CN110343652A - 一种低产高级醇啤酒酵母菌株及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种低产高级醇啤酒酵母菌株及其构建方法，属于生物工程技术领域。本发明低产高级醇啤酒酵母菌株是通过敲出啤酒酵母氮分解代谢抑制基因转录的关键调控因子GAT1基因权序列来获得的。所述低产高级醇啤酒酵母菌株在以小麦为原料的发酵培养基中发酵后，较亲本菌株的高级醇总量降低了21.42％。本发明的菌株发酵性能及生长性能良好，未出现影响重组菌株生长性能或其他情况。

Description

一种低产高级醇啤酒酵母菌株及其构建方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及工业微生物的育种，具体涉及一种低产高级醇啤酒酵母菌株及其构建方法。

背景技术

啤酒中的风味物质主要有高级醇类、酯类、醛类、酚类、酸类、连二酮类等。其中，高级醇是形成啤酒风味和口感的重要的化学物质之一。文献《啤酒生产中高级醇的形成与低产高级醇酵母菌种的选育》以及《控制上面发酵小麦啤酒中高级醇含量的研究进展》中指出，适宜的高级醇含量具有使啤酒口感和香气丰满，酒体柔和协调的作用，但高级醇含量过高，会导致啤酒形成异杂味，不仅影响啤酒的饮用口感和风味质量，而且饮用后还会产生口渴、头痛等症状，对饮用者的身体产生明显的副作用，不利于饮用者的身体健康。因此降低啤酒的高级醇含量对于增强啤酒风味协调性具有非常重要的意义。由于小麦原料蛋白质含量较高、营养丰富，属稞麦、无皮壳，过滤时不能形成良好的滤层，造成过滤困难，一般采用上面发酵啤酒酵母菌种在较高温度下(主发酵温度16-20℃)发酵生产啤酒。小麦啤酒的高级醇含量一般高达300mg/L左右甚至更高，为大麦啤酒的三倍以上，饮后副作用明显，这是阻遏小麦啤酒发展的主要原因之一。工业上为了降低小麦啤酒中高级醇含量通常会调整麦芽汁制备工艺路线，降低α-氨基氮含量，从而降低发酵后啤酒中高级醇的含量，但是对会对啤酒的成品风格造成影响；另一种方式是调整发酵参数，这不仅会影响酵母的生长繁殖，降低发酵速率，也会影响成品啤酒中，除高级醇以外的其他风味物质的含量，导致啤酒风格的变化。

文章《Function and regulation of yeast genes involved in higheralcohol and ester metabolism during beverage fermentation》中报道，高级醇能够抑制神经中枢，对交感神经和视觉神经等产生伤害，其麻醉作用要强于乙醇，其中，丙醇的毒性是乙醇的8.5倍，异丁醇为乙醇的8倍，异戊醇是乙醇的19倍；同时高级醇在人体内分解氧化速度慢，代谢停留时间长；这些因素导致了饮用高级醇含量过高的啤酒会引起饮用者口渴、头痛等症状，这也是导致饮用啤酒醉酒较慢、醉酒后较难醒酒的主要原因。过量的高级醇是啤酒异杂味的主要来源，过量的正丙醇似醚臭、有苦味；过量的丁醇会构成啤酒典型的杂醇油臭味，同时产生不愉快的苦味；若戊醇超标则有腐败味和汗臭味；高级醇类物质及其与乙酸反应生成的代谢衍生物，主要有乙酸异戊酯、乙酸异丁酯、乙酸苯乙酯等，以及乙酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯等酯类物质的含量和比值(醇酯比，高级醇与酯类含量之比)对啤酒的风味具有极其重要的影响和贡献。

啤酒中高级醇的生成途径有两种：啤酒酵母合成高级醇的代谢途径主要有两条：一条是α-酮酸分解代谢途径称为埃尔利希途径，即氨基酸分解代谢途径；另一条为α-酮酸合成代谢途径称为哈里斯途径，即高级醇合成代谢途径。已有文献报道的调控高级醇含量的基因工程育种几乎都是围绕这两条途径展开的。例如，Eden等研究发现敲除BAT1和BAT2基因均能够有效降低高级醇的生成量，石钰等研究发现ILV1基因缺失的重组菌株的正丙醇生成量明显降低。但这些报道，大多是构建的啤酒酵母及下面发酵酵母，针对小麦啤酒所用的上面发酵酵母高级醇代谢相关基因的改造与育种鲜有报道。此外，现代小麦啤酒发酵中有很多工艺方法来降低高级醇含量，比如韩龙在啤酒发酵中通过改变酵母接种量、发酵温度、发酵压力等工艺参数降低高级醇含量，但是在实际的生产中，不同批次间调控效果差异较大，应用并不理想。降低小麦啤酒中高级醇含量的根本方法是构建低产高级醇菌株。

发明内容

本发明的目的是基于上述问题，针对小麦啤酒所用的啤酒酵母，通过调控氮代谢途径构建低产高级醇的啤酒酵母菌株。

本发明为解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

本发明提供了一株通过敲除啤酒酵母出发菌株中编码通用型氨基酸渗透酶Gap1p的GAT1基因全序列，获得低产高级醇的啤酒酵母菌株。

所述GAT1基因其Gene ID为：850523，核苷酸序列见序列表中SEQ NO:1所示。

本发明所述GAT1基因是啤酒酵母氮分解代谢抑制基因转录的关键调控因子。这种氮分解代谢抑制作用抑制精氨酸和丙氨酸的摄取，并刺激支链氨基酸和芳香氨基酸的消耗。GAT1基因编码啤酒酵母通用型氨基酸渗透酶Gap1p，Gap1p能够转运蛋白质中所有常见氨基酸的D-和L-异构体；它是一种受氨基酸丰度调节的诱导型氨基酸渗透酶。

优选地，所述啤酒酵母出发菌株具体为啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)S17，保藏编号为No.CICC1929。

