CN112121068B - 约氏乳杆菌在预防和/或治疗炎性肠病中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药领域，公开了约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)在制备用于预防和/或治疗炎性肠病的药物中的应用、以及一种用于预防和/或治疗炎性肠病的口服微生态制剂，所述微生态制剂包含约氏乳杆菌例如UMNLJ22株。本发明通过约氏乳杆菌可以显著改善柠檬酸杆菌(Citrobacter rodentium)诱导的炎性肠病小鼠模型中的脾脏增生、结肠变短、结肠黏膜增生和结肠炎症反应，发现约氏乳杆菌可以显著缓解小鼠炎性肠病，从而用于预防和/或治疗炎性肠病药物的开发和制备。

Description

约氏乳杆菌在预防和/或治疗炎性肠病中的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)在制备用于预防和/或治疗炎性肠病的药物中的应用以及包含该约氏乳杆菌的口服微生态制剂。
背景技术
炎性肠病(Inflammatory bowel disease,IBD)是一种慢性的、易复发炎症性肠道疾病。临床病症主要表现为腹痛、腹胀、腹泻以及便血。在过去的几十年里，炎性肠病在全球的发病率逐年递增，这使得炎性肠病成为全球的重要公共健康问题。
虽然近些年对炎性肠病的研究更加完整和***，但炎性肠病的发病原因和发病机理还不是很清楚。近年来的研究表明，影响炎性肠病的因素主要包括遗传因素、环境因素和肠道微生物区系。肠道微生物及其产物可作为肠道炎症的启动因子，诱发炎性肠病，并且肠道微生物区系紊乱也是炎性肠病的一种主要病症。因此，肠道微生物区系的动态平衡可能是影响炎性肠病发生与发展的主要因素。
目前，临床上治疗炎性肠病的药物主要包括：传统抗炎药物、免疫抑制剂和抗生素等。但这些治疗药物伴有一定的副作用、无法长期使用或者成本较高。
随着对肠道微生物研究的进一步发展，微生态制剂被应用于炎性肠病的治疗。微生态制剂如益生菌制剂和益生元制剂相对于其他治疗方法具有副作用小、易实行、治疗成本低等优点。大量研究表明，多种益生菌如乳酸菌和双歧杆菌可以缓解炎性肠病，但是依然存在一定的弊端，例如疗效并不明显。
因此，本领域亟需一种安全、高效、无副作用的炎性肠病疗法。
发明内容
如上所述，本领域亟需一种安全、高效、无副作用的炎性肠病疗法，其可以有效地预防、缓解和/或治愈炎性肠病，并且易实行、副作用小、治疗成本低。
本发明人意外地发现，在柠檬酸杆菌(Citrobacter rodentium)诱导的结肠炎小鼠肠道中，约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)的丰度显著降低；而在结肠炎得到缓解后，小鼠肠道中的约氏乳杆菌的丰度显著增加。基于此发现，本发明人完成了本发明。
因此，第一方面，本发明提供了约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)在制备用于预防和/或治疗炎性肠病的药物中的应用。
第二方面，本发明提供了一种用于预防和/或治疗炎性肠病的口服微生态制剂，所述微生态制剂包含约氏乳杆菌例如UMNLJ22株。
本发明的有益效果为：约氏乳杆菌能够显著改善与炎性肠病相关的症状，如脾脏增生、结肠变短、结肠黏膜增生和结肠炎症反应，从而预防、缓解或治愈炎性肠病。本发明为预防、缓解或治愈炎性肠病提供了一种优势菌株，其本身可用作口服微生态制剂，并且可以用于制备预防和/或治疗炎性肠病的药物。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅涉及本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的实施方案。
图1显示分离所得的约氏乳杆菌的核酸序列的MegAlign比对结果。
