CN110551661A

CN110551661A - 一株贝莱斯芽孢杆菌LfF-1菌株及其在生产蛋白酶中的应用

Info

Publication number: CN110551661A
Application number: CN201910884179.4A
Authority: CN
Inventors: 潘进权; 周鲜娇
Original assignee: Lingnan Normal University
Current assignee: Lingnan Normal University
Priority date: 2019-09-19
Filing date: 2019-09-19
Publication date: 2019-12-10
Anticipated expiration: 2039-09-19
Also published as: CN110551661B

Abstract

本发明公开了一株贝莱斯芽孢杆菌LfF‑1菌株及其在生产蛋白酶中的应用。本发明首次分离得到了一株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)LfF‑1菌株，该菌株已于2019年8月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为GDMCC NO：60741。该菌株具有显著的发酵生产蛋白酶的能力，丰富了用于蛋白酶发酵生产的菌种类型；由该菌株可通过发酵罐补料分批发酵工艺生产蛋白酶制剂，蛋白酶活力高达17.84万U/g，酶活回收率高达96.8％，极大地丰富现有商品化蛋白酶的类型，提高了蛋白酶制剂的生产效率；另外，该菌株发酵生产蛋白酶的方法简单易行，在生产蛋白类食品、功能性的多肽制品或饲料添加剂中具有广泛的应用前景。

Description

一株贝莱斯芽孢杆菌LfF-1菌株及其在生产蛋白酶中的应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域。更具体地，涉及一株贝莱斯芽孢杆菌LfF-1菌株及其在生产蛋白酶中的应用。

背景技术

蛋白酶是一类能够水解蛋白质，将其转化为肽及氨基酸的水解酶的统称，其在日化、食品加工、饲料生产及养殖等领域有着广泛的应用。相比于早期的蛋白酸水解工艺来说，运用蛋白酶实现蛋白水解是一种清洁绿色的生产工艺，更具发展潜力。近年来，随着多肽的生理及保健功能不断为人们所认识，多肽作为原料在保健食品、临床食品及饲料添加剂等行业中不断被推广应用。

蛋白酶是各类生物体中重要的消化酶，它参与了生物体内一系列与蛋白水解有关的生理生化过程。所以，各类生物体，包括动物、植物及微生物都具有一定的合成蛋白酶的能力。但是，在不同生物体中蛋白酶所承担的作用通常是有所不同的：其需要水解的对象不同，需要实现的水解目标也不一样；由此，在自然进化的驱动下，来自不同生物体的蛋白酶通常会表现出不同的催化特性，尤其是肽键选择性。因此，从自然界各类生物体中获取性质各异的蛋白酶具有技术可操作性；比如，来自植物体的木瓜蛋白酶与菠萝蛋白酶，来自枯草芽孢杆菌的中性蛋白酶及来自地衣芽孢杆菌碱性蛋白酶，来自米曲霉分泌的蛋白酶，来自毛霉分泌的蛋白酶，来自鱼类消化道分泌的蛋白酶等。

随着蛋白酶制剂被广泛应用于多肽的生产，现有商品化蛋白酶制剂在多肽生产中存在的不足也日益凸显出来：(1)现有用于蛋白酶发酵生产的菌种类型过于单一，单一蛋白酶的活性低，对底物蛋白的水解效率和回收率较低，多肽的转化率不高，导致多肽的生产成本偏高；(2)现有蛋白酶制剂的肽键选择性趋于同质化，蛋白酶制剂间的协同作用较差，由现有商品化蛋白酶构建的复合蛋白酶对底物蛋白的水解效率也不是太理想。因此，寻找更多具有不同肽键选择性的蛋白酶品种，是解决以上所述的现有商品化蛋白酶制剂在多肽生产中存在的不足的关键。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有用于蛋白酶发酵生产的菌种类型较为单一，单一蛋白酶的活性低，对底物蛋白的水解效率和回收率低，多肽的转化率不高，以及现有蛋白酶制剂的肽键选择性趋于同质化等缺陷和不足，提供一株贝莱斯芽孢杆菌LfF-1菌株及其在生产蛋白酶中的应用。

发明人发现现有报道的大多数蛋白酶种类都是开发自陆上生物体内，源自水生生物(尤其是海洋生物体)的蛋白酶研究相对较少。而基于生物进化的原理，海洋生物由于其生存环境的特殊性，生物体内代谢机制将明显不同于陆上生物，这注定其体内蛋白酶会与陆上的生物蛋白酶存在一定的差别。因此，本发明旨在从海洋生物体寻找新型的蛋白酶源。

本发明的第一个目的是提供一株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)LfF-1菌株。

本发明第二个目的是提供包含所述贝莱斯芽孢杆菌LfF-1菌株的微生物制剂。

本发明第三个目的是提供所述贝莱斯芽孢杆菌LfF-1菌株或所述微生物制剂在生产蛋白酶中的应用。

本发明第四个目的是提供所述贝莱斯芽孢杆菌LfF-1菌株或所述微生物制剂在制备蛋白酶制剂中的应用。

本发明第五个目的是提供一种蛋白酶制剂。

本发明第六个目的是提供一种生产蛋白酶的方法。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明经过长期的筛选和分离，从罗非鱼肠道中首次分离得到了一株具有高产蛋白酶能力的菌株，根据其细胞形态、生理生化特征、16s rRNA基因序列、gyrB基因序列的结果，鉴定该菌株属于贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，该菌株已于2019年8月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为GDMCC NO：60741，保藏地址是广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

本发明首先提供了一株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)LfF-1菌株，该菌株已于2019年8月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为GDMCC NO：60741。

