CN110546266A - 高粱的单倍体化 - Google Patents

Abstract

提供了高粱植物，其能够通过在基因组中与花粉特异性表达的patatin磷脂相关的修饰诱导单倍性，从而产生单倍体后代，并且可以通过自交系(即纯合父系和母系)染色体加倍在短时间内产生用于杂交选育。此外，提供了用于产生转基因和非转基因植物单倍体诱导物并改善植物的诱导性能的方法。

Description

高粱的单倍体化

发明领域

本发明涉及通过分子生物学方法、标志物技术和遗传工程简化繁琐的育种程序的领域。特别地，提供了高粱植物，其能够通过基因组中的修饰来诱导单倍性，所述修饰涉及优选地花粉特异性表达的patatin磷脂酶，从而产生单倍体后代并且能够通过染色体加倍在短时间内产生用于杂交育种的自交系(inbred line)。特别地，提供了在patatin磷脂酶中具有突变的高粱植物，产生和鉴定这些突变的方法或突变的植物和编码突变的patatin磷脂酶的相应核酸分子以及载体和宿主细胞，特别是含有所述核酸分子的植物细胞和由这种植物细胞产生的能够产生单倍性的植物，其后代、杂交产物、自交系和它们各自的植物部分和产品。

基于高粱的知识，本发明提供了产生和鉴定转基因和非转基因植物单倍体诱导物和相应植物的方法，所述相应植物已获得单倍性诱导的性质或其诱导性能已得到改善。此外，本发明还包括根据本发明的植物的种子或后代、器官、植物部分、组织或细胞及其用途。

背景技术

高粱在德国是一种相对较新的作物，但由于其大规模生长、干旱耐受性和良好的水和养分效率，它在寻找更多高产作物用于物质生产方面成为科学和实践的焦点，特别是关于生物气生产，但也用作饲料、食品和用于乙醇生产。

高粱的一般育种目标是适应中欧的气候，即改善的寒冷耐受性、改善的产量、与良好的幼时发育相结合的稳定性、和疾病和害虫抗性的开发。

高粱可以像自花授粉作物一样通过育种来改良。通过经由有针对性地选择用于下一作物年的种子产生的最佳植物的精心选择育种可以实现种群的改善。此外，杂交育种已为改良品种创造了新的选择。然而，杂交育种的过程依赖于几个世代连续生成纯合的父系和母系，这也使得杂交育种的过程耗时且昂贵，尽管结果良好。

因此，本发明的目的是提供一种用于高粱育种的高效***。

发明内容

本发明涉及繁琐的育种过程、标志物技术和基因工程的简化领域。本发明提供了高粱植物，其能够通过基因组中的修饰诱导单倍性，所述修饰涉及花粉特异性表达的patatin磷脂酶，从而产生单倍体后代，并且可以通过自交系(即纯合的父系和母系)染色体加倍在短时间内进行杂交育种。此外，该发现可用于产生转基因和非转基因植物单倍体诱导物或改善植物的诱导性能。

因此，本发明涉及在以下第[1]至[29]项中列出并在实施例中说明的实施方案。

[1]能够诱导单倍性的高粱植物，其特征在于所述植物具有一个或多个与内源性patatin磷脂酶相关的修饰，所述内源性patatin磷脂酶优选花粉特异性地表达。

[2]根据[1]的植物，其特征在于所述patatin磷脂酶由根据SEQ ID No.:1或2的核苷酸序列编码或由与SEQ ID No.:1或2具有至少80％相同性的核苷酸序列编码或由在严格条件下与根据SEQ ID No.:1或2的核苷酸序列互补的序列杂交的核苷酸序列编码，或者包含SEQ ID No.:3所示的氨基酸序列或同源氨基酸序列。

[3]根据[1]或[2]的植物，其中所述patatin磷脂酶的修饰是适合作为单倍体诱导物的原因。

[4]根据[1]至[3]之一的植物，其特征在于所述一个或多个修饰

a)为编码[2]中定义的patatin磷脂酶的内源基因中的一个或多个突变，优选取代，导致一个或多个氨基酸交换或生成终止密码子；

b)一个或多个表达盒的***，所述表达盒包含可操作地连接至以下的启动子

(i)编码dsRNA的核酸分子，其中所述dsRNA包含至少19个核苷酸，其与[2]中定义的核苷酸序列的部分序列互补；或者

(ii)编码[2]中定义的所述patatin磷脂酶或所述patatin磷脂酶的功能性部分的核酸分子，其中所编码的patatin磷脂酶或其功能性部分具有一个或多个突变，导致一个或多个氨基酸交换或生成终止密码子；或者

c)引起所述patatin磷脂酶的敲除。

[5]根据[4]的植物，其特征在于所述一个或多个突变导致

a)在根据SEQ ID No.:3的氨基酸位置37至240的范围中的氨基酸交换，优选其中该范围对应于patatin磷脂酶的功能性结构域；和/或

b)在根据SEQ ID No.:3的氨基酸位置241至385的范围中的氨基酸交换，或

c)在根据SEQ ID No.:3的氨基酸位置241至385的范围中生成终止密码子。

[6]根据[4]或[5]的植物，其特征在于所述一个或多个突变用于根据SEQ ID No.:3的氨基酸位置40-93、135-204和/或270-320的范围中，优选在根据SEQ ID No.:3的氨基酸位置53-85、150-192和/或285-311的范围中，或更优选在根据SEQ ID No.:3的氨基酸位置55-75、157-167和/或285-298的范围中的氨基酸交换，或用于在根据SEQ ID No.:3的氨基酸位置322-402范围中，优选在根据SEQ ID No.:3的氨基酸位置342-392的范围中，或更优选在根据SEQ ID No.:3的氨基酸位置362-382的范围中生成终止密码子。

[7]根据[4]至[6]之一的植物，其特征在于所述一个或多个突变导致在根据SEQID No.:3的氨基酸位置59、162和/或291的氨基酸交换，和/或导致在根据SEQ ID No.:3的氨基酸位置372的终止密码子。

[8]根据[1]至[7]之一的植物，其特征在于所述修饰的patatin磷脂酶

(i)包含根据SEQ ID No.:3的氨基酸序列或其中存在至少一个氨基酸交换的同源氨基酸序列，其中根据SEQ ID No.:3的位置59处的精氨酸(R)、位置162处的缬氨酸(V)、和/或位置291处的丝氨酸(S)被另一种氨基酸取代，优选地在位置59处被谷氨酰胺(Q)、在位置162处被异亮氨酸(I)和/或在位置291位处被亮氨酸(L)取代；

(ii)由这样的核苷酸序列编码，所述核苷酸序列包含根据SEQ ID No.:1的DNA序列的编码序列(可衍生自根据SEQ ID No.:2的相应cDNA)或与SEQ ID No.:1具有至少80％相同性的DNA序列的编码序列，其中存在至少一个核苷酸交换，导致氨基酸交换，其中一个或多个核苷酸在根据SEQ ID No.:1的核苷酸位置421-423、815-817、1420-1422和/或1663-1665(对应于根据SEQ ID No.:2的核苷酸位置175-177、484-486、871-873和/或1114-1116)处被交换；

(iii)包含根据SEQ ID No.:6、9或12的氨基酸序列；或者

(iv)由这样的核苷酸序列编码，所述核苷酸序列包含根据SEQ ID No.:4的DNA序列的编码序列(可衍生自根据SEQ ID No.:5的相应cDNA)、根据SEQ ID No.:7的DNA序列的编码序列(可衍生自根据SEQ ID No.:8的相应cDNA)、根据SEQ ID No.:10的DNA序列的编码序列(可衍生自根据SEQ ID No.:11的相应cDNA)或根据SEQ ID No.:13的DNA序列的编码序列(可衍生自根据SEQ ID No.:14的相应cDNA)。

[9]根据[1]至[8]之一的植物，其特征在于所述植物对于所述一个或多个突变是纯合的或杂合的，优选特征在于所述植物对于所述一个或多个突变是纯合的。

[10]核酸分子，其编码[4]至[8]中限定的突变的patatin磷脂酶之一。

[11]根据[10]的核酸分子，其特征在于其在植物中的存在，优选在不存在野生型patatin磷脂酶的情况下，导致所述植物能够诱导单倍性。

[12]核酸分子，其长度为至少15、16、17、18、19或20，优选至少21、22、23、24或25，更优选至少30、35、40、45或50，以及最优选至少100、200、300、500或1000个核苷酸，与[5]至[8]之一中定义的核苷酸序列特异性杂交并且包含所述突变之一，或一对核酸分子，其适合于在聚合酶链反应(PCR)中扩增含有至少一个所述突变的范围，优选是寡核苷酸的形式，优选具有50个核苷酸的最大长度，其优选具有根据SEQ ID No.:28-30、32-34、36-38或40-42的核苷酸序列之一。

[13]载体，优选植物载体，其包含根据[10]至[12]之一的核酸分子，或[4]中定义的表达盒。

[14]宿主细胞，优选植物细胞，其含有根据[10]～[12]之一的核酸分子、[4]中定义的表达盒、根据[13]的载体或作为转基因的根据[10]至[12]之一的核酸分子，任选地在异源启动子，优选花粉特异性启动子的控制下。

[15]获得能够诱导单倍性或相对于野生型具有增加的诱导率的植物的方法，包括以下步骤：

(a)(i)诱变植物细胞并且然后从所述诱变的植物细胞中再生植物，或诱变植物；

(ii)鉴定来自(i)的在内源DNA序列中具有一个或多个突变的植物，所述一个或多个突变对应于和/或导致[4]至[8]中限定的一个或多个突变，其中根据SEQ ID No.:3的氨基酸序列的位置75的天冬氨酸(D)、位置79的甘氨酸(G)和/或位置203的脯氨酸(P)被另一种氨基酸取代，优选在位置75被天冬酰胺(N)取代、在位置79被精氨酸(R)取代和/或在位置203被亮氨酸(L)取代，或与这些对应的，并且与未诱变的植物相比能够以增加的比率诱导获得的单倍体后代；或者

(b)(i)在植物细胞中引入具有一个或多个突变的核酸分子，所述突变对应于[4]至[8]中限定的一个或多个突变和/或导致根据SEQ ID No.:3的氨基酸序列的位置75的天冬氨酸(D)、位置79的甘氨酸(G)和/或位置203的脯氨酸(P)被另一种氨基酸取代，优选在位置75被天冬酰胺(N)取代、在位置79被精氨酸(R)取代和/或在位置203被亮氨酸(L)取代，或与这些对应的，或向植物细胞中引入[4]中定义的表达盒；和

(ii)从(i)的植物细胞再生植物，例如转基因植物。

[16]根据[15]的方法，其中所述内源DNA序列或所述核酸分子是编码核苷酸序列，其包含对于高粱(双色高粱(Sorghum bicolor))SEQ ID No.:3中所示的氨基酸序列、对于向日葵(Helianthus annuus)SEQ ID No.:18中所示的氨基酸序列、对于大麦(Hordeumvulgare)SEQ ID No.:21中所示的氨基酸序列、或对于甜菜(Beta vulgaris)(例如，甜菜)SEQ ID No.:24或27中所示的氨基酸序列。

[17]根据[16]的方法，其中所述核酸分子的引入可以例如通过农杆菌转化、同源重组实施，例如通过CRISPR/Cas或CRISPR/Cpf1和修复模板，并且包括化学诱变和物理诱变、TILLING、定向诱变，例如通过使用锌指核酸酶、TALE(转录激活因子样效应子)核酸酶、大范围核酸酶和CRISPR/Cas或CRISPR/Cpf1***。

[18]植物，其含有根据[14]的植物细胞和/或通过根据[15]-[17]之一的方法可获得，优选其中所述植物为高粱、向日葵、黑麦、小麦、马铃薯、大麦或甜菜。

[19]根据[1]至[9]或[18]之一的植物的器官、植物部分、组织或细胞或根据[1]至[9]或[18]之一的植物的种子或后代，其中所述种子或所述后代具有[4]至[8]中定义的突变和/或根据[10]至[12]之一的核酸分子、根据[4]的表达盒或根据[13]的载体。

[20]获得单倍体植物的方法，包括以下步骤：

(a)将根据[1]至[9]或[18]之一的植物与相同属的植物，优选相同物种的植物杂交，

(b)选择受精的单倍体种子或胚，和

(c)从(b)的种子或胚中产生单倍体植物。

[21]通过[20]的方法可获得的单倍体植物、单倍体受精的种子或胚。

[22]根据[21]的植物的器官、植物部分、组织、细胞、种子或后代。

[23]获得二倍体植物的方法，包括以下步骤：

(a)根据[20]的方法产生单倍体植物；

(b)将所述单倍体植物的至少一个细胞中的单倍体染色体组加倍，和

(c)从(b)的细胞再生所述二倍体植物。

[24]通过根据[23]的方法可获得的二倍体植物。

[25]用于产生杂交植物的方法，包括以下步骤：

(a)将根据[24]的植物与相同属，优选相同物种的第二植物杂交，

(b)根据所需性状选择所述杂交植物。

[26]通过根据[25]的方法可获得的杂交植物。

[27]通过检测patatin磷脂酶基因中的突变例如[4]至[9]中定义的突变，或与所述突变偶联的标志物等位基因来鉴定根据[1]至[9]或[18]之一的植物的方法，优选使用根据[12]的核酸作为分子标记。

[28]根据[10]或[11]的核酸、[4]中定义的表达盒或根据[13]的载体在植物中用于赋予单倍体诱导物的性质或用于增加产生能够诱导单倍性的植物或转基因植物的诱导率的用途。

[29]根据[1]至[9]或[18]之一的植物用于产生单倍体受精的种子或胚或单倍体植物的用途。

[30]根据[12]的核酸作为用于检测patatin磷脂酶基因中的突变的分子标志物的用途。

首先，本申请中使用的一些术语将在下面更详细地解释：

“用来赋予单倍体诱导物的性质”或“赋予单倍体诱导物的性质”或“能够诱导单倍性”可比术语意指通过使用根据本发明的核酸或通过修饰基因组，特别是通过突变patatin磷脂酶改变，植物被改变为能够与来自相同属，优选相同物种的不具有单倍体诱导物性质的植物杂交而产生具有简单(单倍体)染色体组的受精的种子或胚。以绝对单倍体诱导率给出的单倍体诱导物的性质意指至少0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％，优选至少1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％或5％，更优选至少6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％，或甚至更优选至少20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％的受精的种子或胚具有单倍体染色体组。

核苷酸序列的“功能性片段”是指核苷酸序列的区段，其具有与衍生出功能性片段的总核苷酸序列相同或相当的功能。因此，功能性片段可以具有与总核苷酸序列在至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、94％、96％、97％、98％或99％的长度上相同或同源的核苷酸序列。此外，核苷酸序列的“功能性片段”还可以指核苷酸序列的区段，其改变整个核苷酸序列的功能(例如在转录后或转录基因沉默的过程中)。因此，核苷酸序列的功能性片段可包含总核苷酸序列的至少14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25，优选至少30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、120或140，更优选至少160、180、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或1000个连续核苷酸。

蛋白质的“功能性部分”是指蛋白质的部分或编码所述蛋白质的氨基酸序列的部分，其中该部分可以在植物细胞中发挥与总蛋白质相同或相当的功能。考虑到保守和半保守氨基酸交换，蛋白质的功能性部分具有与衍生出所述功能性部分的蛋白质在至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、94％、96％、97％、98％或99％的长度上相同或相似的氨基酸序列。

“单倍体诱导物”也指体内单倍体诱导物。

术语“异源”是指引入的多核苷酸例如源自一个细胞或生物体，所述一个细胞或生物体具有相同物种或另一物种的另一遗传背景，或引入的多核苷酸与原核或真核宿主细胞同源，但随后位于不同的遗传环境并因此不同于任何天然存在的相应多核苷酸。除了相应的内源基因外，还可以存在异源多核苷酸。

“杂交(hybridizing)”或“杂交(hybridization)”应理解为意指其中单链核酸分子附着于很大程度上互补的核酸链，即与其形成碱基配对的过程。用于杂交的标准方法描述于例如Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual 3rd Ed.ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,2001。优选地，应理解核酸分子的至少80％或85％，优选至少90％、91％、92％、93％、94％或95％，特别是优选地至少96％、97％、98％或99％的碱基与很大程度上互补的核酸链形成碱基配对。这种附着的可能性取决于杂交条件的严格性。术语“严格性”是指杂交条件。当碱基配对困难时即为高严格性，当碱基配对容易时即为低严格性。杂交条件的严格性取决于例如盐浓度或离子强度和温度。通常，可以通过提高温度和/或降低盐含量来提高严格性。“严格杂交条件”应理解为意指杂交主要仅在同源核酸分子和同源物之间发生的那些条件。术语“杂交条件”不仅指核酸的实际附着中的主导的条件，也指在随后的洗涤步骤期间主导的条件。严格杂交条件是例如这样的条件，在该条件下主要仅是那些具有至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的序列相同性的核酸分子杂交。严格杂交条件是，例如：在65℃下在4×SSC中杂交，然后在65℃下在0.1×SSC中多次洗涤总共约1小时。本文使用的术语“严格杂交条件”也可以指：在68℃下在0.25M磷酸钠、pH 7.2、7％SDS、1mM EDTA和1％BSA中杂交16小时，并然后在68℃下用2x SSC和0.1％SDS洗涤两次。优选地，杂交在严格条件下进行。

“增加单倍体诱导物的诱导性能”或“单倍体诱导物的诱导性能的增加”或类似表达意味着具有单倍体诱导物性质的植物的单倍体诱导率增加。因此，相比于在不使用所述核酸或没有修饰基因组的情况下，特别是没有本发明的上下文中的patatin磷脂酶突变的情况下实现的单倍体受精的种子的数量，单倍体诱导物与不具有单倍体诱导物性质的相同属优选相同物种的植物杂交得到的具有单倍体染色体组的受精的种子的数量增加至少0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％，优选至少1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％或5％，最优选至少6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、30％或50％，即单倍体诱导率可以相对于先前获得的单倍体诱导率增加至少0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％，优选至少1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％或5％，和最优选至少6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、30％或50％。

关于以双链DNA形式的核酸的“互补”核苷酸序列是指根据沃森-克里克规则，与第一DNA链互补的第二DNA链具有根据碱基配对规则与第一链的碱基相对应的核苷酸。

“分子标志物”是在植物群体中具有多态性的核酸，并且用作参考或定向点。用于检测重组事件的标志物应该能够监测植物群体内的差异或多态性。因此，这种标志物能够检测和区分多种等位基因状态(等位基因)。术语“分子标志物”还指与基因组序列互补或至少很大程度上互补或同源的核苷酸序列，例如用作探针或引物的核酸。对于标志物，这些差异可以在DNA水平上找到，并且例如是多核苷酸序列差异，例如SSR(简单序列重复)、RFLP(限制性片段长度多态性)、FLP(片段长度多态性)或SNP(单核苷酸多态性)。标志物可以衍生自基因组核酸或表达的核酸，例如剪接的RNA、cDNA或EST，并且还可以指这样的核酸，其使用并且被认为适合作为探针或引物对以使用基于PCR的方法扩增序列片段。描述(群体的部分之间的)遗传多态性的标志物可以使用根据现有技术的成熟方法来检测(AnIntroduction to Genetic Analysis.7th Edition,Griffiths,Miller,Suzuki et al.,2000)。这些包括，例如，DNA测序、基于PCR的序列特异性扩增、检测RFLP、通过等位基因特异性杂交(ASH)的手段检测多核苷酸多态性、检测植物基因组的扩增的可变序列、检测3SR(自持序列复制)、检测SSR、SNP、RFLP或AFLP(扩增片段长度多态性)。此外，还已知用于检测EST(表达的序列标签)和源自EST序列的SSR标志物和RAPD(随机扩增的多态性DNA)的方法。根据上下文，说明书中的术语标志物还可以表示物种基因组中可以发现特定标志物(例如，SNP)的特定染色***置。

“可操作地连接”是指以这样的方式连接在共同的核酸分子中，所述方式使得组合的元件彼此定位和定向，从而可以发生核酸分子的转录。可操作地连接至启动子的DNA处于该启动子的转录控制之下。

