CN110536963A - B细胞工程改造 - Google Patents

Abstract

本文描述了用于B细胞基因组工程改造和用于表达转基因和/或用于调节B细胞功能的构建体。

Description

B细胞工程改造

相关申请的交叉引用

本申请要求2017年1月26日提交的美国临时申请第62/450,917号的权益，通过引用将该申请全文纳入本文。

技术领域

本公开涉及基因疗法领域，特别是基因组编辑以及靶向递送转基因编码的构建体至B细胞用于表达有益(治疗性)蛋白质。

背景

基因疗法可以用于遗传工程改造细胞，以具有一种或多种失活的基因和/或致使细胞表达之前并未在该细胞中产生的产物(例如，经由转基因***和/或经由校正内源性序列)。使用转基因***的实例包括核酸酶介导的修饰，包括***编码一种或多种新型治疗性蛋白质(包括治疗性抗体)的一种或多种基因，***编码细胞或个体中缺乏的蛋白质的编码序列，在含有突变的基因序列的细胞中***野生型基因，和/或***编码结合核酸如微小RNA或siRNA的序列。这些技术还可以用于敲除内源性基因的表达和/或改变细胞的毒性概况。参见例如，美国专利号9,394,545；9,150,847；9,206,404；9,045,763；9,005,973；8,956,828；8,936,936；8,945,868；8,871,905；8,586,526；8,563,314；8,329,986；8,399,218；6,534,261；6,599,692；6,503,717；6,689,558；7,067,317；7,262,054；7,888,121；7,972,854；7,914,796；7,951,925；8,110,379；8,409,861；美国专利公开号20030232410；20050208489；20050026157；20050064474；20060063231；20080159996；20100218264；20120017290；20110265198；20130137104；

20130122591；20130177983和20130177960和20150056705。

B细胞通过分泌针对各种抗原的抗体在体液免疫中起作用。它们是专业的抗原呈递细胞(APC)并且通过辅助T细胞激活以分化成产生大量抗原特异性抗体的浆细胞。B细胞发育发生在胎儿肝脏和骨髓中，并且B细胞发育中的关键步骤是生成B细胞受体(BCR)，其是包含独特重链和轻链的复杂结构。BCR生成的过程包括在B细胞成熟的祖B(pro-B)细胞阶段期间重排BCR基因重链和轻链中各种免疫球蛋白(Ig)基因区段。重排的重链和轻链成功配对后，祖B细胞成为前B(pre-B)细胞，其中产生的前BCR在前B细胞的细胞表面上表达。通过前BCR的信号转导进一步驱动B细胞发育，进而使前B细胞扩大。最终，大的前B细胞停止增殖并发生额外的轻链重排，导致独特的IgM BCR表达于现在被认为是未成熟B细胞的细胞表面上。然后这些细胞离开骨髓，并在周边作为过渡性B细胞循环。

未成熟的B细胞的成熟主要发生在还会出现选择的脾脏，从而将破坏产生对自身抗原具有高亲和力的抗体的B细胞(参见，Naradikian等(2014)于药物靶向自身免疫性疾病 中的B细胞，药物治疗的里程碑(Drugs Targeting B-Cells in Autoimmune Diseases, Milestones in Drug Therapy)(X.Bosch等(编著))doi 10.1007/978-3-3-0348-0706-7_2,Springer Basel)。循环B细胞能够进入次级***和脾脏，并从滤泡树突细胞中获得抗原。在进入***/脾脏并与树突细胞相互作用后，B细胞使抗原内化并对其进行处理，使得抗原的肽片段通过MHC II类分子呈递至同源CD4+T细胞。这些T细胞之前已由呈递相同抗原的APC激活。B和T细胞之间的相互作用导致多个事件，包括充分激活T细胞，从而导致T细胞增殖。然后，T细胞产生直接作用于B细胞的细胞因子，以诱导B细胞增殖并使B细胞表面表达的抗体类别转换。***和脾脏内瞬时区域(transient region)中增殖的B细胞簇被称为“生发中心(Germinal Centers)”。这些激活的B细胞分化成专门的抗体分泌细胞(浆母细胞或浆细胞)，它们在完成其分化的最后阶段以成为非增殖浆细胞之前似乎经历预编程数量的***(通常为5-6)。或在，激活的B细胞离开生发中心并分化成记忆B细胞(Zhang等,(2016)Immunol Rev 270(1):8-19)。

激活后，表达基因组增变基因酶激活诱导的胞苷脱氨酶(AID)，这导致抗体基因中的体细胞超突变以及改变抗体效应功能的类别转换重组(CSR)。这些体细胞超突变发生在免疫球蛋白可变区(IgV)基因中以产生对抗原具有不同亲和力的抗体突变体的库(Klein和Heise(2015)Curr Opin Hematol 22(4):379-387)。该过程发生在生发中心内所谓的“暗区(dark zone)”。分化的B细胞迁移到“光区(light zone)”，其中产生更高亲和力抗体的B细胞竞争可用的抗原和/或T细胞辅助，使得它们通过其B细胞受体接收存活信号。产生较低亲和力抗体的B细胞不接收这些存活信号，因为它们不能与它们产生较高亲和力的B细胞同胞竞争，因此它们经历凋亡。然后，产生较高亲和力抗体的B细胞可以再次进入暗区进行额外轮次的增殖和体细胞超突变，可以离开生发中心并分化成浆母细胞或在可以分化成长寿记忆B细胞(Recaldin和Fear(2015)Clin and Exp Immunol 183:65-75)。

因此，在一个非常复杂的过程中，B细胞经诱导以表达大量针对抗原的抗体，用于保护身体免于多种潜在的威胁。有趣的是，存在许多病原体(例如，寄生虫，细菌，病毒)能够破坏抗体反应。这些病原体包括许多导致大量人类疾病的物质，包括但不限于疟原虫(Plasmodium)，血吸虫(Schistosomia)，分枝杆菌(Mycobacterium)，HIV，HCV和HBV(Borhis和Richard(2015)BMC Immunology 16:15doi 10.1186/s12865-015-0079-y)。病原体介导的抗体应答抑制背后起作用的机制尚不清楚，但似乎某些病原体诱导产生不寻常的B细胞亚型，B细胞亚型改变细胞微环境，导致B细胞和T细胞的抑制。例如，已经显示HBV通过Toll样受体9(TLR9)干扰刺激，使得树突细胞产生的IFN-α减少(已知诱导B细胞增殖和分泌IgM)。似乎HBV可以选择性地抑制B淋巴细胞中的TLR9表达(Vincent等(2011)PLoS ONE 6(10):e26315.doi:10.1371/journal.pone.0026315)。

过去的十年中，研究已经就小鼠和人免疫调节性B细胞的独立亚群提供了详尽的证据。通过释放抗炎介质如白介素-10(IL-10)和表达抑制分子如PD-L1，这些抑制物B细胞具有保持免疫耐受并抑制病原性自身免疫和炎症性免疫应答，以及在癌症免疫监视期间抑制应答的能力。这些研究得出的结论是，存在这样的B细胞库，其在免疫耐受中起着抑制物的作用，并且该库现在被称为调节性B细胞或“Breg”。与人Breg相关联的其他表型包括抑制自身免疫炎症和过敏原耐受的作用。最近的研究证明，B细胞在癌症进展中可能起着相互矛盾的作用。例如，由经利妥昔单抗(rituximab)处理的CLL患者分离的产生IL-10的CD1d^高CD5+B细胞揭示，抗-CD20介导的B-细胞消耗主要富集Breg库。富集的Breg被假定将抑制清除抗-CD20结合的肿瘤细胞所需的抗肿瘤免疫力，导致患者对抗CD20治疗产生淋巴瘤抗性和/或最终因癌症进展加重而复发(Bodogai等,(2013)Cancer Res 73:2127-2138)。

值得注意的是，当卵巢癌、非小细胞肺癌和***中存在的CD20+B细胞肿瘤浸润的淋巴细胞与改善的存活和较低的复发率相关联时，发现人B细胞负调节肿瘤生长。这些研究显示，肿瘤浸润的B细胞与有利的结果相关。Breg可以通过分泌抗炎介质如IL-10抑制多样的细胞亚型(包括T细胞)并且可以促进T细胞向调节性T细胞的转换，从而减弱抗肿瘤免疫应答。B细胞抗肿瘤免疫力潜在的机制可能涉及B细胞分泌效应细胞因子，如IFN-γ，其可能使T细胞向Th1或Th2应答极化或者通过它们作为抗原呈递细胞的作用促进T细胞应答(Sarvaria等(2017)Cell Mol Immunol 14(8):662-674)。

然而，人B细胞也已经被证明促进肿瘤进展。人肿瘤组织中存在具有激活的STAT3的B细胞可以与肿瘤血管生成的严重性相关联。此外，转移性卵巢癌患者中CD19+B细胞的浸润；或上皮性卵巢癌患者中CD20+和CD138+B细胞浸润增加与疾病预后和结果不良相关联。此外，在50％的晚期结直肠癌患者中发现用利妥昔单抗减少部分B细胞后肿瘤负荷降低。因此，Breg在癌症中的确切作用尚不清楚，但很可能与Breg亚型的活性有关(Sarvaria，同上)。

相当多的疾病要么是由于分泌的基因产物的功能不全所引起或是可通过治疗性蛋白质的分泌治疗的。例如，凝血障碍是相当常见的遗传疾病，其中凝血级联中的因子在一定程度上是异常的，即缺少表达或产生突变蛋白。大多数的凝血障碍导致血友病，如血友病A(因子VIII缺乏)，血友病B(因子IX缺乏)或血友病C(因子XI缺乏)。这些疾病的治疗通常与严重程度有关。对于轻度血友病，治疗可能涉及旨在增加表达不足因子表达的疗法，而对于较为严重的血友病，治疗包括定期输注缺失的凝血因子(通常通过酶替代疗法(ERT)每周2-3次)以预防出血事件。患有严重血友病的患者通常不鼓励参加许多类型的运动，并且必须采取额外的预防措施以避免日常伤害。

α-1抗胰蛋白酶(A1AT)缺乏症是由于α1-抗胰蛋白酶的缺陷性产生而导致的常染色体隐性遗传病，其导致血液和肺中A1AT水平不足。其可能与慢性阻塞性肺病(COPD)和肝脏疾病的发展相关联。当前，治疗与该缺乏相关联的疾病可以涉及输注外源性A1AT和肺或肝移植。

溶酶体贮积病(LSD)是一组罕见的代谢性单基因疾病，其特征在于缺乏通常涉及废脂质、糖蛋白和粘多糖分解的功能性个体溶酶体蛋白。这些疾病的特征在于这些化合物在细胞中的积累，因为由于特定酶的错误功能而不能将它们加工用于再循环。常见的实例包括高歇氏病(Gaucher's disease)(葡萄糖脑苷脂酶缺乏症-基因名称：GBA)，法布瑞氏症(Fabry's disease)(α半乳糖苷酶缺乏症-GLA)，亨特氏症(Hunter's disease)(艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶缺乏症-IDS)，赫尔勒氏症(Hurler's disease)(α-L-艾杜糖苷酸酶缺乏症-IDUA)和尼曼-皮克氏病(Niemann-Pick's disease)(鞘磷脂磷酸二酯酶1缺陷-SMPD1)。

I型糖尿病是这样一种疾病，其中免疫介导的胰腺β细胞破坏导致这类细胞主要分泌产物的胰岛素严重不足。恢复基线胰岛素水平为这种疾病的许多更严重并发症提供了实质性的缓解，其中可以包括涉及大血管的“大血管”并发症：缺血性心脏病(心绞痛和心肌梗塞)，中风和外周血管疾病，以及由小血管损伤引起的“微血管”并发症。微血管并发症可能包括糖尿病视网膜病变，其影响眼睛视网膜中的血管形成，并可导致视觉症状，视力下降和潜在的失明，以及糖尿病肾病，其可能涉及肾脏组织的瘢痕变化，尿液中损失少量或逐渐增量的蛋白质，以及最终需要透析的慢性肾脏疾病。

然而，提供治疗性蛋白质以治疗对象中的疾病可能受限于对象自身对治疗性蛋白质的免疫应答，包括在对象中通过B细胞产生抗体，其可能限制这类治疗的功效。例如，接受其所不足或缺乏的凝血因子(例如，因子VIII，因子IX等)ERT的血友病患者可能产生针对这些所需蛋白质的抗体(例如，抗-F9抗体)。据估计，15-50％的血友病A患者产生针对治疗性因子8蛋白的抑制性抗体(Krudysz-Amblo等,(2009)Blood 113(11):2587-2594)。在一些情况中，反应可能是严重的(过敏性休克)，导致所需ERT在患者中引发有害副作用的情况(参见例如，JM Lusher(2000)Semin Thromb Hemost 26(2):179-188)。

此外，抗体是分泌的蛋白质产物，已经对其结合可塑性(binding plasticity)进行研究用于开发各种各样的疗法。治疗性抗体可以用于中和直接导致疾病的靶蛋白(例如，黄斑变性中的VEGF)以及用于高度选择性杀伤其持续性和复制危及宿主的细胞(例如，癌细胞，以及自身免疫疾病中的某些免疫细胞，包括产生针对自身抗原的抗体的B细胞)。在这类应用中，治疗性抗体利用机体对其自身的抗体正常的应答以实现选择性杀伤，中和或清除具有抗体靶抗原的细胞或靶蛋白。因此，抗体疗法已经被广泛地用于许多人类病症，包括肿瘤学、风湿病学、移植和眼病。

因此，仍然存在对于这样的其他方法和组合物的需求，所述其他方法和组合物可以用于在对象中以治疗相关水平表达所需转基因以治疗遗传疾病如血友病、糖尿病、溶酶体贮积病和/或A1AT缺乏症，包括治疗和/或避免任何相关毒性，而这可能将转基因或治疗性蛋白质的表达限于所需的组织类型，包括通过限制固有B细胞应答。此外，仍然存在对于将以治疗相关水平表达所需转基因(例如，抗体)用于治疗其他疾病如癌症的其他方法和组合物的需求。