本发明还提供了包含所述贝莱斯芽孢杆菌LfF-1菌株的微生物制剂。

所述贝莱斯芽孢杆菌LfF-1菌株或所述微生物制剂在生产蛋白酶中的应用，也应在本发明的保护范围之内。

所述贝莱斯芽孢杆菌LfF-1菌株或所述微生物制剂在制备蛋白酶制剂中的应用，也应在本发明的保护范围之内。

本发明还提供了一种蛋白酶制剂，包含所述贝莱斯芽孢杆菌LfF-1菌株或所述微生物制剂。

本发明还提供了一种生产蛋白酶的方法，将所述贝莱斯芽孢杆菌LfF-1菌株在发酵培养基中进行发酵，即可得到所述蛋白酶。

所述蛋白酶为中性蛋白酶。

优选地，所述发酵培养基的配方为：2％～4％乳糖，1％～4％牛肉膏，0.1％～0.7％KH₂PO₄，0.05％～0.1％吐温-80，2％～4％麸皮，pH 6.5～8。

更优选地，所述发酵培养基的配方为：2.5％～3.5％乳糖，2％～3％牛肉膏，0.4％～0.6％KH₂PO₄，0.05％～0.08％吐温-80，2.5％～3.5％麸皮，pH 7.0～7.5。

更进一步优选地，所述发酵培养基的配方为：3％乳糖，2％牛肉膏，0.5％KH₂PO₄，0.06％吐温-80，3％麸皮，pH 7.5。

优选地，所述发酵为变温补料分批发酵。

优选地，所述变温补料分批发酵的总时间为55～65h。

更优选地，所述变温补料分批发酵的总时间为60h。

更进一步优选地，所述变温补料分批发酵的变温发酵的条件为：发酵初期(0～24h)，发酵温度为33℃；发酵中后期(24h～60h)，发酵温度为27℃。

更进一步优选地，所述变温补料分批发酵的补料分批发酵的条件为：向发酵罐中流加已灭菌处理的、不含有麸皮渣的发酵培养基。

另外，本发明还提供了一种生产蛋白酶制剂的方法，在所述方法制备得到的蛋白酶中添加冻干保护剂，真空冷冻干燥，即可得到所述蛋白酶制剂。

优选地，所述冻干保护剂的添加量为≥1.5％乳糖。

更优选地，所述冻干保护剂的添加量为1.5％乳糖。

优选地，所述蛋白酶制剂为蛋白酶冻干粉。

本发明具有以下有益效果：

本发明提供了一株贝莱斯芽孢杆菌LfF-1菌株及其在生产蛋白酶中的应用。本发明经过大量的探索，首次筛选分离得到了一株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)LfF-1菌株，该菌株具有显著的发酵生产蛋白酶的能力，丰富了用于蛋白酶发酵生产的菌种类型；由该菌株可通过发酵罐补料分批发酵工艺生产蛋白酶制剂，蛋白酶活力高达17.84万U/g，酶活回收率高达96.8％，极大地丰富现有商品化蛋白酶的类型，提高了蛋白酶制剂的生产效率；另外，该菌株发酵生产蛋白酶的方法简单易行，可大规模推广应用，在生产蛋白类食品、功能性的多肽制品或饲料添加剂中具有广泛的应用前景。

附图说明

图1是富集培养物在初筛平板上形成的水解圈大小和形态。

图2是LfF-1菌株蛋白酶水解得到的牛血清白蛋白水解样液的电泳图谱；其中，1：蛋白marker；2：BSA溶液；3、4、5：诺维信中性蛋白酶水解BSA 5min、1h、3h的水解液；6：BSA溶液；7、8、9：枯草杆菌蛋白酶水解BSA 5min、1h、3h的水解液；10、11、12：LfF-1菌株蛋白酶水解BSA 5min、1h、3h的水解液。

图3是LfF-3菌株蛋白酶水解得到的牛血清白蛋白水解样液的电泳图谱；其中，A：蛋白marker；B、C、D：胰蛋白酶水解BSA 5min、1h、3h的水解液；E：BSA溶液；F、G、H：诺维信碱性蛋白酶水解BSA 5min、1h、3h的水解液；I、J、K：LfF-3蛋白酶水解BSA 5min、1h、3h的水解液；L、M、N：地衣芽孢杆菌蛋白酶水解BSA 5min、1h、3h的水解液。

图4是LfF-1菌株蛋白酶和LfF-3菌株蛋白酶水解得到的大豆蛋白水解样液的电泳图谱；其中，1：蛋白marker；2、3：不同浓度的大豆分离蛋白；4、5、6：LfF-1菌株蛋白酶水解SPI 5min、1h、3h的水解液；7、8、9：枯草杆菌蛋白酶水解SPI 5min、1h、3h的水解液；10、11、12：LfF-3蛋白酶水解SPI 5min、1h、3h的水解液。

图5是不同的蛋白酶水解得到的大豆蛋白水解样液的电泳图谱；其中，A：蛋白marker；B、C、D：诺维信中性蛋白酶水解SPI 5min、1h、3h的水解液；E、F、G：诺维信碱性蛋白酶水解SPI 5min、1h、3h的水解液；H、I、J：地衣芽孢杆菌蛋白酶水解SPI 5min、1h、3h的水解液；K、L、M：胰蛋白酶水解SPI 5min、1h、3h的水解液。

图6是LfF-1菌株的形态学和生理生化特征鉴定结果。

图7是不同碳源对LfF-1菌株发酵产蛋白酶的影响结果。

图8是乳糖的浓度对LfF-1菌株发酵产蛋白酶的影响结果。

图9是不同氮源对LfF-1菌株发酵产蛋白酶的影响结果。

图10是牛肉膏的浓度对LfF-1菌株发酵产蛋白酶的影响结果。

图11是不同磷酸盐对LfF-1菌株发酵产蛋白酶的影响结果。

图12是KH₂PO₄的浓度对LfF-1菌株发酵产蛋白酶的影响结果。

图13是无机盐对贝莱斯芽孢杆菌LfF-1菌株发酵的影响结果。

图14是表面活性剂对贝莱斯芽孢杆菌LfF-1菌株发酵的影响结果。

图15是吐温-80的浓度对贝莱斯芽孢杆菌LfF-1菌株发酵的影响结果。

图16是添加麦麸对贝莱斯芽孢杆菌LfF-1菌株发酵的影响结果。

图17是发酵培养基pH对贝莱斯芽孢杆菌LfF-1菌株发酵的影响结果。

图18是发酵温度对贝莱斯芽孢杆菌LfF-1菌株发酵的影响结果。

图19是发酵模式对贝莱斯芽孢杆菌LfF-1菌株发酵的影响结果。

图20是贝莱斯芽孢杆菌LfF-1菌株发酵罐小试过程中各工艺参数的变化曲线结果。

图21是贝莱斯芽孢杆菌LfF-1菌株补料分批发酵过程中各工艺参数的变化曲线结果。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1贝莱斯芽孢杆菌LfF-1菌株的分离与鉴定