所述低产高级醇的啤酒酵母菌株的构建方法，包括如下步骤：

(1)以所述出发菌株的基因组为模板，扩增得到GAT1基因的上、下游序列；

(2)将所述GAT1基因的上、下游序列的DNA分子以及标记基因KanMX转化至所述出发菌株中，得到重组菌株；

(3)采用Cre-LoxP报告基因挽救***剔除所述重组菌株中的KanMX抗性基因，并丢失以此引入的pSH-Zeocin质粒；

(4)二倍体工业菌株重复所述步骤(1)-(3)。

进一步地，所述低产高级醇的啤酒酵母菌株的构建方法，具体步骤如下：

1)以所述出发菌株的基因组为模板，PCR扩增GAT1基因的上、下游同源序列；

2)以质粒pUG6为模板，PCR扩增得到含有KanMX标记基因的PCR产物；

3)通过醋酸锂化学转化法，将步骤1)和2)获得的PCR产物转化到所述出发菌株中，用G418抗性平板筛选转化子，挑选在G418抗性平板上生长的转化子进行PCR验证，筛选获得阳性转化子，得到重组菌株；

4)利用Cre/loxP报告基因挽救***，将pSH-Zeocin质粒用醋酸锂化学转化到所述步骤3)的重组菌株中，PCR验证筛选得到剔除KanMX抗性标记的转化子，得到基因工程菌株。

5)将步骤4)所得基因工程菌株进行传代培养，以丢弃其中游离的pSH-Zeocin质粒，选取第4-5代及以上代数的菌株，从中提取酵母质粒并以此为模板，用引物进行PCR扩增，验证pSH-Zeocin质粒是否丢失；

6)将所述步骤5)筛选获得的菌株进行第二个等位基因的敲除：

利用步骤3)中所述方法向所述步骤5)中得到的菌株中导入利用所述步骤1)和2)方法所获得的重组片段，筛选得第二个等位基因缺失的重组菌株，并按照所述步骤4)和5)方法去除KanMX抗性基因并丢弃pSH-Zeocin质粒。

进一步地，所述步骤2)中，是以质粒pUG6为模板，以GAT1K-F(如SEQ NO:4所示)和GAT1K-R(如SEQ NO:5所示)为引物对PCR扩增GAT1基因一个等位敲除的loxP-KanMX1-loxP片段。

所述重组菌株可通过上述方法构建获得，这些方法已有许多文献报道，如文献：Gietz R D，Schiestl R H.High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SScarrier DNA/PEG method.[J].Nature Protocols，2007，2(1)：38-41。同时也可用本领域已知的其它方法来构建基因突变的酵母菌株。

本发明的另一目的是提供所述低产高级醇的啤酒酵母菌株的用途。

优选地，所述低产高级醇的啤酒酵母菌株在啤酒发酵中的用途。

本发明中，所述啤酒酵母S17来源于文章：Sun Z G,Wang M Q,Wang Y P,etal.Identification by comparative transcriptomics of core regulatory genes forhigher alcohol production in a top-fermenting yeast at different temperaturesin beer fermentation[J].2019.

所述pSH-Zeocin质粒来源于文章：Li W,Chen S J,Wang J H,et al.Geneticengineering to alter carbon flux for various higher alcohol productions bySaccharomyces cerevisiae for Chinese Baijiu fermentation[J].AppliedMicrobiology and Biotechnology,2018.(第4页表格中)

本发明所述低产高级醇的啤酒酵母菌株在其他发酵性能不受影响的情况下，在以小麦为原料的发酵培养基中发酵后，较亲本菌株的高级醇总量降低了21.42％。本发明的菌株发酵性能及生长性能良好，未出现影响重组菌株生长性能或其他情况。

有益效果：

1.本发明提供的低产高级醇啤酒酵母菌株能够在保持良好发酵性能的前提下，调控GATA家族转录因子Gat1p的表达，达到降低高级醇的效果，为酿造风味良好，口感独特的小麦啤酒奠定了理论基础。

2.本发明选育得到的酵母高级醇生成量明显降低。在经过小麦啤酒发酵后得出结论，进行GAT1基因两个等位敲除后，菌株S17-DΔgat1-k-p的高级醇总量为232.6mg/L，亲本菌株S17的高级醇总量为296.0mg/L。敲除GAT1两个等位基因后菌株相比较亲本菌株的高级醇总量降低了21.42％。

本发明的菌株发酵性能及生长性能良好，未出现影响重组菌株生长性能或其他情况。此外该菌株除高级醇以外的其他风味物质的含量并未受影响，完好地保留了啤酒中的风味物质。

附图说明

图1为同源重组菌株构建流程图；

图2为GAT1A、GAT1B、loxP-KanMX1-loxP片段的电泳图，

其中，M为DL5000 DNA marker；1泳道是以啤酒酵母S17基因组为模板，GAT1A-F和GAT1A-R为引物对PCR扩增的结果(564bp单一条带)；2泳道是以啤酒酵母S17基因组为模板，GAT1B-F和GAT1B-R为引物对PCR扩增的结果(729bp单一条带)；3泳道是以质粒pUG6基因组为模板，GAT1K-F和GAT1K-R为引物对PCR扩增的结果(1663bp单一条带)；

图3为成功敲除GAT1一个等位基因的酵母菌株S17-Δgat1验证电泳图，

其中，M泳道为DL5000 DNA marker；1泳道为上游引物GAT1-M1-U及GAT1-M1-D的PCR产物是一条大小2225bp的特异性条带；2泳道为下游引物GAT1-M2-U及GAT1-M2-D的PCR产物，经0.8％的琼脂糖凝胶电泳，可看到一条大小2887bp的特异性条带；3，4泳道为阴性对照，无条带；

图4为S17-Δgat1菌株剔除KanMX抗性基因的验证电泳图，

其中，M泳道是DL5000 DNA marker；1泳道是以重组菌株S17-Δgat1的基因组为模板，K-F与K-R为引物对PCR扩增得到的片段(1613bp单一片段)；2泳道是以S17-Δgat1-k基因组为模板，K-F与K-R为引物对PCR扩增得到的结果；

图5为S17-Δgat-k菌株丢弃pSH-Zeocin质粒的验证电泳图，

其中，M泳道是DL5000 DNA marker；1泳道是以pSH-Zeocin质粒为模板，Zn-F与Zn-R为引物对PCR扩增得到的片段(1172bp单一片段)；2泳道是以S17-Δbio5-k-p基因组为模板，Zn-F与Zn-R为引物对PCR扩增得到的结果；