除非另有说明，本发明上下文中的“植物”可以是双子叶植物和单子叶植物的任何物种。优选给定的是农业或园艺中的植物或用于产生生物能(生物乙醇，生物气等)的植物。这些包括，例如，马铃薯(Solanum tuberosum)、小麦(Triticum aestivum)、硬粒小麦(Triticum durum)、斯佩耳特小麦(Triticum spelta)、向日葵(Helianthus annuus)、黑麦(Secale cereal)、大麦(Hordeum vulgare)、球茎大麦(Hordeum bulbosum)、甘蓝型油菜(Brassica napus)、甘蓝(Brassica oleracea)、芜菁(Brassica rapa)、芥菜(Brassicajuncacea)、黑芥(Brassica nigra)、大豆(Glycine max)、棉属(Gossypium sp.)、双色高粱(Sorghum bicolor)、苏丹草(Sorghum sudanense)、双色高粱x苏丹草、黑小麦(Triticale)、甘蔗(Saccharum officinarum)、小米(Setaria italica)、水稻(Oryzasativa)、小粒野生稻(Otyza minuta)、澳洲野生稻(Otyza australiensis)、高秆野生稻(Oryza alta)、二穗短柄草(Brachypodium distachyon)、滨海大麦(Hordeum marinum)、山羊草(Aegilops tauschii)、胡萝卜(Daucus glochidiatus)、小胡萝卜(Daucuspusillus)、Daucus muricatus、野胡萝卜(Daucus carota)、巨桉(Eucalyptus grandis)、Erythranthe guttate、黄花螺旋狸藻(Genlisea aurea)、芭蕉属(Musa sp.)、燕麦属(Avena sp.)、美花烟草(Nicotiana sylvestris)、普通烟草(Nicotiana tabacum)、绒毛状烟草(Nicotiana tomentosiformis)、番茄(Solanum lycopersicum)、中果咖啡(Coffeacanephora)、酿酒葡萄(Vitis vinifera)、黄瓜(Cucumis sativus)、川桑(Morusnotabilis)、须弥芥(Crucihimalaya himalaica)、卵叶须弥芥(Crucihimalayawallichii)、弯曲碎米荠(Cardamine flexuosa)、北美独行菜(Lepidium virginicum)、荠菜(Capsella bursa-pastoris)、小拟南芥(Olmarabidopsis pumila)、硬毛南芥(Arabishirsute)、萝卜(Raphanus sativus)、芝麻菜(Eruca vesicaria sativa)、橙(Citrusxsinensis)、麻风树(Jatropha curcas)、毛果杨(Populus trichocarpa)或甜菜(Betavulgaris)。

根据本发明的高粱植物是高粱属植物，特别是以下物种：双色高粱、苏丹草、双色高粱x苏丹草、高粱x almum(双色高粱x假高粱(Sorghum halepense))、芦苇状高粱(Sorghum arundinaceum)、高粱x drummondii、假高粱和/或拟高粱(Sorghum propinquum)或其杂交种以及由其衍生的所有变种。

植物“器官”是指例如叶、茎轴、茎、根、营养芽、分生组织、胚、花药、胚珠、种子或果实，特别是谷粒。术语“植物部分(part)”或“植物部分(parts)”包括但不限于芽轴或茎、叶、花、花序、根、果实和种子以及花粉。植物“部分”还表示几种器官的组合，例如花或种子、或器官的部分，例如，来自芽轴的横截面。植物“组织”是，例如，愈伤组织、贮藏组织、分生组织、叶组织、芽组织、根组织、植物瘤组织或生殖组织和地层组织、地面组织(所谓的实质)、木质部、支持组织和覆盖组织(所谓的表皮)。然而，所述组织不受该列举的限制。植物“细胞”应理解为例如具有细胞壁的分离的细胞或其聚集体或原生质体。

“启动子”是不翻译的DNA片段，通常在编码区的上游，其包括RNA聚合酶的结合位点并启动DNA的转录。启动子还含有其他元件，所述其他元件充当基因表达的调节基因(例如，顺式调节元件)。“核心或最小启动子”是这样的启动子，其具有至少转录起始所需的基本元件(例如，TATA盒和/或起始子)。

在本发明的上下文中，术语“修饰”是指影响特异性和/或表达水平的核苷酸序列，例如，其中调节序列介导特定的组织特异性。这种调节序列可位于最小启动子的转录起始点的上游，但也可位于其下游，例如位于转录的但不翻译的前导序列或内含子内。

“转基因植物”是指这样的植物，其具有整合到其基因组中的至少一个多核苷酸，优选异源多核苷酸。优选地，所述多核苷酸是稳定整合的，这意味着所述整合的多核苷酸在植物中稳定维持、表达并且可以稳定地遗传给后代。将多核苷酸稳定地引入到植物基因组中还包括整合到先前亲本代植物的基因组中，其中所述多核苷酸可以稳定地进一步遗传。术语“异源”是指引入的多核苷酸例如源自一个细胞或生物，所述一个细胞或生物具有相同物种或另一物种的另一遗传背景，或引入的多核苷酸与原核或真核宿主细胞同源，但随后位于不同的遗传环境并因此不同于任何天然存在的相应多核苷酸。除了相应的内源基因外，可以存在异源多核苷酸。

“适合用作单倍体诱导物”或“能够诱导单倍体”是指植物能够从与来自相同属，优选相同物种的植物杂交而产生具有简单(单倍体)染色体组的受精的种子，所述来自相同属，优选相同物种的植物不具有单倍体诱导物的性质。作为单倍体诱导物，以绝对单倍体诱导率给出，意指至少0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％或1％，优选至少1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％或5％，更优选至少6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％或15％，或甚至更优选至少20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％的受精的种子或胚具有单倍体染色体组。

参考于附图和序列以示例的方式描述了本发明的布置和实施例：

图1：以下的氨基酸序列的序列比对(CLUSTAL O 1.2.4)：来自高粱的野生型patatin磷脂酶(Sorghum_PPL_AA，SEQ ID No.:3)、在氨基酸位置59具有氨基酸精氨酸(R)被谷氨酰胺(Q)交换的来自高粱的patatin磷脂酶(Sorghum_PPL_R59Q，SEQ ID No.:6)、在氨基酸位置162具有氨基酸缬氨酸(V)被异亮氨酸(I)交换的来自高粱的patatin磷脂酶(Sorghum_PPL_V162I，SEQ ID No.:9)、在氨基酸位置291具有氨基酸丝氨酸(S)被亮氨酸(L)交换的来自高粱的patatin磷脂酶(Sorghum_PPL_S291L，SEQ ID No.:12)和在氨基酸位置372具有氨基酸谷氨酰胺(Q)被终止密码子交换的来自高粱的patatin磷脂酶(Sorghum_PPL_Q372Stop，SEQ ID No.:15)。氨基酸位置59、162和291以黑色突出显示。

图2：以下的氨基酸序列的序列比对(CLUSTAL O 1.2.4)：来自高粱的野生型patatin磷脂酶(Sorghum bicolor_PPL_AA,SEQ ID No.:3)、来自大麦的patatin磷脂酶(Horghum vulgare_PPL_AA，SEQ ID No.:21)、来自向日葵的patatin磷脂酶(Helianthusannuus_PPL_AA，SEQ ID No.:18)、来自甜菜的patatin磷脂酶1(Beta vulgaris_PPL1_AA，SEQ ID No.:24)和来自甜菜的patatin磷脂酶2(Beta vulgaris phospholipase 2_AA，SEQID No.:27)。代表磷脂酶的功能性结构域的氨基酸位置以粗体显示。

发明详述

本发明提供一种高粱属植物，以下也称为高粱植物，其能够诱导单倍体。借助单倍体诱导的这种性质，所述植物能够与来自相同属，优选相同物种的植物杂交而产生具有简单(单倍体)染色体组的受精的种子或胚，所述来自相同属，优选相同物种的植物不具有单倍体诱导物的性质。因为可以通过单倍体后代中的染色体加倍来生成接种系(即用于杂种选育的纯合父系和母系)，通过该***，本发明人已经能够提供用于选育高粱植物的有效***。

根据本发明的高粱植物的特征在于它们具有一个或多个与patatin磷脂酶相关的修饰，所述修饰赋予单倍体诱导性质或者还改善天然存在的单倍体诱导能力或提高诱导性能。因此，关于patatin磷脂酶的修饰是根据本发明的高粱植物在选育计划中作为单倍体诱导物的适合性的原因。

根据本发明的植物的特征在于它们具有优选至少0.5％的诱导率，并因此不同于野生型植物或非单倍体诱导物。

在本发明上下文中进行的实验中，已发现高粱中的patatin磷脂酶是花粉特异性表达的，并因此可能对花粉管生长或配子体之间的相互作用具有影响。因此，根据本发明的高粱植物的优选特征在于，patatin磷脂酶是花粉特异性表达的和/或对花粉管生长或配子体之间的相互作用具有影响。

在优选的实施方案中，patatin磷脂酶由根据SEQ ID No.:1或2的核苷酸序列编码，或由与SEQ ID No.:1或2具有至少80％、优选85％、更优选90％、甚至更优选95％并且最优选99％相同性的核苷酸序列编码，或由在严格条件下具有与根据SEQ ID No.:1或2的核苷酸序列互补的序列的核苷酸序列编码，或包含SEQ ID No.:3中所示的氨基酸序列或同源氨基酸序列。如上所述，根据本发明的高粱植物包括高粱属的任何物种的植物，特别是以下物种的植物：双色高粱、苏丹草和双色高粱×苏丹草或其杂种以及由其衍生的所有变种。因此，可以合理地假设在物种形成和品种选育过程中，patatin磷脂酶的核苷酸序列和相应的氨基酸序列已经改变。在本文中，术语同源意指所讨论的基因(来自两种不同的植物物种或变种)具有基本相同的功能和共同的前体，并因此通常分别在其核酸或编码的氨基酸序列中显示出显著的相同性，优选至少80％的相同性。

在本发明的上下文中，“同源物”理解为意指相同***发育起源的蛋白质，“类似物”理解为意指执行相同功能但具有不同***发育起源的蛋白质，和“直系同源物”理解为意指执行相同功能的来自另一物种的蛋白质，并且“旁系同源物”被理解为意指已经通过物种内的复制产生的蛋白质，其中该拷贝保留相同的蛋白质功能、其表达模式改变但功能不变、它的蛋白质功能改变或原始基因功能在两个拷贝之间分配。

编码的蛋白质(或氨基酸序列)在其执行相同功能时原则上是本发明上下文中的同源物，无论其是否具有相同或不同的***发育起源或源自相同或不同的物种。同源物进一步能够补充单倍体诱导的性质，即，通过修饰植物的所述基因源自的同源物编码基因产物以赋予单倍体诱导物的性质或以增加单倍体诱导物的诱导性能。因此，由根据SEQ IDNo.:1或2的核苷酸序列编码的patatin磷脂酶的相关同源物或包含根据SEQ ID No.:3的氨基酸序列的patatin磷脂酶的相关同源物可以优选地表征为能够补充在根据本发明的高粱植物中观察到的单倍体诱导物的性质。可选地或可替代地，patatin磷脂酶同源物可优选特征在于通过修饰由所述同源物编码的基因产物来介导单倍体诱导物的性质或增加单倍体诱导物的诱导性能。

用于高粱中互补遗传学的相应技术和方法是本领域技术人员已知的，例如，来自Li et al.,J Genet.94(2015),445-452的出版物，其中通过引入野生型bmr-6基因补充了高粱表型，所述高粱表型特征在于褐色中脉并且由bmr-6基因中的点突变引起。

如实施例2中所示，高粱中的具有来自高粱的patatin磷脂酶的氨基酸序列(SEQID No.:3)的氨基酸序列导致单倍体诱导率部分地大于1.5％。可以假设诱导率的进一步增加可以由进一步的氨基酸交换引起，所述进一步的氨基酸交换引起patatin磷脂酶的编码序列的进一步修饰。因此，本发明包括了包含一个或多个与patatin磷脂酶相关的修饰或突变的高粱植物。

在本发明的上下文中，上述与patatin磷脂酶相关的修饰的优选特征在于它们是导致以下的突变：导致在编码patatin磷脂酶的内源DNA序列中的一个或多个氨基酸交换或产生终止密码子。

突变意味着DNA水平的修饰，即遗传学和/或表观遗传学的改变。例如，遗传学的变化可以是内源DNA序列中或内源DNA序列的调节序列中至少一个核碱基的交换。如果这样的核碱基交换例如在启动子中发生，则这可以导致启动子的活性改变，例如顺式调节元件被修饰使得转录因子对突变的顺式调节元件的亲和力与野生型启动子相比发生改变，这使得具有所述突变的顺式调节元件的启动子的活性增加或减少，这取决于所述转录因子是抑制因子还是诱导因子，或者取决于所述转录因子对突变的顺式调节元件的亲和力被增强或减弱。如果例如在内源DNA序列的编码区中发生这种核碱基交换，这可以导致编码的蛋白质中的氨基酸交换，这可以引起蛋白质的活性或稳定性与野生型蛋白质相比发生变化。遗传学中变化的另一个例子是调节序列和/或内源DNA序列中核苷酸的缺失和调节序列和/或内源DNA序列中核苷酸的添加。表观遗传学的变化可以例如通过改变DNA的甲基化模式而发生。

在获得植物单倍体诱导物的方法的背景下更详细地描述了诱变DNA序列的方法。

由于所述突变导致patatin磷脂酶的氨基酸序列的改变或缩短，可以认为所述突变与野生型植物相比改变(即增加或减少)了高粱植物中内源DNA序列编码的patatin磷脂酶的活性或稳定性。

蛋白质功能性结构域中终止密码子的生成通常导致蛋白质的功能的丧失，而功能性结构域后终止密码子的生成也可导致蛋白质活性或稳定性的增加。在突变(优选氨基酸交换)的情况下，蛋白质的活性可以增加，例如，通过优化序列或同样好地抑制或丧失活性。启动子区域的突变也可导致基因表达的改变。

因此，根据本发明，所述突变改变了patatin磷脂酶的生物活性，使得其在花粉中的原始功能不再执行至与野生型高粱相同的程度。

一方面，这可以通过以下来实现：通过过量表达与增加的蛋白质的量和活性有关的基因，例如通过启动子区域中的突变，通过增加蛋白质的稳定性，例如通过由产生终止密码子来缩短蛋白质，或通过形成更活跃形式的patatin磷脂酶，例如通过功能性结构域中的氨基酸交换，例如其可以导致花粉管生长得更快、将花粉管中生殖细胞的运输与其生长分离、或干扰配子体的相互作用然后进行不完全受精然后进行染色体消除。另一方面，所述基因的过表达还可以抑制、预防或减少patatin磷脂酶的正确形成、折叠和/或稳定性。然而，也可以是减少形成或不形成功能性patatin磷脂酶，例如通过突变启动子区域，形成较少活性、无活性或不稳定形式的patatin磷脂酶，例如通过生成终止密码子或功能性结构域中的氨基酸交换，这反过来可能导致错误的受精。同样地，patatin磷脂酶的定位可以通过所述突变而改变，使得例如它不再是花粉特异性表达的。

因此，本发明还涵盖了具有表达盒的一个或多个***的高粱植物，所述表达盒是通过根据SEQ ID No.:1或2的核酸序列编码patatin磷脂酶的核酸分子或通过与SEQ IDNo.:1或2具有至少80％、优选85％、更优选90％、甚至更优选95％并且最优选99％相同性的核酸序列编码patatin磷脂酶的核酸分子，或是编码该patatin磷脂酶的功能性部分的核酸分子，或包含具有在严格条件下与SEQ ID No.:1或2的核苷酸序列互补的序列杂交的核苷酸序列的核酸分子，或所述表达盒包含编码具有根据SEQ ID No.:3的氨基酸序列的patatin磷脂酶的核酸分子或其同源氨基酸序列或功能性部分，并且可操作地连接至启动子，优选花粉特异性启动子，其中所述编码的patatin磷脂酶或其功能性部分具有一个或多个突变，导致一个或多个氨基酸交换或生成终止密码子，并因而提供与野生型植物或其相应部分相比过表达植物或其部分中编码patatin磷脂酶的编码基因。

本发明同样涵盖的是这样的高粱植物，其中所述patatin磷脂酶的表达被部分或完全抑制或存在减少了量的patatin磷脂酶蛋白或不形成功能性patatin磷脂酶。因此，本发明还包括这样的高粱植物，其中所述patatin磷脂酶的表达通过RNAi方法被部分或完全抑制(Fire et al.,Nature 391(1998),806-811)。因此，根据本发明的植物的特征还在于其具有表达盒的一个或多个***，所述表达盒包含启动子和任选的终止子，其与编码dsRNA的核酸分子可操作地连接，所述dsRNA包含至少19或20，优选至少21、22、23、24或25，更优选至少30、35、40、45或50，最优选至少100、200、300或500个核苷酸，所述核酸分子与根据SEQID No.:1或2的核苷酸序列的部分序列互补或与根据SEQ ID No.:1或2的核苷酸序列的部分序列具有至少80％、优选85％、更优选90％、甚至更优选95％以及最优选99％相同性的核苷酸序列的部分序列互补。

此外，本发明还涵盖这样的高粱植物，在其中通过突变敲除了patatin磷脂酶。

用于表达盒的合适的启动子可以是组成型诱导的启动子(例如：来自”花椰菜花叶病毒”的35S启动子(Odell et al.,Nature 313(1985),810-812)，合适的启动子是那些发育特异性的(例如：开花特异性启动子)或组织特异性的，特别是那些在花粉中具有特异活性的(实例：Chen et al.,Molecular Biology Reports 37(2010),737-744,Zhao et al.,Planta 224(2006),405-412或Twell et al.Genes&Development 5(1991),496-507)。合适的启动子也可以是在自然界中不存在的合成的或嵌合的启动子，其由几种元件组成并含有最小启动子，并且在所述最小启动子的上游具有至少一个顺式调节元件，所述至少一个顺式调节元件作为特定转录因子的结合位点。嵌合的启动子可根据所需特异性而设计并被不同因子诱导或抑制。这样的启动子的实例可以在Gurr和Rushton(TRENDS inBiotechnology 23(2005),275-282)或Venter(Trends in Plant Science 12(2007),118-1249中找到。合适的终止子是例如nos终止子(Depicker et al.,Journal of Molecularand Applied Genetics 126(1982),561-573)。启动子和其他转录调节元件是众所周知的，并且是本领域技术人员可获得的；参见例如WO 00/75359的第23页第5行至第24页第17行。

如实施例2所示，在高粱植物中，根据SEQ ID No.:6所示的patatin磷脂酶的氨基酸序列在氨基酸位置59处氨基酸精氨酸被谷氨酰胺交换或根据SEQ ID No.:9所示的patatin磷脂酶的氨基酸序列在氨基酸位置162处氨基酸缬氨酸被异亮氨酸交换导致大于0.5％的单倍体诱导率。从图2中可以看出，这些氨基酸位置位于patatin磷脂酶的功能性结构域中，其对应于氨基酸位置37至240的范围中。

因此，本发明提供了具有一个或多个突变的高粱植物，所述突变导致根据SEQ IDNo.:3的氨基酸位置37至240的范围中的氨基酸交换，所述范围优选对应于patatin磷脂酶的功能性结构域。在一个优选的实施方案中，在氨基酸位置40至93或135至204的范围中、优选在氨基酸位置53-85或150-192的范围中、更优选在氨基酸位置55-75或157-167的范围中的一个或多个突变导致氨基酸交换。

此外，在高粱植物中，在根据SEQ ID No.:12所示的patatin磷脂酶的氨基酸序列的氨基酸位置291处，氨基酸丝氨酸被亮氨酸交换导致大于1.5％的单倍体诱导率。此外，高粱单倍体诱导物可以通过根据SEQ ID No.:1的核苷酸序列中的突变而生成，所述突变导致在根据SEQ ID No.:3的氨基酸位置372处的终止密码子。该突变在位置372处以终止密码子取代了氨基酸谷氨酰胺(Q)。

从图2中可以看出，这些位置位于patatin磷脂酶的功能性结构域之外。

因此，本发明还提供了具有一个或多个突变的高粱植物，所述突变导致在根据SEQID No.:3的氨基酸位置241至385的范围中的氨基酸交换，所述范围优选对应于patatin磷脂酶的功能性结构域外的区域，其中所述突变也可以导致终止密码子，并因而缩短所述patatin磷脂酶。在一个优选的实施方案中，所述一个或多个突变在氨基酸位置270至320的范围中、优选在氨基酸位置285至311的范围中、更优选在氨基酸位置285至298的范围中导致氨基酸交换和/或在氨基酸位置322-402范围中、优选在氨基酸位置342-392的范围中、更优选在氨基酸位置362-382的范围中导致终止密码子。

在本发明特别优选的实施方案中，根据本发明的植物的特征在于所述一个或多个突变导致在根据SEQ ID：3的氨基酸位置59、162和/或291处的氨基酸交换和/或在根据SEQID No.：3的氨基酸位置372处的终止密码子。