发明内容

在一个或多个遗传基因座的位点特异性修饰B细胞将增强B细胞功能(包括增强这些细胞的抗体产生和/或靶向B细胞以产生限制不需要的固有免疫应答的蛋白质)，分化成浆母细胞和移植能力。经由靶向基因修饰控制B细胞(例如，破坏和/或基因组或附加型基因添加)能够进行高效且较少毒性的蛋白质替代疗法，并且还允许生发中心内的通信被编程。

本发明描述了用于调节B细胞中靶基因表达和/或在B细胞(包括衍生的浆母细胞或浆细胞)中表达转基因的组合物和方法。因此，本文提供了包含下述一种或多种修饰的遗传修饰的B细胞(包括源自遗传修饰的造血干细胞或其他B细胞前体的B细胞)：细胞中包含一个或多个转基因；和/或这样的***和/或缺失，其修饰(i)B细胞受体基因，和/或(ii)生发中心中的细胞相互作用；和/或(c)这样的修饰，其抑制与病原体感染或癌症调节相关联的任何B细胞功能阻抑。转基因可以染色体外(附加型)表达和/或可以被整合到B细胞的基因组中(例如，经由核酸酶介导的靶向整合，例如，到安全港基因座中)。在一些实施方式中，将一种或更多种转基因附加型保持，并将一种或更多种转基因整合到细胞(B细胞或分化成B细胞的HSC)的基因组中。在一些实施方式中，转基因编码涉及凝血级联的蛋白质。在其他实施方式中，转基因编码在溶酶体贮积症中缺陷的酶或编码治疗性抗体。在其他实施方式中，转基因编码这样的分子，所述分析靶向产生不需要的抗体的B细胞，例如，针对治疗性蛋白质的抗体，包括但不限于针对内源性蛋白质(例如，自身免疫疾病中的自身抗体)和/或外源性蛋白质(例如，ERT提供的蛋白质，如凝血因子)的抗体。例如，转基因可以编码这样的抗体，所述抗体识别B细胞上对所需蛋白质(自身免疫疾病中的内源性蛋白质和/或ERT提供的蛋白质)敏感的B细胞受体，以靶向产生针对所需蛋白质而言不需要的抗体的B细胞群。这类抗体的非限制性实例包括这样的抗体，所述抗体识别与这样的B细胞相关的B细胞受体，所述B细胞产生针对ERT提供的蛋白质如血友病中的凝血因子的抗体(例如，产生抗-F9或抗-F8抗体的B细胞)；和/或识别产生针对自体/自身抗原的抗体的B细胞上的B细胞受体，包括但不限于MS中的髓磷脂碱性蛋白(MBP)，***性红斑狼疮(SLE)中的抗核抗体(ANA)，急性风湿热中心脏、关节和其他组织中的糖蛋白，类风湿性关节炎(RA)中IgG的Fc部分的抗体，以及莱特尔氏综合征、干燥综合征、***性硬化症(硬皮病)、炎性肌病、多动脉炎(Polyarteritis nodos)、格雷夫斯病、I型糖尿病等中B细胞产生的自身抗体。本文所述的组合物和方法导致体外和体内高水平的蛋白质产生，包括以足以显示体内临床相关(治疗性)作用的水平。

在一个方面中，本文所公开的是包含至少一种B细胞特异性启动子的多核苷酸表达构建体，其中启动子驱动一种或多种转基因的表达。B细胞启动子可以选自在B细胞中具有活性的任何启动子，包括但不限于免疫球蛋白κ链启动子(Igк,Laurie等(2007)GeneTher 14(23):1623-31)，B29(Hermanson等(1989)Proc Nat’l Acad Sci 86:7341-7345)，BCL6(Ramachandrareddy等(2010)Proc Nat’l Acad Sci 107(26):11930-11935)，CIITA启动子III(Deffernnes等(2001)J.Immunol 167(1):98-106)，mb-1(参见例如，Malone和Wall(2001)J.Immunol 168(7):3369-3375)和EEK启动子，其包含轻链启动子(VKp)，所述轻链启动子(VKp)之前具有内含增强子(intronic enhancer)(iEκ)、MAR和3′增强子(3′Eκ)的轻链启动子(VKp)(参见美国专利号8133727)。在一些实施方式中，使用的B细胞特异性启动子通常在生发中心中表达，因此当细胞位于生发中心时表达转基因(例如，BCL6,Basso等(2010)Blood 115(5):975-984)。在一些实施方式中，转基因经由核酸酶介导的靶向整合***，因此其由细胞基因组中的B细胞特异性启动子控制。在其他实施方式中，B细胞启动子转基因构建体是被染色体外维持的DNA载体的部分。在一些实施方式中，将B细胞启动子-转基因构建体***B细胞基因组的转录沉默和/或安全港区域，如***白蛋白基因或编码T细胞受体亚基的基因(例如，TCRA或TCRB)中。

在一些方面中，转基因编码对象中缺少或不足的酶。在一些实施方式中，转基因编码凝血因子，如因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI或因子XII。在其他实施方式中，转基因编码溶酶体贮积症缺乏的酶，包括但不限于葡糖脑苷脂酶(GBA)，α半乳糖苷酶(GLA)，β-葡糖醛酸糖苷酶(GUSB)，艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)，α-L艾杜糖醛酸酶(IDUA)，鞘磷脂磷酸二酯酶1(SMPD1)或α-葡糖苷酶(GAA)。在一些实施方式中，转基因编码A1AT。可以如本文所述表达的蛋白质的非限制性实例还包括纤维蛋白原，凝血酶原，组织因子，因子V，血管性血友病因子，前激肽释放酶，高分子量激肽原(菲兹杰拉尔德因子(Fitzgerald factor))，纤连蛋白，抗凝血酶III，肝素辅因子II，蛋白C，蛋白S，蛋白Z，蛋白Z相关蛋白酶抑制剂，纤溶酶原，α2-抗纤溶酶，组织纤溶酶原激活物，尿激酶，纤溶酶原激活物抑制剂-1，纤溶酶原激活物抑制剂-2，MMAA，MMAB，MMACHC，MMADHC(C2orf25)，MTRR，LMBRD1，MTR，丙酰-乙酰辅酶A羧化酶(PCC)(PCCA和/或PCCB亚基)，葡萄糖-6-磷酸转运(G6PT)蛋白或葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)，LDL受体(LDLR)，ApoB，LDLRAP-1，PCSK9，线粒体蛋白质，如NAGS(N-乙酰谷氨酸合成酶)，CPS1(氨基甲酰磷酸合成酶I)，和OTC(鸟氨酸转氨甲酰酶)，ASS(精氨基琥珀酸合成酶)，ASL(精氨基琥珀酸酶裂解酶)和/或ARG1(精氨酸酶)，和/或溶质载体家族25(SLC25A13，天冬氨酸/谷氨酸载体)蛋白，UGT1A1或UDP葡糖醛酸基转移酶多肽A1，富马酰乙酰乙酸水解酶(FAH)，丙氨酸-乙醛酸氨基转移酶(AGXT)蛋白，乙醛酸还原酶/羟基丙酮酸还原酶(GRHPR)蛋白，转甲状腺素蛋白基因(TTR)蛋白，ATP7B蛋白，苯丙氨酸羟化酶(PAH)蛋白，脂蛋白裂解酶(LPL)蛋白，工程改造的核酸酶，工程改造的转录因子和/或工程改造的单链可变片段抗体(双抗体，骆驼科等)。在一个优选的实施方式中，转基因编码FVIII多肽。在一些实施方式中，FVIII多肽包括B结构域的缺失。在一些实施方式中，本文提供了由一种或多种转基因表达治疗相关水平的一种或多种治疗性蛋白质的方法和组合物。在某些实施方式中，表达编码替代蛋白质(replacement protein)的转基因构建体导致产生1％正常水平的蛋白质，而在其情况中，产生了2％，3％，4％，5％，10％，15％，20％，30％，50％，80％，100％，150％，200％或更多的正常水平的蛋白质。在一些实施方式中，转基因编码这样的多肽，所述多肽避免病毒、细菌或寄生虫抑制抗体应答。

体外分化成浆母细胞和浆细胞的CD19-阳性B细胞产生上至10,000ng/mL的抗体(IgG、IgM、IgA)。因此，在一些方面，转基因编码治疗性蛋白质，如单链抗体。在一些实施方式中，单链抗体是scFv，而在其他实施方式中，单链抗体是骆驼科或纳米抗体(参见例如，Mejias等(2016)Sci Reports 6:srep24913,doi:10:1038)。在其他方面中，超过一种转基因在B细胞中表达。在一个实施方式中，超过一种转基因包括表达完整抗体或其片段或另一抗原结合蛋白(例如，单体、适配体、DARP素(darpin)、阿迪连接素(adnectin)、亲和体(affibody)、抗运载蛋白(anticalin)、库尼型抑制剂等)所需的序列(Gebauer和Skerra(2009)Curr Opin Chem Biol 13(3):245-55)。

在一些实施方式中，包含编码感兴趣的治疗性蛋白质的转基因的B细胞群经离体工程改造，然后重新导入有此需要的对象中。可以在发育的任何阶段如本文所述进行B细胞工程改造，包括但不限于造血干细胞(HSC)、淋巴祖细胞或成熟B细胞。干细胞或B细胞的祖细胞可以经工程改造，然后体外分化并以祖细胞(谱系决定的B细胞)或成熟细胞给予对象。或者，工程改造的干细胞或B细胞的祖细胞可以如本文所述进行体外工程改造，并在给予后在体内完全分化成成熟的B细胞。因此，对于离体给予，本文所述的B细胞群可以是异源的，这样的话它们包括处于发育各阶段的干细胞，祖细胞和/或成熟的B细胞。或者，B细胞群可以是同源的，并且仅包括干细胞、祖细胞或成熟的细胞。在其他实施方式中，使用可以转导B细胞的递送载体体内生成工程改造的B细胞。在其他实施方式中，递送载体是病毒载体，优选腺相关病毒(AAV)。在优选的实施方式中，AAV载体是AAV6载体。在其他实施方式中，递送载体是非病毒性的，例如mRNA，脂质纳米颗粒(LNP)或者质粒载体。

在其他方面中，本文所述的工程改造的B细胞(包括B细胞群)在体外生长，用于产生由转基因编码的蛋白质。在优选的实施方式中，蛋白质是抗体或抗原结合蛋白(例如，结合对象中产生不需要的抗体的内源性B细胞的抗体，包括产生针对ERT提供的蛋白质如凝血因子的抗体的内源性B细胞和/或产生针对自身免疫疾病中自身蛋白的抗体的B细胞)，或中和不需要的抗体的抗体。由B细胞产生的蛋白质可以经分离并用于蛋白质疗法如酶替代疗法和/或与酶替代疗法联用以减少和/或消除不需要的抗体(例如，ERT后出现的抗-ERT抗体)的固有产生。

在一些方面中，本发明提供了递送B细胞或浆细胞的方法和组合物，所述B细胞或浆细胞表达穿过血脑屏障的转基因，能够用于治疗和/或预防CNS的疾病或影响CNS的疾病。在一些实施方式中，转基因编码患有溶酶体贮积症的对象中缺少的酶。在其他实施方式中，转基因编码葡糖脑苷脂酶(GBA)，α半乳糖苷酶(GLA)，β-葡萄糖醛酸酶(GUSB)，艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(IDS)，α-L艾杜糖醛酸酶(IDUA)，鞘磷脂磷酸二酯酶1(SMPD1)或α-葡萄糖苷酶(GAA)，并被用于治疗或预防分别与高歇氏病(Gaucher disease)(Bae等,(2015)Exp MolMed 47,e153；doi:10:1038/emm.2014.128)，法布瑞氏症(Fabry disease)，VII型MPS(Sly等(1973)J Pediatr.1973年2月；82(2):249-57)，MPS II，MPS I，尼曼-皮克氏病(Niemann-Pick disease)或庞帕病(Pompe disease)相关的CNS疾病。

在其他方面中，本发明的方法和组合物包括修饰的B细胞或B细胞衍生物(浆母细胞、浆细胞)，其包含转基因以及一种或多种其他修饰。其他修饰可以是其他附加型序列或其他整合的序列(可以将其整合到基因组中相同和/或不同的位置)。在一些实施方式中，包含转基因的B细胞还包括有助于穿过血脑屏障效率的其他蛋白质或肽序列(或编码相同物质的多核苷酸)。在一些实施方式中，肽包含本领域已知的肽以促进穿过进入脑中。在其他实施方式中，肽是在B细胞表面上表达的靶向转铁蛋白受体的抗体，而在其他实施方式中，肽是金属转铁蛋白(Karkan等(2008)PLoS ONE 3(6):e2469.

doi:10.1371/journal.poine.0002469)。在一些实施方式中，肽是受体，如VLA-4、ICAM-1、IL-8Ra(CXCR1)或IL-8Rb(CXCR2)(Alter等(2003)J.Immunol170:4497-4505)。在这些实施方式中的任一个中，转基因可以编码溶酶体贮积症中缺少的酶，诸如上述的那些，从而将酶递送到有此需要的对象的CNS中。

在一些方面中，本发明的工程改造的B细胞包括有助于移植后植活(engraftment)的进一步修饰(例如，突变)。在一些实施方式中，抑制特定基因的表达(例如，经由瞬时抑制或永久敲除)以增加生发中心的植活和/或大小。受制于这类抑制的基因包括但不限于，肌醇六磷酸激酶(Zhang等(2014)Basic Res Cardio 109(4):417)，糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β，参见Ko等(2011)Stem Cells 29(1):108-18)，CD26(DPPIV/二肽酰肽酶IV)肽酶，(Tian等(2006)Gene Ther 13(7):652-8)，RhoA(Ghiaur等(2006)Blood 108(6):2087-94)，EAF2(Li等,(2016)Nat Com 7；doi:10.1038/ncomms10836)，自噬蛋白，如Atg5(Pengo等,(2013)Nat Immunol 14(3):298-305)等。在其他实施方式中，工程改造的B细胞可以进一步经工程改造以抑制(例如，敲除)与诱导移植物抗宿主反应相关联的基因。在一些实施方式中，编码B细胞受体的基因被敲除以防止刺激宿主中的B细胞。