本实施例中用到的培养基配方如下：

液体富集培养基：酵母粉0.5％、蛋白胨1.0％、NaCl 0.5％、琼脂1.5％～2.0％，pH7.0～7.2，121℃灭菌20min；

初筛培养基：脱脂奶粉4.0％、蔗糖2.0％、琼脂1.5％～2.0％，自然pH，105℃灭菌20min。

液体种子培养基：酵母粉0.5％、蛋白胨1.0％、NaCl 0.5％、pH 7.0～7.2，121℃灭菌20min；

复筛(发酵)培养基：蔗糖4.0％、蛋白胨2.0％、磷酸氢二钾0.3％、碳酸钙0.3％、吐温-80 0.1％，pH 7.5，121℃灭菌20min；

斜面培养基：酵母粉0.5％、蛋白胨1.0％、NaCl 0.5％、琼脂1.5％～2％，pH 7.0～7.2，121℃灭菌20min。

一、菌株分离与筛选

1、富集培养

分别取捣碎后的罗非鱼肠道、鸢乌贼内脏、鸢乌贼消化道和鸢乌贼墨囊样品10g(或10mL)，接种到装有50mL液体富集培养基的三角瓶中，封口后置于35℃、200r/min的摇床上恒温培养24h，得到富集培养液；按国家标准采用Folin法测定中性蛋白酶的酶活。

蛋白酶活力定义为：1mL酶液在40℃和pH 7.5的条件下，每分钟水解酪蛋白产生lμg酪氨酸为1个酶活力单位，以U/mL表示。

2、初筛

(1)实验方法

将富集培养液在85℃水浴中孵育处理20min，然后按10倍梯度系列稀释，分别从梯度稀释液中吸取0.2mL均匀涂布于初筛培养基上，置于培养箱中35℃恒温培养24h；观察初筛平板上形成的水解圈。

然后，根据初筛平板上水解圈的显著性识别出具有分泌蛋白酶能力的菌落；根据菌落大小、表面形态上的差异从筛选平板上挑选单菌落，将其转接于试管斜面培养基上，于35℃恒温培养24h，之后将试管斜面菌株置于4℃冰箱保存。

(2)实验结果

富集培养物在初筛平板上形成的水解圈大小和形态如图1所示，可以看出，不同分离源得到的富集培养物中微生物菌群有较大的差异，具体表现在三个方面：(1)能在初筛平板上长出的菌落数量有较显著的差异，菌落间存在一定的形态差异；(2)不同菌落的大小、生长速度和蛋白水解圈有明显的差别；例如，b平板上的菌落，菌体生长较缓慢，菌落较小，但是水解圈极显著；c平板上的菌体生长速度快，水解圈也较显著；(3)不同富集培养物在筛选平板上形成的水解圈数量不同，说明不同分离源中产蛋白酶微生物的种类有明显的差异。

3、复筛

(1)实验方法

分别挑取1环初筛得到的试管斜面菌株，接种到50mL液体种子培养基中，置于35℃200r/min的摇床上震荡培养24h，然后吸取2mL种子培养液转接到50mL发酵培养基中，置于32℃200r/min的摇床震荡培养72h；取发酵液1mL采用Folin-酚法测定其蛋白酶活力。

(2)实验结果

产蛋白酶菌株的摇瓶发酵复筛结果如表1所示，可以看出，经平板初筛得到的菌株都具有分泌蛋白酶的能力，在复筛实验中均可以检测到发酵液的蛋白酶活力，说明平板初筛产蛋白酶微生物菌株具有可行性。另外，实验结果还发现，复筛阶段测定的发酵液酶活高低与菌株在初筛平板上水解圈大小有一定的对应关系，但也存在偏差。例如，c平板上的菌落水解圈较显著，但是其发酵液的蛋白酶活力却不高。由此说明，并不能通过初筛平板上水解圈的大小直接判定各菌株的产蛋白酶能力，摇瓶发酵复筛是平板筛选的有效补充。通过复筛可确定LfF-1和LfF-3两个菌株具有较高的产蛋白酶能力，LfF-1菌株的发酵液酶活最高(为1826±1.8U/mL)，LfF-3菌株的发酵液酶活也很高，为1242.7±2.4U/mL，因此，LfF-1菌株和LfF-3菌株均有一定的开发应用价值。

表1产蛋白酶菌株的摇瓶发酵复筛结果

4、蛋白酶水解特性的电泳分析

为考察LfF-1菌株和LfF-3菌株所分泌蛋白酶与现有商品化蛋白酶之间是否有异同，是否为新型的蛋白酶品种，对其进行了蛋白酶水解特性的电泳分析实验。

(1)实验方法

1)蛋白酶的制备

挑取1环LfF-1试管斜面菌株、1环LfF-3试管斜面菌株，分别接种到50mL种子培养基中，然后置于35℃200r/min的摇床上震荡培养24h；然后吸取2mL种子培养液转接到50mL发酵培养基中，置于32℃200r/min的摇床震荡培养72h。将发酵液在4℃1000r/min的条件下离心10min，收集上清液，即可得到LfF-1菌株蛋白酶或LfF-3菌株蛋白酶。