图6为DGAT1A、DGAT1B、D-loxP-KanMX1-loxP片段的电泳图，

其中，M泳道是DL5000 DNA marker；1泳道是以啤酒酵母S17基因组为模板，DGAT1A-F和DGAT1A-R为引物对PCR扩增的结果(486bp单一条带)；2泳道是以啤酒酵母S17基因组为模板，DGAT1B-F和DGAT1B-R为引物对PCR扩增的结果(410bp单一条带)；3泳道是以质粒pUG6基因组为模板，DGAT1K-F和DGAT1K-R为引物对PCR扩增的结果(1663bp单一条带)；

图7为成功敲除GAT1两个等位基因的酵母菌株验证电泳图，

其中，M泳道是DL5000 DNA marker；1泳道是以重组菌株DΔgat1的基因组为模板，DGAT1-M1-U与DGAT1-M1-D为引物对PCR扩增得到的片段(1349bp单一片段)；2泳道是以S17-Δgat1-k的基因组为模板，DGAT1-M1-U与DGAT1-M1-D为引物对PCR扩增得到的结果；3泳道是以重组菌株S17-DΔgat1的基因组为模板，DGAT1-M2-U与DGAT1-M2-D为引物对PCR扩增得到的片段(1632bp单一片段)；4泳道是以S17-Δgat1-k基因组为模板，DGAT1-M2-U与DGAT1-M2-D为引物对PCR扩增得到的结果；

图8为S17-DΔgat1菌株剔除KanMX抗性基因的验证电泳图，

其中，M泳道是DL5000 DNA marker；1泳道是以重组菌株S17-DΔgat1的基因组为模板，K-F与K-R为引物对PCR扩增得到的片段(1613bp单一片段)；2泳道是以S17-DΔgat1-k基因组为模板，K-F与K-R为引物对PCR扩增得到的结果；

图9为S17-DΔgat1-k菌株丢弃pSH-Zeocin质粒的验证电泳图，

其中，M泳道是DL5000 DNA marker；1泳道是以pSH-Zeocin质粒为模板，Zn-F与Zn-R为引物对PCR扩增得到的片段(1172bp单一片段)；2泳道是以S17-DΔgat1-k-p基因组为模板，Zn-F与Zn-R为引物对PCR扩增得到的结果；

图10为重组菌株的发酵工艺路线图。

具体实施方式

下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。

本发明所使用的啤酒酵母是可以采用任何来源的啤酒酵母菌株。

实施例1：低产高级醇啤酒酵母工程菌株的构建

出发菌株啤酒酵母S17通过同源重组的方法构建重组基因工程菌株。

根据Genebank中的酵母基因组数据和整合质粒序列，设计了下述实施例中各引物。

表1本实施例中所用到的PCR引物

菌株主要构建过程如下(同源重组菌株构建流程图如附图1所示)：

1)GAT1基因一个等位敲除所需片段的扩增

以啤酒酵母S17的基因组为模板，以GAT1A-F和GAT1A-R为引物对PCR扩增GAT1基因一个等位敲除的上游同源序列GAT1A片段，长度为564bp；以啤酒酵母S17的基因组为模板，以GAT1B-F和GAT1B-R为引物对PCR扩增GAT1基因一个等位敲除的下游同源序列GAT1B片段，长度为729bp；以质粒pUG6为模板，以GAT1K-F和GAT1K-R为引物对PCR扩增GAT1基因一个等位敲除的loxP-KanMX1-loxP片段，长度为1663bp，其中GAT1A、GAT1B、loxP-KanMX1-loxP片段的电泳图如附图2所示。

2)GAT1基因一个等位敲除重组酵母菌株的构建

将扩增得到的三个片段进行PCR纯化回收后，用醋酸锂转化法将其转化到啤酒酵母菌株中，挑取G418抗性平板上生长较好的转化子，进行初筛。

3)GAT1基因一个等位敲除重组酵母菌株的验证

根据啤酒酵母重组位点两端的基因序列和***的同源重组序列，分别设计两组上下游引物，即为：GAT1-M1-U，GAT1-M1-D，GAT1-M2-U，GAT1-M2-D，以生长较好转化子基因组为模板，进行PCR扩增，验证转化子。将得到的PCR产物分别进行0.8％的琼脂糖凝胶电泳。上游验证得到2225bp条带(核苷酸序列如SEQ NO:26所示)，下游验证得到2887bp条带(核苷酸序列如SEQ NO:27所示)，说明三个片段已成功整合到啤酒酵母菌株S17中，即S17中GAT1的一个等位基因被成功敲除，命名为S17-Δgat1，验证电泳图如附图3所示，2泳道的PCR产物，经0.8％的琼脂糖凝胶电泳，可看到一条大小2887bp的特异性条带，其大小与预期一致。3，4泳道为阴性对照，无条带与预期一致。说明三个重组片段已成功同源重组到啤酒酵母S17基因组中，并且重组位置也正确，S17-Δgat1菌株构建成功。。

4)重组菌株S17-Δgat1中KanMX抗性基因的剔除

利用Cre/loxP报告基因挽救***，将pSH-Zeocin质粒用醋酸锂化学转化到含有KanMX抗性基因的啤酒酵母菌株阳性转化子S17-Δgat1中，涂布于含100μg/mL的Zeocin抗性YEPD平板上，30℃避光培养36h。挑取长势较好个头较大的菌落，接种于YEPD液体培养基中，用酵母质粒提取试剂盒提取质粒后，PCR验证pSH-Zeocin是否导入成功。将已成功导入pSH-Zeocin质粒的重组菌株接入到半乳糖诱导液态培养基中培养4-5h，然后稀释涂布在普通YEPD平板上。挑出单菌落点接于不含抗性的YEPD平板上，再影印到含有G418抗性的YEPD培养基上。在YEPD上生长而在含有G418的平板上不生长即为所得到的菌株。提取酵母基因组，并以K-F和K-R为引物，通过PCR验证筛选获得剔除KanMX抗性标记的转化子，命名为S17-Δgat1-k，验证电泳图如附图4所示，2泳道无条带与预期一致，说明S17-Δgat1已成功剔除KanMX抗性基因，S17-Δgat-k菌株构建成功。

