CN110527737A - 一种转基因油菜及其产品转化体鉴定阳性质粒分子pYCID-1905及应用 - Google Patents
一种转基因油菜及其产品转化体鉴定阳性质粒分子pYCID-1905及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110527737A CN110527737A CN201910775552.2A CN201910775552A CN110527737A CN 110527737 A CN110527737 A CN 110527737A CN 201910775552 A CN201910775552 A CN 201910775552A CN 110527737 A CN110527737 A CN 110527737A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seq
- transformant
- rape
- probe
- primer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 title claims abstract description 82
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 title claims abstract description 77
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 67
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims abstract description 24
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 100
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 60
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 26
- WKBPZYKAUNRMKP-UHFFFAOYSA-N 1-[2-(2,4-dichlorophenyl)pentyl]1,2,4-triazole Chemical compound C=1C=C(Cl)C=C(Cl)C=1C(CCC)CN1C=NC=N1 WKBPZYKAUNRMKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 25
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 17
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims description 14
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 13
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 11
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 11
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 8
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 5
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 claims description 5
- 239000013068 control sample Substances 0.000 claims description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 claims description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 2
- 239000003513 alkali Substances 0.000 claims 1
- 239000002585 base Substances 0.000 claims 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 abstract description 12
- 239000013062 quality control Sample Substances 0.000 abstract description 11
- 238000013461 design Methods 0.000 abstract description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 111
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 11
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 11
- 235000003869 genetically modified organism Nutrition 0.000 description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 9
- 230000008676 import Effects 0.000 description 9
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 4
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 4
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 4
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 244000037671 genetically modified crops Species 0.000 description 3
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- 244000188595 Brassica sinapistrum Species 0.000 description 2
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 2
- 101100380241 Caenorhabditis elegans arx-2 gene Proteins 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000010222 PCR analysis Methods 0.000 description 2