2)牛血清白蛋白水解液的制备

以牛血清白蛋白为底物，用pH 8.0浓度0.05moL/L的Tris-HCl缓冲液溶解牛血清白蛋白，配制成浓度为1％的牛血清白蛋白溶液，按每份10mL分装成七份，然后置于45℃水浴中保温预热5min；按酶活单位与底物蛋白2000U：1g的比例在每份牛血清白蛋白液中加入不同的蛋白酶(胰蛋白酶、诺维信中性蛋白酶、诺维信碱性蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌蛋白酶、LfF-1菌株蛋白酶、LfF-3菌株蛋白酶)，混匀后继续保温酶解，在酶解5min、1h和3h取样，将所取样液置于沸水浴中加热5min灭酶以终止反应；灭酶后的牛血清白蛋白水解样液(BSA)用于电泳分析。

3)大豆蛋白水解液的制备

以大豆蛋白为底物。用pH 8.0浓度0.05moL/L的Tris-HCl缓冲液溶解大豆蛋白，配制成浓度为2％的大豆蛋白溶液，按每份10mL分装成七份，然后置于45℃水浴中保温预热5min；按酶活单位与底物蛋白2000U：1g的比例在每份大豆蛋白液中加入不同的蛋白酶(胰蛋白酶、诺维信中性蛋白酶、诺维信碱性蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶、地衣芽孢杆菌蛋白酶、LfF-1菌株蛋白酶、LfF-3菌株蛋白酶)，混匀后继续保温酶解；分别在酶解5min、1h和3h取样，将所取样液置于沸水浴中加热5min灭酶以终止反应；灭酶后的大豆蛋白水解样液(SPI)用于电泳分析。

4)蛋白水解样液的电泳分析

采用Tricine-SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳***：用浓度49.5％、交联度为5C的丙烯酰胺溶液配制浓度为16.5％的分离胶(其中添加终浓度6mol/L的尿素)；用浓度49.5％、交联度为3C的丙烯酰胺溶液配制浓度为10％的夹层胶，浓度为4％的浓缩胶。将上述牛血清白蛋白水解样液、大豆蛋白水解样液分别与电泳上样缓冲液混合后煮沸5min，各取10uL点样到上样孔，然后于45mA恒流电泳至考马斯亮蓝指示剂到达分离胶底部，结束电泳。取电泳后的胶片用考马斯亮蓝染色液染色20min，然后用脱色剂脱色，并及时观察电泳胶片各泳道上多肽条带的分布情况。

(2)实验结果

LfF-1菌株蛋白酶、LfF-3菌株蛋白酶水解得到的牛血清白蛋白水解样液的电泳图谱分别如图2、3所示，LfF-1菌株蛋白酶、LfF-3菌株蛋白酶和不同的蛋白酶水解得到的大豆蛋白水解样液的电泳图谱如图4、5所示，可以看出，不同蛋白酶对同种底物蛋白的水解条带存在显著的差异：例如用BSA(或SPI)作为底物蛋白，枯草杆菌蛋白酶水解出的多肽条带就明显不同，显示出蛋白酶在底物蛋白肽链上的酶切位点分布存在显著的差异。这一结果与文献报道的采用其它手段检测的蛋白酶肽键选择差异性结果基本相一致。以上结果表明，采用Tricine-SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳***可以有效展示不同蛋白酶对底物蛋白水解特性的差异。

比较LfF-1菌株蛋白酶与其它几种蛋白酶的电泳图谱可以看出，LfF-1菌株蛋白酶对底物蛋白的水解图谱虽然与枯草杆菌蛋白酶有相似的地方，但在分子量小于14.4kDa的区域肽片段的分布又完全不同，尤其是以SPI作为底物蛋白，它们间的差异更为显著。由此说明：LfF-1菌株蛋白酶不同于上述实验的其它几种蛋白酶，属于一种新型的蛋白酶类型，有较好的开发价值；而LfF-3蛋白酶与诺维信中性蛋白酶及枯草杆菌蛋白酶的水解图谱完全相同，是属于同一类型的蛋白酶，研究意义不大。为此，后续仅对LfF-1菌株及其发酵产蛋白酶的特性进行研究。

二、LfF-1菌株的形态学和生理生化特征鉴定

1、实验方法

将纯化后的LfF-1菌株保存于LB试管斜面培养基上，送中国科学院微生物研究所进行菌种鉴定。

2、实验结果

LfF-1菌株的形态学和生理生化特征鉴定结果如图6所示，可以看出，LfF-1菌株的细胞形态呈杆状，可形成芽孢，胞囊膨大，为革兰氏阳性菌，接触酶、氧化酶和淀粉水解呈阳性。

LfF-1菌株可以利用棉子糖、甘露糖、龙胆二糖、蜜二糖、果糖、乳酸、柠檬酸、糊精、甘油、麦芽糖、海藻糖、山梨醇、N-乙酰-D-葡萄胺等碳源正常生长；不能利用甲酸、乙酸、丙酸等；菌株对盐酸胍、利福霉素SV、丁酸钠、氯化锂、1％乳酸钠、8％NaCl、pH5.0不敏感；对二甲胺四环素、万古霉素、林可霉素等敏感。

LfF-1菌株的16s rRNA基因序列如SEQ ID NO：1所示，LfF-1菌株的gyrB基因序列如SEQ ID NO：2所示。

根据以上菌株的细胞形态、生理生化特征、16s rRNA基因序列、gyrB基因序列等实验数据综合分析，并参考《伯杰氏***细菌学手册》以及International Journal ofSystematic and Evolutionary Microbiology有关研究论文，确定了LfF-1菌株的鉴定结果为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，命名为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)LfF-1，并于2019年8月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为GDMCC NO：60741，保藏地址是广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

实施例2贝莱斯芽孢杆菌LfF-1菌株发酵生产蛋白酶工艺条件的优化

本实施例中用到的培养基配方如下：

液体种子培养基：胰蛋白胨1％，酵母膏0.5％，氯化钠1％，pH7.2，121℃灭菌20min；

基础发酵培养基：蔗糖4.0％、蛋白胨2.0％、磷酸氢二钾0.3％、碳酸钙0.3％，pH7.5，121℃灭菌20min。

1、种子培养

从试管斜面上挑取1环LfF-1菌种，转接到50mL种子培养基中，然后置于35℃200r/min的摇床恒温震荡培养24h，即得到LfF-1液体种子。

2、液体发酵

按照试验设计配制好发酵培养基，在无菌条件下吸取2mL LfF-1液体种子转接到装有50mL发酵培养基的三角瓶中，然后将三角瓶置于32℃200r/min的摇床震荡培养72h。