就此而言，在本发明的一个实施方案中，所述修饰的patatin磷脂酶包含根据SEQID No.:3的氨基酸序列，所述根据SEQ ID No.:3的氨基酸序列中存在至少一个氨基酸交换，其中在位置59处的精氨酸(R)、位置162处的缬氨酸(V)和/或位置291处的丝氨酸(S)被另一个氨基酸取代，优选在位置59处被谷氨酰胺(Q)、在位置162处被异亮氨酸(I)和/或在位置291处被亮氨酸(L)取代，或所述修饰的patatin磷脂酶被根据SEQ ID No.:1的核苷酸序列编码，所述根据SEQ ID No.:1的核苷酸序列中存在至少一个核苷酸交换，所述核苷酸交换导致氨基酸交换和/或终止密码子，其中一个或多个核苷酸在根据SEQ ID No.:1的位置421-423、815-817、1420-1422和/或1663-1665(对应于根据SEQ ID NO.:2的核苷酸位置175-177、484-486、871-873和/或1114-1116)处被交换。

作为真核生物的植物在每个细胞具有两个或更多个其遗传信息的拷贝。每个基因通常由两个等位基因代表，所述两个等位基因在纯合状态下相同或在杂合状态下不同。根据本发明的植物的表型由patatin磷脂酶中的一个或多个突变引起，其中根据本发明的植物对于突变的patatin磷脂酶是纯合的或杂合的，优选地对于突变的patatin磷脂酶是纯合的。

在本发明的另一个实施方案中请求保护核酸分子，所述核酸分子包含先前定义的特定突变，所述突变导致基于根据SEQ ID No.:3的氨基酸序列中的氨基酸交换R59Q、V162I、S291L和/或Q372stop。在这种情况下，根据本发明的核酸分子的特征在于其在植物中的存在导致植物能够诱导单倍体，或者在于已经能够诱导单倍体的植物的诱导性能得到改善。优选地，在植物中不存在野生型patatin磷脂酶的情况下，根据本发明的核酸分子的存在导致植物能够诱导单倍体，或改善已经能够诱导单倍体的植物的诱导性能。

根据本发明的核酸分子可以用作转基因，以在植物中赋予单倍体诱导物的性质或增加单倍体诱导物的诱导性能。优选地，根据本发明的核酸分子是分离的核酸分子，其已经从其天然或原始环境(即遗传背景)中分离出。核酸分子可以是双链或单链的，线性或环状的。其可以是基因组DNA、合成DNA、cDNA或RNA类型，例如siRNA或miRNA，其中核碱基尿嘧啶代替核碱基胸腺嘧啶出现在RNA中。

在本发明的一个优选实施方案中，根据本发明的核酸或由所述核酸编码的RNA或由所述核酸编码的蛋白质或多肽对植物中的花粉管生长、对配子体之间的相互作用或对受精本身具有影响。

衍生自修饰的patatin磷脂酶序列(即包含上述任何突变)的DNA杂交探针可用于鉴定根据本发明的植物，即用于检测patatin磷脂酶基因中的突变。为了实现特异性杂交，此类探针应该是特异性的并且具有至少15个核苷酸，优选至少20个核苷酸的长度。关于核酸的杂交的详细指导可以在Tijssen,Laboratory Techniques in Biochemistry andMolecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes,Part 1,Chapter 2,"Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acidassay assays,"Elsevier,New York(1993)；以及在Current Protocols in MolecularBiology,Chapter 2,Ausubel,et al.,eds,Greene Publishing and WileyInterscience,New York(1995)中找到。探针还可用于通过已知的聚合酶链式反应(PCR)过程扩增一系列所述patatin磷脂酶的所述修饰的序列，所述修饰的序列接收了至少一个前述突变。

因此，本发明的主题为长度为至少15、16、17、18、19或20，优选至少21、22、23、24或25，更优选至少30、35、40、45或50，并且最优选至少100、200、300、500或1000个核苷酸的核酸分子，其中所述核酸分子与先前描述的包含所述修饰的patatin磷脂酶基因的核苷酸序列特异性杂交并且包含所述突变之一，或为一对核酸分子，其适合于在聚合酶链反应(PCR)中扩增含有所述至少一个突变的区域，优选是寡核苷酸的形式，优选最大长度为50个核苷酸。核酸分子优选具有在第[12]项中描述的实施方案。

本发明的另一主题是包含根据本发明的核酸分子或前述表达盒的载体。根据本发明的载体可以包含与异源启动子可操作地连接的突变型patatin磷脂酶基因，所述突变型patatin磷脂酶基因具有上述核苷酸序列的特征，或者根据本发明的载体可以包含同其天然启动子一起的突变型patatin磷脂酶基因。

另一种载体可包含patatin磷脂酶的野生型基因，所述patatin磷脂酶的野生型基因与异源启动子可操作地连接。此外，载体可含有重组DNA分子，并因此在植物细胞中表达后导致patatin磷脂酶基因的表达，所述重组DNA分子具有编码双链RNA的核苷酸序列。

此外，载体可含有前述核酸分子，所述前述核酸分子特异性结合patatin磷脂酶的突变的核苷酸序列。

所述载体可以是质粒、粘粒、噬菌体或表达载体、转化载体、穿梭载体或克隆载体，它可以是双链或单链的，线性或环状的，或者所述载体可以通过整合进其基因组或染色体外来转化原核或真核宿主。优选地，根据本发明的核酸分子在具有一个或多个调节序列的表达载体中可操作地连接，所述调节序列允许在原核或真核宿主细胞中转录和任选地表达；参见，例如，Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual 3rdEd.Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,2001和国际申请WO00/75359第21页第20行至第22页第32行。调节序列，优选DNA，可以对于根据本发明的核酸是同源的或异源的。优选地，这些调节序列是启动子或终止子，特别是转录起始起点、核糖体结合位点、RNA加工信号、转录终止位点和/或多腺苷酸化信号。另外，因为直接检测基因的表达是相当困难的，载体通常含有指示因子/报告基因或抗性基因以检测所需载体或DNA分子/核酸分子的转移并选择含有它们的个体。在优选的实施方案中，所述载体是植物载体。

除了上述载体外，本发明还提供了一种方法，包括将所述载体引入宿主细胞。所述载体可以例如通过缀合、迁移、生物射弹转化、农杆菌介导的转化、转染、转导、真空渗透或电穿孔来引入。这些方法以及用于制备所述载体的方法是本领域技术人员熟悉的(Sambrook等人，2001)。

另一方面，本发明涉及含有所述载体、核酸分子或表达盒的宿主细胞。本发明上下文中的宿主细胞可以是原核细胞(例如，细菌)或真核细胞(例如，植物细胞或酵母细胞)。优选地，所述宿主细胞是包含根据本发明的核酸、所述载体或所述表达盒的农杆菌(例如根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)或发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes))或植物细胞。许多方法例如缀合或电穿孔都是本领域技术人员已知的，用这些方法他可以将根据本发明的核酸、本发明的载体或表达盒引入农杆菌中并且他可以用这样的方法如多种转化方法(生物射弹转化、农杆菌介导的转化)将根据本发明的核酸、本发明的载体或表达盒引入植物细胞(Sambrook等，2001)。

更优选地，本发明涉及包含根据作为转基因的本发明的核酸分子、本发明的载体或表达盒的转基因植物细胞，以及包含所述转基因植物细胞的转基因植物或其部分。这样的转基因植物细胞或植物是，例如，优选用根据本发明的核酸分子、用本发明的载体或表达盒稳定转化的植物细胞或植物。本发明的转基因植物优选适合用作单倍体诱导物。在转基因植物细胞的优选实施方案中，所述核酸分子与一个或多个调节序列可操作地连接，所述调节序列允许在植物细胞中的转录和任选地表达。调节序列，优选DNA，可以对于根据本发明的核酸是同源的或异源的。然后，根据本发明的核酸分子和调节序列的总构建体代表转基因。植物的部分可以是受精或未受精的种子、胚、花粉、组织、器官或植物细胞，其中所述受精或未受精的种子、胚或花粉在转基因植物中产生并且作为转基因的根据本发明的核酸、载体或表达盒整合在其基因组中。同样地，本发明还包括转基因植物的后代，作为转基因的根据本发明的核酸、载体或表达盒整合在所述后代的基因组中并且所述后代适合用作单倍体诱导物。

在另一方面，本发明涉及产生适合用作单倍体诱导物的植物的方法。该方法可以包括以下步骤：

(a)诱变植物细胞并然后从所述诱变的植物细胞中再生植物，或诱变植物；和

(b)鉴定(a)的在编码上述patatin磷脂酶的内源DNA序列中具有一个或多个突变的植物，所述一个或多个突变导致一个或多个氨基酸交换或生成终止密码子，优选导致根据氨基酸序列SEQ ID No.:3的一个或多个所述氨基酸交换S291L、R59Q、V162I和Q372stop或导致植物patatin磷脂酶的序列中的对应于根据氨基酸序列SEQ ID No.:3的氨基酸交换S291L、R59Q、V162I和Q372stop的一个或多个氨基酸交换，并且其与未诱变的植物相比能够以增加的比率诱导获得单倍体后代。在这种情况下，至少一个突变导致在所鉴定的植物中赋予单倍体诱导物的性质或者增加单倍体诱导物的诱导性能。

此外，进一步的研究表明存在其他潜在的诱变位点，其适于赋予植物单倍体诱导的性质或适于增加其诱导性能。这些突变导致根据氨基酸序列SEQ ID No.:3的位置75处的天冬氨酸(D)、位置79处的甘氨酸(G)和/或位置203处的脯氨酸(P)被另一个氨基酸的交换，优选在位置75处被天冬酰胺(N)、在位置79处被精氨酸(R)和/或在位置203处被亮氨酸(L)交换或导致对应于在植物patatin磷脂酶中发生的该氨基酸交换的氨基酸交换。

来自上述方法的步骤(b)的内源DNA序列原则上可以编码任何植物patatin磷脂酶。优选地，内源DNA序列编码来自高粱的patatin磷脂酶(SEQ ID No.:3)、来自向日葵的patatin磷脂酶(SEQ ID No.:18)、来自大麦的patatin磷脂酶(SEQ ID No.:21)或来自甜菜的patatin磷脂酶，其中甜菜具有两种推定的patatin磷脂酶(SEQ ID No.:24和27)。步骤(b)中提到的植物patatin磷脂酶优选来自以下的那些：向日葵的patatin磷脂酶(SEQ IDNo.:18)、大麦的patatin磷脂酶(SEQ ID No.:21)或甜菜的patatin磷脂酶，其中甜菜具有两种推定的patatin磷脂酶(SEQ ID No.:24和27)。

本领域技术人员已知如何通过在适合用于产生单倍体的植物的方法中的步骤(a)中的诱变的过程来实现本发明上下文中的突变。这里的诱变包括常规诱变和位点特异性诱变或“基因组编辑”。在常规诱变中不会故意诱导DNA水平的修饰。将植物细胞或植物暴露于诱变条件，例如通过UV光照射或使用化学品进行TILLING(Till等，BMC Plant Biology 4(2004)，12)。随机诱变的另一种方法是借助转座子进行诱变。位点特异性诱变使得能够在DNA水平上引入修饰，所述DNA水平靶向DNA的预定位点。例如，可以使用TALENS(WO2010/079430、WO2011/072246)、大范围核酸酶(Silva et al.,Current Gene Therapy 11(2011),11)、归巢内切核酸酶(Lloyd et al.,Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America 102(2005),2232-237或CRISPR/Cas***(Gaj et al.,Trends in Biotechnology 31(2013),397-405)。

步骤(b)中植物的鉴定可以例如通过分子标记或探针进行。DNA探针是例如引物或引物对，其可用于PCR反应。例如，通过在Tilling群体中测序靶基因或检测DNA中错配的其他方法(例如熔点分析或使用错配特异性核酸酶)可以检测或鉴定tilling突变体。本发明还包括可用于此目的的引物/引物对，例如针对patatin磷脂酶的引物。

此外，通过在整个群体中在PCR中使用转座子特异性引物和靶基因特异性引物并随后对PCR产物进行测序，可以检测通过转座子的手段生成的突变体。这些引物也涵盖在本发明中。本领域技术人员知道在步骤(b)中他们可用于鉴定植物的其他手段和方法。本发明还涉及分子标志物，其检测内源DNA序列中或内源DNA序列的调控序列中是否存在突变。例如，此类标志物是基于SNP的并且对所述突变是特异性的(实例：KASPar或TaqMan标志物)。

步骤(b)中植物的鉴定也可以通过测试未决实施例1中描述的诱导性能来实施。因此，本发明还涉及鉴定根据本发明的植物的方法，其通过检测patatin磷脂酶基因中的突变或通过检测与突变偶联的标志物等位基因(优选使用上述分子标志物)。

通过这种方法产生和鉴定的植物的实例是根据本发明的高粱植物。

本发明还涉及可以通过上述方法产生的或通过上述方法产生的植物或该植物的部分，其中植物的部分可以是受精或未受精的种子、胚、花粉、组织、器官或植物细胞，其中所述受精或未受精的种子、所述胚或所述花粉在转基因植物上产生并且在其基因组中存在至少一个突变。同样地，本发明还包括植物的后代，其具有所述至少一个突变并且适合用作单倍体诱导物。原则上，该方法可以应用于含有patatin磷脂酶的任何植物，并因此可被给予单倍体诱导的性质。优选地，该植物是高粱、向日葵、大麦、甜菜、黑麦、小麦或马铃薯。

另一方面，本发明还涉及产生适合用作单倍体诱导物的转基因植物的方法。该方法可以包括以下步骤：

(a)向植物细胞引入根据本发明的核酸分子，所述根据本发明的核酸分子编码上述patatin磷脂酶并且其中具有一个或多个突变，所述一个或多个突变导致一个或多个所述氨基酸交换或导致生成终止密码子，优选导致根据氨基酸序列SEQ ID No.3的选自S291L、R59Q、V162I和Q372stop的一个或多个氨基酸交换，引入具有一个或多个突变的核酸分子，所述一个或多个突变导致植物patatin磷脂酶序列中的对应于根据氨基酸序列SEQID No.3的氨基酸交换S291L、R59Q、V162I和Q372stop的一个或多个氨基酸交换，引入前述表达盒，所述表达盒包含编码根据本发明的修饰的patatin磷脂酶的核酸分子并且可操作地连接至启动子，或包含启动子和任选的终止子，其与编码包含根据SEQ ID No.:1或2的核苷酸序列的至少19个核苷酸的dsRNA的核酸分子可操作地连接，或与具有与根据SEQ IDNo.:1或2的核苷酸序列的核酸分子可操作地连接，或引入根据本发明的载体；和

(b)从所述植物细胞(a)再生转基因植物。

产生适合用作单倍体诱导物的转基因植物的方法还包括提供两个或更多个上述核酸，任选地根据本发明的核酸的不同实施方案，且任选地在一个或多个载体中，以及通过引入所述两个或更多个核酸来转化植物细胞。可选地或额外地，除了根据本发明的核酸之外，提供已知的一种或多种用于生成单倍体诱导物的其他核酸(例如，操纵的cenh3基因(Ravi and Chan,Nature 464(2010),615-618,EP 2 989 889 A1；EP 3 037 540 A1,WO2016/138021 A1)并将其转化或引入选育***。

产生适合用作单倍体诱导物的植物的方法中的步骤(a)中的核酸分子可以编码任何植物patatin磷脂酶。优选地，内源DNA序列编码来自高粱的patatin磷脂酶(SEQ ID No.:3)、来自向日葵的patatin磷脂酶(SEQ ID No.:18)、来自大麦的patatin磷脂酶(SEQ IDNo.:21)或来自甜菜的patatin磷脂酶，其中甜菜具有两种推定的patatin磷脂酶(SEQ IDNo.:24和27)。在相同步骤(b)中提及的植物patatin磷脂酶优选来自以下的那些：向日葵的patatin磷脂酶(SEQ ID No.:18)、大麦的patatin磷脂酶(SEQ ID No.:21)或甜菜的patatin磷脂酶，其中甜菜具有两种推定的patatin磷脂酶(SEQ ID No.:24和27)。

来自(a)的核酸分子或载体的引入通过转化的手段进行，优选通过植物细胞的稳定转化的手段进行。载体可以例如通过缀合、迁移、生物射弹转化、农杆菌介导的转化、转染、转导、真空渗透或电穿孔来引入。这些方法是本领域技术人员熟悉的(Sambrook等，2001)。此外，还可以通过同源重组将核酸分子引入植物基因组中，例如，通过CRISPR/Cas或CRISPR/Cpf1和修复模板的手段。

本发明还涉及可以通过上述方法产生的或通过上述方法产生的转基因植物或该植物的部分，其中植物的部分可以是受精或未受精的种子、胚、花粉、组织、器官或植物细胞，其中所述受精或未受精的种子、所述胚或所述花粉在转基因植物上产生和引入的核酸作为转基因或所述载体整合在其基因组中。同样地，本发明还包括所述转基因植物的后代，其具有引入的核酸作为转基因并且适合用作单倍体诱导物。原则上，该方法可以应用于含有patatin磷脂酶的任何植物，并因此可被给予单倍体诱导的性质。优选地，该植物是高粱、向日葵、大麦、甜菜、黑麦、小麦或马铃薯。

在另一方面，本发明涉及产生单倍体植物的方法，包括以下步骤：

(a)将本发明的非转基因或转基因诱导植物与相同属，优选相同物种的植物杂交，所述本发明的非转基因或转基因诱导植物适合用作单倍体诱导物，

(b)选择受精的单倍体种子或胚，和

(c)从(b)的种子或胚中产生单倍体植物。

优选地，适合用作单倍体诱导物的植物用作花粉亲本并与相同属，优选相同物种的种子亲本杂交。适合用作单倍体诱导物的植物也可以用作种子亲本并与相同属，优选相同物种的花粉亲本杂交。步骤(a)中的两个杂交伴侣，即种子和花粉亲本，也可以是相同个体。然后，杂交步骤代表自交。

选择单倍体受精的种子或胚可包括检测单倍体以及从多倍体受精的种子或胚胎分离单倍体受精的种子或胚的步骤。受精的种或胚的单倍体的检测可以是表型的或基因型的，例如，通过向诱导物提供胚胎特异性显性标记，所述胚胎特异性显性标记在所有二倍体后代中可见但在诱导的单倍体后代中不可见。此外，倍性状态可以通过流式细胞术确定。此外，完全纯合的分子标志物模式表明是单倍体植物。例如，可以基于来自单倍体的检测的数据自动地分开。

本发明还涉及单倍体受精的种子或胚，其在产生单倍体植物的方法中的步骤(a)中杂交产生，并且涉及通过该方法可以产生或产生的单倍体植物，或者该植物的部分，其中植物的部分可以是种子、胚、组织、器官或植物细胞。同样，本发明还包括所述植物的后代。

此外，本发明还涵盖了双单倍体(二倍体)植物或其部分，其中所述双单倍体(二倍体)植物或其部分是通过所述单倍体植物或其部分的染色体加倍产生的。这些双单倍体(二倍体)植物可以通过以下方法生产：

(a)通过根据本发明的方法的手段产生单倍体植物；

(b)将所述单倍体植物的至少一个细胞中的单倍体染色体组加倍，和

(c)从(b)的细胞再生所述二倍体植物。

在根据本发明的用于产生双单倍体植物的方法中，来自(a)的单倍体植物用细胞***抑制剂秋水仙碱处理。这导致染色体的加倍。本领域技术人员知道该过程，并且例如在Seguí-Simarro and Nuez,Cytogenetic and Genome Research 120(2008),358-369中描述。

用于产生单倍体和双单倍体植物的一般方法是本领域技术人员已知的，例如，来自Dwivedi et al.,Biotechnol.Adv.33(2015),812-29and Murovec&Bohanec,Biochemistry,Genetics and Molecular Biology"Plant Breeding"(2012),eds.Abdurakhmonov,chapter 5，并且可以应用于本发明。

本发明的另一个实施方案包括通过以下步骤产生杂种植物的方法：

(a)将根据本发明的双单倍体(二倍体)植物与相同属，优选相同物种的第二植物杂交，

(b)根据所需性状选择所述杂种植物。

所述双单倍体植物是纯合的，并且通过杂交两个纯合植物发生已知的杂种优势效应，这导致杂种植物的特别显著的性能。因此，通过这种方法获得的杂种植物也是本发明的主题。

在另一方面，本发明涉及根据本发明的核酸、根据本发明的载体或上述表达盒在植物中用于赋予单倍体诱导物的性质或用于增加单倍体诱导物的诱导性能的用途，或根据本发明的核酸、根据本发明的载体或先前描述的表达盒用于产生适合用作单倍体诱导物的植物或转基因植物的用途。此外，本发明还包括上述根据本发明的植物用于产生单倍体受精的种子或胚或单倍体植物的用途，所述根据本发明的植物适合用作单倍体诱导物。本发明的目的和方法的前述说明也适用于所述用途。