5)重组菌株S17-Δgat1-k中游离pSH-Zeocin质粒的丢弃

将已剔除KanMX抗性基因的重组菌株S17-Δgat1-k接种于装有新鲜YEPD液体培养基的试管中，每12h转接一次，转接次数一般为7～9次。提取经多次转接传代后的重组菌株S17-Δgap1-k的基因组，以pSH-Zeocin质粒为阳性对照，并以Zn-F和Zn-R为引物，对重组菌株进行PCR验证，与未传代转化子对照，通过PCR验证筛选获得成功丢弃pSH-Zeocin质粒的重组菌株，命名为S17-Δgat1-k-p，验证电泳图如附图5所示，与预期一致，说明S17-Δbio5-k菌株已成功丢弃pSH-Zeocin质粒，S17-Δbio5-k-p菌株构建成功。

6)GAT1基因第二个等位基因敲除所需片段的扩增

以啤酒酵母S17的基因组为模板，以DGAT1A-F和DGAT1A-R为引物，PCR扩增GAT1基因两个等位敲除所需的上游同源序列DGAT1A片段，长度为486bp。以啤酒酵母S17的基因组为模板，以DGAT1B-F和DGAT1B-R为引物，PCR扩增GAT1基因两个等位敲除所需的下游同源序列DGAT1B片段，长度为410bp。以质粒pUG6为模板DGAT1K-F和DGAT1K-R为引物，PCR扩增GAT1基因两个等位敲除所需的D-loxP-KanMX1-loxP片段，长度为1663bp，其中DGAT1A、DGAT1B、D-loxP-KanMX1-loxP片段的电泳图如附图6所示。

7)GAT1基因第二个等位基因敲除重组酵母菌株的构建

通过醋酸锂化学转化法，将GAT1基因两个等位敲除所需的上游同源序列DGAT1A片段、下游同源序列DGAT1B片段和D-loxP-KanMX1-loxP片段转化重组菌株S17-Δgat1-k-p中。挑取G418抗性平板上生长较好的转化子，进行初筛。

8)GAT1基因第二个等位基因敲除重组酵母菌株的验证

根据酵母重组位点两端的基因序列和***的同源重组序列，分别设计两组上下游引物，即为：DGAT1-M1-U，DGAT1-M1-D，DGAT1-M2-U，DGAT1-M2-D，以生长较好转化子基因组为模板，进行PCR扩增，验证转化子。将得到的PCR产物分别进行0.8％的琼脂糖凝胶电泳。上游验证得到1349bp条带(核苷酸序列如SEQ NO:28所示)，下游验证得到1632bp(核苷酸序列如SEQ NO:29所示)条带，说明三个片段已成功整合到重组菌株S17-Δgat1-k-p中，且整合位置正确。即出发菌株S17中GAT1的两个等位基因被成功敲除，命名为S17-DΔgat1，酵母菌株验证电泳图如附图7所示。验证结果与预期一致，说明GAT1基因两个等位敲除的酵母菌株S17-DΔgat1构建成功。

9)重组菌株S17-DΔgat1中KanMX抗性基因的剔除

利用Cre/loxP报告基因挽救***，将pSH-Zeocin质粒用醋酸锂化学转化到含有KanMX抗性基因的啤酒酵母菌株阳性转化子S17-DΔgat1中，按照步骤4)中方法，以K-F和K-R为引物，通过PCR验证筛选获得剔除KanMX抗性标记的转化子，命名为S17-DΔgat1-k，其验证电泳图如图8所示，验证结果与预期一致，说明S17-DΔgat1已成功剔除KanMX抗性基因，S17-DΔgat1-k菌株构建成功。

10)重组菌株S17-DΔgat1-k中游离pSH-Zeocin质粒的丢弃

通过多次转接传代培养丢失游离的pSH-Zeocin质粒。提取经多次转接传代后的重组菌株S17-DΔgap1-k的基因组，以pSH-Zeocin质粒为阳性对照，并以Zn-F和Zn-R为引物，通过PCR验证，筛选获得成功丢弃pSH-Zeocin质粒的重组菌株，命名为S17-DΔgat1-k-p，验证电泳图如图9所示，与预期一致，说明S17-DΔgat1-k菌株已成功丢弃pSH-Zeocin质粒，S17-DΔgat1-k-p构建成功。

实施例2：重组菌株S17-DΔgat1-k-p小麦啤酒发酵实验

1)发酵工艺路线图：参照附图10.

2)工艺条件：粉碎条件：粉碎度以没有整粒的小麦麦芽为宜，粉碎程度不易过细，以免造成过滤压力过大；液化、糖化条件：粉碎后的小麦麦芽以料水比1:4的比例加入30℃的温水，充分搅拌均匀后，放置于恒温水浴锅中，30℃保持30min，以2.0℃/min升温至65℃，保持90min，迅速升温至78℃，保持10min。糖化过程中每隔5min充分搅拌一次；过滤条件：糖化后的小麦麦芽汁趁热过滤，并用75℃的热水洗糟3次；煮沸条件：将过滤液放置于电磁炉上蒸煮，沸腾后40min加入3‰的苦味酒花(以麦芽重量计)，煮沸时间为70min；冷却条件：自然冷却至室温；离心条件：4000r/min离心5min；麦汁浓度调整条件：调整糖度为12°P；灭菌条件：115℃灭菌20min。

3)小麦麦芽：500g；加水2000mL；酒花1.5g；酵母接种量：10％w/v，于20℃静置发酵。

按上述发酵工艺对啤酒酵母出发菌株S17和选育菌株S17-DΔgat1-k-p进行小麦啤酒发酵实验；发酵期间每隔12h振荡并称重，记录失重；发酵96h时，S17和选育菌株S17-DΔgat1-k-p的失重不再减小，认为发酵结束，停止培养，并称重；测定发酵液的失重、酒精度、残糖、真正发酵度以及主要香气成分含量。以失重、酒精度、残糖、真正发酵度表征其发酵性能，结果见表2；主要香气成分含量结果见表3。

4)GC测定分析方法：发酵液经蒸馏后，酒样进行气相色谱分析，色谱条件为：毛细管色谱柱LZP-930，50m×320μm×1.0μm，载气为纯度为99.99％的氮气，分流比1:10。进样口温度200℃，检测器温度200℃，进样量1μL。采用程序升温，50℃保持8min，5℃/min升温，升温至150℃，保持15min。为保持数据的准确性，每个样品进样两次，取平均值。在同一色谱条件下，用已知的高级醇类标准品色谱峰的保留时间与样品中高级醇类物质色谱峰的保留时间对照进行分析。