3、酶活测定

按国家标准采用Folin法测定蛋白酶的活力，蛋白酶活力定义为lmL酶液在40℃和pH 7.5的条件下，每分钟水解酪蛋白产生lμg酪氨酸为1个酶活力单位，以U/mL表示。

4、发酵培养基营养成分的单因素优化

(1)碳源对贝莱斯芽孢杆菌LfF-1菌株发酵的影响

1)实验方法

碳源种类的选择：分别以4.0％的葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、可溶性淀粉为碳源，基础发酵培养基其它成分不变，接种LfF-1液体种子进行发酵试验，测定各发酵液的蛋白酶活力。

碳源浓度的确定：选用基础发酵培养基，分别以浓度1％、2.0％、3.0％、4.0％、5.0％、6.0％、7.0％的乳糖作为碳源，接种LfF-1液体种子进行发酵试验，测定各发酵液的蛋白酶活力。

2)实验结果

不同碳源对LfF-1菌株发酵产蛋白酶的影响结果如图7所示，可以看出，LfF-1菌株发酵产蛋白酶的最佳碳源为乳糖。乳糖的浓度对LfF-1菌株发酵产蛋白酶的影响结果如图8所示，可以看出，当乳糖的浓度在2％～4％时，蛋白酶的酶活均高于2500U/mL；当乳糖的浓度为3％时，蛋白酶的酶活最高(3200U/mL)；因此，确定发酵培养基中乳糖的浓度为2％～4％。

(2)氮源对贝莱斯芽孢杆菌LfF-1菌株发酵的影响

1)实验方法

氮源种类的选择：在原发酵培养基的基础上，以3％乳糖为碳源，分别以3.0％的牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、大豆粉、NH₄Cl为氮源，基础发酵培养基的其它成分不变，接种LfF-1液体种子进行发酵试验，测定各发酵液的蛋白酶活力。

氮源浓度的确定：在原发酵培养基的基础上，以3％乳糖为碳源，分别添加1.0％、2.0％、3.0％、4.0％、5.0％、6.0％的牛肉膏作为氮源进行发酵试验，测定各发酵液的蛋白酶活力。

2)实验结果

不同氮源对LfF-1菌株发酵产蛋白酶的影响结果如图9所示，可以看出，LfF-1菌株发酵产蛋白酶的最佳氮源为牛肉膏。牛肉膏的浓度对LfF-1菌株发酵产蛋白酶的影响结果如图10所示，可以看出，当牛肉膏的浓度为1％～4％时，蛋白酶的酶活均高于3500U/mL；当牛肉膏的浓度为2％时，蛋白酶的酶活最高(大于4000U/mL)；因此，确定发酵培养基中牛肉膏的浓度为1％～4％。

(3)磷酸盐对贝莱斯芽孢杆菌LfF-1菌株发酵的影响

1)实验方法

磷酸盐种类的选择：在原发酵培养基的基础上，以3％乳糖为碳源，2％的牛肉膏为氮源，分别添加0.3％KH₂PO₄、K₂HPO₄、KH₂PO₄+K₂HPO₄和不加磷酸盐进行发酵试验，测定各发酵液的蛋白酶活力。

磷酸盐浓度的确定：在原发酵培养基的基础上，以3％乳糖为碳源，2％的牛肉膏为氮源，分别添加0.1％、0.3％、0.5％、0.7％、0.9％、1.1％KH₂PO₄，基础发酵培养基其它成分不变，进行发酵试验，测定各发酵液的蛋白酶活力。

2)实验结果

不同磷酸盐对LfF-1菌株发酵产蛋白酶的影响结果如图11所示，可以看出，与空白对照组相比，在发酵培养基中添加一定量的KH₂PO₄可以有效提高LfF-1菌株发酵产蛋白酶的能力。KH₂PO₄的浓度对LfF-1菌株发酵产蛋白酶的影响结果如图12所示，可以看出，当KH₂PO₄的浓度为0.1％～0.7％时，蛋白酶的酶活均高于3500U/mL；当KH₂PO₄的浓度为0.5％时，蛋白酶的酶活最高(4400U/mL)；因此，确定发酵培养基中KH₂PO₄的浓度为0.1％～0.7％。

(4)无机盐对贝莱斯芽孢杆菌LfF-1菌株发酵的影响

1)实验方法

在原发酵培养基的基础上，以3％乳糖为碳源，2％的牛肉膏为氮源，0.4％KH₂PO₄，分别添加0.3％CaCO₃、CaCl₂、MgSO₄、ZnSO₄、Fe₂(SO₄)₃、MnSO₄，基础发酵培养基其它成分不变，进行发酵试验，测定各发酵液的蛋白酶活力。

2)实验结果

无机盐对贝莱斯芽孢杆菌LfF-1菌株发酵的影响结果如图13所示，可以看出，培养基中添加锰离子、锌离子和铁离子对LfF-1菌株发酵产蛋白酶有极显著的抑制作用；钙离子对其产蛋白酶有促进作用，且空白对照组与添加钙离子的效果相当；说明原发酵培养基中无机盐的含量足以满足菌株发酵的需求，不需额外再添加。

(4)表面活性剂对贝莱斯芽孢杆菌LfF-1菌株发酵的影响

1)实验方法

表面活性剂种类的选择：在原发酵培养基的基础上，以3％乳糖为碳源，2％的牛肉膏为氮源，0.4％KH₂PO₄，分别添加0.1％的吐温-80，吐温-20，司盘-80，SDS，曲拉通X-100为表面活性剂，进行发酵试验，测定各发酵液的蛋白酶活力。

表面活性剂浓度的确定：在原发酵培养基的基础上，以3％乳糖为碳源，2％的牛肉膏为氮源，0.4％KH₂PO₄，分别添加0、0.03％、0.06％、0.1％、0.2％、0.4％、0.6％、0.8％的吐温-80，进行发酵试验，测定各发酵液的蛋白酶活力。