在根据本发明的高粱植物的实验中，可以发现基因，特别是可以发现具有一个或多个突变的patatin磷脂酶的基因，所述一个或多个突变适于赋予植物单倍体诱导物的性质和至少0.4％至1.5％或更多的诱导性能，因此可以首次提供用于产生用于杂交选育的单倍体和双单倍体高粱植物的有效且因此经济上适用的***。根据本发明的用于产生这种单倍体诱导物的方法和在其他作物中鉴定patatin磷脂酶也可以转移到该***中。

以下实施例说明了本发明，但不限制本发明的范围。除非另有说明，否则使用标准分子生物学方法，参见例如(Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual3rd Ed.Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,2001),Fritsch et al.,Cold Spring Harbor Laboratory Press:1989；Mayer et al.,Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology,eds.,Academic Press,London,1987)和Weir et al.,Handbook Of Experimental Immunology,Volumes I-IV,Blackwell,eds.,1986)。

实施例

1.鉴定patatin磷脂酶作为在高粱中赋予单倍体诱导性质的靶标

在TILLING种群中，发现了一种能够以约1％的效率诱导单倍体的高粱植物。关注于各种基因作为寻找遗传基础的潜在靶标，这种遗传基础在已鉴定的高粱植物中赋予这种性质。基因的选择是基于它们优先在植物的生殖器官中表达并且在某种程度上在受精中起作用的事实而做出的，因为染色体消除可以通过有缺陷的或不完全的受精发生，例如，缺失地或不正确地将生殖细胞转运到雌性胚珠或通过作用于花粉的能量代谢，产生单倍体染色体组。

根据本发明上下文的初步研究，然后发现了突变的基因，其可以通过生物信息学方法BLASTP和Synteny Study(Altschul et al.,Nucleic Acid Res.25(1997),3389-3402)的手段鉴定为高粱中的patatin磷脂酶，所述高粱中的patatin磷脂酶的核苷酸和氨基酸序列示于SEQ ID No.:1或SEQ ID No.:3，并通过RNA测序(RNASeq)鉴定为花粉特异性表达的patatin磷脂酶。突变的基因在patatin磷脂酶的核苷酸序列中具有点突变(参见SEQID No.:10)，其导致位置291处的氨基酸从丝氨酸变为亮氨酸(参见SEQ ID No.:12)。使用根据SEQ ID No：44和45的引物，使用PCR方法鉴定出patatin磷脂酶的核苷酸序列中的点突变。

为了验证突变的基因是观察到的单倍体诱导的原因，通过选育和生物技术方法将含有该基因的基因座引入到非诱导物的遗传背景中。这使得有可能将单倍体诱导物的性质引入到该非诱导物中，所述单倍体诱导物的性质的引入当突变是纯合的时，平均效率为1.5％，当突变是杂合的时，平均效率为1.2％。在验证期间，可以使用根据SEQ ID No.:36至38的引物通过PCR的手段跟踪突变基因。通过用突变型高粱植物(包含突变基因)授粉高粱植物实施潜在诱导物的诱导性能。在这种情况下，使用的野生型高粱植物与潜在诱导系的几种标志物在遗传上不同。这些标志物用于鉴定纯合的植物，随后通过流式细胞术的手段测试其单倍性。

2.产生进一步的体内高粱单倍体诱导物

在用先前描述的实验验证高粱中的patatin磷脂酶是在高粱中赋予单倍体诱导性质的合适靶标之后，将进一步的突变引入野生型内源基因中。引入的突变导致位置372处的氨基酸谷氨酰胺(Q)被终止密码子交换。这导致patatin磷脂酶蛋白质的缩短，并以1％-3％之间的平均效率使得含有该突变的高粱植物具有单倍体诱导的性质。如图2所示，先前描述的突变S291L和Q372stop位于patatin磷脂酶的功能结构域之外。因此，在下一个实验中，将突变引入patatin磷脂酶的基因，其一方面引起R59Q氨基酸交换，另一方面引起V162I氨基酸交换。这两个突变在功能结构域内并导致高粱获得单倍体诱导物性质，其中初始实验显示诱导率高于约0.5％。四种突变体与野生型蛋白质的序列比对示于图1中。

预期patatin磷脂酶中的额外的或不同的突变或多个突变的组合将导致诱导率增加或进一步增加，因此可以进行筛选TILLING群体的进一步实验以鉴定具有增加的诱导性能的植物。

此外，突变也可以不仅通过TILLING或其他诱变方法的手段在多种高粱物种和由其衍生的变种中引入到patatin磷脂酶中，而是例如可以通过转基因表达patatin磷脂酶来产生其他单倍体诱导物。为此目的，从高粱诱导物系克隆在根据SEQ ID No.:3的patatin磷脂酶中具有突变S291L、R59Q、V162I和/或Q372stop的相应的基因，包括它们的启动子。可以将这些基因克隆到合适的转化载体中并转化到所需的植物中。

上述高粱植物的诱导性质可归因于patatin磷脂酶中所示的突变，其通常导致其生物活性中的变化。然而，不仅可以通过引入所述突变而且可以通过许多其他基因工程方法来改变生物活性。

例如，可以将patatin磷脂酶的野生型基因与合适的启动子一起克隆到转化载体中并转化到所需的植物中，导致patatin磷脂酶的过表达。此外，patatin磷脂酶可通过RNAi降低其活性。为此目的，例如，将要产生发夹构建体，然后将其克隆到合适的转化载体中并转化到所需的植物中，包括合适的启动子和终止子，其允许发夹构建体在花粉形成之前或之时转录。可选地，可以发现进一步降低活性的敲除突变体。

3.产生新的体内单倍体诱导物

在本发明的上下文中的第一次研究给出了合理的理由来规定在一些其他作物中，单倍体诱导的性质或这种性质的改善可以通过patatin磷脂酶的修饰，特别是通过上述的针对高粱植物的相应突变或根据上述根据本发明的方法来赋予。这些是编码推定的patatin磷脂酶的靶基因，所述推定的patatin磷脂酶具有以下氨基酸序列之一：向日葵的patatin磷脂酶(SEQ ID No.:18)、大麦的patatin磷脂酶(SEQ ID No.:21)和甜菜的patatin磷脂酶，其中甜菜具有两种潜在的磷脂酶(SEQ ID No.：24和27)。来自高粱、向日葵、大麦和甜菜的蛋白质序列的序列比对示于图2中，其中表征了额外推定的功能性结构域(粗体)。这些基因在花粉中的表达可以例如通过花粉的RNASeq得到。

根据上述根据本发明的方法，现在可以选择性地将与patatin磷脂酶有关的修饰引入向日葵、大麦(和其他谷物如小麦、黑麦和燕麦)和甜菜中。例如，借助于图2中的序列比对，可以鉴定对应于根据SEQ ID No.:3的位置291、59、162和372处的氨基酸和在根据SEQID No.:3的位置291、59、162和372处交换的那些氨基酸。因此，本发明的主题还有向日葵、大麦或谷物和甜菜植物，其能够诱导单倍性，并且其特征在于它们具有一个或多个修饰，所述修饰涉及上述项[]或权利要求中表征的实施方案(特别针对高粱植物的)之一的内源的、优选花粉特异性表达的patatin磷脂酶，和/或它们通过上述或权利要求中描述的本发明方法可获得。已经有初步迹象表明根据SEQ ID No.:3的氨基酸序列的位置75处的氨基酸交换(天冬氨酸(D)被天冬酰胺(N)取代(D75N))、位置79处的氨基酸交换(甘氨酸(G)被精氨酸(R)取代(G79R))和位置203处的氨基酸交换(脯氨酸(P)被亮氨酸(L)取代(P203L))也可以在高粱和其他作物中赋予单倍体的诱导。

序列表

<110> 科沃施种子欧洲股份两合公司

<120> 高粱的单倍体化

<130> KWS0259PCT

<150> EP17158439.4

<151> 2017-02-28

<160> 45

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2031

<212> DNA

<213> Sorghum bicolor

<400> 1

acgcagtgcc tatatacaca agccaccatc tgtcgttgcc tcctcctcct cagctcatca 60

ctagtcacac gtacacccgc aatcgattga aaatttatcg cgttcgtcca aacaatacca 120

gagctcgacg atcatcttaa ttgttggatc gatctgaata atctttcttc attcgtggcc 180

tcgacgagta agtaggtagc tcatttgatc gatcaaccgc gagtgtgtgc ttgatcgaag 240

gcggcaatgg cgacctacta ctcttcgcgg cgtccatgca acgcctgcag cacgaaggcg 300

atggccggga gcgtggtcgg cgagcccgtc gtgctggggc agagggtgac ggtgctgacg 360

gtggacggcg gcggcatccg tggtctcatc cccggaacca tccttgcctt cctcgaggcc 420

cggctgcagg agctggacgg gccggaggtt aggctcgcgg actacttcga ctacatcgcc 480

gggacgagca ccggcgggct catcaccgcc atgctcaccg cgcccggcaa ggacaggcgg 540

cctctctacg ctgccaagga catcaaccaa ttctacatgg agaattgccc tcgcatcttc 600

cctcaaaagt gagtccgatc atcccggccg gccgccattg ttggcctcgc attattgatc 660

gatcatgcat gcatgcatgc atgtgatgtg taggagcagc aggcttgcgg ccgccatgtc 720

cgcgctgagg aagccaaggt acaacggcaa gtgcctccgt aacctgatca tgagcatgct 780

cggcgagacg agggtgagcg acacgctcac caacgtcatc atccctacct tcgacgtcag 840

gctgctgcag cccatcatct tctccaccta cgacgtacgt acgccgccgg ccgccgtcgt 900

catgaataat caatcagctg tacattattg cacatggctg catgcctact gaacatgttt 960

aatttgcagg ccaagagcat gcctctgaag aacgcgctgc tctccgacgt gtgcatcggc 1020

acgtccgccg cgccgaccta cctcccggcg cactacttcc agaccaagga cgccggcagt 1080

ggcaaggaac gcgagtacaa cctcatcgac ggcggtgtcg ccgccaacaa tccggtaatt 1140

aattaactga aaacgaacga acgcaattcc atatccattg tccagaagat cgatgctaat 1200

tgttgcttag gcacgtcgtt gccgccggcc gattgcattg cacttgcaca tgcgtagacg 1260

atggttgcga tgacgcagat caccaagaag atgcttgcca gcaaggagaa ggccgaggag 1320

ctgtacccag tgaagccgtg gaactgccgc aagttcctgg tgctgtccat cgggacgggg 1380

tcgacgtcgg agcagggcct gtacacggcg cggcagtgct cgcggtgggg catctgccgg 1440

tggatccgga acaacggcat ggcccccatc atcgacatct tcatggcggc gagctcggac 1500

ctggtggaca tccacgtcgc cgcgatgttc cagtcgctcc acagcgacgg cgactacctg 1560

cgcatccagg acaactcgct gcacggcgcc gcggccaccg tggacgcggc gacgccggag 1620

aacatgcgga cgctcgtcgg gatcggggag cggatgctgg cgcagcgggt gtccagggtc 1680

aacgtggaga cagggaggta cgaaccggtg cctggggaag gaagcaacgc tgatgcgctc 1740

gctgggatcg caaggcagct ctcggaggag aggaggacaa ggctcgcgcg ccgcacctcc 1800

gccatcgtca gctccggtgg tgcctctaga cgtacgtgtg cctcaaaggt ctccaatgtc 1860

taagagaagt gaatttgttg cctgattaaa atcttaatta attaattctg tgggctgtgg 1920

ctcaaataaa actatatcat taaaaaaccc gccatgaact agttctagga aaatacgcat 1980

ggttttagaa agaaaaacat aaactaattc taacaaaatg tacacacctc t 2031

<210> 2

<211> 1314

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cDNA of Sorghum bicolor Phospholipase

<400> 2

atggcgacct actactcttc gcggcgtcca tgcaacgcct gcagcacgaa ggcgatggcc 60

gggagcgtgg tcggcgagcc cgtcgtgctg gggcagaggg tgacggtgct gacggtggac 120

ggcggcggca tccgtggtct catccccgga accatccttg ccttcctcga ggcccggctg 180

caggagctgg acgggccgga ggttaggctc gcggactact tcgactacat cgccgggacg 240

agcaccggcg ggctcatcac cgccatgctc accgcgcccg gcaaggacag gcggcctctc 300

tacgctgcca aggacatcaa ccaattctac atggagaatt gccctcgcat cttccctcaa 360

aagagcagca ggcttgcggc cgccatgtcc gcgctgagga agccaaggta caacggcaag 420

tgcctccgta acctgatcat gagcatgctc ggcgagacga gggtgagcga cacgctcacc 480

aacgtcatca tccctacctt cgacgtcagg ctgctgcagc ccatcatctt ctccacctac 540

gacgccaaga gcatgcctct gaagaacgcg ctgctctccg acgtgtgcat cggcacgtcc 600

gccgcgccga cctacctccc ggcgcactac ttccagacca aggacgccgg cagtggcaag 660

gaacgcgagt acaacctcat cgacggcggt gtcgccgcca acaatccgac gatggttgcg 720

atgacgcaga tcaccaagaa gatgcttgcc agcaaggaga aggccgagga gctgtaccca 780

gtgaagccgt ggaactgccg caagttcctg gtgctgtcca tcgggacggg gtcgacgtcg 840

gagcagggcc tgtacacggc gcggcagtgc tcgcggtggg gcatctgccg gtggatccgg 900

aacaacggca tggcccccat catcgacatc ttcatggcgg cgagctcgga cctggtggac 960

atccacgtcg ccgcgatgtt ccagtcgctc cacagcgacg gcgactacct gcgcatccag 1020

gacaactcgc tgcacggcgc cgcggccacc gtggacgcgg cgacgccgga gaacatgcgg 1080

acgctcgtcg ggatcgggga gcggatgctg gcgcagcggg tgtccagggt caacgtggag 1140

acagggaggt acgaaccggt gcctggggaa ggaagcaacg ctgatgcgct cgctgggatc 1200

gcaaggcagc tctcggagga gaggaggaca aggctcgcgc gccgcacctc cgccatcgtc 1260

agctccggtg gtgcctctag acgtacgtgt gcctcaaagg tctccaatgt ctaa 1314

<210> 3

<211> 437

<212> PRT

<213> Sorghum bicolor

<400> 3

Met Ala Thr Tyr Tyr Ser Ser Arg Arg Pro Cys Asn Ala Cys Ser Thr

1 5 10 15

Lys Ala Met Ala Gly Ser Val Val Gly Glu Pro Val Val Leu Gly Gln

20 25 30

Arg Val Thr Val Leu Thr Val Asp Gly Gly Gly Ile Arg Gly Leu Ile

35 40 45

Pro Gly Thr Ile Leu Ala Phe Leu Glu Ala Arg Leu Gln Glu Leu Asp

50 55 60

Gly Pro Glu Val Arg Leu Ala Asp Tyr Phe Asp Tyr Ile Ala Gly Thr

65 70 75 80

Ser Thr Gly Gly Leu Ile Thr Ala Met Leu Thr Ala Pro Gly Lys Asp

85 90 95

Arg Arg Pro Leu Tyr Ala Ala Lys Asp Ile Asn Gln Phe Tyr Met Glu

100 105 110

Asn Cys Pro Arg Ile Phe Pro Gln Lys Ser Ser Arg Leu Ala Ala Ala

115 120 125

Met Ser Ala Leu Arg Lys Pro Arg Tyr Asn Gly Lys Cys Leu Arg Asn

130 135 140

Leu Ile Met Ser Met Leu Gly Glu Thr Arg Val Ser Asp Thr Leu Thr

145 150 155 160

Asn Val Ile Ile Pro Thr Phe Asp Val Arg Leu Leu Gln Pro Ile Ile

165 170 175

Phe Ser Thr Tyr Asp Ala Lys Ser Met Pro Leu Lys Asn Ala Leu Leu

180 185 190

Ser Asp Val Cys Ile Gly Thr Ser Ala Ala Pro Thr Tyr Leu Pro Ala

195 200 205

His Tyr Phe Gln Thr Lys Asp Ala Gly Ser Gly Lys Glu Arg Glu Tyr

210 215 220

Asn Leu Ile Asp Gly Gly Val Ala Ala Asn Asn Pro Thr Met Val Ala

225 230 235 240

Met Thr Gln Ile Thr Lys Lys Met Leu Ala Ser Lys Glu Lys Ala Glu

245 250 255

Glu Leu Tyr Pro Val Lys Pro Trp Asn Cys Arg Lys Phe Leu Val Leu

260 265 270

Ser Ile Gly Thr Gly Ser Thr Ser Glu Gln Gly Leu Tyr Thr Ala Arg

275 280 285

Gln Cys Ser Arg Trp Gly Ile Cys Arg Trp Ile Arg Asn Asn Gly Met

290 295 300

Ala Pro Ile Ile Asp Ile Phe Met Ala Ala Ser Ser Asp Leu Val Asp

305 310 315 320

Ile His Val Ala Ala Met Phe Gln Ser Leu His Ser Asp Gly Asp Tyr

325 330 335

Leu Arg Ile Gln Asp Asn Ser Leu His Gly Ala Ala Ala Thr Val Asp

340 345 350

Ala Ala Thr Pro Glu Asn Met Arg Thr Leu Val Gly Ile Gly Glu Arg

355 360 365

Met Leu Ala Gln Arg Val Ser Arg Val Asn Val Glu Thr Gly Arg Tyr

370 375 380

Glu Pro Val Pro Gly Glu Gly Ser Asn Ala Asp Ala Leu Ala Gly Ile

385 390 395 400

Ala Arg Gln Leu Ser Glu Glu Arg Arg Thr Arg Leu Ala Arg Arg Thr

405 410 415

Ser Ala Ile Val Ser Ser Gly Gly Ala Ser Arg Arg Thr Cys Ala Ser

420 425 430

Lys Val Ser Asn Val

435

<210> 4

<211> 2031

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> genomic DNA of mutated Sorghum bicolor phospholipase R59Q

<400> 4

acgcagtgcc tatatacaca agccaccatc tgtcgttgcc tcctcctcct cagctcatca 60

ctagtcacac gtacacccgc aatcgattga aaatttatcg cgttcgtcca aacaatacca 120

gagctcgacg atcatcttaa ttgttggatc gatctgaata atctttcttc attcgtggcc 180

tcgacgagta agtaggtagc tcatttgatc gatcaaccgc gagtgtgtgc ttgatcgaag 240

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atggccggga gcgtggtcgg cgagcccgtc gtgctggggc agagggtgac ggtgctgacg 360

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gatcatgcat gcatgcatgc atgtgatgtg taggagcagc aggcttgcgg ccgccatgtc 720

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ctcaaataaa actatatcat taaaaaaccc gccatgaact agttctagga aaatacgcat 1980

ggttttagaa agaaaaacat aaactaattc taacaaaatg tacacacctc t 2031

<210> 5

<211> 1314

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cDNA of Sorghum bicolor phospholipase mutant R59Q

<400> 5

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<211> 437

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> amino acid sequence of mutated Sorghum bicolor phospholipase R59Q

<400> 6

Met Ala Thr Tyr Tyr Ser Ser Arg Arg Pro Cys Asn Ala Cys Ser Thr

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Lys Ala Met Ala Gly Ser Val Val Gly Glu Pro Val Val Leu Gly Gln

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Arg Val Thr Val Leu Thr Val Asp Gly Gly Gly Ile Arg Gly Leu Ile

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Pro Gly Thr Ile Leu Ala Phe Leu Glu Ala Gln Leu Gln Glu Leu Asp

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Gly Pro Glu Val Arg Leu Ala Asp Tyr Phe Asp Tyr Ile Ala Gly Thr

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Ser Thr Gly Gly Leu Ile Thr Ala Met Leu Thr Ala Pro Gly Lys Asp

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Arg Arg Pro Leu Tyr Ala Ala Lys Asp Ile Asn Gln Phe Tyr Met Glu

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Asn Cys Pro Arg Ile Phe Pro Gln Lys Ser Ser Arg Leu Ala Ala Ala

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Asn Val Ile Ile Pro Thr Phe Asp Val Arg Leu Leu Gln Pro Ile Ile

165 170 175

Phe Ser Thr Tyr Asp Ala Lys Ser Met Pro Leu Lys Asn Ala Leu Leu

180 185 190

Ser Asp Val Cys Ile Gly Thr Ser Ala Ala Pro Thr Tyr Leu Pro Ala

195 200 205

His Tyr Phe Gln Thr Lys Asp Ala Gly Ser Gly Lys Glu Arg Glu Tyr

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Asn Leu Ile Asp Gly Gly Val Ala Ala Asn Asn Pro Thr Met Val Ala