图2显示约氏乳杆菌对柠檬酸杆菌诱导的炎性肠病小鼠模型的脾脏重量和结肠长度的影响。其中，图2A：各组的小鼠脾脏重量的统计结果；图2B：各组的小鼠结肠长度的统计结果；图2C：各组的小鼠结肠示意图。数据表示为平均值±标准误；n＝12；不同的字母表示组间差异显著，P<0.05。
图3显示约氏乳杆菌对柠檬酸杆菌诱导的炎性肠病小鼠模型的结肠黏膜增生的影响。其中，图3A：各组的小鼠结肠形态学示意图；图3B：各组的小鼠结肠黏膜厚度的统计结果。数据表示为平均值±标准误；n＝12；不同的字母表示组间差异显著，P<0.05；白色标尺代表100μm。
图4显示约氏乳杆菌对柠檬酸杆菌诱导的炎性肠病小鼠模型的结肠细胞增殖的影响。其中，图4A：各组的小鼠结肠Ki67+细胞的染色结果(红色)；图4B：各组的小鼠结肠Ki67+细胞数的统计结果。数据表示为平均值±标准误；n＝12；不同的字母表示组间差异显著，P<0.05；白色标尺代表20μm。
图5显示约氏乳杆菌对柠檬酸杆菌诱导的炎性肠病小鼠模型的结肠炎性细胞浸润的影响。其中，图5A：各组的小鼠结肠炎性细胞的染色结果(红色)；图5B：各组的小鼠结肠炎性细胞浸润的统计结果。数据表示为平均值±标准误；n＝6；不同的字母表示组间差异显著，P<0.05；白色标尺代表20μm。
具体实施方式
下面对本发明进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施方案仅仅是本发明的一部分实施方案，而不是全部的实施方案。基于本发明中的实施方案，本领域普通技术人员可以获得的所有其他实施方案，并且它们都属于本发明保护的范围。
如上所述，本领域亟需一种安全、高效、无副作用的炎性肠病疗法，其可以有效地预防、缓解和/或治愈炎性肠病，并且易实行、副作用小、治疗成本低。
如背景技术部分所述，所谓“炎性肠病”是指一种慢性的、易复发炎症性肠道疾病，其临床病症主要表现为腹痛、腹胀、腹泻以及便血。此外，炎性肠病患者还会出现脾脏增生、结肠变短、结肠黏膜增生、结肠炎性反应等表现。
本发明人意外地发现，在柠檬酸杆菌诱导的结肠炎小鼠肠道中，约氏乳杆菌的丰度显著降低；而在结肠炎得到缓解后，小鼠肠道中的约氏乳杆菌的丰度显著增加。基于此发现，本发明人完成了本发明。
因此，第一方面，本发明提供了约氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)在制备用于预防和/或治疗炎性肠病的药物中的应用。
在本文中，所谓“预防”是指对正常个体或者说易感个体施行的预防性干预，由此使该个体免于出现某种疾病或者病症。在本发明中，预防的效果表现在以下几个方面：相对于对照组，脾脏不发生增生，结肠长度不会变短，结肠粘膜不会发生增生，并且不会出现结肠炎症反应。
在本文中，所谓“治疗”是对患病个体施行的治疗性干预，由此使该患病个体的疾病或者病症相对于未施行所述治疗性干预之前不再发展、有所缓解或者得到治愈。在本发明中，治疗的效果表现为以下几个方面：相对于患病组(即柠檬酸杆菌灌胃组)，治疗组小鼠的脾脏增生得到抑制，回复到与对照组相当的水平；结肠长度变短被抑制，结肠长度与对照组相当；结肠粘膜增生被抑制，回复到与对照组相当的水平，并且结肠炎症反应得到显著抑制。
另外，本发明人还对从结肠炎小鼠肠道中分离到的该约氏乳杆菌进行了序列比对分析。结果发现，该分离菌为约氏乳杆菌菌株UMNLJ22。因此，在一个实施方案中，所述约氏乳杆菌为UMNLJ22株。
如上所述，所述约氏乳杆菌是从柠檬酸杆菌诱导的结肠炎小鼠肠道中分离得到的。换言之，所述结肠炎是由肠道微生物例如柠檬酸杆菌诱导的。因此，在一个实施方案中，所述结肠炎为由肠道微生物诱导的炎性肠病，例如为由柠檬酸杆菌诱导的炎性肠病。
如背景技术部分所述，炎性肠病可以分为溃疡性结肠炎和克罗恩氏病。