在其他方面中，本发明的工程改造的B细胞还包括这样的修饰(突变如基因组***和/或缺失；转基因的附加型表达等)，其调节生发中心中的细胞相互作用(例如，T细胞-B细胞相互作用)和/或抑制与病原体感染相关联的任何B细胞功能(例如，抗体产生、细胞因子表达、信号转导等)阻抑。在一些方面中，本发明的工程改造的B细胞还包含蛋白质(或编码这些蛋白质的序列)用于抑制涉及致癌行为的B细胞。例如，在一些实施方式中，工程改造的B细胞包含针对泛素水解酶UCH-L1的表面表达抗体(包括编码相同物质的转基因)以抑制某些类型的大B细胞淋巴瘤所涉及的B细胞(Bedekovics等(2016)Blood 127(12):1564-74)。

在另一方面，提供了包含本文所述一种或多种细胞、表达构建体和/或任选的核酸酶的药物组合物。

对于核酸酶介导的靶向整合本发明的表达构建体到B细胞中合适的位置，可以使用任何核酸酶，包括但不限于一种或多种锌指核酸酶(ZFN)、TALEN、CRISPR/Cas核酸酶和/或TtAgo核酸酶，从而使表达构建体被整合到通过核酸酶切割的区域(基因)中。在某些实施方式中，采用一对或多对核酸酶。核酸酶可以mRNA形式导入或者可以使用非病毒或病毒载体给予细胞。在一些方面中，可以通过慢病毒或者通过非整合的慢病毒递送核酸酶多核苷酸。在其他方面中，可以通过AAV和/或DNA寡聚体递送表达盒。

在本文所述的组合物和方法中的任一项中，表达盒和/或核酸酶可以载于AAV载体，包括但不限于AAV1，AAV3，AAV4，AAV5，AAV6，AAV8，AAV9和AAVrh10或假型AAV，如AAV2/8，AAV8.2，AAV2/5和AAV2/6等。在某些实施方式中，使用相同的AAV载体类型递送多核苷酸(表达构建体和/或核酸酶)。在其他实施方式中，使用不同的AAV载体类型递送多核苷酸。多核苷酸可以使用一种或多种载体递送。在其他实施方式中，多核苷酸经由脂质纳米颗粒(LNP)递送。在某些实施方式中，多核苷酸经由向完整动物的脾脏或***中给予递送。在其他实施方式中，多核苷酸经由外周静脉中的静脉内给予递送。

本文所述方法可以在体外、离体和/或体内实施。在某些实施方式中，将组合物导入活的完整哺乳动物。该哺乳动物在递送时可能处于发育的任意阶段，例如，胚胎，胎儿，新生儿，婴儿，少年或成年。此外，靶细胞可以是健康的或患病的。在某些实施方式中，动脉内、腹腔内或肌肉内递送一种或多种组合物至特定组织(例如，脾脏或***)。离体递送可以使用同源性或异源性细胞群进行，包括干细胞、B细胞祖细胞和/或成熟B细胞。

还提供了这样的试剂盒，其包括本文所述的表达构建体、AAV载体、B细胞和/或药物组合物中的一种或多种。该试剂盒还可以包括编码核酸酶的核酸(例如，编码ZFN、TALEN或Cas和修饰的Cas蛋白质的RNA分子，以及引导RNA)，或核酸酶蛋白的等分，细胞，进行本发明的方法的说明书等。

基于本公开内容整体，这些和其它方面对于本领域技术人员而言将是显而易见的。

附图简要说明

图1是显示体外B细胞遵循的解冻和分化方案(参见Jourdan等(2009)Blood 114:5173-5181)。

图2A-2C是证明体外分化的B细胞产生抗体的能力的图表，包括IgM抗体(图2A)、IgG抗体(图2B)和IgA抗体(图2C)。用细胞因子(“+细胞因子”)或不用细胞因子处理样品，然后通过ELISA检测抗体的量。在第t4、t7和t10天收集上清液，并通过特异性ELISA对总IgM、IgG和IgA抗体水平进行定量。数据代表技术重复。误差线代表标准差。

图3A-3D是描述解冻后将mRNA电穿孔进入B细胞后0天(图3A)、1天(图3B)、2天(图3C)或3天(图3D)后GFP阳性细胞百分比的图表。在t0、t1、t2和t3用mRNA电穿孔CD19+B细胞，其中t等于解冻后确定mRNA添加的最佳时间点的天数。CD19+阳性B细胞(2.0E+05细胞)与GFP mRNA(2μg)混合，然后电穿孔。24小时后收集细胞，并通过流式细胞仪分析以评估GFP水平。解冻后的第2天(t2)具有最高水平的GFP，并将其选择用作进一步的研究。数据代表技术重复。误差线代表标准差。

图4A和4B是描述针对转导的细胞中GFP表达进行门选的流式细胞术的图表。图4A限定了与侧向散射(“SSC”)和前向射散(“FSC”)相关的图像区域。图4B例证了模拟处理的B细胞组(左图)和用编码mRNA的GFP电穿孔的那些(右图)之间的差异。如图4B右图所示，GFPmRNA的表达导致GFP生成的荧光增加，而该荧光在门选之后是可定量的。

图5A-5C是描述B细胞中基因组编辑的图表。在多个基因座的深度测序证明使用靶向AAVS1、CCR5和TCRA(TRAC)的锌指核酸酶稳健的基因组编辑。通过将含有***和缺失(***缺失)的序列计数除以总序列计数计算基因组修饰百分比。CD19+阳性B细胞(2.0E+5细胞)与ZFN mRNA(4μg)混合，然后电穿孔。转染后随时间(t＝天)收集细胞。数据代表技术重复。误差线代表标准差。图5A描述了AAVS1基因座处第4、7和10天的基因组编辑。图5B在CCR5基因座处显示了相似的数据组，而图5C显示了TCRA(TRAC)基因座处的数据。

图6A-6C显示了瞬时冷激对B细胞基因组编辑的作用。CD19+阳性B细胞(2.0E+5细胞)与ZFN mRNA(0.75、1.5、3和6μg)混合，然后电穿孔。将电穿孔后的细胞分成两组。将一组置于37℃孵育器4天。第二组置于30℃过夜，然后转移到37℃孵育器3天。深度测序揭示了用瞬时冷激处理的细胞中的基因组编辑(％***缺失)增加。

图7A和7B描述了测试用于递送CMV启动子-GFP供体到CD19+B细胞的多种AAV血清型的转导能力。图7A显示了具有以2.4E+6、1.2E+6、6.0E+5、3.0E+5载体基因组(vg)/细胞的载体剂量递送的CMV-GFP的重组AAV血清型2、5、6、8和9的结果。数据显示了n＝2个生物学重复，其中在转导后的第4、7和10天分析细胞的GFP表达，并证明了AAV6容易地转导了B细胞。误差线表示技术和生物学重复的标准偏差。图7B是描述所示实验中使用的表达盒的示意图。

图8描述了使用的示例性的AAV表达盒。显示了用于***AAVSI、CCR5和TCRA(TRAC)基因座的示例性供体盒。AAVS1具有分别由801和568个碱基对长度组成的左(“AAVS1-L”)和右(“AAVS1-R”)同源臂。CCR5具有分别由473和1431个碱基对长度组成的左(“CCR5-L”)和右(“CCR5-R”)同源臂。TCRA(“TRAC”)具有分别由925和989个碱基对长度组成的左(“TRAC-L”)和右(“TRAC-R”)同源臂。供体包含磷酸甘油酸激酶(“PGK”)或B细胞特异性启动子(“EEK”，其包含轻链启动子(VKp)，之前为内含增强子(iEκ)、MAR和3增强子(3′Eκ)；美国专利号8,133,727)，其后为GFP编码的转基因(“GFP”)和牛生长激素聚腺苷酸化信号(“pA”)。AAV2反向末端重复(“ITR”)被用于实现包装到AAV衣壳中。

图9A-9C是显示促进多个基因座处高水平转基因添加的rAAV2/6载体和ZFN mRNA的组合的图表。GFP表达的水平通过流式细胞术测量。向B细胞添加ZFN mRNA和AAV供体后随时间(t＝天数)收集B细胞培养物。评估AAVS1(图9A)、CCR5(图9B)和TCRA(TRAC，图9C)基因座的转基因添加。ZFN:供体样品显示了持续的GFP表达，而仅有供体的样品显示了GFP表达随时间的降低。各图表下方示出的是针对核酸酶的靶位点(例如，在图9A中的“ZFN:AAVS1”)。还示出了GFP转基因(例如，在图9A中，“供体：PGK-AAVS1”表示GFP转基因由PGK启动子驱动，并且GFP编码序列侧接与AAVSI基因中核酸酶位点具有同源性的同源臂)的描述。在图9A-9C中，左图显示了转染后4天(t4)收集后的结果；中间图显示了转染后7天(t7)收集后的结果；而右图显示了转染后10天收集后的结果。

图10A和10B是显示CD19+B细胞中AAVS1(图10A)和CCR5(图10B)基因座处靶向整合GFP供体的百分比的图表。靶向整合(转基因添加)的确认通过深度测序实现。通过将含有整合靶标的序列计数除以总序列计数计算基因修饰百分比。向B细胞添加ZFN mRNA和AAV供体后随时间(t＝天数)收集B细胞。AAVSI数据表示3次独立实验。CCR5数据表示2次独立实验。误差线代表标准差。各图表下示出了核酸酶的靶位点以及如上所述供体的结构。

图11是描述确定同源性驱动的重组(HDR)或经由非同源末端连接(NHEJ)的末端捕获是否被B细胞用于靶向整合结果的图表。图表下方的表格显示了ZFN特异性和供体的结构。所有供体使用PGK启动子，但是只有实验#1具有通过匹配核酸酶切割位点的同源臂侧接的供体GFP转基因。错配的ZFN和供体同源臂样品显示了相似的GFP表达，因为供体仅不包含任何添加的核酸酶。当同源臂匹配核酸酶靶位点时，出现最大的靶向整合，证明HDR用于B细胞中的整合。

图12是描述PGK启动子驱动的GFP表达与B细胞特异性启动子EEK驱动的GFP表达之间比较的图表。B细胞与靶向TCRA(TRAC)基因座的ZFN mRNA(4μg)混合，然后电穿孔。电穿孔后，然后用包含TRAC同源臂的AAV6转导CD19+B细胞，所述TRAC同源臂侧接转基因表达盒以及驱动GFP转基因表达的B细胞特异性启动子(EEK)或PGK。将它们以2.4E+06vg/细胞的载体剂量递送。该数据证明，相较于PGK启动子，B细胞特异性启动子(EEK)的使用显示出GFP表达的轻微增长。

图13A-13D是描述以一系列供体AAV剂量CD19+B中GFP转基因表达的量的图表。在所有情况中，使用TCRA特异性核酸酶将GFP转基因整合到TCRA(TRAC)基因座中。当在不存在核酸酶的情况下进行转导时，还在各图表中显示GFP表达结果。供体构建体包含TCRA特异性同源臂以及上述EEK启动子或PGK启动子之一。使用的AAV范围包括：3.0E+05vg/细胞(图13D)、6.0E+05vg/细胞(图13C)、1.2E+06vg/细胞(图13B)和2.4E+06vg/细胞(图13A)。CD19+阳性B细胞与靶向TCRA基因座的ZFN mRNA(4μg)混合，然后电穿孔。电穿孔后，用包含TRAC同源臂的AAV转导CD19+B细胞，所述TRAC同源臂具有驱动GFP表达的B细胞特异性启动子(EEK)或PGK。它们以2.4E+06、1.2E+06、6.0E+05和3.0E+05vg/细胞的载体剂量递送。PGK启动子驱动的GFP表达的百分比随着剂量的减少而降低，而B细胞特异性启动子在8倍稀释后维持GFP表达。两种启动子之间在3.0E+05vg/细胞时存在几乎5倍的差异。

图14A-14C是描述基因编辑操作后对抗体产生影响的图表，通过ELISA测量操作的结果证明IgG体外产生没有重大损失。总的分泌IgG水平独立于实验过程中的处理(显示在第4、7和10天合并的分泌IgG水平)，表明电穿孔和转导对IgG产生没有负面影响。添加细胞因子对于IgG产生十分重要。用AAVS1特异性ZFN(图14A)、CCR5特异性ZFN(图14B)或TCRA(TRAC)特异性ZFN(图14C)处理CD19+B细胞。用于各数据组的各种条件包括：与具有匹配的同源臂的GFP转基因配对的特异性ZFN(“ZFN:供体”)、GFP转基因和同源臂(“供体”)，单独的特异性ZFN(“ZFN”)，在BTX装置中仅用缓冲液处理的CD19+B细胞(“BTX细胞”)，未处理的CD19+B细胞加上细胞因子(“B细胞”)和不具有细胞因子的未处理的CD19+B细胞(“B细胞-Cytos”)。用细胞因子处理所有ZFN:供体、供体、ZFN、BTX细胞和B细胞。

图15A-15C是描述基因编辑操作后对抗体产生影响的图表，通过ELISA测量证明IgM体外产生没有重大损失。用AAVS1特异性ZFN(图15A)、CCR5特异性ZFN(图15B)或TCRA(TRAC)特异性ZFN(图15C)处理CD19+B细胞。样品在上述图14中描述。

图16是描述由经来自单个人供体的细胞因子处理的分化的CD19+B细胞产生IgM的图表。CD19+B细胞进行以AAV2、5、6、8或9病毒的处理。在添加的细胞因子存在的情况下，如ELISA所测量，当仅用AAV2处理时，IgM产生被“增强”。抗体对人群中野生型AAV的流行性是稳健的并且并未与疾病相关联。这里显示的是由于将被认为是被AAV再感染而出现的抗体产生的潜在增强。

图17A和17B是描述因为AAV2“增强”而导致增加IgM表达的潜在机制的示意图。左图(图17A)描述的是AAV感染后在B细胞中产生抗体的简化情况。右侧示出的组图(图17B)是表示如何利用AAV作为增强剂(booster)来增加由工程改造的B细胞中抗体启动子驱动的***转基因的表达的实例。