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Met Thr Gln Ile Thr Lys Lys Met Leu Ala Ser Lys Glu Lys Ala Glu

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435

<210> 7

<211> 2031

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> genomic DNA of mutated Sorghum bicolor phospholipase V162I

<400> 7

acgcagtgcc tatatacaca agccaccatc tgtcgttgcc tcctcctcct cagctcatca 60

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gtggacggcg gcggcatccg tggtctcatc cccggaacca tccttgcctt cctcgaggcc 420

cggctgcagg agctggacgg gccggaggtt aggctcgcgg actacttcga ctacatcgcc 480

gggacgagca ccggcgggct catcaccgcc atgctcaccg cgcccggcaa ggacaggcgg 540

cctctctacg ctgccaagga catcaaccaa ttctacatgg agaattgccc tcgcatcttc 600

cctcaaaagt gagtccgatc atcccggccg gccgccattg ttggcctcgc attattgatc 660

gatcatgcat gcatgcatgc atgtgatgtg taggagcagc aggcttgcgg ccgccatgtc 720

cgcgctgagg aagccaaggt acaacggcaa gtgcctccgt aacctgatca tgagcatgct 780

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catgaataat caatcagctg tacattattg cacatggctg catgcctact gaacatgttt 960

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<211> 1314

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cDNA Sorghum bicolor Phospholipase mutant V162I

<400> 8

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ggcggcggca tccgtggtct catccccgga accatccttg ccttcctcga ggcccggctg 180

caggagctgg acgggccgga ggttaggctc gcggactact tcgactacat cgccgggacg 240

agcaccggcg ggctcatcac cgccatgctc accgcgcccg gcaaggacag gcggcctctc 300

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tgcctccgta acctgatcat gagcatgctc ggcgagacga gggtgagcga cacgctcacc 480

aacatcatca tccctacctt cgacgtcagg ctgctgcagc ccatcatctt ctccacctac 540

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gaacgcgagt acaacctcat cgacggcggt gtcgccgcca acaatccgac gatggttgcg 720

atgacgcaga tcaccaagaa gatgcttgcc agcaaggaga aggccgagga gctgtaccca 780

gtgaagccgt ggaactgccg caagttcctg gtgctgtcca tcgggacggg gtcgacgtcg 840

gagcagggcc tgtacacggc gcggcagtgc tcgcggtggg gcatctgccg gtggatccgg 900

aacaacggca tggcccccat catcgacatc ttcatggcgg cgagctcgga cctggtggac 960

atccacgtcg ccgcgatgtt ccagtcgctc cacagcgacg gcgactacct gcgcatccag 1020

gacaactcgc tgcacggcgc cgcggccacc gtggacgcgg cgacgccgga gaacatgcgg 1080

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acagggaggt acgaaccggt gcctggggaa ggaagcaacg ctgatgcgct cgctgggatc 1200

gcaaggcagc tctcggagga gaggaggaca aggctcgcgc gccgcacctc cgccatcgtc 1260

agctccggtg gtgcctctag acgtacgtgt gcctcaaagg tctccaatgt ctaa 1314

<210> 9

<211> 437

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> amino acid sequence of mutated Sorghum bicolor phospholipase

V162I

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Arg Val Thr Val Leu Thr Val Asp Gly Gly Gly Ile Arg Gly Leu Ile

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Pro Gly Thr Ile Leu Ala Phe Leu Glu Ala Arg Leu Gln Glu Leu Asp

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Gly Pro Glu Val Arg Leu Ala Asp Tyr Phe Asp Tyr Ile Ala Gly Thr

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Ser Thr Gly Gly Leu Ile Thr Ala Met Leu Thr Ala Pro Gly Lys Asp

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Arg Arg Pro Leu Tyr Ala Ala Lys Asp Ile Asn Gln Phe Tyr Met Glu

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Asn Cys Pro Arg Ile Phe Pro Gln Lys Ser Ser Arg Leu Ala Ala Ala

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Leu Ile Met Ser Met Leu Gly Glu Thr Arg Val Ser Asp Thr Leu Thr

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Ser Ile Gly Thr Gly Ser Thr Ser Glu Gln Gly Leu Tyr Thr Ala Arg

275 280 285

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Glu Pro Val Pro Gly Glu Gly Ser Asn Ala Asp Ala Leu Ala Gly Ile

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<210> 10

<211> 2031

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> genomic DNA of mutated Sorghum bicolor phospholipase S291L

<400> 10

acgcagtgcc tatatacaca agccaccatc tgtcgttgcc tcctcctcct cagctcatca 60

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cctcaaaagt gagtccgatc atcccggccg gccgccattg ttggcctcgc attattgatc 660

gatcatgcat gcatgcatgc atgtgatgtg taggagcagc aggcttgcgg ccgccatgtc 720

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catgaataat caatcagctg tacattattg cacatggctg catgcctact gaacatgttt 960

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tcgacgtcgg agcagggcct gtacacggcg cggcagtgct tgcggtgggg catctgccgg 1440

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taagagaagt gaatttgttg cctgattaaa atcttaatta attaattctg tgggctgtgg 1920

ctcaaataaa actatatcat taaaaaaccc gccatgaact agttctagga aaatacgcat 1980

ggttttagaa agaaaaacat aaactaattc taacaaaatg tacacacctc t 2031

<210> 11

<211> 1314

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cDNA of Sorghum bicolor phospholipase mutant S291L

<400> 11

atggcgacct actactcttc gcggcgtcca tgcaacgcct gcagcacgaa ggcgatggcc 60

gggagcgtgg tcggcgagcc cgtcgtgctg gggcagaggg tgacggtgct gacggtggac 120

ggcggcggca tccgtggtct catccccgga accatccttg ccttcctcga ggcccggctg 180

caggagctgg acgggccgga ggttaggctc gcggactact tcgactacat cgccgggacg 240

agcaccggcg ggctcatcac cgccatgctc accgcgcccg gcaaggacag gcggcctctc 300

tacgctgcca aggacatcaa ccaattctac atggagaatt gccctcgcat cttccctcaa 360

aagagcagca ggcttgcggc cgccatgtcc gcgctgagga agccaaggta caacggcaag 420

tgcctccgta acctgatcat gagcatgctc ggcgagacga gggtgagcga cacgctcacc 480

aacgtcatca tccctacctt cgacgtcagg ctgctgcagc ccatcatctt ctccacctac 540

gacgccaaga gcatgcctct gaagaacgcg ctgctctccg acgtgtgcat cggcacgtcc 600

gccgcgccga cctacctccc ggcgcactac ttccagacca aggacgccgg cagtggcaag 660

gaacgcgagt acaacctcat cgacggcggt gtcgccgcca acaatccgac gatggttgcg 720

atgacgcaga tcaccaagaa gatgcttgcc agcaaggaga aggccgagga gctgtaccca 780

gtgaagccgt ggaactgccg caagttcctg gtgctgtcca tcgggacggg gtcgacgtcg 840

gagcagggcc tgtacacggc gcggcagtgc ttgcggtggg gcatctgccg gtggatccgg 900

aacaacggca tggcccccat catcgacatc ttcatggcgg cgagctcgga cctggtggac 960

atccacgtcg ccgcgatgtt ccagtcgctc cacagcgacg gcgactacct gcgcatccag 1020

gacaactcgc tgcacggcgc cgcggccacc gtggacgcgg cgacgccgga gaacatgcgg 1080

acgctcgtcg ggatcgggga gcggatgctg gcgcagcggg tgtccagggt caacgtggag 1140

acagggaggt acgaaccggt gcctggggaa ggaagcaacg ctgatgcgct cgctgggatc 1200

gcaaggcagc tctcggagga gaggaggaca aggctcgcgc gccgcacctc cgccatcgtc 1260

agctccggtg gtgcctctag acgtacgtgt gcctcaaagg tctccaatgt ctaa 1314

<210> 12

<211> 437

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> amino acid sequence of mutated Sorghum bicolor phospholipase

S291L

<400> 12

Met Ala Thr Tyr Tyr Ser Ser Arg Arg Pro Cys Asn Ala Cys Ser Thr

1 5 10 15

Lys Ala Met Ala Gly Ser Val Val Gly Glu Pro Val Val Leu Gly Gln

20 25 30

Arg Val Thr Val Leu Thr Val Asp Gly Gly Gly Ile Arg Gly Leu Ile

35 40 45

Pro Gly Thr Ile Leu Ala Phe Leu Glu Ala Arg Leu Gln Glu Leu Asp

50 55 60

Gly Pro Glu Val Arg Leu Ala Asp Tyr Phe Asp Tyr Ile Ala Gly Thr

65 70 75 80

Ser Thr Gly Gly Leu Ile Thr Ala Met Leu Thr Ala Pro Gly Lys Asp

85 90 95

Arg Arg Pro Leu Tyr Ala Ala Lys Asp Ile Asn Gln Phe Tyr Met Glu

100 105 110

Asn Cys Pro Arg Ile Phe Pro Gln Lys Ser Ser Arg Leu Ala Ala Ala

115 120 125

Met Ser Ala Leu Arg Lys Pro Arg Tyr Asn Gly Lys Cys Leu Arg Asn

130 135 140

Leu Ile Met Ser Met Leu Gly Glu Thr Arg Val Ser Asp Thr Leu Thr

145 150 155 160

Asn Val Ile Ile Pro Thr Phe Asp Val Arg Leu Leu Gln Pro Ile Ile

165 170 175

Phe Ser Thr Tyr Asp Ala Lys Ser Met Pro Leu Lys Asn Ala Leu Leu

180 185 190

Ser Asp Val Cys Ile Gly Thr Ser Ala Ala Pro Thr Tyr Leu Pro Ala

195 200 205

His Tyr Phe Gln Thr Lys Asp Ala Gly Ser Gly Lys Glu Arg Glu Tyr

210 215 220

Asn Leu Ile Asp Gly Gly Val Ala Ala Asn Asn Pro Thr Met Val Ala

225 230 235 240

Met Thr Gln Ile Thr Lys Lys Met Leu Ala Ser Lys Glu Lys Ala Glu

245 250 255

Glu Leu Tyr Pro Val Lys Pro Trp Asn Cys Arg Lys Phe Leu Val Leu

260 265 270

Ser Ile Gly Thr Gly Ser Thr Ser Glu Gln Gly Leu Tyr Thr Ala Arg

275 280 285

Gln Cys Leu Arg Trp Gly Ile Cys Arg Trp Ile Arg Asn Asn Gly Met

290 295 300

Ala Pro Ile Ile Asp Ile Phe Met Ala Ala Ser Ser Asp Leu Val Asp

305 310 315 320

Ile His Val Ala Ala Met Phe Gln Ser Leu His Ser Asp Gly Asp Tyr

325 330 335

Leu Arg Ile Gln Asp Asn Ser Leu His Gly Ala Ala Ala Thr Val Asp

340 345 350

Ala Ala Thr Pro Glu Asn Met Arg Thr Leu Val Gly Ile Gly Glu Arg

355 360 365

Met Leu Ala Gln Arg Val Ser Arg Val Asn Val Glu Thr Gly Arg Tyr

370 375 380

Glu Pro Val Pro Gly Glu Gly Ser Asn Ala Asp Ala Leu Ala Gly Ile

385 390 395 400

Ala Arg Gln Leu Ser Glu Glu Arg Arg Thr Arg Leu Ala Arg Arg Thr

405 410 415

Ser Ala Ile Val Ser Ser Gly Gly Ala Ser Arg Arg Thr Cys Ala Ser

420 425 430

Lys Val Ser Asn Val

435

<210> 13

<211> 2031

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> genomic DNA of mutated Sorghum bicolor phospholipase Q372stop

<400> 13

acgcagtgcc tatatacaca agccaccatc tgtcgttgcc tcctcctcct cagctcatca 60

ctagtcacac gtacacccgc aatcgattga aaatttatcg cgttcgtcca aacaatacca 120

gagctcgacg atcatcttaa ttgttggatc gatctgaata atctttcttc attcgtggcc 180

tcgacgagta agtaggtagc tcatttgatc gatcaaccgc gagtgtgtgc ttgatcgaag 240

gcggcaatgg cgacctacta ctcttcgcgg cgtccatgca acgcctgcag cacgaaggcg 300

atggccggga gcgtggtcgg cgagcccgtc gtgctggggc agagggtgac ggtgctgacg 360

gtggacggcg gcggcatccg tggtctcatc cccggaacca tccttgcctt cctcgaggcc 420

cggctgcagg agctggacgg gccggaggtt aggctcgcgg actacttcga ctacatcgcc 480

gggacgagca ccggcgggct catcaccgcc atgctcaccg cgcccggcaa ggacaggcgg 540

cctctctacg ctgccaagga catcaaccaa ttctacatgg agaattgccc tcgcatcttc 600

cctcaaaagt gagtccgatc atcccggccg gccgccattg ttggcctcgc attattgatc 660

gatcatgcat gcatgcatgc atgtgatgtg taggagcagc aggcttgcgg ccgccatgtc 720

cgcgctgagg aagccaaggt acaacggcaa gtgcctccgt aacctgatca tgagcatgct 780

cggcgagacg agggtgagcg acacgctcac caacgtcatc atccctacct tcgacgtcag 840

gctgctgcag cccatcatct tctccaccta cgacgtacgt acgccgccgg ccgccgtcgt 900

catgaataat caatcagctg tacattattg cacatggctg catgcctact gaacatgttt 960

aatttgcagg ccaagagcat gcctctgaag aacgcgctgc tctccgacgt gtgcatcggc 1020

acgtccgccg cgccgaccta cctcccggcg cactacttcc agaccaagga cgccggcagt 1080

ggcaaggaac gcgagtacaa cctcatcgac ggcggtgtcg ccgccaacaa tccggtaatt 1140

aattaactga aaacgaacga acgcaattcc atatccattg tccagaagat cgatgctaat 1200

tgttgcttag gcacgtcgtt gccgccggcc gattgcattg cacttgcaca tgcgtagacg 1260

atggttgcga tgacgcagat caccaagaag atgcttgcca gcaaggagaa ggccgaggag 1320

ctgtacccag tgaagccgtg gaactgccgc aagttcctgg tgctgtccat cgggacgggg 1380

tcgacgtcgg agcagggcct gtacacggcg cggcagtgct cgcggtgggg catctgccgg 1440

tggatccgga acaacggcat ggcccccatc atcgacatct tcatggcggc gagctcggac 1500

ctggtggaca tccacgtcgc cgcgatgttc cagtcgctcc acagcgacgg cgactacctg 1560

cgcatccagg acaactcgct gcacggcgcc gcggccaccg tggacgcggc gacgccggag 1620

aacatgcgga cgctcgtcgg gatcggggag cggatgctgg cgtagcgggt gtccagggtc 1680

aacgtggaga cagggaggta cgaaccggtg cctggggaag gaagcaacgc tgatgcgctc 1740

gctgggatcg caaggcagct ctcggaggag aggaggacaa ggctcgcgcg ccgcacctcc 1800

gccatcgtca gctccggtgg tgcctctaga cgtacgtgtg cctcaaaggt ctccaatgtc 1860

taagagaagt gaatttgttg cctgattaaa atcttaatta attaattctg tgggctgtgg 1920

ctcaaataaa actatatcat taaaaaaccc gccatgaact agttctagga aaatacgcat 1980

ggttttagaa agaaaaacat aaactaattc taacaaaatg tacacacctc t 2031

<210> 14

<211> 1116

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cDNA of Sorghum bicolor phospholipase mutant Q372stop

<400> 14

atggcgacct actactcttc gcggcgtcca tgcaacgcct gcagcacgaa ggcgatggcc 60

gggagcgtgg tcggcgagcc cgtcgtgctg gggcagaggg tgacggtgct gacggtggac 120

ggcggcggca tccgtggtct catccccgga accatccttg ccttcctcga ggcccggctg 180

caggagctgg acgggccgga ggttaggctc gcggactact tcgactacat cgccgggacg 240

agcaccggcg ggctcatcac cgccatgctc accgcgcccg gcaaggacag gcggcctctc 300

tacgctgcca aggacatcaa ccaattctac atggagaatt gccctcgcat cttccctcaa 360

aagagcagca ggcttgcggc cgccatgtcc gcgctgagga agccaaggta caacggcaag 420

tgcctccgta acctgatcat gagcatgctc ggcgagacga gggtgagcga cacgctcacc 480

aacgtcatca tccctacctt cgacgtcagg ctgctgcagc ccatcatctt ctccacctac 540

gacgccaaga gcatgcctct gaagaacgcg ctgctctccg acgtgtgcat cggcacgtcc 600

gccgcgccga cctacctccc ggcgcactac ttccagacca aggacgccgg cagtggcaag 660

gaacgcgagt acaacctcat cgacggcggt gtcgccgcca acaatccgac gatggttgcg 720

atgacgcaga tcaccaagaa gatgcttgcc agcaaggaga aggccgagga gctgtaccca 780

gtgaagccgt ggaactgccg caagttcctg gtgctgtcca tcgggacggg gtcgacgtcg 840

gagcagggcc tgtacacggc gcggcagtgc tcgcggtggg gcatctgccg gtggatccgg 900

aacaacggca tggcccccat catcgacatc ttcatggcgg cgagctcgga cctggtggac 960

atccacgtcg ccgcgatgtt ccagtcgctc cacagcgacg gcgactacct gcgcatccag 1020

gacaactcgc tgcacggcgc cgcggccacc gtggacgcgg cgacgccgga gaacatgcgg 1080

acgctcgtcg ggatcgggga gcggatgctg gcgtag 1116

<210> 15

<211> 371

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> amino acid sequence of mutated Sorghum bicolor phospholipase