溃疡性结肠炎于1875年首先由Willks和Moxon描述，1903年Willks和Boas将其命名为溃疡性结肠炎，1973年世界卫生组织(WHO)医学科学国际组织委员会正式命名为慢性非特异性溃疡性结肠炎。该病是一种主要侵及结肠黏膜的慢性非特异性炎性疾病，常始自左半结肠，可向结肠近端乃至全结肠，以连续方式逐渐进展。临床症状轻重不一，可有缓解与发作相交替，患者可仅有结肠症状，也可伴发全身症状。
克罗恩氏病又称局限性回肠炎、局限性肠炎、节段性肠炎和肉芽肿性肠炎、也译为克隆氏病，是一种原因不明的肠道炎症性疾病。克罗恩氏病在整个胃肠道的任何部位均可发生，但常发于末端回肠和右半结肠，以腹痛、腹泻、肠梗阻为主要症状，且有发热、营养障碍等肠外表现。病程多迁延，常有反复，不易根治。
在一个实施方案中，所述炎症性肠病包括溃疡性结肠炎和克罗恩病。
如本领域技术人员可以理解的那样，所述约氏乳杆菌还可以与预防和/或治疗炎性肠病的其他药物联合使用。所述其他药物可以为5-氨基水杨酸。
第二方面，本发明提供了一种用于预防和/或治疗炎性肠病的口服微生态制剂，所述微生态制剂包括约氏乳杆菌。
在一个实施方案中，所述约氏乳杆菌为约氏乳杆菌UMNLJ22株。
在本文中，所谓“微生态制剂”是利用正常微生物或促进微生物生长的物质制成的活的微生物制剂。也就是说，一切能促进正常微生物群生长繁殖的及抑制致病菌生长繁殖的制剂都称为“微生态制剂”。
在一个实施方案中，所述炎性肠病为由肠道微生物诱导的炎性肠病。在一个具体实施方案中，所述炎性肠病为由柠檬酸杆菌诱导的炎性肠病。
在一个实施方案中，所述炎性肠病为溃疡性结肠炎或克罗恩病。
本发明的有益效果为：约氏乳杆菌能够显著改善与炎性肠病相关的症状，如脾脏增生、结肠变短、结肠黏膜增生和结肠炎症反应，从而预防、缓解或治愈炎性肠病。本发明为预防、缓解或治愈炎性肠病提供了一种优势菌株，其本身可用作口服微生态制剂，并且可以用于制备预防和/或治疗炎性肠病的药物。
实施例
提供以下实施例以更好地理解本发明。下述实施例中的试验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规化试剂商店购买所得。应注意，上文的发明内容部分以及下文的详细描述仅为具体阐释本发明之目的，无意于以任何方式对本发明进行限制。在不背离本发明的精神和主旨的情况下，本发明的范围由随附的权利要求书确定。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不旨在限制本发明。
试验动物
试验选用48只SPF级4周龄雌性C57BL/6小鼠(购自北京华阜康实验动物技术有限公司)，在23±1℃鼠房内进行饲养，每天光照时间为12小时(8点至20点)，自由采食和饮水，适应一周后开始正式试验。
试剂和材料
柠檬酸杆菌(DBS100)购自美国ATCC生物资源中心，编号51459；
小鼠维持日粮购自北京华阜康生物实验动物技术有限公司，货号为1022；
多聚甲醛、苏木精和伊红染料购自北京中杉金桥生物技术有限公司；
Ki67抗体购自美国BD公司，CD4、CD8、CD11b、F4/80抗体和Alexa Fluor 594二抗购自美国Biolegend公司；
UinQ-10柱式胶回收试剂盒购自北京艾德莱生物公司。
主要仪器设备
多功能酶标仪：
Figure BDA0002709624110000061
M，购自美国Molecular Devices公司；
立式大容量震荡培养箱：ZHIY-300s，购自中国上海知楚仪器有限公司；
隔水式电热恒温培养箱：PXY-DHS.500-BS，购自中国上海跃进集团；
电泳仪：Mini-DNA，购自美国Bio-Rad公司；
石蜡切片机：RM2233，购自德国Leica公司；
冰冻切片机：CM3050S，购自德国Leica公司；
Olympus倒置显微镜：CK40-SLP，购自日本Olympus公司；
数码成像***：DP72，购自日本OLYMPUS公司；
凝胶成像分体***：Gel Doc XR+，购自美国Bio-Rad公司；