表2表明：小麦啤酒发酵实验时，本发明所获得的啤酒酵母菌株与初始的原菌相比，发酵性能没有明显变化。GAT1基因的两个等位敲除没有对啤酒酵母S17的发酵性能产生影响。

表2小麦原料啤酒发酵的发酵性能

注：所示数据为三个平行试验结果的平均值

表3表明，相比亲本菌株S17，本发明得到的菌株S17-DΔgat1-k-p的各个高级醇均有不同程度的降低。从高级醇总量来看，亲本菌株S17的高级醇总量是296.0mg/L，而本发明得到的菌株的高级醇生成量为232.6mg/L，相比较亲本菌株降低了21.42％。这说明本发明得到的菌株可以在很大程度上降低小麦啤酒酒中高级醇的含量，为优化啤酒口感，提供了理论基础。

表3小麦原料啤酒发酵的主要香气成分含量(mg/L)

针对此次试验两株菌株酿造的小麦啤酒进行了感官品评(评委由本实验室四位啤酒专家组成)，表4表明：与原始菌株S17相比，本发明得到的双敲除GAT1基因的重组菌株S17-DΔgat1-k-p通过上面发酵制得的小麦啤酒的口感有明显提高，饮后上头现象得到改善。这说明本发明得到的菌株可以在很大程度上优化啤酒口感。

表4小麦原料啤酒发酵的品评结果

此外经测定，啤酒酵母S17所产乙酸乙酯、乙酸异戊酯含量分别为27.5mg/L以及5.5mg/L，总量为33mg/L。本发明中双敲除GAT1基因的重组菌株菌株S17-DΔgat1-k-p的乙酸乙酯、乙酸异戊酯含量含量与出发菌株S17含量相近，并无明显差异。需要说明的是小麦啤酒的醇酯比过高会对啤酒的口感产生不好的影响，一方面在适当降低高级醇的生成量，可显著提升啤酒的口感，在此基础上，如能继续保持或者提高酯类物质含量会更进一步地提高啤酒的口感。

本发明中重组菌株菌株S17-DΔgat1-k-p即实现了在降低高级醇的基础上，保持了酯类(乙酸乙酯、乙酸异戊酯)的产量，由此说明通过基因的敲出没有对重组菌株中除高级醇以外的其他风味物质(如酯类物质)的含量产生影响，完好地保留了啤酒中的风味物质。

序列表

<110> 天津科技大学

<120> 一种低产高级醇啤酒酵母菌株及其构建方法

<130> 1

<141> 2019-07-24

<160> 29

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1533

<212> DNA

<213> 啤酒酵母 S17()

