，其特征在于：
(1)如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列；
(2)任何含有(1)中连续50个氨基酸序列。
2.权利要求1所述蛋白质或多肽在制备抗过敏性哮喘药物中的应用。
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