- 235000019779 Rapeseed Meal Nutrition 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 101150092805 actc1 gene Proteins 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 238000013475 authorization Methods 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 2
- 239000008157 edible vegetable oil Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000007859 qualitative PCR Methods 0.000 description 2
- 239000004456 rapeseed meal Substances 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 101150044453 Y gene Proteins 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000036651 mood Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 239000013558 reference substance Substances 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Botany (AREA)
- Mycology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种转基因油菜及其产品转化体鉴定阳性质粒分子pYCID‑1905的设计及其应用，涉及转基因安全领域中转基因油菜的***和转化体鉴定技术。pYCID‑1905的碱基序列如SEQ ID NO.1所示。利用pYCID‑1905作为阳性对照和质控样品，能对油菜及其产品进行转化体的普通PCR和实时荧光PCR鉴定检测，对我国批准和将批准转基因油菜品种的覆盖率为100％；本发明解决了转基因油菜转化体鉴定检测中缺乏阳性对照或标准品的技术难题，避免了品系鉴定检测中针对每个检测靶标设置阳性对照的问题，降低了制备每个油菜转化体阳性对照的人力成本和经济成本。
Description
技术领域
本发明涉及转基因安全领域中转基因油菜的***和转化体鉴定技术，尤其涉及一种阳性质粒分子pYCID-1905的设计及其应用。
背景技术
近20多年来，全球转基因生物研发及商业化迅猛发展，1992年以来，全球批准了4133项转基因产品的监管审批，涉及26个转基因作物的476个转化体，种植面积累计超过23亿公顷，产生了巨大的经济效益。与此同时，转基因生物的安全性问题一直备受社会各界关注，为此，包括中国、欧盟、美国、日本和韩国等在内50多个国家和地区纷纷颁布实施转基因生物安全管理法律法规，以规范转基因生物的研发和产业化应用。
在转基因生物***工作中，一方面要监管已批准进口或商业化转基因产品的种植及应用情况，另一方面要监管非授权转基因产品的非法种植或应用情况。非授权转基因产品是指未经批准而释放到市场上的转基因产品，包括在别的国家批准而在我国并未获批的转基因材料、田间非法种植的仅批准进口用作加工原料的转基因材料，以及尚处于试验阶段的转基因材料。转基因油菜是四大转基因作物之一，是食用油和饲料菜粕的重要来源，已在加拿大、美国、澳大利亚等国进行大规模商业化种植。为了满足食用油和菜粕供应，我国每年需从国外进口油菜籽，在2015年进口量超过500万吨，其中90％以上为转基因菜籽。我国也是油菜种植大国，转基因研究活跃，不断有品种进入田间试验阶段。由于转基因产品存在潜在的环境和食用安全风险，一旦发生非授权转基因油菜的非法扩散事件，将扰乱正常贸易秩序，在消费者中引发恐慌情绪，对国民经济、生活产生一系列的恶劣影响。国际上关于非授权转基因作物的报道屡见不鲜，我国急需建立针对非授权转基因油菜的检测监管技术体系。
对转基因油菜进行筛查检测是对非授权转基因油菜进行监管检测的第一步鉴定出含有转基因成分的样品后，再进一步进行转化体特异性检测；经过转化体特异性检测，如果样品中含有的转基因成分不是源于已授权转化体，证明样品中含有非授权转基因成分，要立即启动转基因***的应急预案，防止发生安全风险。经过十余年的转基因检测技术体系建设，我国针对已批转的和在申请安全证书的转基因油菜建立了完善的转化体特异性检测技术标准体系，发布了一系列的标准，包括国家标准、农业部公告、进出口检验检疫标准等，另外欧盟也发布了相应的标准。但受原材料供应等方面的限制，油菜转化体标准物质或标准样品的研制严重落后于检测方法的开发，导致在转基因油菜转化体鉴定检测过程中经常面临缺乏标准物质或标准样品的难题，影响了检测标准的实施。通过研制转基因油菜转化体鉴定检测的标准样品，将进一步完善我国的转基因检测、监测技术标准体系，有效发挥标准方法在转基因生物***中的作用。通过研制、使用转基因油菜转化体鉴定阳性质粒分子和与之配套的检测方法，将大大提高我国对转基因油菜产品非法扩散的检测、监测水平，为我国的转基因生物***提供有效的技术支撑。
结合上述考虑，以解决缺乏转基因油菜转化体鉴定检测用标准样品这一难题为切入点，调研我国批准进口和在我国申请转基因生物安全证书的转基因油菜品种，分析转基因油菜标准方法中转化体鉴定的检测序列，确定进行转基因油菜转化体鉴定的靶标及靶标序列，与油菜内标基因聚合构建到常用载体pUC18载体骨架上，研制转基因油菜转化体鉴定检测用质粒分子。
经对现有专利和其他文献的检索，尚未发现任何采用本发明的设计或相似设计构建转基因油菜转化体鉴定通用的阳性质粒分子和应用的报道。
发明内容
本发明的目的在于以解决转基因检测工作中缺乏转基因油菜转化体鉴定检测用标准物质这一难题为切入点，调研在我国批准进口和正在申请生物安全证书的转基因油菜品种，确定转基因油菜的转化体鉴定检测靶标；调研针对油菜转化体发布的各种标准，确定各检测靶标的核苷酸序列；人工合成各转化体鉴定检测靶标和油菜内标基因的融合序列，构建到常用在pUC18中，为转基因油菜转化体鉴定检测提供阳性对照和质控样品。
本发明一个方面提供了一种转基因油菜及其产品转化体鉴定阳性质粒分子pYCID-1905，其特征在于：其碱基序列如SEQ ID NO.1所示：
本发明另一个方面提供了一种转基因油菜及其产品转化体鉴定阳性质粒分子pYCID-1905，其含有11个油菜转化体靶标和2个油菜内标基因，依次为：
GT73 3’端序列如SEQ ID NO.2；
MS1 3’端序列，见SEQ ID NO.3；
MS1 5’端序列，见SEQ ID NO.4；
OXY235 3’端序列，见SEQ ID NO.5；
OXY235 5’端序列，见SEQ ID NO.6；
MS8 5’端序列，见SEQ ID NO.7；
MS8 3’端序列，见SEQ ID NO.8；
RF3 3’端序列，见SEQ ID NO.9；
RF3 5’端序列，见SEQ ID NO.10；
T45 3’端序列，见SEQ ID NO.11；
RF1 5’端序列，见SEQ ID NO.12；
Topas 19/2 3’端序列，见SEQ ID NO.13；
RF2 5’端序列，见SEQ ID NO.14；
73496 5’端序列，见SEQ ID NO.15；
MON88302 5’端序列，见SEQ ID NO.16
油菜内标基因HMG I/Y序列，见SEQ ID NO.17；
油菜内标基因CruA序列，见SEQ ID NO.18.