<400> 1

atgcacgttt tctttccttt gcttttccgc ccttcccctg ttctgttcat cgcatgtgca 60

tatatatata tagatatata tatacattgt acacggtgca cggtagtgaa cataactatg 120

agcacgaaca gagtcccgaa cctcgacccg gacttgaatt taaacaaaga aatctgggac 180

ctgtactcga gcgcccagaa aatattgccc gattctaacc gtattttgaa cctttcttgg 240

cgtttgcata accgcacgtc tttccatcga attaaccgca taatgcaaca ttctaactct 300

attatggact tctccgcctc gccctttgcc agcggcgtga acgccgctgg cccaggcaac 360

aacgacctcg atgacaccga tactgataac cagcaattct tcctttcaga catgaacctc 420

aacggatctt ctgtttttga aaatgtgttt gacgacgatg acgatgatga tgacgtggag 480

acgcactcca ttgtgcactc agacctgctc aacgacatgg acagcgcttc ccagcgtgct 540

tcacataatg cttctggttt ccctaatttt ctggacactt cctgctcgtc ctccttcgat 600

gaccacttta ttttcaccaa taacttacca tttttaaata ataatagcat taataataat 660

catagtcata atagtagtca taataataac agtcccagca tcgccaataa tacaaacgca 720

aacacaaaca caaacacaag tgcaagtaca aacaccaata gtcctttact gagaagaaac 780

ccctccccat ctatagtgaa gcctggctcg cgaagaaatt cctccgtgag gaagaagaaa 840

cctgctttga agaagatcaa gtcttccact tctgtgcaat cttcggctac tccgccttcg 900

aacacctcat ccaatccgga tataaaatgc tccaactgca caacctccac cactccgctg 960

tggaggaagg accccaaggg tcttcccctg tgcaatgctt gcggcctctt cctcaagctc 1020

cacggcgtca caaggcctct gtcgttgaag actgacatca ttaagaagag acagaggtcg 1080

tctaccaaga taaacaacaa tataacgccc cctccatcgt cgtctctcaa tccgggagca 1140

gcagggaaaa agaaaaacta tacagcaagt gtggcagcgt ccaagaggaa gaactcactg 1200

aacattgtcg cacctttgaa gtctcaggac atacccattc cgaagattgc ctcaccttcc 1260

atcccacaat acctccgctc taacactcgc caccaccttt cgagttccgt acccatcgag 1320

gcggaaacgt tctccagctt tcggcctgat atgaatatga ctatgaacat gaaccttcac 1380

aacgcctcaa cctcctcctt caacaatgaa gccttctgga agcctttgga ctccgcaata 1440

gatcatcatt ctggagacac aaatccaaac tcaaacatga acaccactcc aaatggcaat 1500

ctgagcctgg attggttgaa tctgaattta tag 1533

<210> 2

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

ggtcccgctt tccgattt 18

<210> 3

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

cctgcagcgt acgaagcttc agctggtgcg actcatagtg ctgttatt 48

<210> 4

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

aataacagca ctatgagtcg caccagctga agcttcgtac gctgcagg 48

<210> 5

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

aatagatgtt gggtcacagc ataggccact agtggatctg ata 43

<210> 6

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

tatcagatcc actagtggcc tatgctgtga cccaacatct att 43

<210> 7

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

tttcagacac gaccaaa 17

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 8

ccctgttctg ttcatcgc 18

<210> 9

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 9

cctgcagcgt acgaagcttc agctggcaca atggagtgcg tct 43

<210> 10

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 10

agacgcactc cattgtgcca gctgaagctt cgtacgctgc agg 43

<210> 11

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 11

aggtgcgaca atgttcagtg gcataggcca ctagtggatc tgata 45

<210> 12

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 12

tatcagatcc actagtggcc tatgccactg aacattgtcg cacct 45

<210> 13

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 13

tgaagcggac atggaaag 18

<210> 14

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 14

cgatggaccc gaatctcc 18

<210> 15

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 15

ctcagtggca aatcctaa 18

<210> 16

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 16

ggatttgcca ctgaggtt 18

<210> 17

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 17

gccgaccaag ttaccaga 18

<210> 18

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 18

cgcagcatag tgttagtg 18

<210> 19

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 19

ttccgtcagc cagtttag 18

<210> 20

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 20

gactaaactg gctgacgg 18

<210> 21

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 21

aggtctcggt tgctctta 18

<210> 22

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 22

cagctgaagc ttcgtacgc 19

<210> 23

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 23

gcataggcca ctagtggatc tg 22

<210> 24

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 24

cccacacacc atagcttca 19

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 25

agcttgcaaa ttaaagcctt 20

<210> 26

<211> 2225

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 26

cgatggaccc gaatctcccc tgttcgtgaa cggctttgat attgtccatg tatgtcttgt 60

catcgggcaa gtcagcggtt agtgggtcct tgatgtagaa agtgtcttgc aggtcacgag 120

caggatgctg ttgtgggacg taaagggcat cgaagttcca gaaacctgtc tcgacgtatt 180

ggttcgaggg catctctgtg aatcccatgg aaaagaaaat ttgtctaaat tcctctctga 240

ctttgtttaa ggggtgaaga gcacctgaag atatttgcac accttgagaa ttgaaattgt 300

aaggcttgaa cttcaagtcc ttgtatgcat tggtggagac catgtcggag gtaagatcgg 360

tttccaattt ggtgaggtcg gtcgagaact ctggcccttt ggtaacgttg aaatctgtga 420

ttttaccttg agcaattaac tttcttttct tcaagtcgtt caaaatcttg gcgtcaatgc 480

tatccagatg cgagttgttc ttgatttgcg ctagaataga ttgcgtttca tcagtaagct 540

catttaaatc ggtattttgc aattttgcgg agagttcaag ctcgtttgag gcgtttttgg 600

cgatccagcc gttcttgaaa gctctagcct gaccgacctt accaacttga ggacccagtt 660