Q372stop

<400> 15

Met Ala Thr Tyr Tyr Ser Ser Arg Arg Pro Cys Asn Ala Cys Ser Thr

1 5 10 15

Lys Ala Met Ala Gly Ser Val Val Gly Glu Pro Val Val Leu Gly Gln

20 25 30

Arg Val Thr Val Leu Thr Val Asp Gly Gly Gly Ile Arg Gly Leu Ile

35 40 45

Pro Gly Thr Ile Leu Ala Phe Leu Glu Ala Arg Leu Gln Glu Leu Asp

50 55 60

Gly Pro Glu Val Arg Leu Ala Asp Tyr Phe Asp Tyr Ile Ala Gly Thr

65 70 75 80

Ser Thr Gly Gly Leu Ile Thr Ala Met Leu Thr Ala Pro Gly Lys Asp

85 90 95

Arg Arg Pro Leu Tyr Ala Ala Lys Asp Ile Asn Gln Phe Tyr Met Glu

100 105 110

Asn Cys Pro Arg Ile Phe Pro Gln Lys Ser Ser Arg Leu Ala Ala Ala

115 120 125

Met Ser Ala Leu Arg Lys Pro Arg Tyr Asn Gly Lys Cys Leu Arg Asn

130 135 140

Leu Ile Met Ser Met Leu Gly Glu Thr Arg Val Ser Asp Thr Leu Thr

145 150 155 160

Asn Val Ile Ile Pro Thr Phe Asp Val Arg Leu Leu Gln Pro Ile Ile

165 170 175

Phe Ser Thr Tyr Asp Ala Lys Ser Met Pro Leu Lys Asn Ala Leu Leu

180 185 190

Ser Asp Val Cys Ile Gly Thr Ser Ala Ala Pro Thr Tyr Leu Pro Ala

195 200 205

His Tyr Phe Gln Thr Lys Asp Ala Gly Ser Gly Lys Glu Arg Glu Tyr

210 215 220

Asn Leu Ile Asp Gly Gly Val Ala Ala Asn Asn Pro Thr Met Val Ala

225 230 235 240

Met Thr Gln Ile Thr Lys Lys Met Leu Ala Ser Lys Glu Lys Ala Glu

245 250 255

Glu Leu Tyr Pro Val Lys Pro Trp Asn Cys Arg Lys Phe Leu Val Leu

260 265 270

Ser Ile Gly Thr Gly Ser Thr Ser Glu Gln Gly Leu Tyr Thr Ala Arg

275 280 285

Gln Cys Ser Arg Trp Gly Ile Cys Arg Trp Ile Arg Asn Asn Gly Met

290 295 300

Ala Pro Ile Ile Asp Ile Phe Met Ala Ala Ser Ser Asp Leu Val Asp

305 310 315 320

Ile His Val Ala Ala Met Phe Gln Ser Leu His Ser Asp Gly Asp Tyr

325 330 335

Leu Arg Ile Gln Asp Asn Ser Leu His Gly Ala Ala Ala Thr Val Asp

340 345 350

Ala Ala Thr Pro Glu Asn Met Arg Thr Leu Val Gly Ile Gly Glu Arg

355 360 365

Met Leu Ala

370

<210> 16

<211> 2979

<212> DNA

<213> Helianthus annuus

<400> 16

atgaataaca tcaatcttgt aatagtttcg cttgtaatcg cgattgtagc catccaaccc 60

cttgcgcaag agcaaaccga tgtaggtgag gcaaatttcg tcactgttct tagcatcgat 120

ggtgggggtg ttcgtggcat tgttcccgcc accttgcttg cttttcttga atccaaaatt 180

caggtactcg aacttaaaat gcacatgtgc atcatattac aagctgtaac ttattattga 240

aatgtgccgt ctcttcggat aggaaataga tgggccagat gcacgaattg cggattattt 300

tgatgtaata gccggaacaa gcacaggagg gctgatgaca actatgcttg cagctcctaa 360

tgagaaaaat cgtcccatgt tcgccgcaaa agacattacc aacttctact ttcaacattc 420

gcctaggatc ttccctaaaa tagggtaaac tctaactagt ttccggatct ataagatcat 480

cattaaatac aagtttcatt ttctttttcg aatcaaatac agacacacat ttgatgaggc 540

gcaaccttat ccttctcaaa acgaagcctg cgaaatgggg tattctccta caaagacttt 600

tgtaattcat gttctagtgg gtgtttggat gtgcgtttta aaactgatta ttatttacat 660

gtagtttctg aagaaaataa aacagttatt caaacacttt ttgttaataa ttctactaga 720

aaaaaaaaat ccttgtcagg aaattaatta aaaaaaagtt accatctatt aaagttcttt 780

cttactaatc aaaagttttt aaattttatt atcatgttat tataactaaa catacacatc 840

caaacactat ctcataccac atgattacac aagtctatta tttgaatatg ctaacttagt 900

attttcatat aataagtttt taaaacgcca catccaaaac ccttgattct tattttacat 960

tgtgtagcta aaacagtgtt tatacataaa aacaatcagt tatataaatc aaagcattat 1020

ttaactaaag taagctcggt tcaaactcga taagagaatt aatatatacg agtcgagttc 1080

ctgttgacca gatttcgcta gtgttaagtt tcgagttcaa aattgtatat gaacttgaac 1140

ctgtgtatca tcatacttga catttaaacc ataatgttgt tgaataaata aagtgatttt 1200

attttgtagt cggaccaaat tcatgaattc ggtagtaacc gtacttggtg aggccaccgg 1260

accaaagtat gatggtaaat atcttcgagc catggcaaag atgatgttaa aaaacctcac 1320

tattaaagat acgttgacga atgttgtcat acctgctttc gacattaggc ggcttcaacc 1380

tgttatcttc tcctctgctc aagtaattaa actcgttttt tatatttata gcagttctct 1440

atttaaaatt gattgtgtat cataaaatgg tttctgtttg atacgtttag ggaaaagagg 1500

tcgcgtggaa aaatgctttg ctagcagacg tatgcattag taccgcggcg gcaccaacat 1560

ttttcccgcc atactatttt gagactagag acgtcgatgg aaccaagcac acttttgatc 1620

taatcgatgg cggggtagct gcaaacaatc cggtagttac atttcaacaa tattgagttt 1680

gcattttatt tttaggacaa gtagtcacat tagggtgaag ggtgtgttca agctcatccc 1740

gaaggtggga gcggtgttcc cactcgtacc tcatggcgca ttttcttctt tgttgcagct 1800

ccaattttaa aaagccaccc cgccttttcc attccatagc gccacgtcaa ctgggaaatg 1860

gtgttcccac tggtattgga gatttggagg cgctacgcca cctctgtcat cccgaagcca 1920

caccctccac ccttaggagt gttatcggtt cagttttcgg tttatacagt ttaaaggttt 1980

ttttttggtt gaaaccaaaa accgaactga actgaacgga attcgggtag ttcacaactg 2040

aaccaaaaac tgaatccata ttcggttttc tgtttgaccg aataatcatt atttgttatt 2100

tgattgtgcg aggttaaata agattgagca aaaattgtaa ttaattggat ttggctaaat 2160

gacaatttaa ataaccgtta tttgttatcc gattcaaacc gaacacccaa ctcgatttgg 2220

tttaataccg aaccgacaac cggatacgta attcagttcg ctattaaaag gttcgggttt 2280

ggtagggttt aacccatttg aaatcgaatc ttcagagaaa gggttcgcta atgtcaccca 2340

cataaccaaa gaaatcttgt ttaaatgtta atggcagaca catttggcta tcacacatat 2400

aaccaaagaa gcggtgatgg ggaaatacag gttctctggc ccggaggttt tcgacggaag 2460

acggatgctt gtgctttcac tcggcactgg tacgcagacg tacaatgact tatatactgc 2520

acaaaaggct gcaaaatggg ggttgcttag ttggatcttt accaatggta ctgcgccaat 2580

cctccgcatt tttggtgatg ccatgtcaga tatggtcgac atccatgtgt caactatatt 2640

ccaatcgttg caagtcgaaa aaaactatct gcgtattcag gtataactaa gaacatataa 2700

atataatgtt gtataggtta catgtttagt aacaaggagt ttttttatgg gcaggaagat 2760

aacttgaaag gggaagcaac tgcaatggat atttcatcac ctgagaacat gagggcgcta 2820

gaggacattg gcaagaaatt gttgaagaaa ccgttgtcga gattggatgt ggagacaggc 2880

aagcttgaac cagttaaagg agaaggtacg aatgctgatg cattagcacg tttcgccact 2940

ttgctttgtg ccgaacgaaa gcgccgcaat ccagcttaa 2979

<210> 17

<211> 1305

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cDNA of Helianthus annuus phospholipase

<400> 17

atgaataaca tcaatcttgt aatagtttcg cttgtaatcg cgattgtagc catccaaccc 60

cttgcgcaag agcaaaccga tgtaggtgag gcaaatttcg tcactgttct tagcatcgat 120

ggtgggggtg ttcgtggcat tgttcccgcc accttgcttg cttttcttga atccaaaatt 180

caggaaatag atgggccaga tgcacgaatt gcggattatt ttgatgtaat agccggaaca 240

agcacaggag ggctgatgac aactatgctt gcagctccta atgagaaaaa tcgtcccatg 300

ttcgccgcaa aagacattac caacttctac tttcaacatt cgcctaggat cttccctaaa 360

ataggacaca catttgatga ggcgcaacct tatccttctc aaaacgaagc ctgcgaaatg 420

ggtcggacca aattcatgaa ttcggtagta accgtacttg gtgaggccac cggaccaaag 480

tatgatggta aatatcttcg agccatggca aagatgatgt taaaaaacct cactattaaa 540

gatacgttga cgaatattgt catacctgct ttcgacatca ggcggcttca acctgttatc 600

ttctcctctg ctcaaggaaa agaggtcgcg tggaaaaatg ctttgctagc agacgtatgc 660

attagtaccg cggcggcacc aacgtttttc ccgccatact attttgagac tagagatgtc 720

gatggaacca agcacacttt tgatctaatc gatggcgggg tagctgcaaa caatccgaca 780

catttggcta tcacacatat aaccaaagaa gcggtgatgg ggaaatacag gttctctggc 840

ccggaggttt tcgacggcag acggatgctt gtgctttcac tcggcactgg tacgcagacg 900

tacaatgact tatacactgc acaaaaggct gcaaaatggg ggttgcttag ttggatcttt 960

accaatggta ctgcgccaat cctccgcatt tttggtgatg ccatgtcaga tatggtcgac 1020

atccatgtgt caactatatt ccaatcgttg caagtcgaaa aaaactatct gcgtattcag 1080

gaagataact tgaaagggga agcaactgca atggatattt catcacccga gaacatgagg 1140

gcgctagagg acattggcaa gaaattgttg aagaaaccgt tgtcgagatt ggatgtggag 1200

acaggcaagc ttgaaccagt taaaggagaa ggtacgaatg ctgatgcatt agcacgtttc 1260

gccactttgc tttgtgccga acgaaagcgc cgcaatccag cttaa 1305

<210> 18

<211> 434

<212> PRT

<213> Helianthus annuus

<400> 18

Met Asn Asn Ile Asn Leu Val Ile Val Ser Leu Val Ile Ala Ile Val

1 5 10 15

Ala Ile Gln Pro Leu Ala Gln Glu Gln Thr Asp Val Gly Glu Ala Asn

20 25 30

Phe Val Thr Val Leu Ser Ile Asp Gly Gly Gly Val Arg Gly Ile Val

35 40 45

Pro Ala Thr Leu Leu Ala Phe Leu Glu Ser Lys Ile Gln Glu Ile Asp

50 55 60

Gly Pro Asp Ala Arg Ile Ala Asp Tyr Phe Asp Val Ile Ala Gly Thr

65 70 75 80

Ser Thr Gly Gly Leu Met Thr Thr Met Leu Ala Ala Pro Asn Glu Lys

85 90 95

Asn Arg Pro Met Phe Ala Ala Lys Asp Ile Thr Asn Phe Tyr Phe Gln

100 105 110

His Ser Pro Arg Ile Phe Pro Lys Ile Gly His Thr Phe Asp Glu Ala

115 120 125

Gln Pro Tyr Pro Ser Gln Asn Glu Ala Cys Glu Met Gly Arg Thr Lys

130 135 140

Phe Met Asn Ser Val Val Thr Val Leu Gly Glu Ala Thr Gly Pro Lys

145 150 155 160

Tyr Asp Gly Lys Tyr Leu Arg Ala Met Ala Lys Met Met Leu Lys Asn

165 170 175

Leu Thr Ile Lys Asp Thr Leu Thr Asn Ile Val Ile Pro Ala Phe Asp

180 185 190

Ile Arg Arg Leu Gln Pro Val Ile Phe Ser Ser Ala Gln Gly Lys Glu

195 200 205

Val Ala Trp Lys Asn Ala Leu Leu Ala Asp Val Cys Ile Ser Thr Ala

210 215 220

Ala Ala Pro Thr Phe Phe Pro Pro Tyr Tyr Phe Glu Thr Arg Asp Val

225 230 235 240

Asp Gly Thr Lys His Thr Phe Asp Leu Ile Asp Gly Gly Val Ala Ala

245 250 255

Asn Asn Pro Thr His Leu Ala Ile Thr His Ile Thr Lys Glu Ala Val

260 265 270

Met Gly Lys Tyr Arg Phe Ser Gly Pro Glu Val Phe Asp Gly Arg Arg

275 280 285

Met Leu Val Leu Ser Leu Gly Thr Gly Thr Gln Thr Tyr Asn Asp Leu

290 295 300

Tyr Thr Ala Gln Lys Ala Ala Lys Trp Gly Leu Leu Ser Trp Ile Phe

305 310 315 320

Thr Asn Gly Thr Ala Pro Ile Leu Arg Ile Phe Gly Asp Ala Met Ser

325 330 335

Asp Met Val Asp Ile His Val Ser Thr Ile Phe Gln Ser Leu Gln Val

340 345 350

Glu Lys Asn Tyr Leu Arg Ile Gln Glu Asp Asn Leu Lys Gly Glu Ala

355 360 365

Thr Ala Met Asp Ile Ser Ser Pro Glu Asn Met Arg Ala Leu Glu Asp

370 375 380

Ile Gly Lys Lys Leu Leu Lys Lys Pro Leu Ser Arg Leu Asp Val Glu

385 390 395 400

Thr Gly Lys Leu Glu Pro Val Lys Gly Glu Gly Thr Asn Ala Asp Ala

405 410 415

Leu Ala Arg Phe Ala Thr Leu Leu Cys Ala Glu Arg Lys Arg Arg Asn

420 425 430

Pro Ala

<210> 19

<211> 1531

<212> DNA

<213> Hordeum vulgare

<400> 19

atggcaagct actggtgccg gcgaccgtgc gagtcgtgca gcacgagggc gatggcgggc 60

agcgtggtcg gccagccggt ggcgccgggg cagagggtga cggtgctgac catcgacggc 120

ggcggcatcc gcggcctcat cccgggcacc atcctcgcct tcctcgaggc caggctgcag 180

gagctggacg ggccggacgc gcgcctggcc gactacttcg actgcatcgc cggcaccagc 240

accggcgggc tcatcaccgc catgctcacc gcgcccggcc aggacggccg cccgctcttc 300

gccgccaagg acgtcaaccg cttctacctc gacaacgggc cctacatctt cccccaaagg 360

cgagagcacg agcgatctca tggccatgga tcatgccagc tgaaccggtg attgatgtgt 420

gaattgtgtt gagctgtgcc aggaggtgcg cgctcgccgc ggtgaccgcg tcgctgaggc 480

ggccgaggta cagcggcaag tacctgcacg gcaagatcag gagcatgctg ggcgagacga 540

ggctgtgcga cgcgctcacc gacgtcgtca tccccacctt cgacgtcaag cttctccagc 600

ccatcatctt ctccacatac gacgtatgct aatttacgcc attgatcaga tagatccatc 660

ctccttggat cagacagaca tggggctaaa atcgttgaag gatcatgcgt gcaggccagg 720

aacatgcccc tgaagaacgc gcggcttgcc gacatctgca tcggcacctc cgccgccccg 780

acctacctcc cggcgcacca cttccacacc caagacgaca acggtaagga gcgcgagtac 840

aacctcatcg acggcggcgt cgccgccaac aatccggtaa ccaaccaatc aagcgtccat 900

cagtcatcac atattcagat acgctgcccg agcacactga tgaactgagt tgtgagagat 960

gcagacgatg gtgaccatga cgcagatcac caagaagatg atggtcaagg acagggagga 1020

gctgtacccg gtgaagccgt cggactgcgg caagttcctg gtgctgtcca tcgggaccgg 1080

ctcgacgtcg gaccaggggc tgtacacggc caagcagtgc tcccagtggg gcatcatccg 1140

ctggctgcgc aacaagggca tggcgcccat catcgacatc ttcatggcgg ccagctccga 1200

cctcgtcgac atccacgccg ccgtgctctt ccagtcgctg cacagcgacg gtaactacct 1260

ccgcatccag gacaactcgc tccacggccc agccgcgacg gtggacgccg ccacgcccga 1320

gaacatggcg gagctcctca ggatcggcga gcggatgttg gcacagaggg tgtccagggt 1380

gaacgtcgag accgggaggt acgaggagat acggggcgcc gggagcaacg ccgacgcgct 1440

cgccggcttc gccaaacagc tctccgacga gaggaggaca aggctcggcc gccggcgcgt 1500

tggcgccggc cgtctgaaat ccagacgctg a 1531

<210> 20

<211> 1269

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cDNA of Hordeum vulgare phospholipase

<400> 20

atggcaagct actggtgccg gcgaccgtgc gagtcgtgca gcacgagggc gatggcgggc 60

agcgtggtcg gccagccggt ggcgccgggg cagagggtga cggtgctgac catcgacggc 120

ggcggcatcc gcggcctcat cccgggcacc atcctcgcct tcctcgaggc caggctgcag 180

gagctggacg ggccggacgc gcgcctggcc gactacttcg actgcatcgc cggcaccagc 240

accggcgggc tcatcaccgc catgctcacc gcgcccggcc aggacggccg cccgctcttc 300

gccgccaagg acgtcaaccg cttctacctc gacaacgggc cctacatctt cccccaaagg 360

aggtgcgcgc tcgccgcggt gaccgcgtcg ctgaggcggc cgaggtacag cggcaagtac 420

ctgcacggca agatcaggag catgctgggc gagacgaggc tgtgcgacgc gctcaccgac 480

gtcgtcatcc ccaccttcga cgtcaagctt ctccagccca tcatcttctc cacatacgac 540

gccaggaaca tgcccctgaa gaacgcgcgg cttgccgaca tctgcatcgg cacctccgcc 600

gccccgacct acctcccggc gcaccacttc cacacccaag acgacaacgg taaggagcgc 660

gagtacaacc tcatcgacgg cggcgtcgcc gccaacaatc cgacgatggt gaccatgacg 720

cagatcacca agaagatgat ggtcaaggac agggaggagc tgtacccggt gaagccgtcg 780

gactgcggca agttcctggt gctgtccatc gggaccggct cgacgtcgga ccaggggctg 840

tacacggcca agcagtgctc ccagtggggc atcatccgct ggctgcgcaa caagggcatg 900

gcgcccatca tcgacatctt catggcggcc agctccgacc tcgtcgacat ccacgccgcc 960

gtgctcttcc agtcgctgca cagcgacggt aactacctcc gcatccagga caactcgctc 1020

cacggcccag ccgcgacggt ggacgccgcc acgcccgaga acatggcgga gctcctcagg 1080

atcggcgagc ggatgttggc acagagggtg tccagggtga acgtcgagac cgggaggtac 1140

gaggagatac ggggcgccgg gagcaacgcc gacgcgctcg ccggcttcgc caaacagctc 1200

tccgacgaga ggaggacaag gctcggccgc cggcgcgttg gcgccggccg tctgaaatcc 1260

agacgctga 1269

<210> 21

<211> 422

<212> PRT

<213> Hordeum vulgare

<400> 21

Met Ala Ser Tyr Trp Cys Arg Arg Pro Cys Glu Ser Cys Ser Thr Arg

1 5 10 15

Ala Met Ala Gly Ser Val Val Gly Gln Pro Val Ala Pro Gly Gln Arg

20 25 30

Val Thr Val Leu Thr Ile Asp Gly Gly Gly Ile Arg Gly Leu Ile Pro

35 40 45

Gly Thr Ile Leu Ala Phe Leu Glu Ala Arg Leu Gln Glu Leu Asp Gly

50 55 60

Pro Asp Ala Arg Leu Ala Asp Tyr Phe Asp Cys Ile Ala Gly Thr Ser

65 70 75 80

Thr Gly Gly Leu Ile Thr Ala Met Leu Thr Ala Pro Gly Gln Asp Gly

85 90 95

Arg Pro Leu Phe Ala Ala Lys Asp Val Asn Arg Phe Tyr Leu Asp Asn

100 105 110

Gly Pro Tyr Ile Phe Pro Gln Arg Arg Cys Ala Leu Ala Ala Val Thr

115 120 125

Ala Ser Leu Arg Arg Pro Arg Tyr Ser Gly Lys Tyr Leu His Gly Lys

130 135 140

Ile Arg Ser Met Leu Gly Glu Thr Arg Leu Cys Asp Ala Leu Thr Asp

145 150 155 160

Val Val Ile Pro Thr Phe Asp Val Lys Leu Leu Gln Pro Ile Ile Phe

165 170 175

Ser Thr Tyr Asp Ala Arg Asn Met Pro Leu Lys Asn Ala Arg Leu Ala

180 185 190

Asp Ile Cys Ile Gly Thr Ser Ala Ala Pro Thr Tyr Leu Pro Ala His

195 200 205

His Phe His Thr Gln Asp Asp Asn Gly Lys Glu Arg Glu Tyr Asn Leu

210 215 220

Ile Asp Gly Gly Val Ala Ala Asn Asn Pro Thr Met Val Thr Met Thr

225 230 235 240

Gln Ile Thr Lys Lys Met Met Val Lys Asp Arg Glu Glu Leu Tyr Pro

245 250 255

Val Lys Pro Ser Asp Cys Gly Lys Phe Leu Val Leu Ser Ile Gly Thr

260 265 270

Gly Ser Thr Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Ala Lys Gln Cys Ser Gln