具体实施方式

本文公开了这样的方法和组合物，其用于遗传工程改造B细胞，包括敲除内源性基因和***(稳定地或附加型地)表达盒用于表达转基因。该方法可以体外、离体或体内进行并且可以用于表达任何转基因，用于治疗和/或预防可以通过给予一种或多种转基因改善的任何疾病或病症。

概述

除非另有说明，本方法的实施以及本文所述组合物的制备与应用采用本领域技术范围内的分子生物学、生物化学、染色质结构与分析、计算化学、细胞培养、重组DNA与相关领域的常规技术。这些技术在文献中已有充分描述。参见例如，Sambrook等，MOLECULARCLONING:A LABORATORY MANUAL(《分子克隆：实验室手册》)第2版，冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，1989以及第3版，2001；Ausubel等，CURRENT方案IN MOLECULAR BIOLOGY(《新编分子生物学实验指南》)，纽约约翰韦利父子公司(JohnWiley&Sons,New York)1987及定期更新；METHODS INENZYMOLOGY(《酶学方法》)丛书，圣迭戈学术出版社(Academic Press,San Diego)；Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE ANDFUNCTION(《染色质结构与功能》)，第3版，学术出版社，圣迭戈，1998；METHODS INENZYMOLOGY(《酶学方法》)，第304卷，“Chromatin(染色质)”(P.M.Wassarman和A.P.Wolffe编)，学术出版社，圣迭戈，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY(《分子生物学方法》)，第119卷，“Chromatin方案(染色质方法)”(P.B.Becker编)，托托瓦的休玛纳出版社(HumanaPress,Totowa)，1999。

定义

术语"核酸"，"多核苷酸"和"寡核苷酸"互换使用并指脱氧核糖核苷酸或核糖核甘酸聚合物，可以是直链或环状构型的，是单链或双链形式的。出于本公开目的，这些术语不意在限制聚合物的长度。所述术语可涵盖天然核苷酸的已知类似物，以及在碱基、糖和/或磷酸部分(例如，硫逐磷酸酯主链)经修饰的核苷酸。一般而言，具体核苷酸的类似物具有相同的碱基配对特异性；即，A的类似物将与T碱基配对。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可以互换使用以指氨基酸残基的聚合物。该术语还应用于其中一种或多种氨基酸是对应的天然产生的氨基酸的化学类似物或经修饰的衍生物的氨基酸聚合物。

“重组”表示两种多核苷酸之间交换遗传信息的过程，包括但不限于通过非同源末端连接(NHEJ)和同源性重组的捕获。就本公开的目的而言，“同源重组(HR)”指发生这种交换的特定形式，例如在修复细胞内双链断裂期间通过同源导向修复机制发生。

在本公开的某些实施方式中，本文所述的一种或多种靶向的核酸酶在靶序列(例如，细胞染色质)中的预定位点(例如，白蛋白基因)处产生双链断裂(DSB)。DSB介导本文所述的构建体整合。任选地，该构建体对于该断裂区域内的核苷酸序列具有同源性。表达构建体可被物理整合(physically integrated)，或者，表达盒被用作模板用于通过同源重组进行的断裂修复，导致将表达盒中的全部或部分核苷酸序列导入细胞染色质。因此，细胞染色质中的第一序列可改变，并且在某些实施方式中，可转化成表达盒中存在的序列。因此，使用术语“替换”或“置换”可理解为表示一种核苷酸序列被另一种核苷酸序列替换(即，信息意义上序列的替换)，而不一定要求一种多核苷酸被另一种多核苷酸物理或化学替换。

在本文所述的任何方法中，外源性核苷酸序列(“表达构建体”或“表达盒”或“载体”)可包含与感兴趣区域中基因组序列同源但不相同的序列，由此刺激同源重组以在感兴趣区域***非相同序列。因此，在某些实施方式中，表达盒序列中与感兴趣区域序列同源的部分呈现与待替换的基因组序列有约80-99％(或其间任意整数)的序列相同性。在其它实施方式中，表达盒和基因组序列间的同源性超过99％，例如，超过100个连续碱基对的基因组序列与表达盒的同源区之间相差仅1个核苷酸。在某些情况中，表达盒的非同源部分可包含不存在于感兴趣区域的序列，从而将新序列导入感兴趣区域。在这些情况中，非同源序列一般侧接50-1,000个碱基对(或其间的任何整数值)或大于1,000的任何数量个碱基对的序列，其与感兴趣区域中的序列同源或相同。

术语"序列"指任意长度的核苷酸序列，可以是DNA或RNA；可以是直链、环状或支链且可以是单链或双链。术语"转基因"指***基因组的核苷酸序列。转基因可以是任意长度，例如长度为2-100,000,000个核苷酸(或其间或其上的任意整数值)，优选长度为约100-100,000个核苷酸(或其间的任意整数)，更优选长度为约2000-20,000个核苷酸(或其间的任意值)，甚至更优选长度为约5-15kb(或其间的任意值)。

"染色体"是包含细胞的全部或部分基因组的染色质复合体。细胞基因组通常由其核型表征，其为包含该细胞基因组的全部染色体的集合。细胞基因组可包含一条或多条染色体。

"附加体"是复制的核酸、核蛋白复合体或其它包含并非细胞染色体核型部分的核酸的结构。附加体的示例包括质粒和某些病毒基因组。本文所述肝特异性构建体可以被附加型保持或者可以被稳定地整合到细胞中。

"外源性"分子是通常不存在于细胞内的分子，但可通过一种或多种遗传、生化或其它方法导入细胞。“正常存在于细胞中”相对于细胞的具体发育阶段和环境条件确定。因此，例如，仅在肌肉的胚胎发育期间存在的分子对于成体肌肉细胞是外源性分子。类似地，相对于非热激的细胞，通过热激诱导的分子是外源性分子。例如，外源性分子可以包括功能失常的内源性分子的功能性形式或者正常功能的内源性分子的功能失常形式。

外源性分子可以是小分子或大分子等，小分子如由组合化学方法所产生，大分子如蛋白质、核酸、碳水化合物、脂质、糖蛋白、脂蛋白、多糖、上述分子的任何经修饰衍生物，或者是包含一种或多种上述分子的任何复合物。核酸包括DNA和RNA，其可以是单链或双链的；可以是直链、支链或环状的；并且可以具有任何长度。核酸包括能够形成双链体的那些，以及形成三链体的核酸。参见，例如美国专利号5,176,996和5,422,251。蛋白质可包括但不限于，DNA结合蛋白、转录因子、染色质重构因子、甲基化DNA结合蛋白、聚合酶、甲基化酶、脱甲基化酶、乙酰基转移酶、脱乙酰酶、激酶、磷酸酶、连接酶、脱泛素化酶、整合酶、重组酶、连接酶、拓扑异构酶、旋转酶和解旋酶。

外源性分子可以是与内源性分子同一类型的分子，例如外源性蛋白质或核酸。例如，外源性核酸可以包括感染性病毒基因组、导入细胞内的质粒或附加体，或包含通常不存在于细胞内的染色体。本领域技术人员已知将外源性分子导入细胞内的方法，包括但不限于脂质介导的转移(即脂质体，包括中性和阳离子脂质)、电转导、直接注射、细胞融合、粒子轰击、磷酸钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转移和病毒载体介导的转移。外源性分子也可以是与内源性分子相同类型但源自与该细胞来源不同物种的分子。例如，可将人核酸序列引入原始源自小鼠或仓鼠的细胞系。

相反，"内源性"分子是通常存在于特定环境条件下特定发育阶段的特定细胞中的分子。例如，内源性核酸可以包括染色体、线粒体基因组、叶绿体或其它细胞器，或天然产生的附加型核酸。其他内源性分子可包括蛋白质，例如，转录因子和酶。

本文所用术语“外源性核酸的产物”包括多核苷酸和多肽产物，例如，转录产物(多核苷酸诸如RNA)和翻译产物(多肽)。

"融合"分子是其中两个或多个亚单元分子相连(优选共价相连)的分子。亚基分子可以是相同化学类型的分子，也可以是不同化学类型的分子。融合分子的实例可以包括但不限于，融合蛋白(例如，DNA结合结构域和切割结构域之间的融合体)，可操作地连接切割结构域的多核苷酸DNA结合结构域(例如，sgRNA)之间的融合体，和融合核酸(例如，编码融合蛋白的核酸)。

细胞内融合蛋白的表达可由融合蛋白递送入细胞造成或通过向细胞递送编码融合蛋白的多核苷酸而引起，其中所述多核苷酸被转录，转录本经翻译产生所述融合蛋白。细胞中蛋白质的表达也可涉及反式剪接、多肽切割和多肽连接。用于将多核苷酸和多肽递送至细胞的方法在本公开内容中的他处呈现。

就本公开的目的而言，"基因"包括编码基因产物(见前文)的DNA区域，以及调节基因产物生成的DNA区域，不论这类调节序列是否毗邻编码和/或转录序列。因此，基因包括但不必限于，启动子序列、终止子、翻译调节序列，例如核糖体结合位点和内部核糖体进入位点、增强子、沉默子、绝缘子、边界元件、复制起点、基质连接位点和基因座控制区域。

"基因表达"指基因所含信息转化成基因产物。基因产物可以是基因的直接转录产物(例如，mRNA、tRNA、rRNA、反义RNA、核糖酶、结构RNA或任何其它类型的RNA)或通过mRNA翻译产生的蛋白质。基因产物还包括经修饰的RNA，通过如下加工修饰，例如加帽、聚腺苷酸化、甲基化，和编辑，以及通过如下加工修饰的蛋白质，例如，甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、ADP-核糖基化、豆蔻酰化和糖基化。

基因表达的"调控"指基因活性的改变。表达的调控可包括但不限于，基因活化和基因阻遏。基因组编辑(例如，切割，改变，失活，随机突变)可以用于调控表达。基因失活指相较于没有包含本文所述ZFP、TALE或CRISPR/Cas***的细胞，基因表达的任何减少。因此，基因失活可以是部分或完全的。“遗传修饰的”细胞包括细胞中遗传物质有任何改变的细胞，包括但不限于附加型和/或基因组修饰。遗传修饰的非限制性实例包括***和/或缺失(例如，附加型和/或靶向整合一种或多种转基因、RNA或非编码序列)和/或突变(例如，点突变、取代等)，它们改变细胞内蛋白质表达)。

"感兴趣区域"是需要结合外源性分子的细胞染色质的任意区域，例如，基因或者基因内或与之毗邻的非编码序列。结合可以是出于靶向DNA切割和/或靶向重组的目的。感兴趣区域可以存在于例如染色体，附加体，细胞器基因组(例如，线粒体、叶绿体)，或感染性病毒基因组中。感兴趣区域可处于基因的编码区中，转录的非编码区域例如前导序列、尾随序列或内含子中，或非转录区域中编码区的上游或下游。感兴趣区域可如单一核苷酸对一样小，或长达2,000个核苷酸对，或任意整数值的核苷酸对。

"真核"细胞包括但不限于，真菌细胞(例如酵母)、植物细胞、动物细胞、哺乳动物细胞和人细胞(例如，B细胞)，包括干细胞(多能(multipotent)和多潜能(pluripotent))。

涉及两个或多个组件(例如序列元件)的并置，所述组件设置成组件都可正常发挥作用并允许组件中至少一种能介导施加于至少一种其它组件上的作用时，术语"操作性相连"和"操作性连接"(或"可操作地连接")互换使用。例如，若转录调节序列控制编码序列响应一种或多种转录调节因子存在与否时的转录水平，则所述转录调节序列如启动子与所述编码序列操作性连接。转录调节序列一般与编码序列以顺式操作性地连接，但无需紧邻该序列。例如，增强子是操作性地连接编码序列的转录调节序列，尽管它们是不连续的。

蛋白质、多肽或核酸的"功能性片段"是序列与全长蛋白质、多肽或核酸不相同但保留全长蛋白质、多肽或核酸的相同功能的蛋白质、多肽或核酸。功能片段可具有比相应的天然分子更多、更少或相同数量的残基，和/或可含有1个或多个氨基酸或核苷酸取代。用于确定核酸功能(例如，编码功能、与另一核酸杂交的能力)的方法是本领域熟知的。类似地，用于确定蛋白质功能的方法也是熟知的。例如，B-结构域缺失的人因子VIII是全长因子VIII蛋白的功能性片段。

多核苷酸"载体"或"构建体"能将基因序列转移至靶细胞。通常，"载体构建体"、"表达载体"、"表达构建体"、"表达盒"和"基因转移载体"指能指导感兴趣基因表达并能将基因序列转移至靶细胞的核酸构建体。因此，该术语包括克隆和表达载体，以及整合载体。

术语“对象”和“患者”可以互换使用，并且表示哺乳动物例如人类患者和非人类灵长类，以及实验室动物例如兔、狗、猫、大鼠、小鼠和其他动物。因此，术语“对象”或“患者”表示可给予本发明表达盒的任何哺乳动物患者或对象。本发明的对象包括患有病症的那些。

B细胞表达构建体

本文描述了表达盒(构建体)，用于指导B细胞(包括浆母细胞和浆细胞)中转基因表达，包括给予(例如，静脉内递送)对象表达盒后体内指导B细胞(包括浆母细胞和浆细胞)中转基因表达。表达构建体可以被附加型维持并且染色体外驱动转基因表达，或者，表达构建体可以被整合到B细胞的基因组中，例如通过核酸酶介导的靶向整合。

本发明的表达盒可以使用任何合适的启动子序列。在某些实施方式中，启动子是组成型启动子。在其他实施方式中，启动子是诱导型和/或B细胞特异性启动子。还考虑了用这样的无启动子构建体如本文所述遗传修饰细胞，所述无启动子构建体中的转基因通过内源性B细胞启动子驱动。

应当理解的是，本文所述构建体可以使用任何转基因。此外，本文所述构建体的个别表达构建体组件(启动子、增强子、绝缘子、内含子、转基因等)可以存在或者不存在，并且可以任意组合混合和匹配。