tggacatcac atctttgatt tgaagttgac ccaactcttg gatgagcttg actagtttaa 720

tttcgtacga accttcattc aaaatttgag caccttcttt ggtcaagtca tacgtaaccg 780

tgtcgacctt ggaaaactct aacttgttgt gggctttcaa agagttcaaa gcggaaagaa 840

catcttgaga gccgtgctga gggaaagttg ccagtgtgga cttgatctca tccaattcat 900

ctagtttttt tagaatttct aattggaagt cagacatctt tacgttaggg ggtgagagag 960

ggaggggggt gcctttaatg tatatatacg taagatatat atatatatgt atatatatgg 1020

aaatgtattc acaactttac atgtgcatta accacaagta ctgcgtacgt tcaagattac 1080

agcaatgcgt tttattaatt tttcaagcat ttttcacgta gagaggaaca aagtttactg 1140

aaaagaaaag aggtagagaa aaacagaaaa attttttttt tctgtttttc ctgcctcttt 1200

tctttgtttg attcaatatg gtcgaccggg taaacccctg ataaaacgat accaaagccg 1260

ggtcacctaa cttatggcca aatgcgaccg gtcccgcttt ccgattttag ccggcgaaga 1320

cgtacttggc gccataatca aaacctagct tgcccaatac ttctgagttc tacgtggtgc 1380

aaaaatattt tttttttttt gaaaaaccta ccctatttca ttatagatgc atccatcagt 1440

attacggtgt cctcacacaa ccctgtctct gcacaacgta atacctcctt ttcccgtctg 1500

ctagctctca tttcgcggta atccaacttc aaccagcaac ccggatcttc tatacgcagt 1560

ccggtgtgtg ggtgcatgac tgattggtcc ggccgataac aggtgtgctt gcacccagtg 1620

cccaacgtca acaaagcagg aacaacgggc tgataaggga gaagataaga taagataaga 1680

taacaaatca ttgcgtccga ccacaggccg acacatagca gaacgatgtg aagcagcgca 1740

gcatagtgtt agtgccggtg cagctaccgc tggtattaac agccaccaca atacagagca 1800

acaataataa cagcactatg agtcgcacca gctgaagctt cgtacgctgc aggtcgacaa 1860

cccttaatat aacttcgtat aatgtatgct atacgaagtt attaggtcta gagatctgtt 1920

tagcttgcct cgtccccgcc gggtcacccg gccagcgaca tggaggccca gaataccctc 1980

cttgacagtc ttgacgtgcg cagctcaggg gcatgatgtg actgtcgccc gtacatttag 2040

cccatacatc cccatgtata atcatttgca tccatacatt ttgatggccg cacggcgcga 2100

agcaaaaatt acggctcctc gctgcagacc tgcgagcagg gaaacgctcc cctcacagac 2160

gcgttgaatt gtccccacgc cgcgcccctg tagagaaata taaaaggtta ggatttgcca 2220

ctgag 2225

<210> 27

<211> 2887

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 27

ggatttgcca ctgaggttct tctttcatat acttcctttt aaaatcttgc taggatacag 60

ttctcacatc acatccgaac ataaacaacc atgggtaagg aaaagactca cgtttcgagg 120

ccgcgattaa attccaacat ggatgctgat ttatatgggt ataaatgggc tcgcgataat 180

gtcgggcaat caggtgcgac aatctatcga ttgtatggga agcccgatgc gccagagttg 240

tttctgaaac atggcaaagg tagcgttgcc aatgatgtta cagatgagat ggtcagacta 300

aactggctga cggaatttat gcctcttccg accatcaagc attttatccg tactcctgat 360

gatgcatggt tactcaccac tgcgatcccc ggcaaaacag cattccaggt attagaagaa 420

tatcctgatt caggtgaaaa tattgttgat gcgctggcag tgttcctgcg ccggttgcat 480

tcgattcctg tttgtaattg tccttttaac agcgatcgcg tatttcgtct cgctcaggcg 540

caatcacgaa tgaataacgg tttggttgat gcgagtgatt ttgatgacga gcgtaatggc 600

tggcctgttg aacaagtctg gaaagaaatg cataagcttt tgccattctc accggattca 660

gtcgtcactc atggtgattt ctcacttgat aaccttattt ttgacgaggg gaaattaata 720

ggttgtattg atgttggacg agtcggaatc gcagaccgat accaggatct tgccatccta 780

tggaactgcc tcggtgagtt ttctccttca ttacagaaac ggctttttca aaaatatggt 840

attgataatc ctgatatgaa taaattgcag tttcatttga tgctcgatga gtttttctaa 900

tcagtactga caataaaaag attcttgttt tcaagaactt gtcatttgta tagttttttt 960

atattgtagt tgttctattt taatcaaatg ttagcgtgat ttatattttt tttcgcctcg 1020

acatcatctg cccagatgcg aagttaagtg cgcagaaagt aatatcatgc gtcaatcgta 1080

tgtgaatgct ggtcgctata ctgctgtcga ttcgatacta acgccgccat ccagtgtcga 1140

aaacgagctc tcgagaaccc ttaatataac ttcgtataat gtatgctata cgaagttatt 1200

aggtgatatc agatccacta gtggcctatg ctgtgaccca acatctattg cggcggtgac 1260

agaatagttg aaaggcgcag ggctcacaca caggaatggc cctcccaaat ttaaaagaga 1320

actaaaccag ttatcctagg caattacttt atttgagtct tatatgacgt cactagaagc 1380

tcagtaagag caaccgagac ctgaacatcc tttttttttt gcttctttat ttggcagcat 1440

ttttcaaaaa taataaaatg gaagccgcga gtacgaacaa tgatgtgttc tgggaatacc 1500

tcgtcaaaac aagacaatgg caaggatttt ctttcatcag gcagaaagat ctggatctga 1560

atggcatcat tttgtgatgt gtaaaagcgg gaccttgtta tttcgacttt ttgcatcatg 1620

ttgatgcaat ttgctacttt tccgacggtg cgctccaacg gatgggtatt tccttaataa 1680

caaggcattt ctctggaagt tggcttactg tttgaaatca cagccggtca caaaataaag 1740

taaaaaaact atctctctcc acaagaagta attacaggtt gtatactaca tatgatcgta 1800

tttctttatg aacactaagg agtttcccgc tgtgtaccgc aatatccaca caaaaggaag 1860

gaagaaactt ctgtggcttg acagataaat aactgcagta gtcggtgcgt actaattgtt 1920

tggtcgtgtc tgaaaaatct tgaattttca gaaaagaata agccccaaat gtcagtgatg 1980

gtagtagcag tactccccta cgattttaga tactttagag agcccacctt cagaatcgga 2040

aggaggataa ttttgtaaag cccttctgtt ttttctcttg cataacttat atttccacat 2100

caaaaagtag tgtgctaaga aaaaggagac gagaaaaagg attacggcac tctctgcatc 2160

tagacatata ccaaaagttg ggtttgctca cgaaaatacc ataattgtgg tgtcaaaaaa 2220

atcctgcctc ataataccac tgcagcaatt gtggatgact aaaaaataac ttgcattcca 2280

cgatgttatt ttactttata aagcacctgc aatttttttt tttgtattaa ctcatcgagt 2340

atgtctgatg tgtaaactga accaggctta atatcgtttc taattcttgt tgtgagaaaa 2400

ctttcctgcc tagtgtattt cgtcagggcg aaccttcgga taggcaccga actccgagat 2460

tcttgctcca atttaagaaa taagcttttt ccgtcccaat acaatagaac attattaaag 2520

ttaataataa aaatggcacg gcaccagttg gaagttaaat cccaacattt gctgcaagaa 2580

tagaaaagaa gtcataacaa atttgcatat tacttacggc ttcaaaaaag caccgaaact 2640