275 280 285

Trp Gly Ile Ile Arg Trp Leu Arg Asn Lys Gly Met Ala Pro Ile Ile

290 295 300

Asp Ile Phe Met Ala Ala Ser Ser Asp Leu Val Asp Ile His Ala Ala

305 310 315 320

Val Leu Phe Gln Ser Leu His Ser Asp Gly Asn Tyr Leu Arg Ile Gln

325 330 335

Asp Asn Ser Leu His Gly Pro Ala Ala Thr Val Asp Ala Ala Thr Pro

340 345 350

Glu Asn Met Ala Glu Leu Leu Arg Ile Gly Glu Arg Met Leu Ala Gln

355 360 365

Arg Val Ser Arg Val Asn Val Glu Thr Gly Arg Tyr Glu Glu Ile Arg

370 375 380

Gly Ala Gly Ser Asn Ala Asp Ala Leu Ala Gly Phe Ala Lys Gln Leu

385 390 395 400

Ser Asp Glu Arg Arg Thr Arg Leu Gly Arg Arg Arg Val Gly Ala Gly

405 410 415

Arg Leu Lys Ser Arg Arg

420

<210> 22

<211> 9001

<212> DNA

<213> Beta vulgaris

<220>

<221> misc_feature

<222> (2702)..(2702)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 22

ttttccaaca acataccgag tagttttctc caagtttaag ttatttatgt tattgtaatt 60

gtaatgtaag agctagtaaa gctcagttta gtttctttgt ttttagtatg aatgtaccat 120

ttttagtatg taattatgct tttaattaat gcaaaatttt ccgttgtaaa aaaaagtcta 180

catgtccctc ttgcagagat aaatgtaagg gacattattg cttagttctc gactaattta 240

caataagttt ataattggtt atcatggttc atgagtactc ctgttcatag aaggacaata 300

atttataaag gtttcttagt agcttccaat gacggagctc aatgaccctg ttaattagct 360

aagtaataag ttggccatta gccaataaca actgtattat tagctagtaa gttcattaga 420

tcgatataac ttataagtct aatgaatata aatatgaata agatggaact gaaatgagtt 480

ttatatttga aaaattagtg gcatacgtgc ttaaacgttt ttttgattat ggctagaaga 540

cttagaacga agttggagga attcttcatt catataaatt tatgctagat aaactaatag 600

ccagtcaagt caagtttatg tttttaaaaa aaatcttatc tcatgtagta cgagaatctt 660

tattttataa tttcgttata ataaatatgc atttcactcc tttcaaatcg ttagctacat 720

cacttctgca accaagcaag caagccataa tatttaatca caggttcttt aatactatag 780

tctatatata catgcaatcc acttacatta attatcatct tattctccca tcatcaagaa 840

aacacattac aatccaaaga aataaaacat ggagaattct agatctctgg gtaaccctgt 900

tagccctaga ccccctaatc atggtaatct cataacaatt ttaagtattg atgggggagg 960

cattagggga ataatccctg cagttatgct tgaattcctt gaatcacaac tccaggtatg 1020

tacataatta agaaatgatg atatacgatc atctttagta ctcttgttaa atgatttgac 1080

gtaagaaatc atgtatatat tatgcatgcc ttactataat attgcgtgca tgttcataat 1140

cacaacagaa gttagatggt gaggaagcaa gattggctga ttattttgat gttattgccg 1200

gaacgagcac cggtggcctc ataactgcca tgttaaccgc ccctaacgac aaaactcggc 1260

cactctacgc cgccaaggag attactcctt tttatcttga gcattgtccg aagatcttcc 1320

gccaaccaag gtaaataaat caaatttatc atctatgtat atcaggattg gtaaattaga 1380

gaggatgaaa aacccttaaa tgcttggaac tattaacgct cgagttccaa ttatgggcca 1440

ttgtctctta taggtctcaa ctattgattt ttttctatag caggcgcgga tgtaagattt 1500

tgaatttgga agggtcctaa ctaaaccaaa gaaataaatt acaatgacca tattaacata 1560

taagaagttt agttttaaca ataagaaaac caacagttgg tcttgtaaga gaccgtctac 1620

ttttaattta aaagtaggcg cggcccaagc ccaatattaa gaagagaata gatcatattt 1680

cttaatatag tgactacttt aatctattta gtgaccattt taatctattt agtgaccagt 1740

ttaatctatt cattaataac attctttaat tcatttagtg actgatttaa tccatttagt 1800

gactagctta atccattttg taagactgac ggactatttt taaaaattgt ttgttctaat 1860

tcaaaattta gaagggaaat aaaagaagga gaagagaatg gacgactagg atggtgcaag 1920

atacctaaaa aaagtgttag gttagagaga aattgaatgg gcttcttagg agaatgtagg 1980

tttgcattgt ctaattttat attaaaatta gaccgtctat tataataatt tgtggaaaac 2040

aaaactttat attatttgaa tcatgtatta gatatacctt aattatattg atatcttaat 2100

gttatcttca tttttagtaa attcaacaga tttgatttgt acatccgtta acatatgcga 2160

cactaacatt tgatatcttc agttatatgt tcataatttt tttttttaaa aagttggaca 2220

taaatttggt aaacgaaaat agagacaaat tcacaatttt acatagtaat attattttca 2280

agtatttgga aacaagcttg gtcaaactta atatagcaat accgtagaaa gtcaaattat 2340

tgaatttatt tgaaacaaaa ggagaataat cgttatatca caaaaaaaaa agtattaaaa 2400

ttagagctaa attaagagag attggtagca ttcaagataa tgaaatgatg attagatata 2460

aaaaagaaaa gatgataaaa gagaaaagtt aaagaacagg aagggcatgt tctcttcagc 2520

ataaaacagc tgaactgaac taacctgaat tgaactgatt ggagctgaac tgaactgaac 2580

tgaactgaac tgaattgaat ttaatttaat ttaattgtat tgaattaaat taaatttaat 2640

ttaatttaat tgaattgaat taaattgaat gtaataaata tataaataat atttaaacaa 2700

tnagtacagt tattataata ataattgtgc ccttctgaaa ttgttaaggc acgtcgtttg 2760

caagatttgt ccttttgcat taaaatttgg gtgcaaatcc tgcacaaatt gaaatatata 2820

gtattatctc tccactcatt tttatcttct tgtatcattt taggctcgac aataatgact 2880

ctgccagagg ggtagttgaa ccttcttata tcatcatcat aattcataat aataatttta 2940

ttatatatac tccctccgtt ccaaaatata gttctcgttt ctttttttta cgatgatttg 3000

tgcaagtaga atctaagtgg aataataaaa tttttttgtt tatttaaata aatattgtat 3060

ggaaaaggat gattttagga gagaaaaatg gaaaataatt ggtgaaagag tattaattgt 3120

aatattttag ttgaataaat aacagaaaaa ccaaaatata agaagcaaat aaatgatggg 3180

acacgatctt tgtagacaaa ttacagaaaa atttggaaac gaatatggaa atgggaacta 3240

tattttggga cacccaaata gaaatgggaa ctatattttg ggacggaggg agtaatatta 3300

ataatcataa attattaata ataatagtaa taattaatga tactaatgat aattaataac 3360

cgaagatcgc gtgattattt gtgttggagt tgtagtggga tatttggttc aatagggact 3420

ctaatgaagc tgctaagcgg gccgaaatac gatggaaagt accttcacaa tctagtaaag 3480

gaattgctcg gacaaagaag gttgcatcaa gcgttgacta atgtggttat cccaactttt 3540

gatatcaaga atcttcagcc tgttctcttt tctacttata tggtatgttg ttgaatttcc 3600

aatttattga agtacattat tattgtaccc ttggttatct tattcattag caaatactag 3660

cattcaaata gcatttatag tgatttgtca agaaaaaaaa taagtagagg aatcatagtt 3720

atcacttatt agaactacct cttttagaag aatatacttc ctctattttt ttagatggaa 3780

catttacctt tttggtgagt agattaaaat aatcatatgt tgtatttaaa aaaacagaat 3840

tagtatatat cttcttttgt gtcatataat acacttgatc aatttaaaag ataacatgat 3900

tccaatattg acttttttat acacataatt tcacatgtca aataatagaa aaaaagtcaa 3960

ctttgctgaa tttggagatg ataatacata gtttatgtgt tggttaagta atttcatact 4020

actacattga tagattatga aattgatcaa gaaaactaat caataattaa tgattataat 4080

gatctaggtc ccaattgcta aagaattgga cgtgttgctg tcagacatat gcataggcac 4140

gtctgcagct ccaacgttcc taccagcgca tcattttgaa aacaaagatg atcagggcaa 4200

tgtcaaagaa ttcaacctca ttgatggtgg tattgctgcc aataatcctg taagattatt 4260

tcttcatcca tgtttggatt ttctctccat ccctaaattt aatttgatta ggaattagtc 4320

attcttaata aaaattatga atcatcaatt aaattatcta ataaaaagta attcaaacat 4380

ttgttcgata taatgtactt atttttttta ttaaatttta attttcagac atattccaaa 4440

tgtcgtccta caaaagaaat tgcaaatcca tctaaaaact tcgtttgata catctaataa 4500

tgtatgttcg agtcaatcat taaattttca tatcaagata aatatcaaag taagatgttt 4560

caaactttta cttagtcgat taattctatt aattccagtc aatttaccat caacttcttc 4620

ggtcttccca aaacaaatgg aaaaatatat attcactgca tacgtgtctt tgtgttatat 4680

tcctatctct aaagtattta agtttttatg atattaggac atatatattc tctagtattt 4740

aatgagaaag atcgaaaagt tttcgtatat tcataaaacc ttaacaactg ctattcaaaa 4800

tatacgataa gtttcatcaa cattacccac taattaaatg taatttcact gtataagtac 4860

agtcattagt ggcaataagc gaagtgacaa aacaaatagt gaagagcaac ccgaatttct 4920

tcccgataaa ggccacggat cgtgaacggt tgctggtgat atcgttaggg actggatccg 4980

acaaggtaga gcagctctat aatgctaaaa gcgcagcaaa gtggggaatt atttcatggt 5040

tatttgacaa tggtaatact ccactacttg atgcttttaa tcaatcaaag gctgatatgg 5100

tcgatttcca caattctgtg gcctttcaag catatggttc tcttgacaat tatcttcgca 5160

tccaagtaag ttatttttat tatacggatt tggatgttta tgtacgtata tatacttctg 5220

ttaaaggttg ataagatgag agttacgcgc tcattttacc aaggatcttt ggtttcaatg 5280

gtaatttggg accggtcaga cccgtggctg cgggcctatc acggtcaaga atttttattt 5340

caggctcgca ccgtcacgag cctgcctaga tggctcgcga gccgaacact catttccttt 5400

gctttttagc ctaaaactgt caaaagtcca aaaaacgaca taaaacacgg gccagctcgc 5460

aggagccacg agcccagtcc gtggataaaa tcttgaaatt tcaggcccga cccaccattt 5520

ccccaaaccc gcgggccgag cccgtgaaca agctcatgcc ctgatgccca ggtctaggtc 5580

tgcctcgcac ggagccttca tcccgaagcc cattacaagc cagacaccca actccctaca 5640

acaccacatc aacccttcca atccactcgc cttccctctt cactgctgcc ggctgccctc 5700

taggtttatc attttttcta agctcttttg tctaagttaa atccactggt ttctttcatt 5760

ttctttttga tttaagttcg attaccaatg tttctttaac tttgcaactt ttggggagat 5820

accttattgt aatttgctct aatgaaagtt tcttatgctt ataataatgc tcaattgtct 5880

ttcttgatct agtaatctga gagttatcca gttttaaata gttagagcta gtttcactaa 5940

tggtggcaat aagggtgtgg cagggggcga tgcttggttt tggactttgg taatggtggt 6000

aatgaaggga ggttacacag tgaggatggt ggttggtgta attggtgggg aaactcgggg 6060

tagagagata acccctaaag gcgagattat gcttagtcaa tcgaaaggtg tgcctatttt 6120

aagcggacca cctaaaggtc ggattattat aatcaatttt tcctaaataa attgcaattt 6180

gtggttggat ttctagtttg aaactaaatc tcaattgcaa gtctgcaacc gtatgaacta 6240

tgaaccattt tgaggttaat atatctatag atttttattt caaaaaaata taaaaatata 6300

ttatttcaaa aaggtccaag aatacgtctt ttaagagtgt ccaagaacat ctaaccacga 6360

gttatatatt tgtctattat gtggtgatca ctttttcaag atttgaggtc tttaattagg 6420

ccttgatgat atagatttgt tagagaaaaa catttgcttg attaaaaaag gaaataaatg 6480

atatgacaaa tgactaattg actcatgtct aaccttttaa atgtggtgtg atttaactcg 6540

acatttaata tgtggttggt ttgataaatt ttagcgagca cgctttatat aagtgtaact 6600

tatatatctt gtgcataagt ttagttattt attttttact ttattaaaca aaattgataa 6660

atatgatata gttaattaaa tatattactc tcataaatca agctacccta aatctgtaaa 6720

tgcaaattat attgcaggat gatacactaa agggagtatc agcatcagtc gatgtggcaa 6780

ccacagaaaa tttggcaaat cttgtcacaa ttggaaaggc actcttgaaa aagccagtat 6840

ccaggattaa tttcgatacg ggtagatatc aacctatccc taatggaggg accaatgagg 6900

aagccttaat taggtacttg atttaaataa atcattcata aagaatcacg ctcattgctt 6960

gtcaataaaa tatttatgtt tatgtttaat actaatgctt gttttctaat acttttaaca 7020

ctttactttc ttacatgaga tgccgagacg agtgtagagt aatttattgt gtaggtaact 7080

ttttgctcta tatgagtcac ttatataaaa gtgacatata tatggtaata agttacctgt 7140

aagacgaggt taactatttg ccataaatag gtcactttac ttatatagaa gtgactcatt 7200

taagattaaa attaagttac cttttattta aaattgaccc atattgattt gaaaagtgac 7260

ccatattgat ttgaaaagtg acccatttaa gctttaagtg aactgatgtg acaataaatt 7320

tattatacac ccggtgcaca taatacaaat tgtttaaatt atcaagggtt tgttggacaa 7380

aagtaattgt tagttgtaag cttctagcta tgagtttgtg agcttttaga tgcctaggta 7440

gtttctaact tttagttatg aaactagttg tctaaagtgt ttggtaataa taattattga 7500

cgaaatttta acatgtaaat aatatttaaa tttggcaact tttgataaaa gctaccgaaa 7560

agcttaatca tcttagattt tgaccaagac tactcaaaag ctaaaagtta tctaaaagtt 7620

acatccaaaa gctactttga ggaatattta aacaattttt tcaaagacta aaagctatct 7680

taactacata aaaagtatgt caaaagttac accaaacatg tcctacattg accacgttat 7740

tctaacctac aaaactgact gggcaaacct gctactttgc aagaggtatc agtttattag 7800

ggtgtttcat cttacctacc taaacagtaa aagtaaatat ataaataaaa caaatattaa 7860

ttttatataa atattttatg agattagtat taatgtatat cctataatat caacattcaa 7920

aaaactttta cgaatagata aaaagatata ttaagaatta aaattatgca aattcaaaag 7980

tcaattcaaa ttactcctat taaaaattgg cggtatatga tttaaacttt caaaaataag 8040

aaaattataa aattatgtca ctctttgtta ctactgaata catgtttgtc caattgacag 8100

gtttgcgaaa ctccttaccg aggaaaagag cagacgcgaa caatatcgga cgaaccgaag 8160

tgactaatat cacatttttt aaacccatgt ttcaatggat actatgatta tatagtatat 8220

atatatgtat acaatacatc atgatctgga aaaaaactta cgctcgattt atgataaata 8280

aatttgtcaa accatgtagc tctcacaaaa tctgtaatat ttaatgaatt ttagtatgcg 8340

tagatatggc ctatgggcgt ggaatattta tccatgtaac tcatttattt ttacagctaa 8400

gtcattgcat tttaatctac gaaatttctc ttttaatcaa taacctaaaa ataaatagtt 8460

tgtgcatcaa tttctctcta tttactctgt aagtatttgt tgtttttctt tattgaacga 8520

taactacagt gccactccta tatatacaag agatcacttt ctaaacctag ggataactat 8580

acaagaagag aaactaaccg ttaaaatctt tctacgatca ataaaaggag gaatatataa 8640

tcacatgaaa gtgcgaaata atcaatacaa gtgagtttaa ttccctccgc cactctaact 8700

catttcccta ctctacactt aattctccca cgctatcaat cccattcatt tactccagta 8760

tcagatgcta gtaattcttc atagaatatg aaatatacta ggattatatt ttgcgtttgg 8820

atatagtttt ggtagaataa caattctact ctagttacgt tttctactat tattgggata 8880

tcctttagaa tgtaacctat aaaatatgat caataaaaac actcaaatca aggaagttta 8940

cgcaaatata gcctggtatc aaagctatac taatcttaaa gattattttt tccttcgatc 9000

c 9001

<210> 23

<211> 1224

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cDNA of Beta vulgaris phospholipase 1

<400> 23

atggagaatt ctagatctct gggtaaccct gttagcccta gaccccctaa tcatggtaat 60

ctcataacaa ttttaagtat tgatggggga ggcattaggg gaataatccc tgcagttatg 120

cttgaattcc ttgaatcaca actccagaag ttagatggtg aggaagcaag attggctgat 180

tattttgatg ttattgccgg aacgagcacc ggtggcctca taactgccat gttaaccgcc 240

cctaacgaca aaactcggcc actctacgcc gccaaggaga ttactccttt ttatcttgag 300

cattgtccga agatcttccg ccaaccaagt gggatatttg gttcaatagg gactctaatg 360

aagctgctaa gcgggccgaa atacgatgga aagtaccttc acaatctagt aaaggaattg 420

ctcggacaaa gaaggttgca tcaagcgttg actaatgtgg ttatcccaac ttttgatatc 480

aagaatcttc agcctgttct cttttctact tatatggtcc caattgctaa agaattggac 540

gtgttgctgt cagacatatg cataggcacg tctgcagctc caacgttcct accagcgcat 600

cattttgaaa acaaagatga tcagggcaat gtcaaagaat tcaacctcat tgatggtggt 660

attgctgcca ataatccttc attagtggca ataagcgaag tgacaaaaca aatagtgaag 720

agcaacccga atttcttccc gataaaggcc acggatcgtg aacggttgct ggtgatatcg 780

ttagggactg gatccgacaa ggtagagcag ctctataatg ctaaaagcgc agcaaagtgg 840

ggaattattt catggttatt tgacaatggt aatactccac tacttgatgc ttttaatcaa 900

tcaaaggctg atatggtcga tttccacaat tctgtggcct ttcaagcata tggttctctt 960

gacaattatc ttcgcatcca agatgataca ctaaagggag tatcagcatc agtcgatgtg 1020

gcaaccacag aaaatttggc aaatcttgtc acaattggaa aggcactctt gaaaaagcca 1080

gtatccagga ttaatttcga tacgggtaga tatcaaccta tccctaatgg agggaccaat 1140

gaggaagcct taattaggtt tgcgaaactc cttaccgagg aaaagagcag acgcgaacaa 1200

tatcggacga accgaagtga ctaa 1224

<210> 24

<211> 407

<212> PRT

<213> Beta vulgaris

<400> 24

Met Glu Asn Ser Arg Ser Leu Gly Asn Pro Val Ser Pro Arg Pro Pro

1 5 10 15

Asn His Gly Asn Leu Ile Thr Ile Leu Ser Ile Asp Gly Gly Gly Ile

20 25 30

Arg Gly Ile Ile Pro Ala Val Met Leu Glu Phe Leu Glu Ser Gln Leu

35 40 45

Gln Lys Leu Asp Gly Glu Glu Ala Arg Leu Ala Asp Tyr Phe Asp Val

50 55 60

Ile Ala Gly Thr Ser Thr Gly Gly Leu Ile Thr Ala Met Leu Thr Ala

65 70 75 80

Pro Asn Asp Lys Thr Arg Pro Leu Tyr Ala Ala Lys Glu Ile Thr Pro

85 90 95

Phe Tyr Leu Glu His Cys Pro Lys Ile Phe Arg Gln Pro Ser Gly Ile

100 105 110

Phe Gly Ser Ile Gly Thr Leu Met Lys Leu Leu Ser Gly Pro Lys Tyr

115 120 125

Asp Gly Lys Tyr Leu His Asn Leu Val Lys Glu Leu Leu Gly Gln Arg

130 135 140

Arg Leu His Gln Ala Leu Thr Asn Val Val Ile Pro Thr Phe Asp Ile

145 150 155 160

Lys Asn Leu Gln Pro Val Leu Phe Ser Thr Tyr Met Val Pro Ile Ala

165 170 175

Lys Glu Leu Asp Val Leu Leu Ser Asp Ile Cys Ile Gly Thr Ser Ala

180 185 190

Ala Pro Thr Phe Leu Pro Ala His His Phe Glu Asn Lys Asp Asp Gln

195 200 205

Gly Asn Val Lys Glu Phe Asn Leu Ile Asp Gly Gly Ile Ala Ala Asn

210 215 220

Asn Pro Ser Leu Val Ala Ile Ser Glu Val Thr Lys Gln Ile Val Lys

225 230 235 240

Ser Asn Pro Asn Phe Phe Pro Ile Lys Ala Thr Asp Arg Glu Arg Leu

245 250 255

Leu Val Ile Ser Leu Gly Thr Gly Ser Asp Lys Val Glu Gln Leu Tyr

260 265 270

Asn Ala Lys Ser Ala Ala Lys Trp Gly Ile Ile Ser Trp Leu Phe Asp

275 280 285

Asn Gly Asn Thr Pro Leu Leu Asp Ala Phe Asn Gln Ser Lys Ala Asp

290 295 300

Met Val Asp Phe His Asn Ser Val Ala Phe Gln Ala Tyr Gly Ser Leu

305 310 315 320

Asp Asn Tyr Leu Arg Ile Gln Asp Asp Thr Leu Lys Gly Val Ser Ala

325 330 335

Ser Val Asp Val Ala Thr Thr Glu Asn Leu Ala Asn Leu Val Thr Ile

340 345 350

Gly Lys Ala Leu Leu Lys Lys Pro Val Ser Arg Ile Asn Phe Asp Thr

355 360 365

Gly Arg Tyr Gln Pro Ile Pro Asn Gly Gly Thr Asn Glu Glu Ala Leu

370 375 380

Ile Arg Phe Ala Lys Leu Leu Thr Glu Glu Lys Ser Arg Arg Glu Gln

385 390 395 400

Tyr Arg Thr Asn Arg Ser Asp

405

<210> 25

<211> 14701

<212> DNA

<213> Beta vulgaris

<220>

<221> misc_feature

<222> (10783)..(10802)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 25

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ttttgtttgt ggaattgctg tcacgtttaa ttaccattca agtgtgatct ccttctagta 120

gattgtgatc ttgcttgtgg tatattggat ggtgtgagcc ccagacgtga ttttgttcgg 180

ttgatgcggt tgtgcatcgt ttctccaaaa ccctagttgg tttggtgcgg ttacgcatcg 240

ttattttgat gggttatggt ggcccatcca agctattgtg ttggtgcggt tgtacatagt 300

tgatgcccta agtgacgaat tgaatcatga aggttggttg gttgtccata attcaaaaag 360

ggtatttctt ggttgtccat aattcaaaaa aggtatttct tggttgtccc taatccaaaa 420

tggtgtgtat tggttgtccc taatcttaaa agctggttat tgaaggcgtt gatttcacgt 480

cttattggtc tcctagtaat aattctttta tatatttttt caattggagt gttggtgtta 540

ctatcctatg attgaggggg gagtattaga gttatggtaa gtatattata ttagagtatt 600

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tttaagttta agttaaaaat ttataataaa ttaattaagt gtatggcatg catgtatagt 1980