本文所述构建体可以包含于任何病毒或非病毒载体中。构建体可以被附加型地维持或者可以被整合到细胞的基因组中(例如，经由核酸酶介导的靶向整合)。

非病毒载体包括DNA或RNA质粒，DNA MC，裸核酸和与递送载剂如脂质体、脂质纳米颗粒、纳米颗粒或泊咯沙姆复合的核酸。可用于携带本文所述表达盒的病毒载体包括但不限于，逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒载体、牛痘和单纯性疱疹病毒载体。宿主基因组中的整合可采用逆转录病毒、慢病毒和腺相关病毒基因转移方法进行，并且如本文所述，可以通过核酸酶介导的整合促进。

在某些优选的实施方式中，构建体可以包括在可以被附加型维持或整合到B细胞基因组(例如，经由核酸酶介导的靶向整合)的腺相关病毒(“AAV”)载体或载体***中。重组AAV载体的构建在多个公开文本中，包括美国专利号5,173,414；Tratschin等.，Mol.Cell.Biol.5:3251-3260(1985)；Tratschin等.，Mol.Cell.Biol.4:2072-2081(1984)；Hermonat和Muzyczka，PNAS

81:6466-6470(1984)；和Samulski等.，J.Virol.63:03822-3828(1989)。

因此，在某些实施方式中，表达构建***于AAV构建体上并且进一步包含侧接如本文所述的表达构建体元件(例如，增强子、启动子、任选的内含子、转基因等)的5'和3'ITR。任选地，间隔子分子也包括在表达构建体的一个或多个组件之间，例如，位于5'ITR和增强子之间和/或位于聚腺苷酸化信号和3'ITR之间。间隔子可以作为同源臂以促进重组到安全港基因座(例如，白蛋白)中。在某些实施方式中，构建体是如图8所示的构建体。

在某些实施方式中，本文所述AAV载体可以源自任何AAV。在某些实施方式中，AAV载体源自缺陷型和非病原性细小病毒腺相关2型病毒。所有这类载体源自仅保留侧接转基因表达盒的AAV 145bp反向末端重复的质粒。高效的基因转移和稳定的转基因递送是该载体***的关键特征，这归因于向转导的细胞的基因组的整合。(Wagner等.,Lancet 351:9117 1702-3(1998),Kearns等.,Gene Ther.9:748-55(1996))。还可以根据本发明使用其他AAV血清型，包括AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9和AAVrh.10以及任何新型AAV血清型。特别优选的是AAV6血清型。在一些实施方式中，使用嵌合AAV，其中病毒核酸ITR序列的病毒源与衣壳序列的病毒源是异源性的。非限制性的实例包括这样的嵌合病毒，其具有源自AAV2的ITR和源自AAV5、AAV6、AAV8或AAV9的衣壳(即分别为AAV2/5、AAV2/6、AAV2/8和AAV2/9)。

逆转录病毒载体包括基于鼠白血病病毒(MuLV)、长臂猿白血病病毒(GaLV)、类人猿免疫缺陷型病毒(SIV)、人类免疫缺陷型病毒(HIV)，及其组合的那些(参见例如，Buchscher等.,J.Virol.66:2731-2739(1992)；Johann等.,J.Virol.66:1635-1640(1992)；Sommerfelt等.,Virol.176:58-59(1990)；Wilson等.,J.Virol.63:2374-2378(1989)；Miller等.,J.Virol.65:2220-2224(1991)；

PCT/US94/05700)。

本文所述构建体还可以纳入腺病毒载体***。基于腺病毒的载体能够在许多细胞类型中获得极高的转导效率，并且不需要细胞***。采用这种载体，已获得了高效价和高水平的表达。该载体可在相对简单的***中大量产生。

pLASN和MFG-S是已用于临床试验的逆转录病毒载体的示例(Dunbar等.，Blood85:3048-305(1995)；Kohn等.，Nat.Med.1:1017-102(1995)；Malech等.，PNAS 94:2212133-12138(1997))。PA317/pLASN是用于基因治疗试验的第一治疗载体。(Blaese等.，Science 270:475-480(1995))。已在MFG-S包装的载体中观察到50％或更高的转导功效。(Ellem等.,Immunol Immunother.44(1):10-20(1997)；Dranoff等.,Hum.Gene Ther.1:111-2(1997)。

复制缺陷型重组腺病毒载体(Ad)还可以与本文所述多核苷酸联用。大多数腺病毒载体是经工程改造的，从而转基因替代了Ad E1a、E1b和/或E3基因；随后该复制缺陷型载体在提供缺失反式基因功能的人293细胞中传播。Ad载体可体内转导多种类型的组织，包括不***的、分化的细胞，例如发现于肝、肾和肌肉中的那些。传统的Ad载体具有较大携载能力。临床试验中Ad载体应用的一个示例涉及用于采用肌内注射进行抗肿瘤免疫的多核苷酸治疗(Sterman等.，Hum.7:1083-9(1998))。临床试验中腺病毒载体用于转基因的应用的其它示例包括Rosenecker等.，Infection 24:1 5-10(1996)；Sterman等.，Hum.Gene Ther.9:71083-1089(1998)；Welsh等.,Hum.Gene Ther.2:205-18(1995)；Alvarez等.,Hum.GeneTher.5:597-613(1997)；Topf等.,Gene Ther.5:507-513(1998)；Sterman等.,Hum.GeneTher.7:1083-1089(1998)。

采用包装细胞来形成能够感染宿主细胞的病毒颗粒。这类细胞包括HEK293和Sf9细胞，其可以用于包装AAV和腺病毒，和ψ2细胞或PA317细胞，其包装逆转录病毒。用于基因治疗的病毒载体通常由将核酸载体包装成病毒颗粒的生产细胞系产生。所述载体通常包含包装和后续整合进入宿主(若可行)所需的最小病毒序列，其它病毒序列被编码待表达的蛋白质的表达盒所替代。失去的病毒功能通过包装细胞系以反式提供。例如，用于基因治疗的AAV载体通常仅加工来自AAV基因组的反向末端重复(ITR)序列，其为包装和整合进入宿主基因组所需。病毒DNA被包装进入细胞系，其包含编码其它AAV基因，即rep和cap，但缺乏ITR序列的辅助质粒。所述细胞系也用腺病毒(作为辅助物)感染。辅助病毒促进AAV载体的复制和AAV基因从辅助质粒的表达。因为缺乏ITR序列，辅助质粒不以显著的量包装。腺病毒的污染可通过，例如，热处理(相比AAV，腺病毒对热处理更为敏感)来减少。在一些实施方式中，使用杆状病毒表达***产生AAV(参见例如，美国专利号6,723,551和7,271,002)。

由293或杆状病毒***纯化AAV颗粒通常涉及使产生病毒的细胞生长，然后由该细胞上清液收集病毒颗粒，或裂解该细胞并由粗裂解物收集病毒。然后通过本领域技术人员已知的方法纯化AAV，包括离子交换色谱(例如，参见美国专利号7,419,817和6,989,264)，离子交换色谱和CsCl密度离心(例如，PCT公开WO2011094198A10)，免疫亲和力色谱(例如，WO2016128408)或使用AVB琼脂糖的纯化(例如，GE医疗生命科学公司(GE Healthcare LifeSciences))。

在许多基因治疗应用中，希望将基因治疗载体以高度特异性递送至特定组织类型。因此，病毒载体可经修饰以通过将配体表达成与病毒包衣蛋白融合的位于病毒外表面上的蛋白来具有针对给定细胞类型的特异性。选择对于已知存在于感兴趣的细胞类型上的受体具有亲和力的配体。例如，Han等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92:9747-9751(1995)，报道了莫洛尼鼠白血病病毒可经修饰以表达融合至gp70的人调蛋白，并且该重组病毒感染表达人表皮生长因子受体的某些人乳腺癌细胞。该原理可延伸至其它病毒-靶细胞对，其中靶细胞表达受体，并且病毒表达包含针对该细胞表面受体的配体的融合蛋白。例如，丝状噬菌体可经工程改造以显示对于几乎任何所选细胞受体具有特异性结合亲和力的抗体片段(例如，FAB或Fv)。尽管上文描述主要应用至病毒载体，相同的原理可应用至非病毒载体。所述载体可经工程改造以包含特定的摄取序列，其有利于被特定靶细胞摄取。

本文所述多核苷酸可以包括一种或多种非天然碱基和/或主链。具体的，本文所述的表达盒可以包括甲基化的胞嘧啶以实现感兴趣区域内的转录静止状态。

此外，本文所述的表达构建体还可以包括其他转录或翻译调节元件或其他序列，例如，Kozak序列，其他启动子，增强子，绝缘子，内含子，内部核糖体进入位点，编码2A肽的序列，弗林蛋白酶切割位点和/或聚腺苷酸化信号。此外，感兴趣基因的控制元件可以可操作地连接报告基因以产生嵌合基因(例如，报告物表达盒)。

修饰

本文描述了包含一种或多种下述修饰的遗传修饰的B细胞：(a)在细胞中提供一种或多种转基因(以任意组合整合和/或附加型)；(b)一种或多种基因中的***和/或缺失，其修饰(i)B细胞受体基因，和/或(ii)生发中心中的细胞相互作用；和/或(c)这样的修饰(突变)，其抑制与病原体感染或癌症调节相关联的任何B细胞功能阻抑。通常，本文所述遗传修饰的B细胞源自包含一种或多种这些遗传修饰的HSC。

在某些实施方式中，本文所述构建体可以用于B细胞表达任何转基因。一种或多种转基因可以在经修饰的B细胞中附加型表达和/或在核酸酶介导的靶向整合一种或多种这样的转基因后表达。示例性的转基因(也称之为感兴趣的基因和/或外源性序列)包括但不限于任何多肽编码序列(例如，cDNA)，启动子序列，增强子序列，表位标签，标志物基因，切割酶识别位点和/或各种类型的表达构建体。标志物基因包括但不限于，编码介导抗生素抗性(例如，氨苄青霉素抗性、新霉素抗性、G418抗性、嘌呤霉素抗性)的蛋白质的序列、编码有色或荧光或发光蛋白质(例如，绿色荧光蛋白、强化绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、荧光素酶)的序列，和介导增强的细胞生长和/或基因扩大的蛋白质(例如，二氢叶酸还原酶)。表位标签包括，例如，一个或多个拷贝的FLAG、His、myc、Tap、HA或任何可检测的氨基酸序列。

在优选的实施方式中，转基因包括编码其表达在细胞中为所需要的任何多肽的多核苷酸，包括但不限于抗体，抗原，酶，受体(细胞表面或核)，激素，淋巴因子、细胞因子、报告多肽、生长因子和上述任一种的功能性片段。例如，编码序列可以是cDNA。

在某些实施方式中，转基因编码在任意遗传疾病，包括但不限于溶酶体贮积症(例如，高歇氏病、法布瑞氏病、亨特氏病、赫尔勒氏病、尼曼-皮克氏病等)，代谢障碍和/或血液紊乱如血友病和血红蛋白病等中不足或缺乏的蛋白质的功能形式。参见例如，美国专利公开号20140017212和20140093913；美国专利号9,255,250和9,175,280。

例如，转基因可以包括编码在患有遗传性疾病，包括但不限于任何下述遗传疾病的对象中缺乏或无功能的多肽的序列：软骨发育不全，色盲，酸性麦芽酶缺乏，腺苷脱氨酶缺乏(OMIM号102700)，肾上腺脑白质营养不良，艾卡尔迪综合征，α-1抗胰蛋白酶缺乏，α-地中海贫血，雄激素不敏感综合征，阿佩尔综合征，致心律失常性右心室，发育不良，毛细血管扩张性共济失调，巴思综合征，β-地中海贫血，蓝橡皮疱疹神经综合征，卡纳万病、慢性肉芽肿病(CGD)，猫叫综合征，囊性纤维化、真皮病、外胚层发育不良、凡科尼贫血、纤维增生异常进行性，脆性X线综合征、半乳糖增多症、高歇尔病、全身神经节苷脂病(例如，GM1)，血色素沉着症，β球蛋白第6个密码子中的血红蛋白C突变(HbC)，血友病，亨特氏综合症，赫尔勒氏综合征，低磷酸盐血症，凯尼菲特综合征(Klinefleter syndrome)，克拉贝病(KrabbesDisease)，LG综合征(Langer-Giedion Syndrome)，白细胞粘附缺陷(LAD,OMIM号116920)，脑白质营养不良，长QT综合征，马凡氏综合征，莫比乌斯综合征，粘多糖症(MPS)，甲髌骨综合征，肾源性尿崩症，神经纤维瘤病，尼曼-皮克氏病，成骨不全症、卟啉症、普瑞德-威利综合征、早衰症、普罗特斯综合征、视网膜母细胞瘤、瑞特综合征、鲁宾斯坦-塔伊比综合征、三菲利波综合征、严重联合免疫缺陷(SCID)，舒瓦克曼综合症(Shwachman syndrome)，镰状细胞疾病(镰状细胞性贫血)，史密斯-马吉利综合征，史蒂克勒氏综合征，泰-萨二氏病，血小板减少性无桡骨(TAR)综合征，特雷切尔柯林斯综合征，三体，结节性硬化症，特纳氏综合征，尿素循环紊乱，冯希佩尔-朗道病(von Hippel-Landau disease)，瓦登伯格综合症，威廉斯综合征，威尔逊氏病，威斯科特-奥尔德里奇综合征，X-连锁淋巴细胞增生性综合症(XLP，OMIM号308240)，获得性免疫缺陷，溶酶体贮积病(例如，高歇病，GM1，法布瑞氏病和泰-萨二氏病)，黏多糖贮积症(mucopolysaccahidosis)(例如，亨特氏症，赫尔勒氏症)，血红蛋白病(例如，镰状细胞疾病，HbC，α-地中海贫血，β-地中海贫血)和血友病。