aatcgagaaa gcttataata tcggtataca tttgaatgta ttttaactat ttctatatca 2700

aaaaaaaaaa aaaaaattgt atatttttcg ttattctcta attcgtatca cattttatcc 2760

ctaagggaat ctatctctaa tttgcaatag tgtagatacc gtctgcggat agagcgctag 2820

agatagctgg ctttaatctg ctagagtacc atggaacacc agtgataact ctggtaactt 2880

ggtcggc 2887

<210> 28

<211> 1349

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 28

cgcagcatag tgttagtgcc ggtgcagcta ccgctggtat taacagccac cacaatacag 60

agcaacaata ataacagcac tatgagtcgc acacttgcgg tgcccggccc agccacatat 120

atataggtgt gtgccactcc cggccccggt attagcatgc acgttttctt tcctttgctt 180

ttccgccctt cccctgttct gttcatcgca tgtgcatata tatatataga tatatatata 240

cattgtacac ggtgcacggt agtgaacata actatgagca cgaacagagt cccgaacctc 300

gacccggact tgaatttaaa caaagaaatc tgggacctgt actcgagcgc ccagaaaata 360

ttgcccgatt ctaaccgtat tttgaacctt tcttggcgtt tgcataaccg cacgtctttc 420

catcgaatta accgcataat gcaacattct aactctatta tggacttctc cgcctcgccc 480

tttgccagcg gcgtgaacgc cgctggccca ggcaacaacg acctcgatga caccgatact 540

gataaccagc aattcttcct ttcagacatg aacctcaacg gatcttctgt ttttgaaaat 600

gtgtttgacg acgatgacga tgatgatgac gtggagacgc actccattgt gccagctgaa 660

gcttcgtacg ctgcaggtcg acaaccctta atataacttc gtataatgta tgctatacga 720

agttattagg tctagagatc tgtttagctt gcctcgtccc cgccgggtca cccggccagc 780

gacatggagg cccagaatac cctccttgac agtcttgacg tgcgcagctc aggggcatga 840

tgtgactgtc gcccgtacat ttagcccata catccccatg tataatcatt tgcatccata 900

cattttgatg gccgcacggc gcgaagcaaa aattacggct cctcgctgca gacctgcgag 960

cagggaaacg ctcccctcac agacgcgttg aattgtcccc acgccgcgcc cctgtagaga 1020

aatataaaag gttaggattt gccactgagg ttcttctttc atatacttcc ttttaaaatc 1080

ttgctaggat acagttctca catcacatcc gaacataaac aaccatgggt aaggaaaaga 1140

ctcacgtttc gaggccgcga ttaaattcca acatggatgc tgatttatat gggtataaat 1200

gggctcgcga taatgtcggg caatcaggtg cgacaatcta tcgattgtat gggaagcccg 1260

atgcgccaga gttgtttctg aaacatggca aaggtagcgt tgccaatgat gttacagatg 1320

agatggtcag actaaactgg ctgacggaa 1349

<210> 29

<211> 1632

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 29

gactaaactg gctgacggaa tttatgcctc ttccgaccat caagcatttt atccgtactc 60

ctgatgatgc atggttactc accactgcga tccccggcaa aacagcattc caggtattag 120

aagaatatcc tgattcaggt gaaaatattg ttgatgcgct ggcagtgttc ctgcgccggt 180

tgcattcgat tcctgtttgt aattgtcctt ttaacagcga tcgcgtattt cgtctcgctc 240

aggcgcaatc acgaatgaat aacggtttgg ttgatgcgag tgattttgat gacgagcgta 300

atggctggcc tgttgaacaa gtctggaaag aaatgcataa gcttttgcca ttctcaccgg 360

attcagtcgt cactcatggt gatttctcac ttgataacct tatttttgac gaggggaaat 420

taataggttg tattgatgtt ggacgagtcg gaatcgcaga ccgataccag gatcttgcca 480

tcctatggaa ctgcctcggt gagttttctc cttcattaca gaaacggctt tttcaaaaat 540

atggtattga taatcctgat atgaataaat tgcagtttca tttgatgctc gatgagtttt 600

tctaatcagt actgacaata aaaagattct tgttttcaag aacttgtcat ttgtatagtt 660

tttttatatt gtagttgttc tattttaatc aaatgttagc gtgatttata ttttttttcg 720

cctcgacatc atctgcccag atgcgaagtt aagtgcgcag aaagtaatat catgcgtcaa 780

tcgtatgtga atgctggtcg ctatactgct gtcgattcga tactaacgcc gccatccagt 840

gtcgaaaacg agctctcgag aacccttaat ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag 900

ttattaggtg atatcagatc cactagtggc ctatgccact gaacattgtc gcacctttga 960

agtctcagga catacccatt ccgaagattg cctcaccttc catcccacaa tacctccgct 1020

ctaacactcg ccaccacctt tcgagttccg tacccatcga ggcggaaacg ttctccagct 1080

ttcggcctga tatgaatatg actatgaaca tgaaccttca caacgcctca acctcctcct 1140

tcaacaatga agccttctgg aagcctttgg actccgcaat agatcatcat tctggagaca 1200

caaatccaaa ctcaaacatg aacaccactc caaatggcaa tctgagcctg gattggttga 1260

atctgaattt atagatcccc caaaaaaaaa aaagtactcg cttctttcca tgtccgcttc 1320

atatatatat acacatacta atcaaactct atgtatacat agaataaaaa gaagaacact 1380

atatttattt cataaaaaaa aaaaaaaaat aacaaaaaaa gtgcaacatt tatcaaaagc 1440

tcagtgtgcg ttatgcttcc atgtgaccca acatctattg cggcggtgac agaatagttg 1500

aaaggcgcag ggctcacaca caggaatggc cctcccaaat ttaaaagaga actaaaccag 1560

ttatcctagg caattacttt atttgagtct tatatgacgt cactagaagc tcagtaagag 1620

caaccgagac ct 1632

Claims (7)

1.一种低产高级醇的啤酒酵母菌株，其特征在于：所述菌株通过敲除啤酒酵母出发菌株中编码通用型氨基酸渗透酶Gap1p的GAT1基因全序列获得。

2.如权利要求1所述一种低产高级醇的啤酒酵母菌株，其特征在于：所述GAT1基因的核苷酸序列见序列表中SEQ NO:1所示。

3.如权利要求1所述一种低产高级醇的啤酒酵母菌株，其特征在于：所述啤酒酵母出发菌株为啤酒酵母S17，保藏编号为No.CICC1929。

4.一种构建权利要求1所述低产高级醇的啤酒酵母菌株的方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)以所述出发菌株的基因组为模板，扩增得到GAT1基因的上、下游序列；

(2)将所述GAT1基因的上、下游序列的DNA分子以及标记基因KanMX转化至所述出发菌株中，得到重组菌株；

(3)采用Cre-LoxP报告基因挽救***剔除所述重组菌株中的KanMX抗性基因，并丢失以此引入的pSH-Zeocin质粒；

(4)二倍体工业菌株重复所述步骤(1)-(3)。

5.如权利要求4所述一种构建低产高级醇的啤酒酵母菌株的方法，其特征在于：包括如下步骤：

1)以所述出发菌株的基因组为模板，PCR扩增GAT1基因的上、下游同源序列；

2)以质粒pUG6为模板，PCR扩增得到含有KanMX标记基因的PCR产物；

3)通过醋酸锂化学转化法，将所述步骤1)和2)获得的PCR产物转化到所述出发菌株中，用G418抗性平板筛选转化子，挑选在G418抗性平板上生长的转化子进行PCR验证，筛选获得阳性转化子，得到重组菌株；

4)利用Cre/loxP报告基因挽救***，将pSH-Zeocin质粒用醋酸锂化学转化到所述步骤3)的重组菌株中，PCR验证筛选得到剔除KanMX抗性标记的转化子，得到基因工程菌株；

5)将所述步骤4)所得基因工程菌株进行传代培养，以丢弃其中游离的pSH-Zeocin质粒，选取第4-5代及以上代数的菌株，从中提取酵母质粒并以此为模板，用引物进行PCR扩增，验证pSH-Zeocin质粒是否丢失；

6)将所述步骤5)筛选获得的菌株进行第二个等位基因的敲除：

利用所述步骤3)中方法向所述步骤5)中得到的菌株中导入利用所述步骤1)和2)方法所获得的重组片段，筛选得第二个等位基因缺失的重组菌株，并按照所述步骤4)和5)方法去除KanMX抗性基因并丢弃pSH-Zeocin质粒。

6.权利要求1-3任一所述低产高级醇的啤酒酵母菌株的用途。

7.权利要求1-3任一所述低产高级醇的啤酒酵母菌株在啤酒发酵中的用途。