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gaataacaaa gaataaatgg gggaagtaga gtgaatatat tatataattc atataatagt 2100

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actcgaagcg agaggattaa tcattgctgt cggcggtgaa tacttagatt gtttttaaaa 3900

aaaacttgag ggagtgatac tagcagatca tgtatcctca tgtttgtcaa tgaaggtgtg 3960

caaagtatat gctagtatgc tactaccgcc catgaccctg aaattcaatt tttcattgtt 4020

tgttttagtt gcattgtcct atttggctat ttcaatactt tagtaacttt aaaaaaaaaa 4080

tacttcctcc atctcttttt actcgctaca ctttttatta tgggaagttt cacattactt 4140

gctacacttc ttttttgggc aataaactat ctctatctct ctcctcccac atgagtcccg 4200

tgttgagatc ctctagagtt ccaaaaaaac tctacacggt agagttcgtt aaatatcagt 4260

cgttgattaa gaaatcaaag gcttgtattt tgttttccaa aaatcccccc tattttcccc 4320

cgaatatcct gccaatatct tttccttttc caccaatcat gagcctttga ttttatgata 4380

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catctttttg ccggccacca agctggagat gtagacatat agaagtagtt tatgattttc 4740

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tatatatata tatatatata tatatatata tatataggat gaggaactag ctcatgtggt 10920

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aaaaaaaata ttagaaaaaa gaaattcaag aaaaaaaaaa ttgggatcaa aattttttaa 11160

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tcatttctca tttaaagagc attctcatat gatattactc ctatatatat tcgtgcttgt 11280

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cgtggtaaga tgaatttcct ttagactgtc ctcacacagg gccactcacc cagaagacca 14220

acaacccccc tccccccaac tatattgaaa tttttgcttg caccaagatt tgaaccttgg 14280

cttcccatat gtgagacacg aaaccatacc attggaccca agggtccttg gtatataaag 14340

tagcatacat gtgacacaca aagagagaca gtagatgttg cttcaggtaa tgcagaaacc 14400

ccctatatga tcaacatgat caacagaact atgtatatct atacttcttt ccctagataa 14460

gcaagaattt atggaggcta actatccttg tttccctgta atgcttatac aagaagatgc 14520

aaaatagaaa gctcagagcc agatactctc ttaatagacc caggagtaac ctgaacttgc 14580

taccatattc aacacattta agccagaagg taaaacacag aagttcgaaa gtaaagacag 14640

caagttcaca aagctaggga tctttttgaa gtgcaaccat cggacattat gggattgcta 14700

a 14701

<210> 26

<211> 1215

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> cDNA of Beta vulgaris phospholipase 2

<400> 26

atgacgaact tacaaagctc tcctccatcc ttcaattact acaacaggaa gaaattggtc 60

acaatcctta gcatcgacgg tggtggcatt cgaggcatta ttcctgctgt cattcttgct 120

tttcttgagc gacttcttca ggagttggat ggagaggaag taagactagc agattatttt 180

gatgtgatag caggaacaag cacgggaggg ttgattacag ccatgttaac tgcaccagat 240

gactataatc gtcctctata tgctgcgaaa gatatcacaa cattttactt gaagcatggt 300

cctcaaatat ttcctcagga aaggggacca cttgctcagc tgattagctt catcaaagca 360

atgacagggc caaaatatga tggcaagtat ttacgccata tactaaggga aaaattgaaa 420

gagacaaggt tgcatcacac actaacaaat gttgtcattc caacttttga cattaagacc 480

ttccaaccag ttatattctc ttcctacaag attctaagtt atcctgatct ggatgcgaaa 540

ttatcagata tatgtatagg cacatcggcc gctcctacca ttctgccttc tttctatttc 600

caaaatgcat ttgaaaacga aaagacaagg gaattcaacc tcattgatgg tggaattgtg 660

agtacaaatc cgacttatct ggcaataaat gaagttacca aacaaatgat gaaggagaat 720

ccagattacg ggaccatcca taataagttg ctggttttat cgataggaac aggatcagga 780

aaaattgagc agaaatacaa tgctaaaact gcaggaaagt gggggcttgt ctcttggctt 840

tttcaaaatg gatcatcacc aattataagt gctttttatg aagccggggc tgacttagtt 900

gattaccaaa ataatatcct cttccaatcg tttcgttcag aggacaagta ccttcgtgtg 960

caagatgaca gcttaacagg aacaactgct tcaacagatg tagcaacaga gaagaacttg 1020

gaaaatctag tgaaaattgg tcaagaattg cttaacaaac cagccagcag ggtggaccca 1080

gaaactgggc atctgaaagc aattccacac cttggtacca atgcagatgc tcttcgaagg 1140

ttcgcaaaac aactctcgga tgaaagaaaa taccgcaggg gcaaagactc caatcagatg 1200

caagagtaca gctga 1215

<210> 27

<211> 404

<212> PRT

<213> Beta vulgaris

<400> 27

Met Thr Asn Leu Gln Ser Ser Pro Pro Ser Phe Asn Tyr Tyr Asn Arg

1 5 10 15

Lys Lys Leu Val Thr Ile Leu Ser Ile Asp Gly Gly Gly Ile Arg Gly

20 25 30

Ile Ile Pro Ala Val Ile Leu Ala Phe Leu Glu Arg Leu Leu Gln Glu

35 40 45

Leu Asp Gly Glu Glu Val Arg Leu Ala Asp Tyr Phe Asp Val Ile Ala

50 55 60

Gly Thr Ser Thr Gly Gly Leu Ile Thr Ala Met Leu Thr Ala Pro Asp

65 70 75 80

Asp Tyr Asn Arg Pro Leu Tyr Ala Ala Lys Asp Ile Thr Thr Phe Tyr

85 90 95

Leu Lys His Gly Pro Gln Ile Phe Pro Gln Glu Arg Gly Pro Leu Ala

100 105 110

Gln Leu Ile Ser Phe Ile Lys Ala Met Thr Gly Pro Lys Tyr Asp Gly

115 120 125

Lys Tyr Leu Arg His Ile Leu Arg Glu Lys Leu Lys Glu Thr Arg Leu

130 135 140

His His Thr Leu Thr Asn Val Val Ile Pro Thr Phe Asp Ile Lys Thr

145 150 155 160

Phe Gln Pro Val Ile Phe Ser Ser Tyr Lys Ile Leu Ser Tyr Pro Asp

165 170 175

Leu Asp Ala Lys Leu Ser Asp Ile Cys Ile Gly Thr Ser Ala Ala Pro

180 185 190

Thr Ile Leu Pro Ser Phe Tyr Phe Gln Asn Ala Phe Glu Asn Glu Lys

195 200 205

Thr Arg Glu Phe Asn Leu Ile Asp Gly Gly Ile Val Ser Thr Asn Pro

210 215 220

Thr Tyr Leu Ala Ile Asn Glu Val Thr Lys Gln Met Met Lys Glu Asn

225 230 235 240

Pro Asp Tyr Gly Thr Ile His Asn Lys Leu Leu Val Leu Ser Ile Gly

245 250 255

Thr Gly Ser Gly Lys Ile Glu Gln Lys Tyr Asn Ala Lys Thr Ala Gly

260 265 270

Lys Trp Gly Leu Val Ser Trp Leu Phe Gln Asn Gly Ser Ser Pro Ile

275 280 285

Ile Ser Ala Phe Tyr Glu Ala Gly Ala Asp Leu Val Asp Tyr Gln Asn

290 295 300

Asn Ile Leu Phe Gln Ser Phe Arg Ser Glu Asp Lys Tyr Leu Arg Val

305 310 315 320

Gln Asp Asp Ser Leu Thr Gly Thr Thr Ala Ser Thr Asp Val Ala Thr

325 330 335

Glu Lys Asn Leu Glu Asn Leu Val Lys Ile Gly Gln Glu Leu Leu Asn

340 345 350

Lys Pro Ala Ser Arg Val Asp Pro Glu Thr Gly His Leu Lys Ala Ile

355 360 365

Pro His Leu Gly Thr Asn Ala Asp Ala Leu Arg Arg Phe Ala Lys Gln

370 375 380

Leu Ser Asp Glu Arg Lys Tyr Arg Arg Gly Lys Asp Ser Asn Gln Met

385 390 395 400

Gln Glu Tyr Ser

<210> 28

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R59Q mutant - primer AlleleX

<400> 28

gaaggtgacc aagttcatgc tccgtccagc tcctgcagct 40

<210> 29

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R59Q mutant - primer alleleY

<400> 29

gaaggtcgga gtcaacggat tcgtccagct cctgcagcc 39

<210> 30

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> R59Q mutant - primer common

<400> 30

tccccggaac catccttgcc tt 22

<210> 31

<211> 201

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> partial sequence indicating detectable single nucleotide

polymorphism that causes amino acid substitution R59Q in Sorghum

bicolor phospholipase

<400> 31

gagcccgtcg tgctggggca gagggtgacg gtgctgacgg tggacggcgg cggcatccgt 60

ggtctcatcc ccggaaccat ccttgccttc ctcgaggccc rgctgcagga gctggacggg 120

ccggaggtta ggctcgcgga ctacttcgac tacatcgccg ggacgagcac cggcgggctc 180

atcaccgcca tgctcaccgc g 201

<210> 32

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> V162I mutant - primer AlleleX

<400> 32

gaaggtgacc aagttcatgc tgagcgacac gctcaccaac a 41

<210> 33

<211> 41

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> V162I mutant - primer AlleleY

<400> 33

gaaggtcgga gtcaacggat tgagcgacac gctcaccaac g 41

<210> 34

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> V162I mutant - primer common

<400> 34

ctgcagcagc ctgacgtcga a 21

<210> 35

<211> 201

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> partial sequence indicating detectable single nucleotide

polymorphism that causes amino acid substitution V162I in Sorghum

bicolor phospholipase

<400> 35

catgtccgcg ctgaggaagc caaggtacaa cggcaagtgc ctccgtaacc tgatcatgag 60

catgctcggc gagacgaggg tgagcgacac gctcaccaac rtcatcatcc ctaccttcga 120

cgtcaggctg ctgcagccca tcatcttctc cacctacgac gtacgtacgc cgccggccgc 180

cgtcgtcatg aataatcaat c 201

<210> 36

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> S291L mutant - primer AlleleX

<400> 36

gaaggtgacc aagttcatgc tggcagatgc cccaccgcg 39

<210> 37

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> S291L mutant - primer AlleleY

<400> 37

gaaggtcgga gtcaacggat tggcagatgc cccaccgca 39

<210> 38

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> S291L mutant - primer common

<400> 38

gcctgtacac ggcgcggca 19

<210> 39

<211> 201

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> partial sequence indicating detectable single nucleotide

polymorphism that causes amino acid substitution S291L in Sorghum

bicolor phospholipase

<400> 39

ctgtacccag tgaagccgtg gaactgccgc aagttcctgg tgctgtccat cgggacgggg 60

tcgacgtcgg agcagggcct gtacacggcg cggcagtgct ygcggtgggg catctgccgg 120

tggatccgga acaacggcat ggcccccatc atcgacatct tcatggcggc gagctcggac 180

ctggtggaca tccacgtcgc c 201

<210> 40

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Q372stop mutant - primer AlleleX

<400> 40

gaaggtgacc aagttcatgc tgaccctgga cacccgctg 39

<210> 41

<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Q372stop mutant - primer AlleleY

<400> 41

gaaggtcgga gtcaacggat tgttgaccct ggacacccgc ta 42

<210> 42

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Q372stop mutant - primer common

<400> 42

gtcgggatcg gggagcggat 20

<210> 43

<211> 197

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> partial sequence indicating detectable single nucleotide

polymorphism that causes amino acid substitution Q372stop in

Sorghum bicolor phospholipase

<400> 43

gcatccagga caactcgctg cacggcgccg cggccaccgt ggacgcggcg acgccggaga 60

acatgcggac gctcgtcggg atcggggagc ggatgctggc gyagcgggtg tccagggtca 120

acgtggagac agggaggtac gaaccggtgc ctggggaagg aagcaacgct gatgcgctcg 180

ctgggatcgc aaggcag 197

<210> 44

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Forward Primer

<400> 44

ggcccccatc atcgacatc 19

<210> 45

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Reverse Primer

<400> 45

aatcaggcaa caaattcact tctc 24

Claims (15)

1.一种能够诱导单倍性的高粱植物，其特征在于所述植物具有与编码patatin磷脂酶的内源基因有关的一个或多个修饰。

2.根据权利要求1的植物，其特征在于所述patatin磷脂酶由根据SEQ ID No.:1或2的核苷酸序列编码，或由与SEQ ID No.:1或2具有至少80％相同性的核苷酸序列编码，或者由在严格条件下与根据SEQ ID No.:1或2的核苷酸序列的互补序列杂交的核苷酸序列编码，或者包含SEQ ID No.:3所示的氨基酸序列或同源氨基酸序列。

3.根据权利要求1或2的植物，其特征在于所述一个或多个修饰是编码所述patatin磷脂酶的所述内源基因中的一个或多个突变，优选是导致一个或多个氨基酸交换或生成终止密码子的取代，优选地，其中所述一个或多个突变导致氨基酸交换，所述氨基酸交换

a)在根据SEQ ID No.:3的氨基酸位置37至240的范围中，优选其中该区域对应于patatin磷脂酶的功能性结构域；和/或

b)在根据SEQ ID No.:3的氨基酸位置241至385的范围中，或

c)在根据SEQ ID No.:3的氨基酸位置241至385的范围中生成终止密码子。

4.根据权利要求3的植物，其特征在于，所述一个或多个突变导致在根据SEQ ID No.:3的氨基酸位置59、162和/或291的氨基酸交换，和/或导致在根据SEQ ID No.:3的氨基酸位置372的终止密码子。

5.根据权利要求1至4之一的植物，其特征在于所述修饰的patatin磷脂酶

(i)包含根据SEQ ID No.:3的氨基酸序列或其中存在至少一个氨基酸交换的同源氨基酸序列，其中根据SEQ ID No.:3的位置59处的精氨酸(R)、位置162处的缬氨酸(V)、和/或位置291处的丝氨酸(S)被另一种氨基酸取代，优选地在位置59处被谷氨酰胺(Q)、在位置162处被异亮氨酸(I)和/或在位置291位处被亮氨酸(L)取代；

(ii)由这样的核苷酸序列编码，所述核苷酸序列包含根据SEQ ID No.:1的DNA序列的编码序列或与SEQ ID No.:1具有至少80％相同性的DNA序列的编码序列，其中存在导致氨基酸交换的至少一个核苷酸交换，其中在根据SEQ ID No.:1的核苷酸位置421-423、815-817、1420-1422和/或1663-1665处一个或多个核苷酸被交换；

(iii)包含根据SEQ ID No.:6、9或12的氨基酸序列；或者(iii)由包含根据SEQ IDNo.:4、SEQ ID No.:7、SEQ ID No.:10或SEQ ID No.:13的DNA序列的编码序列的核苷酸序列编码。

6.一种核酸分子，其编码权利要求3至5中任一项所述的突变的patatin磷脂酶。

7.根据权利要求6的核酸分子，其特征在于在不存在野生型patatin磷脂酶的情况下，所述核酸分子在植物中的存在导致所述植物能够诱导单倍性。

8.核酸分子，其长度为至少15、16、17、18、19或20，优选至少21、22、23、24或25，更优选至少30、35、40、45或50，以及最优选至少100、200、300、500或1000个核苷酸，其与权利要求4或5中定义的核苷酸序列特异性杂交并且包含所述突变之一，或一对核酸分子，其适合于在聚合酶链反应(PCR)中扩增含有至少一个所述突变的范围，优选是寡核苷酸的形式，优选具有50个核苷酸的最大长度，其优选具有以下根据SEQ ID No.:28-30、32-34、36-38或40-42的核苷酸序列之一。

9.宿主细胞，优选植物细胞，其含有根据权利要求6-8之一的核酸分子，包含根据权利要求6-8之一的核酸分子的载体，优选植物载体，或作为转基因的根据权利要求6至8之一的核酸分子，任选地在异源启动子的控制下。

10.一种获得能够诱导单倍性或相对于野生型具有增加的诱导率的植物的方法，包括以下步骤：

(a)(i)诱变植物细胞并且然后从所述诱变的植物细胞中再生植物，或诱变植物；

(ii)鉴定来自(i)的在内源DNA序列中具有一个或多个突变的植物，所述一个或多个突变对应于和/或导致在权利要求3至5中所述的一个或多个突变，其中根据SEQ ID No.:3的氨基酸序列的位置75的天冬氨酸(D)、位置79的甘氨酸(G)和/或位置203的脯氨酸(P)被另一种氨基酸取代，优选在位置75被天冬酰胺(N)取代、在位置79被精氨酸(R)取代和/或在位置203被亮氨酸(L)取代，或与这些对应的，并且与未诱变的植物相比能够以增加的比例诱导单倍体后代的获得；或者

(b)(i)在植物细胞中引入具有一个或多个突变的核酸分子，所述一个或多个突变对应于权利要求3至5之一所述的一个或多个突变和/或导致根据SEQ ID No.:3的氨基酸序列的位置75的天冬氨酸(D)、位置79的甘氨酸(G)和/或位置203的脯氨酸(P)被另一种氨基酸取代，优选在位置75被天冬酰胺(N)取代、在位置79被精氨酸(R)取代和/或在位置203被亮氨酸(L)取代，或与它们对应的，和

(ii)从(i)的植物细胞再生植物，

优选地，其中所述内源DNA序列或所述核酸分子是编码核苷酸序列，其包含对于高粱(双色高粱(Sorghum bicolor))的SEQ ID No.:3、对于向日葵(Helianthus annuus)的SEQID No.:18、对于大麦(Hordeum vulgare)的SEQ ID No.:21、或对于甜菜(Beta vulgaris)(例如，甜菜)的SEQ ID No.:24或27中所示的氨基酸序列。

11.植物，其含有根据权利要求9的植物细胞和/或可通过根据权利要求10的方法获得，优选其中所述植物是高粱、向日葵、黑麦、小麦、马铃薯、大麦或甜菜。

12.根据权利要求1至5或11之一的植物的器官、植物部分、组织或细胞，或根据权利要求1至5或11之一的植物的种子或后代，其中所述种子或所述后代具有权利要求3至5之一定义的突变和/或权利要求6至8之一的核酸分子或包含根据权利要求6至8之一的核酸分子的载体，优选植物载体。

13.一种获得单倍体植物的方法，包括以下步骤：

(a)将根据权利要求1至5或11的植物与相同属的植物，优选相同物种的植物杂交，

(b)选择受精的单倍体种子或胚，和

(c)从(b)的种子或胚胎中产生单倍体植物。

14.通过根据权利要求13的方法可获得的单倍体植物、单倍体受精的种子或胚。

15.根据权利要求14的植物的器官、植物部分、组织、细胞、种子或后代。