可以如本文所述表达的蛋白质(包括其功能性片段如截短型式)的非限制性实例还包括纤维蛋白原，凝血酶原，组织因子，因子V，因子VII，因子VII，因子IX，因子X，因子XI，因子XII(哈格曼因子)，因子XIII(纤维蛋白稳定因子)，血管性血友病因子，前激肽释放酶，高分子量激肽原(菲兹杰拉尔德因子(Fitzgerald factor))，纤连蛋白，抗凝血酶III，肝素辅因子II，蛋白C，蛋白S，蛋白Z，蛋白Z相关蛋白酶抑制剂，纤溶酶原，α2-抗纤溶酶，组织纤溶酶原激活物，尿激酶，纤溶酶原激活物抑制剂-1，纤溶酶原激活物抑制剂-2，葡糖脑苷脂酶(GBA)，α-半乳糖苷酶A(GLA)，艾杜糖醛酸硫酸酯酶(IDS)，艾杜糖醛酸酶(IDUA)，酸性鞘磷脂酶(SMPD1)，MMAA，MMAB，MMACHC，MMADHC(C2orf25)，MTRR，LMBRD1，MTR，丙酰-乙酰辅酶A(PCC)(PCCA和/或PCCB亚基)，葡萄糖-6-磷酸转运体(G6PT)蛋白或葡萄糖-6-磷酸酶(G6Pase)，LDL受体(LDLR)，ApoB，LDLRAP-1，PCSK9，线粒体蛋白质，如NAGS(N-乙酰谷氨酸合成酶)，CPS1(氨基甲酰磷酸合成酶I)，和OTC(鸟氨酸转氨甲酰酶)，ASS(精氨基琥珀酸合成酶)，ASL(精氨基琥珀酸酶裂解酶)和/或ARG1(精氨酸酶)，和/或溶质载体家族25(SLC25A13，天冬氨酸/谷氨酸载体)蛋白，UGT1A1或UDP葡糖醛酸基转移酶多肽A1，富马酰乙酰乙酸水解酶(FAH)，丙氨酸-乙醛酸氨基转移酶(AGXT)蛋白，乙醛酸还原酶/羟基丙酮酸还原酶(GRHPR)蛋白，转甲状腺素蛋白基因(TTR)蛋白，ATP7B蛋白，苯丙氨酸羟化酶(PAH)蛋白，脂蛋白裂解酶(LPL)蛋白，工程改造的核酸酶，工程改造的转录因子和/或治疗性单链抗体。

在其他实施方式中，本文所述的工程改造的B细胞包括一种或多种编码一种或多种抗体的转基因，所述抗体是旨在经由细胞表面表达的特定分子靶标靶向免疫细胞的经工程改造的分子。在一些实施方式中，工程改造的B细胞表达设计为靶向内源性B细胞的抗体。这些抗体可以诱导抗体介导的B细胞或涉及减弱免疫应答的其他免疫细胞杀伤(例如，通过ADCC或补体介导的杀伤)。

本文所述的B细胞可以经遗传修饰以产生一种或多种抗体，所述抗体对于产生不需要抗体的B细胞具有特异性。产生不需要抗体的B细胞的非限制性实例包括产生针对ERT中给予的蛋白质(血友病患者中的凝血因子如F8、F9等，和/或溶酶体贮积症中缺乏或不足的蛋白质)的抗体的B细胞。将编码抗体的构建体导入B细胞前体或离体B细胞中，从而当细胞再次导入患者中时，产生抗体的B细胞特异性地靶向这样的细胞(B细胞)，所述细胞产生被工程改造的抗体结合的蛋白质(例如，抗体)。在某些实施方式中，工程改造的抗体对针对外源性供给的治疗性蛋白质(经ERT和/或基因疗法)的抗体具有特异性，从而使针对治疗性蛋白质的抗体被中和。因此，本文所述组合物和方法包括工程改造的B细胞，其产生特异性靶向患者中产生的靶抗体(例如，抗-F9抗体)的抗体。这些组合物和方法的工程改造的B细胞可以成熟B细胞或者以前体细胞(如HSC或淋巴祖细胞)给予对象，所述前体细胞在给予后可以在对象中分化或者可以经体内遗传修饰。在其他实施方式中，从遗传修饰的B细胞的转基因(例如，抗-ERT抗体)产生的蛋白质经分离并给予有此需要的对象，例如，需要针对其体内产生的抗-ERT抗体的抗体的患者。

在其他实施方式中，转基因可以是对B细胞具有特异性的抗体，所述B细胞对涉及自身免疫疾病的蛋白质敏感。术语“自身免疫疾病”指其中对象具有针对其自身组织的破坏性免疫应答的任何疾病或病症。自身免疫疾病可以影响几乎对象(例如，人)中的各个器官***，包括但不限于神经、胃肠和内分泌***的疾病，以及皮肤和其他***、眼睛、血液和血管的疾病。自身免疫疾病的实例包括但不限于，桥本氏甲状腺炎(Hashimoto'sthyroiditis)，***性红斑狼疮，干燥综合症，格雷夫斯氏病(Graves'disease)，硬皮病(Scleroderma)，类风湿性关节炎(Rheumatoid arthritis)，多发性硬化(Multiplesclerosis)，重症肌无力和糖尿病。因此，本文所述的B细胞可以包含针对对象中B细胞群的分子(例如，工程改造的抗体)，所述B细胞群对涉及自身免疫疾病的自身抗原敏感(并产生针对其的抗体)，所述自身抗原包括但不限于，髓磷脂碱性蛋白(MBP)，胰岛素，ANA，关节或肌肉蛋白，甲状腺蛋白等。

在某些实施方式中，转基因可以包含标志物基因(上述)，从而允许选择已经经历靶向整合的细胞，以及编码其他功能的连接序列。标志物基因的非限制实例包括GFP，药物选择标志物等。

本文所述的构建体还可以用于递送非编码转基因。编码反义RNA、RNAi、shRNA和微小RNA(miRNA)的序列也可以用于靶向***。

在某些实施方式中，转基因包括长度大于1kb的序列(例如，编码序列，也称之为转基因)，例如，2-200kb，2-10kb(或其间任意值)。转基因还可包括一个或多个核酸酶靶位点。转基因还可包括一个或多个同源臂。同源臂包含这样的序列，所述序列对于侧接核酸酶切割靶位点的序列具有高度同源性。同源臂可以包括50、100、200、500、1000、2000或更多个核苷酸或其间任意值。

当被整合(例如，核酸酶介导的整合)时，转基因可以***内源性基因，从而使所有、一些或没有内源性基因表达。

核酸酶

如上文所述，表达盒可以附加型保持或者可以整合到细胞的基因组中。整合可以是随机的。在某些实施方式中，转基因构建体的整合靶向特定基因，然后通过一种或多种核酸酶(例如，锌指核酸酶(“ZFN”)、TALEN、TtAgo、CRISPR/Cas核酸酶***和寻靶内切核酸酶)切割，并通过同源定向修复(HDR)或通过非同源末端连接(NHEJ)驱动的过程期间的末端捕获整合构建体。。参见例如，美国专利号9,394,545；9,150,847；9,206,404；9,045,763；9,005,973；8,956,828；8,936,936；8,945,868；8,871,905；8,586,526；8,563,314；8,329,986；8,399,218；6,534,261；6,599,692；6,503,717；6,689,558；7,067,317；7,262,054；7,888,121；7,972,854；7,914,796；7,951,925；8,110,379；8,409,861；美国专利公开号20030232410；20050208489；20050026157；20050064474；20060063231；20080159996；20100218264；20120017290；20110265198；20130137104；20130122591；20130177983和20130177960和20150056705，其公开通过引用其全部内容纳入本文用于所有目的。

转基因表达构建体的靶向整合可以使用任何核酸酶。

在某些实施方式中，核酸酶包含锌指核酸酶(ZFN)，其包含锌指DNA结合结构域和切割(核酸酶)结构域。参见例如，美国专利号9,255,250；9,200,266；9,045,763；9,005,973；9,150,847；8,956,828；8,945,868；8,703,489；8,586,526；6,534,261；6,599,692；6,503,717；6,689,558；7,067,317；7,262,054；7,888,121；7,972,854；7,914,796；7,951,925；8,110,379；8,409,861。

在其他实施方式中，核酸酶包含TALEN，其包含TAL-效应物DNA结合结构域和切割(核酸酶)结构域。参见例如，美国专利号8,586,526和美国专利公开号20130196373。

在其他实施方式中，核酸酶包含CRISPR/Cas核酸酶***，其包含单个引导RNA用于识别靶位点和一个或多个切割结构域。参见例如，美国专利公开号20150056705。在一些实施方式中，使用了CRISPR-Cpf1***(参见Fagerlund等,(2015)Genom Bio 16:251)。应当理解的是，术语“CRISPR/Cas”***指CRISPR/Cas和CRISPR/Cfp1***。

核酸酶的切割结构域可以是野生型的或突变的，包括形成专性异二聚体的非自然产生的(工程改造的)切割结构域。参见例如，美国专利号8,623,618；7,888,121；7,914,796；和8,034,598和美国专利公开号20110201055。

核酸酶可以在靶位点中产生一个或多个双链和/或单链切割。在某些实施方式中，核酸酶包括催化灭活的切割结构域(例如，FokI和/或Cas蛋白)。参见例如，美国专利号9,200,266；8,703,489，以及Guillinger等(2014)Nature Biotech.32(6):577-582。催化灭活的切割结构域可以与催化激活的结构组合，作为切口酶以产生单链切割。因此，可以联用两种切口酶以在特定区域产生双链切割。本领域已知其它切口酶，例如，AMcCaffery等(2016)Nucleic Acids Res.44(2):e11.doi:10.1093/nar/gkv878.电子出版于2015年10月19日。

在某些实施方式中，核酸酶切割安全港基因(例如，CCR5，Rosa，白蛋白，AAVS1，TCRA，TCRB等。参见例如，美国专利号7,888,121；7,972,854；7,914,796；7,951,925；8,110,379；8,409,861；8,586,526；美国专利公开号20030232410；20050208489；20050026157；20060063231；20080159996；201000218264；20120017290；20110265198；20130137104；20130122591；20130177983和20130177960。在优选的实施方式中，核酸酶切割内源性白蛋白基因，从而使表达盒整合到肝细胞的内源性白蛋白基因座中。例如，白蛋白特异性核酸酶述于美国专利号9,150,847；和美国专利公开号20130177983和20150056705中。

递送

本文所述构建体(和/或核酸酶)可以通过任何合适的方式体内递送到任何细胞类型中，优选脾脏或次级***。相似地，当与用于靶向整合的核酸酶联用时，核酸酶可以多核苷酸和/或蛋白质形式递送，例如，使用非病毒载体，病毒载体和/或以RNA形式，例如，mRNA。

非病毒递送核酸的方法包括电穿孔、脂质转染、显微注射、基因枪、病毒颗粒、脂质体、免疫脂质体、其他纳米颗粒、聚阳离子或脂质:核酸偶联物、裸DNA、人工病毒粒，和试剂增强型DNA摄取。利用例如Sonitron 2000***(Rich-Mar)的声孔效应也可用于递送核酸。其它示例性的核酸递送***包括Amaxa生物***公司(德国科隆)、迈克赛特公司(Maxcyte,Inc.)(马里兰州罗克韦尔)、BTX分子递送***公司(马萨诸塞州霍利斯顿)和哥白尼治疗公司(Copernicus Therapeutics Inc.)(参见例如US6008336)提供的那些。

在优选的实施方式中，表达构建体是AAV载体。任选的核酸酶可以mRNA形式或使用一种或多种病毒载体(AAV、Ad等)给予。给予可以通过其中多核苷酸被递送至所需靶细胞的任何方式。考虑了体内和离体方法。外周血管中的静脉内注射是一种优选的给予方法。其他体内给予模式包括例如直接注射到包含B细胞的组织，包括***，骨髓，血浆，淋巴***和脾脏。

在涉及递送超过一种多核苷酸(例如，本文所述的构建体和多核苷酸形式的核酸酶)的***中，使用一种或多种相同和/或不同的载体递送两种或多种多核苷酸。例如，多核苷酸形式的核酸酶可以mRNA形式递送，而本文所述的B细胞特异性构建体可以经由其他形态诸如病毒载体(例如，AAV)、小圆环DNA、质粒DNA、线性DNA、脂质体、脂质纳米颗粒、纳米颗粒等递送。

药学上可接受的运载体部分地由所给予的特定组合物以及用于给予组合物的特定方法确定。因此，有多种合适的药物组合物制剂可用，如下所述(参见例如，Remington’sPharmaceutical Sciences(《雷明顿药物科学》)；第17版，1989)。

待给予的表达盒(以及任选的核酸酶和/或经修饰的细胞)的有效量因患者而异。相应地，有效量最好由给予组合物(例如，细胞)的医师确定，并且本领域普通技术人员可以容易地确定适当剂量。在给予之前分析治疗性多肽的血清、血浆或其他组织水平并与初始水平比较可以确定给予的量是否太低，处于正确的范围内或者太高。初始和后续给予的合适方法也是可变的，但是如果需要的话，典型特征是初始给予，然后是后续给予。后续给予可以各种时间间隔给予，从每天到每年到每隔几年。本领域技术人员将理解的是，可以推荐合适的免疫抑制技术以通过免疫抑制递送载体来避免抑制或阻断转导，参见例如，Vilquin等,(1995)Human Gene Ther.,6:1391-1401。

离体和体内给予的制剂包括液体或乳化液体中的悬浮液(例如，遗传修饰的细胞，脂质体，脂质纳米颗粒或纳米颗粒的悬浮液)。活性成分通常与赋形剂混合，后者是药学上可接受的，并与活性成分相容。合适的赋形剂包括例如水、盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等和其组合。另外，组合物可含有少量辅助物质，如湿润或乳化剂，pH缓冲剂，稳定剂或增强药物组合物效力的其他试剂。

应用

本文所公开的方法和组合物用于通过提供表达疾病中缺乏或不足的产物的转基因提供对于任何疾病的疗法，或以其他方式治疗或预防疾病。细胞可以经体内修饰或者可以经离体修饰，并且后续给予对象。因此，方法和组合物提供了这类遗传疾病的治疗和/或预防。此外，本文所公开的方法和组合物允许修饰B细胞，从而使这些细胞展现出修饰的毒性，抗体产生和/或处理特征。