2)实验结果

表面活性剂对贝莱斯芽孢杆菌LfF-1菌株发酵的影响结果如图14所示，可以看出，不同类型的表面活性剂对LfF-1菌株发酵产蛋白酶的作用不同，SDS、曲拉通X-100表现出抑制作用；而吐温-80、吐温-20、司盘-80对该菌株发酵产酶有一定的促进作用；相比而言，吐温-80的促进作用效果最显著。

吐温-80的浓度对贝莱斯芽孢杆菌LfF-1菌株发酵的影响结果如图15所示，可以看出，当吐温-80的浓度为0.05％～0.1％时，蛋白酶的酶活均高于4400U/mL；当吐温-80的浓度为0.06％时，蛋白酶的酶活最高(5500U/mL)；因此，确定吐温-80的浓度为0.05％～0.1％。

(5)添加麦麸对贝莱斯芽孢杆菌LfF-1菌株发酵的影响

1)实验方法

在原发酵培养基的基础上，以3％乳糖为碳源，2％的牛肉膏为氮源，0.4％KH₂PO₄，0.06％吐温-80，分别添加麸皮1.5％、3％、4.5％、6％、7.5％进行发酵试验，测定各发酵液的蛋白酶活力。

2)实验结果

添加麦麸对贝莱斯芽孢杆菌LfF-1菌株发酵的影响结果如图16所示，可以看出，当麦麸的浓度为2％～4％时，蛋白酶的酶活均高于6000U/mL；当麦麸的浓度为3％时，蛋白酶的酶活为7000U/mL；因此，在发酵培养基中添加3％的麸皮可有效补充培养基的营养成分，显著促进贝莱斯芽孢杆菌LfF-1菌株的发酵产蛋白酶。

(6)发酵培养基pH对贝莱斯芽孢杆菌LfF-1菌株发酵的影响

1)实验方法

采用优化后的发酵培养基，调剂其pH分别为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0，接种LfF-1菌种进行发酵试验，测定各发酵液的蛋白酶活力。

2)实验结果

发酵培养基pH对贝莱斯芽孢杆菌LfF-1菌株发酵的影响结果如图17所示，可以看出，当培养基pH为6.5～8时，蛋白酶的酶活均高于6000U/mL；当培养基pH为7.5时，蛋白酶的酶活最高(大于7500U/mL)；因此，确定发酵培养基的pH为6.5～8。

5、发酵培养基营养成分的正交优化

(1)实验方法

采用正交试验的方法对上述单因素筛选出的乳糖、牛肉膏、KH₂PO₄和吐温-80四个因素进行进一步的优化，试验设计如表2所示。

(2)实验结果

发酵培养基的正交试验结果如表2所示，可以看出，乳糖浓度对贝莱斯芽孢杆菌LfF-1菌株发酵的影响最显著，其次是吐温-80浓度，牛肉膏和KH₂PO₄浓度的影响最较弱。根据分析确定四个因素的最优组合为A2B1C2D3，即4％乳糖、2％牛肉膏、0.5％KH₂PO₄、0.09％吐温-80。

表2发酵培养基的正交试验结果

根据以上发酵培养基营养成分的单因素优化和正交优化的实验结果，最终确定贝莱斯芽孢杆菌LfF-1菌株的发酵培养基的配方为：2％～4％乳糖，1％～4％牛肉膏，0.1％～0.7％KH₂PO₄，0.05％～0.1％吐温-80，2％～4％麸皮，pH 6.5～8；最佳发酵培养基的配方为：3％乳糖，2％牛肉膏，0.5％KH₂PO₄，0.06％吐温-80，3％麸皮，pH 7.5。

6、发酵条件的优化

(1)发酵温度对贝莱斯芽孢杆菌LfF-1菌株发酵的影响

1)实验方法

采用以上优化后的发酵培养基，分别在24℃、27℃、30℃、33℃、36℃、39℃、42℃的温度条件下进行发酵试验，测定各发酵液的蛋白酶活力。

2)实验结果

发酵温度对贝莱斯芽孢杆菌LfF-1菌株发酵的影响结果如图18所示，可以看出，当发酵温度为27℃～33℃时，蛋白酶的酶活均高于7500U/mL；当发酵温度为27℃时，蛋白酶的酶活最高(大于8000U/mL)；因此，确定发酵温度为27℃～33℃。

(2)发酵模式对贝莱斯芽孢杆菌LfF-1菌株发酵的影响

1)实验方法

采用优化后的发酵培养基，分别在恒温(固定温度为33℃)及变温(前30h固定温度为33℃，后期温度稳定在27℃)条件下进行发酵试验，测定发酵液蛋白酶活力随发酵时间的变化曲线。

2)实验结果

发酵模式对贝莱斯芽孢杆菌LfF-1菌株发酵的影响结果如图19所示，可以看出，采用33℃恒温发酵，菌体生长速度较快，培养基中蛋白酶的增长速度也相对较快，在70h左右达到顶峰；后续随着培养时间的延长，培养基中蛋白酶的含量呈现下降的趋势；这应该是由于在相对较高的温度下，菌体衰老凋亡，蛋白酶的分泌速率减慢；另外，由于蛋白酶离体后不稳定，部分蛋白酶分子之间会相互水解，导致发酵液中蛋白酶的浓度降低。而采用变温发酵的模式，菌体前期生长速度较快，中后期保存较缓慢的生长，由于培养温度较低，菌体衰亡缓慢，因此发酵液中蛋白酶的积累持续了一个更长的时间，在92h达到峰值；另外，由于中后期的培养温度较低，菌体分泌出的蛋白酶相对更稳定，这有利于发酵液中蛋白酶产量的积累。因此，变温发酵模式更有利于贝莱斯芽孢杆菌LfF-1菌株发酵产蛋白酶。