本发明另一个方面提供了一种转基因油菜及其产品转化体鉴定阳性质粒分子pYCID-1905，其为在pUC18载体上***融合序列SEQ ID No.19，构成的质粒分子。
本发明另一个方面提供了本发明所述质粒分子作为转基因油菜及其产品转化体鉴定的阳性对照和或质控样品。
本发明另一个方面提供了用于普通PCR检测转基因油菜及其产品鉴定的试剂盒，其包括前述的质粒分子以及转基因油菜转化体和油菜内标基因的检测引物。
在本发明的技术方案中，转基因油菜转化体和油菜内标基因的检测引物如下：
MS1 5′：
引物F 5′—CGGTGAGTAATATTGTACGGCTAA—3′SEQ ID NO.20
R 5′—ATCTCTGGTTAAACATTCCATCTTTG—3′SEQ ID NO.21,
RF1 5′：
引物F 5′—CCTGTGGTCTCAAGATGGATCA—3′SEQ ID NO.22
R 5′—GGTGACTACACGCGACTCAT—3′SEQ ID NO.23；
RF2 5′：
引物F 5′—TTGGTGGACCCTTGAGGAAAC—3′SEQ ID NO.24
R 5′—CCATCTAATAGGGTGAGACAAT—3′SEQ ID NO.25；
MS8 5′：
引物F 5′—CCTTTTCTTATCGACCATGTACTC—3′SEQ ID NO.26
R 5′—AATTTTAAAAACTTGTGGGATGCT—3′SEQ ID NO.27；
RF3 3′：
引物F 5′—CAATAACTTTGTTGGGCTTATGG—3′SEQ ID NO.28
R 5′—CTCGTCTCGGACCTCCGAAAACC—3′SEQ ID NO.29；
OXY235 3′：
F 5′—TTTGTTTATTGCTTTCGCC—3′SEQ ID NO.30
R 5′—CCAGGGGATTCAGTTGGA—3′SEQ ID NO.31；
Topas 19/2 3′：
引物F 5′—CGGCCTTAATCCCACCCCAG—3′SEQ ID NO.32
R 5′—AGTTCCAAACGTAAAACGGCTT—3′SEQ ID NO.33；
T45 3′：
引物F 5′—TCCCATTTATTTACGGTCAC—3′SEQ ID NO.34
R 5′—CCATGGGAATTCATTTACAA—3′SEQ ID NO.35；
GT73 3′：
引物F 5′—AATAACGCTGCGGACATCTA—3′SEQ ID NO.36
R 5′—CAGCAAGATTCTCTGTCAACAA—3′SEQ ID NO.37；
73496 5′：
引物F 5′—ACTTGTTCGTTGGAGTTGTC—3′SEQ ID NO.38
R 5′—TCGTGTTCAGTCCAATGACC—3′SEQ ID NO.39；
MON88302 5′：
引物F 5′—CTCCTCAAGTTGTACAGTCTTGAAGAGA—3′SEQ ID NO.40
R 5′—CAGGACCTGCAGAAGCTTGATAAC—3′SEQ ID NO.41；
油菜内标准基因CruA：
CruAF398 5′—GGCCAGGGCTTCCGTGAT—3′SEQ ID NO.42
CruAR547 5′—CTGGTGGCTGGCTAAATCGA—3′SEQ ID NO.43；
油菜内标准基因HMG I/Y：
hmg-F 5′—TCCTTCCGTTTCCTCGCC—3′SEQ ID NO.44
hmg-R 5′—TTCCACGCCCTCTCCGCT—3′SEQ ID NO.45。
本发明另一个方面提供了一种用于实时荧光PCR鉴定转基因油菜及其产品的试剂盒，其包括本发明所述的质粒分子以及转基因油菜转化体和油菜内标基因的检测引物对和探针。
在本发明的技术方案中，转基因油菜转化体和油菜内标基因的检测引物和探针如下：
RT73转化体：
引物RT73F 5′—CCATATTGACCATCATACTCATTGCT—3′SEQ ID NO.46
RT73R 5′—GCTTATACGAAGGCAAGAAAAGGA—3′SEQ ID NO.47，
探针RT73P 5′—TTCCCGGACATGAAGATCATCCTCCTT—3′SEQ ID NO.48；
MS1转化体5’；
引物MS1-5F 5′—ATCTCTGGTTAAACATTCCATCTTTG—3′SEQ ID NO.49
MS1-5R 5′—CGAGCTTTCTAATTTCAAACTATTCGG—3′SEQ ID NO.50，
探针MS1-5P 5′—TGGATAGGTTCTTCAGCATCATCACACC—3′SEQ ID NO.51；
MS1转化体3′:
引物MS1-MLD025 5′—ACGCTGCGGACATCTACATT—3′SEQ ID NO.52
MS1-MDB175 5′—CTAGATCGGAAGCTGAAGATGG—3′SEQ ID NO.53，
探针MS1-TM030 5′—CTCATTGCTGATCCACCTAGCCGACTT—3′SEQ ID NO.54；
OXY235转化体5’：
引物OXY235-5F 5′—CTAACTTTTGGTGTGATGATGCTGA—3′SEQ ID NO.55
OXY235-5R 5′—CGATAGATGGTGGTGTGAGTCTTG—3′SEQ ID NO.56，
探针OXY235-5P 5′—AGCTGATGGCAAGTTAATCTCCCCGAAGTCG—3′SEQ ID NO.57；