冷冻离心机，Legend micro 21R，购自美国Thermo Fisher公司。
实施例1.约氏乳杆菌的分离、鉴定和培养
1.1.约氏乳杆菌的分离
将小鼠结肠食糜置于1.5ml离心管中，加入500μl PBS，涡旋振荡1分钟使其完全悬浮。将所得悬液用以10倍连续梯度稀释后涂布于MRS(Man,Rogosa and Sharpe)琼脂板，37℃培养过夜。
1.2.约氏乳杆菌的鉴定
挑取所述约氏乳杆菌的单克隆于MRS液体培养基中，静置培养后扩增16S rDNA全长，引物序列分别为：
27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；
1492R：5’-CGGYTACCTTGTTACGACTT-3’。
PCR反应体系见表1：
表1.PCR反应体系
Figure BDA0002709624110000071
PCR反应条件如下：
Figure BDA0002709624110000072
用1％琼脂糖凝胶电泳检测所得PCR产物，并用UinQ-10柱式胶回收试剂盒纯化回收，由华大基因进行测序，并将测序结果进行MegAlign比对。
结果：约氏乳杆菌的核酸序列测定以及MegAlign比对结果见图1。经过16S rDNA全长测序、序列比对分析显示所得的分离菌为约氏乳杆菌菌株UMNLJ22。
1.3.约氏乳杆菌的培养
将所述约氏乳杆菌活化两次后接种至含有50mL MRS液体培养基的50mL离心管中，密封形成微氧环境，并于37℃恒温培养箱中静置培养24小时，备用。
实施例2.约氏乳杆菌对炎性肠病小鼠的预防和治疗
2.1.柠檬酸杆菌的培养
将柠檬酸杆菌(DBS100)活化两次后接种至含有50mL LB(Luria-Bertani)培养基的锥形瓶中，密封形成微氧环境，于37℃恒温摇床中，220rpm培养12小时，备用。
2.2.炎性肠病小鼠模型的建立、分组及给药
在一周适应期后，根据体重将小鼠随机分为4组，每组12只，包括：
对照组：该组小鼠每2天灌服一次PBS；
患病组(即柠檬酸杆菌灌胃组)：该组小鼠每2天灌服一次PBS，并于第8天灌服2×109CFU的柠檬酸杆菌，之后继续饲养一周，其中每2天灌服一次PBS；
预防组：小鼠每2天灌服一次109CFU的约氏乳杆菌，并于第8天灌服2×109CFU的柠檬酸杆菌，之后继续饲养一周，其中每2天灌服一次PBS；
治疗组：小鼠每2天灌服一次PBS，并于第8天灌服2×109CFU的柠檬酸杆菌，之后继续饲养一周，其中每2天灌服一次约氏乳杆菌。
试验周期为14天。
2.3.样品采集
在试验第15天时，将小鼠禁食6小时，用眼球法采取小鼠血液后，将其断颈处死。取小鼠脾脏并测量脾脏重量；并取小鼠结肠组织，测量其长度并拍取代表性图片，随后将所述结肠组织固定于4％多聚甲醛或包埋于冰冻切片包埋剂中。
2.4.结肠石蜡切片及染色
1)结肠组织石蜡切片的制备：
A.组织脱水、透明和浸蜡：将固定于4％多聚甲醛中的结肠组织取出，PBS洗涤3次，保存于70％乙醇中；随后将所述组织从70％乙醇中取出，依次浸入80％乙醇40分钟、95％乙醇1小时、无水乙醇I 30分钟、无水乙醇II 30分钟、二甲苯I 5分钟、二甲苯II 5分钟、蜡溶液I 1小时、蜡溶液II 1小时。
B.包埋：将所述蜡溶液倒入包埋盒中，置入组织块后，安装持蜡器。
C.切片：用手动切片机将所述蜡块切成5μm厚的蜡带，随后将所述蜡带浸入43℃水浴中并使其粘附于载玻片表面。
D.烤片：37℃保温过夜，62℃烤所述载玻片1小时。
2)苏木精-伊红染色：
A.脱蜡：将所述切片依次浸入二甲苯I10分钟、二甲苯II 10分钟、无水乙醇8分钟、95％乙醇5分钟、70％乙醇5分钟、50％乙醇5分钟、蒸馏水5分钟。
B.染色：滴加苏木精染液染色1分钟、蒸馏水洗涤3次(每次2分钟)、1％盐酸酒精溶液分化5秒、蒸馏水洗涤3次(每次5分钟)、滴加伊红染液染色1分钟、蒸馏水洗涤3次(每次2分钟)。