7、发酵工艺的小试

(1)摇瓶发酵工艺在发酵罐中的小试

1)实验方法

发酵培养基：4％乳糖，2％牛肉膏，0.5％KH₂PO₄，0.09％吐温-80，3％麸皮，pH 7.5。

发酵条件设置：发酵初期(0～24h)，温度为33℃，无菌空气流量为125L/h，搅拌转速为180r/min，通过自动滴加格雷特消泡剂控制发酵罐中泡沫水平；

发酵中后期(24h～结束)，温度27℃，无菌空气流量为175L/h，搅拌转速为300r/min，通过自动滴加格雷特消泡剂控制发酵罐中泡沫水平。

2)实验结果

贝莱斯芽孢杆菌LfF-1菌株发酵罐小试过程中各工艺参数的变化曲线结果如图20所示，可以看出，由于发酵罐供氧及传质效率显著优于摇瓶；因此，LfF-1菌株在发酵罐中生长及发酵产酶的速率均显著比摇瓶阶段要高：菌体生长在24h左右基本达到顶峰，蛋白酶积累量在48h左右达到峰值，最大产率达到了13000U/mL，相比于摇瓶发酵提前了44h，产率提高了约30％。由于发酵罐中菌体生长及代谢非常旺盛，到发酵中期(24～48h)，培养基中氧气及营养物质的供应不足，导致菌体生长代谢受阻，过早凋亡；因此，在40h后，发酵培养基的pH就出现了逐渐上升的趋势。另外，由于无菌空气流量较大，菌体呼吸强度高，培养基的蒸发量大，到后期发酵罐中培养基体积较发酵初期有大幅度的减少(由初始的2.5L减少到1.8L)，培养液的粘度显著增加。

(2)补料分批发酵工艺的小试

为了改善发酵后期菌体的生长代谢环境，进一步考察该菌株的补料分批发酵工艺，具体的实验方法和实验结果如下：

1)实验方法

发酵条件设置：发酵初期(0～24h)，发酵温度为33℃，无菌空气流量为125L/h，搅拌转速为180r/min，通过自动滴加格雷特消泡剂控制发酵罐中泡沫水平；

发酵中后期(24h～结束)，发酵温度27℃，无菌空气流量为210L/h，搅拌转速为350r/min，通过自动滴加格雷特消泡剂控制发酵罐中泡沫水平，按10mL/min的流量向发酵罐中流加2L已灭菌处理的、已过滤去除麸皮渣的发酵培养基。

2)实验结果

贝莱斯芽孢杆菌LfF-1菌株补料分批发酵过程中各工艺参数的变化曲线结果如图21所示，可以看出，采用补料分批发酵的方式，可及时补充发酵罐中营养物质，从而使菌体的衰亡期往后推迟了约20h(发酵60h后培养基pH上升，溶氧量增加，说明菌体已开始衰亡)。由于补充了发酵罐中培养基，发酵液得以稀释，使得酶浓度降低，发酵液中酶活增长相对较平缓，但延续了更长时间，在60h左右达到了峰值，最大产率达到11500U/mL；虽然发酵液的最大酶活低于分批发酵，不过，通过补料后，发酵罐中培养液的最终体积可收获3.6L，若是考虑体积因素，补料发酵工艺的生产效率要显著高于分批发酵工艺。

实施例3贝莱斯芽孢杆菌LfF-1菌株蛋白酶制剂的制备

1、蛋白酶液的制备

采用补料分批发酵工艺、5升全自动发酵罐制备蛋白酶液，具体实验方法如下：

发酵中后期(24h～60h)，温度27℃，无菌空气流量为210L/h，搅拌转速为350r/min，通过自动滴加格雷特消泡剂控制发酵罐中泡沫水平，按10mL/min的流量向发酵罐中流加已灭菌处理的发酵培养基2L(过滤除去原培养基麸皮渣)。

将发酵液从发酵罐中取出后用滤布进行过滤，收集滤液；滤液在4℃、10000r/min的条件下离心10min，收集上清液即为蛋白酶液。

2、蛋白酶冻干粉的制备

(1)冻干保护剂的筛选

1)实验方法

在上述制备得到的蛋白酶液中分别加入不同类型的冻干保护剂：脱脂奶粉、乳糖、麦芽糖、蔗糖、甘露糖、海藻糖，最终浓度均为3％；混匀后将蛋白酶液置于-50℃的冰箱中冻结；将完全冻结的蛋白酶液置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥；观察冻干粉的形态、水溶性，并测定冻干粉的酶活。

2)实验结果

不同冻干保护剂对制备得到的蛋白酶冻干粉的影响结果如表3所示，可以看出，添加乳糖后，制备得到的蛋白酶冻干粉形态呈粉状、具有较好的干粉形态，水溶性好，冻干过程中蛋白酶活力和回收率均最高，可达到93.7％；因此，乳糖是LfF-1菌株蛋白酶的最佳冻干保护剂。

表3不同冻干保护剂制备得到的蛋白酶冻干粉的影响结果

(2)冻干保护剂添加量的确定

1)实验方法

在蛋白酶液中分别添加不同浓度(0.5％、1.0％、1.5％、2.0％、2.5％、3.0％、4.0％、5.0％)的乳糖，混匀后将蛋白酶液置于-50℃的冰箱中冻结，将完全冻结的蛋白酶液置于真空冷冻干燥机中冷冻干燥；观察冻干粉的形态、水溶性，并测定冻干粉的酶活。

2)实验结果

冻干保护剂添加量对制备得到的蛋白酶冻干粉的影响结果如表4所示，可以看出，蛋白酶液中乳糖添加量在大于或等于1.5％时，冷冻干燥制备得到的蛋白酶冻干粉成形效果较好，蛋白酶活力高达17.84万U/g，酶活回收率高达96.8％；若乳糖添加量过低，则蛋白酶冻干粉成形困难，而且冻干保护效果不理想，酶活回收率也低。但随着乳糖添加量的增加，蛋白酶冻干粉被乳糖所稀释，从而导致单位质量蛋白酶冻干粉的酶活降低，蛋白酶冻干粉品质下降；因此，确定蛋白酶液中乳糖的最佳添加量为1.5％。