OXY235转化体3’：
引物QOXY235-3LG 5′—AGAGAATCGTGAAATTATCTCTACCG—3′SEQ ID NO.58
QOXY235-3LV 5′—ATTGACCATCATACTCATTGCTGA—3′SEQ ID NO.59，
探针QOXY235-3L 5′—CCATGTAGATTTCCCGGACATGAAGCC—3′SEQ ID NO.60；
MS8转化体5’；
引物QMS8RG 5′—CCTTGAGGACGCTTTGATCATATT—3′SEQ ID NO.61
QMS8RV 5′—CCTTTTCTTATCGACCATGTACTC—3′SEQ ID NO.62，
探针QMS8RFAM 5′—CCGAGTTCGACGGCCGAGTACTG—3′SEQ ID NO.63；
MS8转化体3’；
引物MS8L-KVM085 5′—GTTAGAAAAAGTAAACAATTAATATAGCCGG—3′SEQ ID NO.64
MS8L-HCA048 5′—GGAGGGTGTTTTTGGTTATC—3′SEQ ID NO.65，
探针MS8L-TM011 5′—AATATAATCGACGGATCCCCGGGAATTC—3′SEQ ID NO.66；
RF3转化体3’；
引物QRF3RG 5′—TTTGTACAAAACTTGGACCCCTAGGT—3′SEQ ID NO.67
QRF3RV 5′—TTCTTTCAAGATGGGAATTAACATCT—3′SEQ ID NO.68，
探针QRF3P5′—TGCCTTTTCTTATCGCGAGATGAAAAAGGC—3′SEQ ID NO.69；
RF3转化体5’：
RF3DPA165 5′—CATAAAGGAAGATGGAGACTTGAG—3′SEQ ID NO.70
RF3KVM084AGCATTTAGCATGTACCATCAGACA—3′SEQ ID NO.71，
探针RF3TM010 5′—CGCACGCTTATCGACCATAAGCCCA—3′SEQ ID NO.72；
T45转化体：
引物T45KVM172 5′—CAATGGACACATGAATTATGC—3′SEQ ID NO.73
T45MDB599 5′—GACTCTGTATGAACTGTTCGC—3′SEQ ID NO.74，
探针T45TM026 5′—TAGAGGACCTAACAGAACTCGCCGT—3′SEQ ID NO.75；
RF1转化体：
引物RF1-MDB118 5′—CTAAGGGAGGTCAAGATGTAGC—3′SEQ ID NO.76
RF1-KVM170 5′—CGGGCCTAACTTTTGGTGTG—3′SEQ ID NO.77，
探针RF1-TM022 5′—CTCATCATCCTCACCCAGTCAGCATCA—3′SEQ ID NO.78；
Topas转化体：
引物TOPAS 19/2MDB685 5′—GTTGCGGTTCTGTCAGTTCC—3′SEQ ID NO.79
TOPAS 19/2KVM180CGACCGGCGCTGATATATGA—3′SEQ ID NO.80，
探针TOPAS 19/2TM029 5′—TCCCGCGTCATCGGCGG—3′SEQ ID NO.81；
RF2转化体：
引物RF2-MDB207 5′—GGGTGAGACAATATATCGACG—3′SEQ ID NO.82
RF2-KVM171 5′—GGGCATCGCACCGGTGAG—3′SEQ ID NO.83，
探针RF2-TM024 5′—CACCGGCCAAATTCGCTCTTAGCCGT—3′SEQ ID NO.84；
73496转化体：
引物73496-2824 5′—GTTCTTCTCTTCATAGCTCATTACAGTTTT—3′SEQ ID NO.85
73496-2825 5′—CAAACCTCCATAGAGTTCAACATCTTAA—3′SEQ ID NO.86，
探针73496-QP-83 5′—TTAGTTAGATCAGGATATTCTTG—3′SEQ ID NO.87；
MON88302转化体：
引物88302QF 5′—TCCTTGAACCTTATTTTATAGTGCACA—3′SEQ ID NO.88
88302QR 5′—TCAGATTGTCGTTTCCCGCCTTCA—3′SEQ ID NO.89，
探针88302QP 5′—TAGTCATCATGTTGTACCACTTCAAACACT—3′SEQ ID NO.90；
油菜内标准基因
CruA：qCruAF 5′—GGCCAGGGCTTCCGTGAT—3′SEQ ID NO.91
qCruAR 5′—CCGTCGTTGTAGAACCATTGG—3′SEQ ID NO.92，
探针qCruAP 5′—AGTCCTTATGTGCTCCACTTTCTGGTGCA—3′SEQ ID NO.93；
油菜内标准基因HMG I/Y：qhmg-F 5′—GGTCGTCCTCCTAAGGCGAAAG—3′SEQ IDNO.94和qhmg-R5′—CTTCTTCGGCGGTCGTCCAC—3′SEQ ID NO.95，
探针qhmg-P 5′—CGGAGCCACTCGGTGCCGCAACTT—3′SEQ ID NO.96。
本发明再一个方面提供了一种转基因油菜及其产品普通PCR鉴定的方法，其包括以下步骤：
1)提取样品总DNA，