C.脱水、透明、封片：将所述切片依次浸入70％乙醇2秒、95％乙醇5秒、无水乙醇5分钟、二甲苯I 5分钟、二甲苯II 5分钟，然后在载玻片上滴加1滴中性树胶，盖玻片封片，干燥过夜。在显微镜下观察拍照。用ImageJ软件测量结肠黏膜厚度。
2.5.结肠冰冻切片及免疫荧光染色
1)结肠组织冰冻切片的制备：
包埋于冰冻切片包埋剂中结肠组织用冰冻切片机切成6μm厚的条带，粘附与载玻片表面；丙酮固定10分钟后保存于-80℃。
2)免疫荧光染色：
A.将冰冻切片取出恢复至室温，用PBS洗涤1次。
B.用3％BSA室温封闭30分钟，用PBS洗涤3次。
C.将Ki67、CD4、CD8、CD11b和F4/80用PBS按1:200的比例稀释成抗体稀释液，滴于载玻片上，4℃孵育过夜。
D.用PBS洗涤3次，将Alexa Fluor 594以1:200的比例稀释成抗体稀释液，滴于载玻片上，37℃孵育1小时。
E.用PBS洗涤3次，将Hoechst 33258以1:1000的比例稀释，滴于载玻片上，室温孵育5分钟。
F.在载玻片上滴加1滴封片剂，盖玻片封片，荧光显微镜下避光观察拍照。
2.6.统计分析
数据以平均值±SEM表示，并通过单因素方差分析进行分析。采用GraphPadPrism7.0版(美国加利福尼亚州圣地亚哥市GraphPad软件公司)进行邓肯式多重比较以确定差异，P<0.05被认为差异显著。
2.7.实验结果
(1)约氏乳杆菌对柠檬酸杆菌诱导的炎性肠病小鼠模型的脾脏重量的影响
各组小鼠脾脏重量统计结果如图2A所示。与对照组相比，患病组小鼠脾脏重量显著增加，而预防组与治疗组的小鼠脾脏重量均显著小于患病组，与对照组相当。结果表明，补充约氏乳杆菌可显著缓解柠檬酸杆菌诱导的炎性肠病引起的小鼠脾脏增生。
(2)约氏乳杆菌对柠檬酸杆菌诱导的炎性肠病小鼠模型的结肠长度的影响
各组小鼠结肠组织长度的代表性图片和结肠长度测量如图2C所示，各组小鼠结肠长度统计结果如图2B所示。从该图中可以看出，与对照组相比，患病组的小鼠结肠显著变短，而预防组与治疗组的小鼠结肠长度均显著长于患病组，并且与对照组相当。结果表明，补充约氏乳杆菌可显著缓解柠檬酸杆菌引起的结肠变短。
(3)约氏乳杆菌对柠檬酸杆菌诱导的炎性肠病小鼠模型的结肠黏膜增生的影响
图3A和3B分别为各组小鼠结肠形态学示意图和黏膜厚度统计结果。与对照组相比，患病组的小鼠的结肠形态均无显著性变化，但结肠黏膜厚度显著增加，而预防组与治疗组的小鼠结肠黏膜厚度显著小于患病组，并且与对照组相当。结果表明：约氏乳杆菌可显著缓解由柠檬酸杆菌诱导的结肠黏膜增厚。
(4)约氏乳杆菌对柠檬酸杆菌诱导的炎性肠病小鼠模型的结肠细胞增殖的影响
图4A和4B分别为各组小鼠结肠Ki67+细胞染色结果和统计结果。与对照组相比，患病组的小鼠的结肠上皮Ki67+细胞数显著增加，而预防组与治疗组的小鼠的结肠上皮Ki67+细胞数显著小于患病组，并且与对照组相当。结果表明：约氏乳杆菌可显著缓解由柠檬酸杆菌诱导的结肠黏膜增生。
(5)约氏乳杆菌对柠檬酸杆菌诱导的炎性肠病小鼠模型的结肠炎性细胞浸润的影响
图5A与5B分别为各组小鼠结肠炎性细胞染色结果和统计结果。与对照组相比，患病组的小鼠的结肠上皮炎性细胞浸润显著增多，如CD4+、CD8+T淋巴细胞、CD11b+、F4/80+巨噬细胞，而预防组与治疗组的小鼠的结肠上皮炎性细胞浸润显著小于患病组。结果表明：约氏乳杆菌可显著缓解由柠檬酸杆菌诱导的小鼠结肠的炎症反应。

Claims (2)

1.约氏乳杆菌（Lactobacillus johnsonii）在制备用于预防和/或治疗由肠道微生物诱导的炎性肠病的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其中所述炎性肠病为由柠檬酸杆菌（Citrobacter rodentium）诱导的炎性肠病。
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