表4冻干保护剂添加量对制备得到的蛋白酶冻干粉的影响结果

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 岭南师范学院

<120> 一株贝莱斯芽孢杆菌LfF-1菌株及其在生产蛋白酶中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1470

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

actgcaagtc gagcggacag atgggagctt gctccctgat gttagcggcg gacgggtgag 60

taacacgtgg gtaacctgcc tgtaagactg ggataactcc gggaaaccgg ggctaatacc 120

ggatggttgt ttgaaccgca tggttcagac ataaaaggtg gcttcggcta ccacttacag 180

atggacccgc ggcgcattag ctagttggtg aggtaacggc tcaccaaggc gacgatgcgt 240

agccgacctg agagggtgat cggccacact gggactgaga cacggcccag actcctacgg 300

gaggcagcag tagggaatct tccgcaatgg acgaaagtct gacggagcaa cgccgcgtga 360

gtgatgaagg ttttcggatc gtaaagctct gttgttaggg aagaacaagt gccgttcaaa 420

tagggcggca ccttgacggt acctaaccag aaagccacgg ctaactacgt gccagcagcc 480

gcggtaatac gtaggtggca agcgttgtcc ggaattattg ggcgtaaagg gctcgcaggc 540

ggtttcttaa gtctgatgtg aaagcccccg gctcaaccgg ggagggtcat tggaaactgg 600

ggaacttgag tgcagaagag gagagtggaa ttccacgtgt agcggtgaaa tgcgtagaga 660

tgtggaggaa caccagtggc gaaggcgact ctctggtctg taactgacgc tgaggagcga 720

aagcgtgggg agcgaacagg attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa cgatgagtgc 780

taagtgttag ggggtttccg ccccttagtg ctgcagctaa cgcattaagc actccgcctg 840

gggagtacgg tcgcaagact gaaactcaaa ggaattgacg ggggcccgca caagcggtgg 900

agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgaa gaaccttacc aggtcttgac atcctctgac 960

aatcctagag ataggacgtc cccttcgggg gcagagtgac aggtggtgca tggttgtcgt 1020

cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga gcgcaaccct tgatcttagt 1080

tgccagcatt cagttgggca ctctaaggtg actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg 1140

gatgacgtca aatcatcatg ccccttatga cctgggctac acacgtgcta caatggacag 1200

aacaaagggc agcgaaaccg cgaggttaag ccaatcccac aaatctgttc tcagttcgga 1260

tcgcagtctg caactcgact gcgtgaagct ggaatcgcta gtaatcgcgg atcagcatgc 1320

cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca caccgcccgt cacaccacga gagtttgtaa 1380

cacccgaagt cggtgaggta accttttagg agccagccgc cgaaggtggg acagatgatt 1440

ggggtgaagt cgtacaaagg gtaaccaaat 1470

<210> 2

<211> 852

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atccggcggt cttcacggtg taggggcgtc tgtcgtaaac gccttgtcga ctactcttga 60

cgttacggtt catcgtgacg gaaaaatcca ctatcaggcg tacgagcgcg gtgtgcctgt 120

ggccgatctt gaagtgatcg gagatactga taagaccgga acgattacgc acttcgttcc 180

ggatccggaa atcttcaaag aaacaactgt atacgactat gatctgcttt caaatcgtgt 240

ccgggaattg gccttcctga caaaaggcgt aaacatcacg atcgaagaca aacgtgaagg 300

acaagaacgg aaaaacgagt accactatga aggcggaatc aaaagctatg ttgagtactt 360

aaaccgttcc aaagaagtcg ttcatgaaga gccgatttat atcgaaggcg agaaagacgg 420

cataacggtt gaagttgcat tgcaatacaa cgacagctat acaagcaata tttattcttt 480

cacaaataat atcaacacat acgaaggcgg cacgcacgaa gccggattta aaaccggtct 540

gacccgtgtc ataaacgact atgcaagaag aaaagggatt ttcaaagaaa atgatccgaa 600

tttaagtggg gatgatgtga gagaagggct gactgccatt atttcaatta agcaccctga 660

tccgcaattc gaagggcaga cgaaaaccaa gctcggcaac tctgaagcga gaacgatcac 720

tgacacgctg ttttcttctg cgctggaaac attccttctt gaaaatccgg actcagcccg 780

caaaatcgtt gaaaaggttt aatggccgca agagcgcgga tggcagcgaa aaagcgcggg 840

aattgacccg cc 852

Claims

1.一株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)LfF-1菌株，其特征在于，该菌株已于2019年8月16日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为GDMCC NO：60741。

2.包含权利要求1所述贝莱斯芽孢杆菌LfF-1菌株的微生物制剂。

3.权利要求1所述贝莱斯芽孢杆菌LfF-1菌株或权利要求2所述微生物制剂在生产蛋白酶中的应用。

4.权利要求1所述贝莱斯芽孢杆菌LfF-1菌株或权利要求2所述微生物制剂在制备蛋白酶制剂中的应用。

5.一种蛋白酶制剂，其特征在于，包含权利要求1所述贝莱斯芽孢杆菌LfF-1菌株或权利要求2所述微生物制剂。

6.一种生产蛋白酶的方法，其特征在于，将权利要求1所述贝莱斯芽孢杆菌LfF-1菌株在发酵培养基中进行发酵，即可得到所述蛋白酶。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基的配方为：2％～4％乳糖，1％～4％牛肉膏，0.1％～0.7％KH₂PO₄，0.05％～0.1％吐温-80，2％～4％麸皮，pH 6.5～8。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基的配方为：2.5％～3.5％乳糖，2％～3％牛肉膏，0.4％～0.6％KH₂PO₄，0.05％～0.08％吐温-80，2.5％～3.5％麸皮，pH 7.0～7.5。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述发酵为变温补料分批发酵；所述变温补料分批发酵的总时间为55～65h。

10.一种生产蛋白酶制剂的方法，在权利要求6～9任一所述方法制备得到的蛋白酶中添加冻干保护剂，真空冷冻干燥，即可得到所述蛋白酶制剂。