2)利用前述的转基因油菜鉴定单元和油菜内标基因的检测引物对本发明所述的阳性质粒分子，以及样品基因组DNA进行PCR扩增；
3)琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色后鉴定是否存在扩增产物；在阳性质粒分子正常扩增且样品中油菜内标准基因正常扩增的情况下，如存在扩增产物则说明油菜样品中含相应油菜转化体。
本发明再一个方面提供了一种转基因油菜及其产品实时荧光PCR鉴定的方法，其包括以下步骤：
1)提取样品总DNA；
2)利用前述转基因油菜转化体和油菜内标基因的检测引物对和探针对本发明所述的阳性质粒分子，以及样品基因组DNA进行PCR扩增；
3)实时荧光PCR产物根据是否有典型扩增曲线判断是否有相应油菜转化体；在阳性质粒分子正常扩增且样品中油菜内标准基因正常扩增的情况下，如存在扩增产物则说明油菜样品中含有油菜转化体。
本发明再一个方面提供了本发明所述质粒分子的制备方法，其是将在pUC18载体上***融合序列SEQ IDNo.19，构成的质粒分子；或者将SEQ ID No.2-18依次连接构成融合序列，再将该融合序列***pUC18载体中。
本发明的目的是这样实现的：
一、阳性质粒分子pYCID-1905的设计
阳性质粒分子pYCID-1905是一个聚合11个油菜转化体和2个油菜内标准基因的阳性质粒分子。
(一)设计
1.转基因油菜转化体鉴定阳性质粒分子pYCID-1905含有11个油菜转化体，分别是我国批准进口的9个油菜转化体GT73、MS1、OXY235、MS8、RF3、T45、RF1、Topas 19/2、RF2和正在我国申请安全证书的2个油菜转化体73496、MON88302。通过鉴定这11个转化体可以全覆盖我国已批准进口和正在申请安全证书的所有转基因油菜品种。
2.转基因油菜转化体鉴定阳性质粒分子pYCID-1905含有2个油菜内标基因，分别是HMG I/Y基因和CruA基因。
3.转基因油菜转化体鉴定阳性质粒分子pYCID-1905中11个转化体的靶标序列是根据针对这些转化体发布的农业部标准(农业部公告)、国家标准(GB/T)、进出口检验检疫标准(SN/T)和欧盟标准综合确定的，质粒分子pYCID-1905可与各个标准配套使用。
4.转基因油菜转化体鉴定阳性质粒分子pYCID-1905可同时用作各转化体的普通定性PCR检测和实时荧光PCR检测的质控对照。
(二)构建
将11个转化体的靶标序列和2个油菜内标准基因的靶标序列拼接到一起，进行人工合成，将人工合成的融合序列构建到载体pUC18上，构建出聚合11个转化体和2个油菜内标准基因的阳性质粒分子pYCID-1905(图1)。
(三)特征
1.碱基序列如SEQ ID NO.1所示，其DNA区含有11个转化体特异性序列和2个油菜内标准基因序列；
2.位于第437位至3175位的碱基是9个已批准油菜转化体的融合序列，依次是(1)GT73、(2)MS1、(3)OXY235、(4)MS8、(5)RF3、(6)T45、(7)RF1、(8)Topas 19/2、(9)RF2。
3.位于第3176位至3531位的碱基是2个油菜内标准基因HMG I/Y和CruA定性定量检测靶标的融合序列。
4.位于第3532位至4065位的碱基是2个正在申请安全证书油菜转化体的融合序列，依次是(1)73496、(2)MON88302。
5.以上所述序列是转基因油菜转化体鉴定阳性质粒分子pYCID-1905的特征序列，可以用作转基因油菜转化体鉴定检测时的阳性对照和质控样品。
二、阳性质粒分子pYCID-1905的应用
利用pYCID-1905作为阳性对照和质控样品，对油菜样品进行转化体鉴定的普通PCR和实时荧光PCR筛查检测：
合成油菜内标准基因HMG I/Y(CruA)和油菜转化体的引物组合(引物/探针组合)；提取样品总DNA，分别利用内标准基因和油菜转化体的引物组合(引物/探针组合)对阳性质粒分子和样品基因组DNA进行PCR扩增；普通PCR产物以琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色后鉴定是否存在扩增产物；实时荧光PCR产物根据是否有典型扩增曲线判断是否有扩增产物；在阳性质粒分子正常扩增且样品中油菜内标准基因正常扩增的情况下，如存在扩增产物则说明油菜样品中含有相应油菜转化体。
与现有技术相比，本发明具有下列优点和积极效果：
(1)提供了转基因油菜转化体鉴定检测通用的阳性质粒分子pYCID-1905；
(2)pYCID-1905聚合了转基因油菜转化体鉴定检测用的11个转化体鉴定靶标和2个油菜的内标准基因序列；
(3)pYCID-1905可用作9个授权油菜转化体和2个待授权油菜转化体的鉴定检测；
(4)解决了转基因油菜转化体鉴定检测中缺乏阳性对照或标准品的技术难题，避免了转化体鉴定检测中针对每个转化体设置阳性对照的问题，降低了制备多个阳性对照的人力成本和经济成本；
(5)适用于对转基因油菜及其制品实施转化体鉴定检测、监测和***。
附图说明
图1是阳性质粒分子pYCID-1905结构图；
图2是采用定性PCR方法验证阳性质粒分子中11个油菜转化体和2个油菜内标准基因的检测靶标。靶标顺序：(1)GT73转化体，(2)MS1转化体，(3)OXY235转化体，(4)MS8转化体,(5)RF3转化体，(6)T45转化体，(7)RF1转化体，(8)Topas 19/2转化体，(9)RF2转化体，(10)73496转化体，(11)MON88302转化体，(12)油菜内标基因HMG I/Y，(13)油菜内标基因CruA。