下述实施例包括本公开的示例性实施方式，其中任选使用的核酸酶包括锌指核酸酶(ZFN)。将理解的是，这是仅是出于示例的目的并且可以使用其他核酸酶，例如，TALEN，CRISPR/Cas***，具有工程改造的DNA结合结构域的寻靶核酸内切酶(大范围核酸酶)和/或自然产生的工程改造的寻靶核酸内切酶(大范围核酸酶)DNA结合结构域和异源性切割结构域的融合体和/或大范围核酸酶和TALE蛋白的融合体。此外，将理解的是本文所述表达构建体可以携载于其他载体(除了AAV以外)上，以在治疗和预防由蛋白产生不足所导致的疾病中产生相同结果。

实施例

实施例1：方法

细胞培养

冷冻人外周血CD19+B细胞购自干细胞技术公司(STEMCELL Technologies)(加拿大温哥华)。之前已经描述了体外B细胞分化培养***(参见图1)(Jourdan等,同上)。所有培养在伊氏改良型达氏培养基(Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium)(康宁公司(Corning)，纽约州康宁)和10％胎牛血清(VWR，宾夕法尼亚州德纳)中进行。

在24孔板中以2.0E+5细胞/孔的密度在0.5mL的培养基中培养细胞。将细胞解冻并在包含抗-His Ab(5μg/mL)、ODN(10μg/mL)、sCD40L(50ng/mL)、IL-2(10ng/mL)、IL-10(50ng/mL)和IL-15(10ng/mL)的B细胞激活培养基中培养4天。在培养的第4天时，收获细胞，收集上清液，用DPBS洗涤细胞并转移至包含IL-2(10ng/mL)、IL-6(40-50ng/mL)、IL-10(50ng/mL)和IL-15(10ng/mL)的浆母细胞(Plasma Blast)(PB)生成培养基。在培养的第7天时，收获细胞，收集上清液，用DPBS洗涤细胞并转移至包含IL-6(40-50ng/mL)、IL-15(10ng/mL)、IFN-α(500U/mL)的浆细胞(PC)生成培养基。在培养的第10天，收获细胞并收集上清液。

B细胞基因修饰

ZFN试剂：

ZFN旨在靶向TCRA(TRAC，SBS53909和SBS53885，参见美国专利公开号US-2017-0211075-A1)、CCR5(SBS8266和SBS8196，参见美国专利号7,925,921)和AAVS1(SBS30035和SBS30054，参见美国专利号8,110,379)。将CCR5和AAVS1 ZFN编码序列克隆到质粒pGEM4Z的修饰形式(普罗麦格公司(Promega)，威斯康星州麦迪逊)，其包含***基因序列3'的64个腺嘌呤序列(Boczkowski等(2000)Canc Res 60:1028-1034)，将其通过SpeI消化线性化以产生mRNA合成的模板。使用Accuprime PFX DNA聚合酶试剂盒(英杰公司(Invitrogen)，加利福尼亚州卡尔斯巴德)经由PCR扩增ZFN编码序列由线性DNA模板(各ZFN一个)产生TRAC ZFNmRNA。PCR产物被用作mRNA合成的模板。使用mMESSAGE mMACHINE T7 ULTRA试剂盒(生命技术公司(Life Technologies)，加利福尼亚州卡尔斯巴德)按照制造商的方案制备mRNA。

简言之，将1.0μg编码ZFN的DNA用作mRNA合成的模板，在37℃下提供的缓冲液中孵育2小时，然后进行试剂盒提供的DNA酶消化。并未进行体外聚-A加尾反应(tailingreaction)，因为聚-A尾在PCR生成TRAC模板时被纳入了DNA模板。AAVS1和CCR5模板包含载体中的聚-T模板。然后使用RNeasy迷你试剂盒(凯杰公司(Qiagen)，加利福尼亚州卡尔斯巴德)按照制造商的方案纯化mRNA，并在Nanodrop 8000(赛默飞世尔科技公司(ThermoScientific),马萨诸塞州沃瑟姆市)上定量。用于mRNA模板的引物是正向引物：5’GCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAG(SEQ ID NO:1)和反向引物：5’TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTGGCAACTAGAAGGCACAG(SEQ ID NO:2)。

AAV载体

所有AAV载体在圣加蒙医药公司(Sangamo Therapeutics)生产，如下所述。AAVS1、CCR5和TRAC的AAV供体模板包含对其靶基因座的同源臂。AAVS1具有分别为801和568个碱基对长度的左和右同源臂。CCR5具有分别为473和1431个碱基对长度的左和右同源臂。TRAC具有分别为925和989个碱基对长度的左和右同源臂。将包含启动子、GFP序列和人生长激素聚腺苷酸化信号(hGHpA)的GFP表达盒克隆到右同源臂和左同源臂之间。启动子是磷酸甘油酸激酶(PGK)或B细胞特异性(EEK)启动子。B细胞特异性(EEK)启动子包含人κ轻链启动子上游的3’-增强子、MAR和内含增强子(Luo等(2009)Blood 113:1422-1431)。将TRAC供体模板克隆到pAAV载体中。将AAVS1和CCR5供体模板克隆到源自pAAV-MCS的定制质粒pRS165中(Lombardo等(2011)Nat Methods 8:861-869；Wang等(2012)Genome Res 22:1316-1326)(安捷伦科技公司(Agilent Technologies)，加利福尼亚州圣克拉拉)。将AAV2反向末端重复(ITR)用于使用三重转染方法使包装成为AAV载体(Xiao和Samulski(1998)J.Virol 72:2224-2232)。简言之，将HEK 293细胞接种于10层的CellSTACK腔室(康宁公司，马萨诸塞州阿克顿(Acton))，生长3天至80％的密度，然后使用磷酸钙方法使用AAV辅助质粒、腺病毒辅组质粒和包含ITR的供体载体质粒转染，所述AAV辅助质粒表达AAV2 Rep和血清型特异性Cap基因。3天后，通过3轮冷冻/解冻裂解细胞，并通过离心去除细胞碎片。使用聚乙二醇由裂解物沉淀AAV，并通过在氯化铯梯度上超离心过夜纯化。载体通过透析配制并过滤灭菌。

IgM、IgG、IgAELISA：

在B细胞激活、浆母细胞生成和浆细胞生成培养步骤结束时收集上清液。使用市售酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒(拜森实验室公司(Bethyl Laboratories)；德克萨斯州蒙哥马利)根据制造商的方面测试IgM、IgG、IgA。简言之，向平板内添加上清液，室温下振荡孵育1小时，然后用试剂盒中提供的缓冲液洗涤4次。添加试剂盒中提供的检测抗体并在室温下孵育1小时，然后用试剂盒中提供的洗涤缓冲液洗涤4次。添加试剂盒中提供的辣根过氧化物酶(HRP)并在室温下孵育30分钟，然后用试剂盒中提供的缓冲液洗涤4次。添加试剂盒中提供的四甲基联苯胺(TMB)并允许其显色30分钟。用试剂盒提供的终止溶液使反应终止，并使用酶标仪在450nM处读取吸光度。

实施例2：体外培养的B细胞中的抗体产生

将CD19+B细胞如上所述和图1所示解冻和培养。在第t4、t7和t10天收集培养上清液，并通过ELISA检测总IgM、IgG和IgA，如上所述。

结果(图2A-2C)证明细胞响应抗体产生的细胞因子刺激并产生所预期的抗体。

实施例3：mRNA电穿孔

用编码转基因(GFP)的mRNA处理培养的B细胞以确定导入mRNA的最佳时间范围。用2μg GFP mRNA在第t0、t1、t2或t3天电穿孔CD19+B细胞(2.0E+05个细胞)，其中t0是解冻细胞的那天(图1)。通过FAC分析对电穿孔的细胞进行分析，其中如图4所示进行门选。结果(图3A-3D)证明在第t2天的电穿孔导致最高的GFP表达，所以选择该时间范围用于后续研究。

实施例4：核酸酶切割培养的B细胞

将对于3个基因座AAVS1、CCR5和TCRA具有特异性的ZFN用于切割其在培养的B细胞中的靶标。将CD19+B细胞解冻，并在B细胞激活培养基中培养2天。用DPBS洗涤细胞2次，然后重悬于BTXpress高性能电穿孔溶液(哈佛仪器公司(Harvard Apparatus)，马萨诸塞州霍利斯顿)至2.0E+6细胞/mL的最终浓度。细胞(100μL)和电穿孔溶液与ZFN mRNA(4μg)混合，然后在MOS96多孔电穿孔平板2mm(哈佛仪器公司)中的BTX ECM830方波电穿孔器(哈佛仪器公司)中电穿孔。电穿孔后，将细胞转移到24孔板中的B细胞激活培养基中2天。2天后，收获细胞，收集上清液并用DPBS洗涤细胞，然后转移至浆母细胞生成培养基。3天后，收获细胞，收集上清液并用DPBS洗涤细胞，然后转移至浆细胞生成培养基。收集细胞用于第t4、t7和t10天的基因组DNA(gDNA)分离，以通过深度测序进行ZFN活性分析。简言之，CD19+B细胞(2.0E+5个细胞)与ZFN mRNA(4μg)混合，然后电穿孔。

为了测量在TCRA(TRAC)、CCR5和AAVS1基因座处的ZFN活性，通过QIAamp DNA迷你试剂盒(凯杰公司，加利福尼亚州卡尔斯巴德)按照制造商的说明分离DNA。使用了100纳克的基因组DNA(gDNA)。使用热启动柔性聚合酶(Hot Start Flex Polymerase)(新英格兰生物实验室公司(New England Biolabs)，马萨诸塞州伊普斯威奇)进行针对AAVS1和TRAC基因座的两步PCR。三步PCR用于CCR5基因座。亿明达(Illumina)深度测序测量各基因座处的***缺失。如下示出用于各基因座的引物：

AAVS1引物：

AAVS1正向：

GACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNCCGGTTAATGTGGCTCTGGT(SEQ ID NO:3)

AAVS1反向：

ACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNGACTAGGAAGGAGGAGGCCT(SEQ ID NO:4)。

AAVS1扩增子为：

5’NNNNGACTAGGAAGGAGGAGGCCTAAGGATGGGGCTTTTCTGTCACCAATCCTGTCCCTAGTGGCCCCACTGTGGGGTGGAGGGGACAGATAAAAGTACCCAGAACCAGAGCCACATTAACCGGNNNN(SEQ ID NO:5)。

CCR5引物：

CCR5正向1：CTGTGCTTCAAGGTCCTTGTCTGC(SEQ ID NO:6)，

CCR5反向1：CTCTGTCTCCTTCTACAGCCAAGC(SEQ ID NO:7)，

CCR5正向2：CTGCCTCATAAGGTTGCCCTAAG(SEQ ID NO:8)，

CCR5反向2：

CCAGCAATAGATGATCCAACTCAAATTCC(SEQ ID NO:9)，

CCR5正向3：

ACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNGCCAGGTTGAGCAGGTAGATG(SEQ ID NO:10)，

CCR5反向3：

AGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCTCTACTCACTGGTGTTCATCTTT(SEQ ID NO:11)。

CCR5扩增子为：

5’NNNNNGCCAGGTTGAGCAGGTAGATGTCAGTCATGCTCTTCAGCCTTTTGCAGTTTATCAGGATGAGGATGACCAGCATGTTGCCCACAAAACCAAAGATGAACACCAGTGAGTAGAGC(SEQ ID NO:12)。

TCRA(TRAC)引物：

TCRA正向：

5’ACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNCCTCTTGGTTTTACAGATACGAAC(SEQ ID NO:13)

TCRA反向：

5’GACGTGTGCTCTTCCGATCTCTCACCTCAGCTGGACCAC(SEQ ID NO:14)

TCRA扩增子为：

5’NNNNCCTCTTGGTTTTACAGATACGAACCTAAACTTTCAAAACCTGTCAGTGATTGGGTTCCGAATCCTCCTCCTGAAAGTGGCCGGGTTTAATCTGCTCATGACGCTGCGGCTGTGGTCCAGCTGAGGTGAG(SEQ IDNO:15)。

这些研究的结果在图5A-5C中显示并且使用这些方法证明了核酸酶在培养的B细胞中具有活性，并且在多个基因座处实现了大于80％的修饰。

这些实验还完成了瞬时(过夜)冷激(参见美国专利号8,772,008)对核酸酶切割活性影响的测试。在这些研究中，使用的输入mRNA量的范围是0.75-6μg。电穿孔后，将培养物分开并将一部分置于37℃孵育器4天。第二组置于30℃过夜，然后转移到37℃孵育器3天。进行深度测序以测量％***缺失，作为核酸酶切割结果检测。

结果(如图6A-6C所示)证明冷激过程增加了总体切割活性。

实施例5：B细胞AAV血清型转导比较

将包含转基因(GFP)表达盒的AAV病毒用于比较不同AAV血清型转导培养的B细胞的能力。简言之，将细胞解冻并在24孔板中的B细胞激活培养基中以2.0E+5细胞/孔的密度培养2天。收集细胞，计数，然后以2.0E+5细胞/孔的密度接种于24孔板中。用AAV血清型2、5、6、8和9以2.4E+6、1.2E+6、6.0E+5、3.0E+5载体基因组(vg)/细胞的密度转导B细胞。AAV载体基因组包含CMV启动子驱动的eGFP表达盒和反向末端重复(ITR)，参见图7B。AAV载体在圣加蒙医药公司生产。收集细胞培养物(来自24孔板单个孔中500μL的25μL)并在第t4、t7和t10天与DPBS(175μL)混合用于使用Guava EasyCyte5HT(EMD密理博公司(EMD Millipore)，美国萨诸塞州比尔里卡)分析GFP表达。使用InCyte型号2.5(EMD密理博公司)分析数据。

结果(图7A)证明在向浆母细胞和浆细胞的分化过程期间，AAV6在转导培养的B细胞时是最高效的AAV血清型。

实施例6：核酸酶驱动的靶向整合

然后，将上述核酸酶与转基因供体(GFP，对象中缺乏或不足的蛋白质和/或感兴趣的治疗性抗体)联用以测试***支持靶向整合供体到基因组中的能力。用GFP制备了多个示例性的供体(图8)，包括侧接同源臂的GFP转基因，其中该臂对围绕AAVS1、CCR5或TCRA切割位点的区域具有同源性。此外，测试了两种不同的启动子，PGK或EEK。

将CD19+B细胞解冻，并在B细胞激活培养基中培养2天。使用了靶向相同基因座(AAVS1、TCRA、CCR5、白蛋白、HPRT等)的ZFN mRNA和AAV供体或mRNA供体的组合。用DPBS洗涤细胞2次，然后重悬于BTXpress高性能电穿孔溶液(哈佛仪器公司，马萨诸塞州霍利斯顿)至2.0E+6细胞/mL的最终浓度。细胞(100μL)和电穿孔溶液与ZFN mRNA(4μg)混合，然后在MOS96多孔电穿孔平板2mm(哈佛仪器公司)中的BTX ECM830方波电穿孔器(哈佛仪器公司)中电穿孔。电穿孔后，将细胞转移到24孔板中0.5mL的B细胞激活培养基中。然后以2.4x 10⁶vg/细胞添加AAV，所述AAV包含针对靶基因座的同源供体模板。轻柔振荡平板2分钟。2天后，收获细胞培养物，收集25μL的细胞培养物，与DPBS(175μL)混合用于流式细胞术分析，剩余的细胞培养物在台式离心机中离心，收集上清液，并用DPBS洗涤细胞，然后转移到浆母细胞生成培养基。3天后，收获细胞培养物，收集25μL的细胞培养物，与DPBS(175μL)混合用于流式细胞术分析，剩余的细胞培养物在台式离心机中离心，收集上清液，并用DPBS洗涤细胞，然后转移到浆细胞生成培养基。3天后，实验结束，收集细胞培养物(来自24孔板单个孔中500μL的25μL)并与PBS(175μL)混合用于流式细胞术分析，剩余的细胞培养物在台式离心机中离心，收集上清液，用DPBS洗涤细胞并收获gDNA。

对于流式细胞术，在给予mRNA和AAV供体后第2、5和8天收集细胞培养物(来自24孔板单个孔中500μL的25μL)并与PBS(175μL)混合。使用Guava EasyCyte 5HT(MD密理博公司，美国萨诸塞州比尔里卡)分析GFP表达。使用InCyte型号2.5(EMD密理博公司)分析数据。结果(图9A-9C)证明在所有情况中存在GFP转基因的整合，并且特异性核酸酶的使用导致最高百分比的GFP阳性细胞。

为了测量CCR5和AAVS1供体的靶向整合，通过QIAamp DNA迷你试剂盒(凯杰公司，加利福尼亚州卡尔斯巴德)按照制造商的说明分离DNA。使用了100纳克的gDNA，然后使用热启动柔性聚合酶(新英格兰生物实验室公司，马萨诸塞州伊普斯威奇)和热启动Taq主混合物试剂盒(HotStartTaq Master Mix Kit)(凯杰公司，加利福尼亚州卡尔斯巴德)进行三步PCR.亿明达(Illumina)深度测序测量各基因座处的靶向整合。如下示出各步骤的引物：

AASV1引物：

第1步PCR引物：

AAVS1正向1；5’CGGAACTCTGCCCTCTAACG(SEQ ID NO:16)。

AAVS1反向1:5’GTGTGTCACCAGATAAGGAATCTG(SEQ ID NO:17)。

第2步PCR引物：

AAVS1正向2：5’CGTCTCTCTCCTGAGTCCG(SEQ ID NO:18)。

AAVS1反向2：5’GTGTGTCACCAGATAAGGAATCTG(SEQ ID NO:17)。

第3步PCR引物：

AAVS1正向3：

5’CTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNCTCTGGTTCTGGGTACTTTTATCTG(SEQ IDNO:19)。

AAVS1反向3：

5’AGACGTGTGCTCTTCCGATCTGTGTGTCACCAGATAAGGAATCTG(SEQ ID NO:20)。

AAVS1野生型扩增子序列：

5’NNNNCTCTGGTTCTGGGTACTTTTATCTGTCCCCTCCACCCCACAGTGGGGCCACTAGGGACAGGATTGGTGACAGAAAAGCCCCATCCTTAGGCCTCCTCCTTCCTAGTCTCCTGATATTGGGTCTAACCCCCACCTCCTGTTAGGCAGATTCCTTATCTGGTGACACAC(SEQ ID NO:21)。

AAVS1 GFP-TI序列(SEQ ID NO:22)：

5’NNNNCTCTGGTTCTGGGTACTTTTATCTGTCCCCTCCACCCCACAGTGGGGCAAGCTTCGAGCCATCAGGGCCTGGTTCTTTCCGCCTCAGAAGGCCTTTTGCAGTTTATCAGGATGAGGATGACCAGCATGTTGCCCACAAAACCAAAGATGAACACCAGATTCCTTATCTGGTGACACAC

CCR5引物

第1步PCR引物：

CCR5正向1：5’GCTCTACTCACTGGTGTTCATCTTT(SEQ ID NO:12)。

CCR5反向1：5’CTCTGTCTCCTTCTACAGCCAAGC(SEQ ID NO:7)。

第2步PCR引物：

CCR5正向2：5’GCTCTACTCACTGGTGTTCATCTTT(SEQ ID NO:12)。

CCR5反向2：5’CCAGCAATAGATGATCCAACTCAAATTCC(SEQ ID NO:9)。

第3步PCR引物：

CCR5正向3：

5’ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTNNNNNGCCAGGTTGAGCAGGTAGATG(SEQ IDNO:23)。

CCR5反向3：

5’AGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCTCTACTCACTGGTGTTCATCTTT(SEQ ID NO:11)。

CCR5扩增子野生型序列：

5’NNNNNGCCAGGTTGAGCAGGTAGATGTCAGTCATGCTCTTCAGCCTTTTGCAGTTTATCAGGATGAGGATGACCAGCATGTTGCCCACAAAACCAAAGATGAACACCAGTGAGTAGAGC(SEQ ID NO:12)

CCR5 TI-GFP序列：

5’NNNNNGCCAGGTTGAGCAGGTAGATGTCAGTCATGCTCTTCAGCCTTTTGCAGTTTCTCGAGCCATCAGGGCCTGGTTCTTTCCGCCTCAGAAGTAGAAAGATGAACACCAGTGAGTAGAGC(SEQ ID NO:24)

结果(如图10A和10B)证明了这些基因座38％-50％的靶向整合。

还使用非匹配的转基因供体进行实验。这些非匹配的供体中的同源臂与这样的序列不具有同源性，所述序列侧接共导入的核酸酶的核酸酶靶位点。例如，TCRA(TRAC)特异性ZFN与包含CCR5同源臂的GFP转基因供体联用。该供体还与AAVS1特异性ZFN联用。匹配的ZFN靶位点和供体同源臂的整合增强将表明，至少部分表明，转基因整合依赖于同源性依赖性重组反应。结果(图11)证明当供体侧接这样的同源臂时出现供体整合的增强，所述同源臂匹配核酸酶切割位点周围区域，并且因此表明培养的B细胞主要依赖于同源重组实现靶向整合。对于非匹配的供体，整合处于低水平，这表明使用NHEJ通过末端捕获也可能发生整合。

还比较了使用包含两种替代性启动子的供体构建体转导的细胞。GFP表达通过如上所述的流式细胞术分析(参见图12)，并且结果证明EEK启动子在B细胞中驱动的GFP表达比PGK启动子高。

使用恒定剂量的ZFN mRNA进行比较各种量的AAV供体构建体的滴定。用4μ的TCRA(TRAC)特异性ZFN通过电穿孔处理培养的B细胞，然后用3.0E+05至2.4E+06vg/细胞范围的供体AAV转导。此外，还在这些条件下比较了两种启动子。结果(图13A-13D)证明在较低供体浓度下，在B细胞向浆母细胞和浆细胞发展期间，EEK启动子在超过8倍稀释时保持GFP表达。这些实验还证实使用核酸酶驱动靶向整合导致B细胞中较高的GFP表达。

实施例7：基因组编辑期间的抗体表达

对于经电穿孔递送ZFN对以及GFP供体的培养的B细胞，通过如上所述的ELISA分析IgG和IgM水平。结果(图14和15)证明B细胞产生的抗体水平并不受到电穿孔或电穿孔和后续AAV供体转导的高度影响。

实施例8：培养的B细胞中AAV潜在的增强剂功能

在表达抗-AAV抗体的培养的B细胞中，将B细胞再次暴露于B细胞对其具有反应性的AAV血清型可能会引起“增强剂”作用并且诱导抗-AAV抗体产生的增加。来自一个人供体的一个CD19+B细胞群证明了AAV2处理后IgM分泌增加。由于AAV2的普遍存在，已知抗-AAV2抗体在人群中具有强烈的流行性。因此，在该研究中，显示了来自一个人供体潜在表达抗-AAV2抗体的CD19+B细胞群，以在暴露于AAV2后诱导IgM产生的峰值，而不是其他AAV血清型(图16)。

抗体表达峰值潜在的机制示于图17，并且显示了该***用于表达感兴趣的转基因的用途。

实施例9：AAV2体内暴露后转基因表达的增强

构建转基因供体盒用于将转基因***B细胞启动子的下游。用特异性核酸酶，和包含与感兴趣的转基因连接的抗体特异性启动子的供体构建体离体处理B细胞。选择用于该工作的B细胞之前被验证产生抗-AAV2抗体。将细胞再次导入对象，并在一段很短的移植时间后，用AAV2或AAV2肽处理对象。AAV增强上调抗体启动子，导致转基因表达的峰值。

实施例10：通过靶向整合B细胞特异性抗体的B细胞修饰

构建转基因供体盒(AAV、mRNA、质粒等)用于***编码抗体的转基因，其中一种或多种抗体对B细胞具有特异性，所述B细胞产生针对由ERT递送的蛋白质(或自身抗原)而言不需要的抗体(例如，抑制剂)，例如，产生针对凝血因子如F9的抗体(抗-F9抗体)的B细胞。供体盒可以包括核酸酶靶基因座(例如，白蛋白、TCRA、CCR5、AAVS1等)的同源臂，并且向有此需要的对象(具有抗-F9抗体的血友病患者)联合合适的核酸酶体内给予和/或离体给予B细胞群(成熟细胞群、干细胞群和/或B细胞祖细胞群)。

离体或体内修饰后，产生抗体的B细胞分泌靶蛋白，其结合产生不需要抗体的B细胞。然后，这些靶抗体通过动员或激活抗体依赖性细胞毒性细胞或通过补体介导的裂解来介导裂解。因此，在患者中，这些导入的B细胞导致产生不需要抗体(例如，针对ERT递送的蛋白质或自身抗原的抗体)的内源性B细胞减少。

本文中提及的所有专利、专利申请和出版物均以参考的方式用全文纳入本文。

尽管出于理解清楚的目的，本发明通过说明和示例的方式提供了一些细节，但本领域技术人员可理解在不偏离本发明的精神或范围的情况下可实施各种改变和改进。因此，上述说明和实施例不应理解为是限制性的。

Claims (18)

1.一种遗传修饰的B细胞，其包括一种或多种修饰，其包括：

(a)一种或多种转基因，和/或

(b)***和/或缺失，其修饰(i)B细胞受体基因，和/或(ii)生发中心中的细胞相互作用，和/或

(c)修饰，所述修饰抑制与病原体感染或癌症调节相关的任何B细胞功能阻抑。

2.如权利要求1所述的遗传修饰的B细胞，其中，所述转基因中的一种或多种被整合到所述B细胞的内源性基因座中。

3.如权利要求1或2所述的遗传修饰的B细胞，其中，所述转基因编码患有血友病、溶酶体贮积症的患者中缺乏或不足的蛋白质，治疗性抗体和/或当与治疗性蛋白质融合时促进穿过血脑屏障的肽。

4.如权利要求3所述的遗传修饰的B细胞，其中，所述治疗性抗体对生成抑制性抗体或在自身免疫疾病中起作用的B细胞具有特异性，所述抑制性抗体针对酶替代疗法(ERT)提供的蛋白质。

5.如权利要求3所述的遗传修饰的B细胞，其中，所述治疗性抗体对能够减弱抗肿瘤应答的调节性B细胞(Breg)具有特异性。

6.如权利要求4所述的遗传修饰的B细胞，其中，由ERT提供的蛋白质是凝血因子。

7.如权利要求6所述的遗传修饰的B细胞，其中，所述凝血因子是因子IX(F9)。

8.如权利要求1-7中任一项所述的遗传修饰的B细胞，其中，所述转基因还包含驱动所述转基因表达的启动子。

9.如权利要求8所述的遗传修饰的B细胞，其中，所述启动子是谱系特异性B细胞启动子。

10.如权利要求1-9中任一项所述的遗传修饰的B细胞，其中，所述转基因在所述细胞中表达。

11.如权利要求10所述的遗传修饰的B细胞，其中，所述转基因被整合到选自下述的安全港基因座中：AAVS1、TCRA、CCR5或白蛋白。

12.如权利要求1-11中任一项所述的遗传修饰的B细胞，其源自遗传修饰的造血干细胞。

13.一种在有此需要的对象中产生蛋白质的方法，所述方法包括给予所述对象权利要求1-12中任一项所述的B细胞群。

14.如权利要求13所述的方法，其中，所述蛋白质调控所述对象中的抗体应答。

15.权利要求1-12中任一项所述的遗传修饰的B细胞在对象中产生蛋白质的方法中的用途，所述方法包括：在使所述B细胞在所述对象中产生所述蛋白质的条件下向所述对象导入所述B细胞或其前体细胞。

16.如权利要15所述的用途，其中，所述蛋白质是疾病或病症诸如血友病或溶酶体贮积症或自身免疫疾病中缺乏或不足的蛋白质或对产生针对ERT中提供的治疗性蛋白质的抗体的B细胞具有特异性的抗体。

17.如权利要求16所述的用途，其中，所述ERT中提供的治疗性蛋白质是凝血因子如因子IX(F9)，并且所述抗体对产生抗-凝血因子(抗-F9)抗体的B细胞具有特异性。

18.一种包括一种或多种权利要求1-12中任一项所述的B细胞的试剂盒。