图3是采用实时荧光PCR方法验证阳性质粒分子中11个油菜转化体和2个油菜内标准基因的检测靶标。
图4利用质粒分子pYCID-1905做阳性对照，对部分油菜品种进行普通PCR转化体鉴定检测。检测结果显示每个检测靶标，只有pYCID-1905和相应的转化体有扩增产物。
图5利用质粒分子pYCID-1905做阳性对照，对部分油菜品种进行实时荧光PCR转化体鉴定检测。检测结果显示每个检测靶标，只有pYCID-1905和相应的转化体有扩增曲线。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明详细说明：
一、阳性质粒分子pYCID-1905的构建
(一)确定转基因油菜转化体鉴定检测靶标
查阅转基因油菜产业化相关资料，我国批准进口的油菜转化体有9个，分别是GT73、MS1、OXY235、MS8、RF3、T45、RF1、Topas 19/2、RF2；正在我国申请安全证书的油菜转化体有2个，分别是73496和MON88302。确定用11个油菜转化体靶标进行转基因油菜的转化体鉴定检测，通过鉴定检测的结果，可判定样品中的转基因成分是来源于授权转基因油菜还是非授权转基因油菜。
(二)确定11个转化体的靶标序列
收集农业部发布的标准(农业部公告)、国家标准(GB/T)、进出口检验检疫标准(SN/T)和欧盟标准中针对这11个转化体的检测方法及引物/探针序列。分析每个引物/探针组合的扩增序列及在转化体特异性序列上的结合位点，确定拟构建到质粒上的靶标序列。GT73 3’端序列长207bp，见SEQ ID NO.2；MS1 3’端序列长191bp，见SEQ ID NO.3；MS1 5’端序列长200bp，见SEQ ID NO.4；OXY235 3’端序列长344bp，见SEQ ID NO.5；OXY235 5’端序列长129bp，见SEQ ID NO.6；MS8 5’端序列长164bp，见SEQ ID NO.7；MS8 3’端序列长134bp，见SEQ ID NO.8；RF3 3’端序列长361bp，见SEQ ID NO.9；RF3 5’端序列长256bp，见SEQ ID NO.10；T45 3’端序列长304bp，见SEQ ID NO.11；RF1 5’端序列长254bp，见SEQ IDNO.12；Topas 19/2 3’端序列长134bp，见SEQ ID NO.13；RF2 5’端序列长206bp，见SEQ IDNO.14；73496 5’端序列长284bp，见SEQ ID NO.15；MON88302 5’端序列长250bp，见SEQ IDNO.16。
(三)确定2个油菜内标基因的靶标序列
在转基因油菜检测中应用最广泛的内标基因有两个，分别是HMG I/Y和CruA基因。查阅这两个基因的普通PCR方法和实施荧光PCR方法的检测方法及引物/探针序列。分析每个引物/探针组合的扩增序列及在筛查元件上的结合位点，确定拟构建到质粒上的靶标序列。油菜内标基因HMG I/Y序列长206bp，见SEQ ID NO.17；油菜内标基因CruA序列长150bp，见SEQ ID NO.18.
(四)构建质粒分子pYCID-1905
将11个油菜转化体的15个转化体特异性靶标(MS1、OXY235、MS8和RF3 4个转化体的核苷酸序列包含了5′端和3′端转化体特异性序列)和2个油菜内标基因的核苷酸序列拼接到一起，形成一个融合序列(SEQ ID NO.19)。将拼接的融合序列委托上海生工合成，合成后***到pUC18载体上，构建成质粒分子pYCID-1905。
二、阳性质粒分子pYCID-1905的验证
(一)测序验证
对质粒分子pYCID-1905进行全分子测序，验证靶标序列的准确性。
(二)普通PCR方法验证
根据发布的标准，合成11个转化体和2个油菜内标基因的普通PCR引物。MS1 5′：引物F5′—CGGTGAGTAATATTGTACGGCTAA—3′SEQ ID NO.20和R 5′—ATCTCTGGTTAAACATTCCATCTTTG—3′SEQ ID NO.21,扩增产物194bp；RF1 5′：引物F 5′—CCTGTGGTCTCAAGATGGATCA—3′SEQ ID NO.22和R5′—GGTGACTACACGCGACTCAT—3′SEQ IDNO.23，扩增产物200bp；RF2 5′：引物F 5′—TTGGTGGACCCTTGAGGAAAC—3′SEQ ID NO.24和R5′—CCATCTAATAGGGTGAGACAAT—3′SEQ ID NO.25，扩增产物200bp；MS8 5′：引物F 5′—CCTTTTCTTATCGACCATGTACTC—3′SEQ ID NO.26和R 5′—AATTTTAAAAACTTGTGGGATGCT—3′SEQ ID NO.27，扩增产物159bp；RF3 3′：引物F 5′—CAATAACTTTGTTGGGCTTATGG—3′SEQ IDNO.28和R5′—CTCGTCTCGGACCTCCGAAAACC—3′SEQ ID NO.29，扩增产物284bp；OXY235 3′：F5′—TTTGTTTATTGCTTTCGCC—3′SEQ ID NO.30和R 5′—CCAGGGGATTCAGTTGGA—3′SEQ IDNO.31，扩增产物331bp；Topas 19/2 3′：引物F 5′—CGGCCTTAATCCCACCCCAG—3′SEQ IDNO.32和R 5′—AGTTCCAAACGTAAAACGGCTT—3′SEQ ID NO.33，扩增产物110bp；T45 3′：引物F 5′—TCCCATTTATTTACGGTCAC—3′SEQ ID NO.34和R5′—CCATGGGAATTCATTTACAA—3′SEQID NO.35，扩增产物233bp；GT73 3′：引物F 5′—AATAACGCTGCGGACATCTA—3′SEQ ID NO.36和R 5′—CAGCAAGATTCTCTGTCAACAA—3′SEQ ID NO.37，扩增产物204bp；73496 5′：引物F5′—ACTTGTTCGTTGGAGTTGTC—3′SEQ ID NO.38和R 5′—TCGTGTTCAGTCCAATGACC—3′SEQID NO.39，扩增产物281bp；MON88302 5′：引物F 5′—CTCCTCAAGTTGTACAGTCTTGAAGAGA—3′SEQ ID NO.40和R5′—CAGGACCTGCAGAAGCTTGATAAC—3′SEQ ID NO.41，扩增产物150bp；油菜内标准基因CruA：CruAF3985′—GGCCAGGGCTTCCGTGAT—3′SEQ ID NO.42和CruAR5475′—CTGGTGGCTGGCTAAATCGA—3′SEQ ID NO.43，扩增产物150bp；油菜内标准基因HMG I/Y：hmg-F 5′—TCCTTCCGTTTCCTCGCC—3′SEQ ID NO.44和hmg-R5′—TTCCACGCCCTCTCCGCT—3′SEQ ID NO.45，扩增产物206bp。
利用合成的普通PCR引物，以构建的阳性质粒分子为模板，进行PCR扩增。PCR反应采用25ul反应体系，含1μL阳性质粒分子，1×PCR Buffer(含10mM Tris HCl pH8.3，KCl50mM)，200uM dNTPs，2.5mM MgCl2，250nM的正向引物和反向引物，DNATaq酶1u。反应程序为，94℃ 2分钟预变性，94℃ 15秒，60℃30秒，72℃ 30秒，35次循环，72℃保温2分钟。PCR产物以琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色后鉴定是否存在扩增产物。
(三)实时荧光PCR方法验证
合成11个转化体和2个油菜内标基因的实时荧光PCR引物/探针。RT73转化体：引物RT73F5′—CCATATTGACCATCATACTCATTGCT—3′SEQ ID NO.46和RT73R 5′—GCTTATACGAAGGCAAGAAAAGGA—3′SEQ ID NO.47，探针RT73P 5′—TTCCCGGACATGAAGATCATCCTCCTT—3′SEQ ID NO.48；MS1转化体5’；引物MS1-5F5′—ATCTCTGGTTAAACATTCCATCTTTG—3′SEQ ID NO.49和MS1-5R 5′—CGAGCTTTCTAATTTCAAACTATTCGG—3′SEQ ID NO.50，探针MS1-5P 5′—TGGATAGGTTCTTCAGCATCATCACACC—3′SEQ ID NO.51；MS1转化体3′:引物MS1-MLD025 5′—ACGCTGCGGACATCTACATT—3′SEQ ID NO.52和MS1-MDB175 5′—CTAGATCGGAAGCTGAAGATGG—3′SEQ ID NO.53，探针MS1-TM030 5′—CTCATTGCTGATCCACCTAGCCGACTT—3′SEQ ID NO.54；OXY235转化体5’：引物OXY235-5F 5′—CTAACTTTTGGTGTGATGATGCTGA—3′SEQ ID NO.55和OXY235-5R 5′—CGATAGATGGTGGTGTGAGTCTTG—3′SEQ ID NO.56，探针OXY235-5P 5′—AGCTGATGGCAAGTTAATCTCCCCGAAGTCG—3′SEQ ID NO.57；OXY235转化体3’：引物QOXY235-3LG 5′—AGAGAATCGTGAAATTATCTCTACCG—3′SEQ ID NO.58和QOXY235-3LV 5′—ATTGACCATCATACTCATTGCTGA—3′SEQ ID NO.59，探针QOXY235-3L 5′—CCATGTAGATTTCCCGGACATGAAGCC—3′SEQ ID NO.60；MS8转化体5’；引物QMS8RG 5′—CCTTGAGGACGCTTTGATCATATT—3′SEQ ID NO.61和QMS8RV 5′—CCTTTTCTTATCGACCATGTACTC—3′SEQ ID NO.62，探针QMS8RFAM 5′—CCGAGTTCGACGGCCGAGTACTG—3′SEQ ID NO.63；MS8转化体3’；引物MS8L-KVM0855′—GTTAGAAAAAGTAAACAATTAATATAGCCGG—3′SEQ ID NO.64和MS8L-HCA048 5′—GGAGGGTGTTTTTGGTTATC—3′SEQ ID NO.65，探针MS8L-TM011 5′—AATATAATCGACGGATCCCCGGGAATTC—3′SEQ ID NO.66；RF3转化体3’；引物QRF3RG 5′—TTTGTACAAAACTTGGACCCCTAGGT—3′SEQ ID NO.67和QRF3RV 5′—TTCTTTCAAGATGGGAATTAACATCT—3′SEQ ID NO.68，探针QRF3P5′—TGCCTTTTCTTATCGCGAGATGAAAAAGGC—3′SEQ ID NO.69；RF3转化体5’：RF3DPA165 5′—CATAAAGGAAGATGGAGACTTGAG—3′SEQ ID NO.70和RF3KVM084
AGCATTTAGCATGTACCATCAGACA—3′SEQ ID NO.71，探针RF3TM010 5′—CGCACGCTTATCGACCATAAGCCCA—3′SEQ ID NO.72；T45转化体：引物T45KVM172 5′—CAATGGACACATGAATTATGC—3′SEQ ID NO.73和T45MDB5995′—GACTCTGTATGAACTGTTCGC—3′SEQ ID NO.74，探针T45TM026 5′—TAGAGGACCTAACAGAACTCGCCGT—3′SEQ ID NO.75；RF1转化体：引物RF1-MDB118 5′—CTAAGGGAGGTCAAGATGTAGC—3′SEQ ID NO.76和RF1-KVM1705′—CGGGCCTAACTTTTGGTGTG—3′SEQ ID NO.77，探针RF1-TM022 5′—CTCATCATCCTCACCCAGTCAGCATCA—3′SEQ ID NO.78；Topas转化体：引物TOPAS 19/2MDB6855′—GTTGCGGTTCTGTCAGTTCC—3′SEQ ID NO.79和TOPAS19/2KVM180CGACCGGCGCTGATATATGA—3′SEQ ID NO.80，探针TOPAS 19/2TM029 5′—TCCCGCGTCATCGGCGG—3′SEQ ID NO.81；RF2转化体：引物RF2-MDB207 5′—GGGTGAGACAATATATCGACG—3′SEQ ID NO.82和RF2-KVM171 5′—GGGCATCGCACCGGTGAG—3′SEQ ID NO.83，探针RF2-TM024 5′—CACCGGCCAAATTCGCTCTTAGCCGT—3′SEQ ID NO.84；73496转化体：引物73496-2824 5′—GTTCTTCTCTTCATAGCTCATTACAGTTTT—3′SEQ ID NO.85和73496-2825 5′—CAAACCTCCATAGAGTTCAACATCTTAA—3′SEQ ID NO.86，探针73496-QP-835′—TTAGTTAGATCAGGATATTCTTG—3′SEQ ID NO.87；MON88302转化体：引物88302QF 5′—TCCTTGAACCTTATTTTATAGTGCACA—3′SEQ ID NO.88和88302QR 5′—TCAGATTGTCGTTTCCCGCCTTCA—3′SEQ ID NO.89，探针88302QP 5′—TAGTCATCATGTTGTACCACTTCAAACACT—3′SEQ ID NO.90。油菜内标准基因CruA：qCruAF 5′—GGCCAGGGCTTCCGTGAT—3′SEQ ID NO.91和qCruAR 5′—CCGTCGTTGTAGAACCATTGG—3′SEQID NO.92，探针qCruAP 5′—AGTCCTTATGTGCTCCACTTTCTGGTGCA—3′SEQ ID NO.93；油菜内标准基因HMG I/Y：qhmg-F 5°—GGTCGTCCTCCTAAGGCGAAAG—3′SEQ ID NO.94和qhmg-R5′—CTTCTTCGGCGGTCGTCCAC—3′SEQ ID NO.95，探针qhmg-P 5′—CGGAGCCACTCGGTGCCGCAACTT—3′SEQ ID NO.96。
利用合成的实时荧光PCR引物，以构建的阳性质粒分子为模板，进行实时荧光PCR扩增。实时荧光PCR分析在一台CFX96PCR仪上进行，PCR反应体系20μL，含1μL质粒模板,1×PCR buffer，1U Taq DNA聚合酶，4.5mM MgCl2,300μM dNTPs,200nM引物,和100nM探针。PCR反应程序：50℃ 2分钟和95℃ 10分钟预变性以后，进行50次PCR循环：95℃ 15秒变性，60℃
1分钟退火及延伸，收集荧光信号。
三、应用方法
(一)利用pYCID-1905作为转基因油菜普通PCR筛查检测的阳性对照和质控样品
用转基因油菜GT73、Topas 19/2、T45、MS1、RF1、RF2、MS8、RF3、OXY235、MON88302和73496作为测试样品，利用合成的普通PCR引物，以质粒分子pYCID-1905为阳性对照，对提取的DNA样品进行转基因成分筛查检测。
PCR反应采用25ul反应体系，含1μL DNA模板，1×PCR Buffer(含10mM Tris HClpH8.3，KCl 50mM)，200uM dNTPs，2.5mM MgCl2，250nM的正向引物和反向引物，1U DNA Taq酶。反应程序为，94℃2分钟预变性，94℃15秒，60℃30秒，72℃30秒，35次循环，72℃保温2分钟。PCR产物以琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色后鉴定是否存在扩增产物。
(二)利用pYCID-1905作为转基因油菜实时荧光PCR筛查检测的阳性对照和质控样品
利用合成的实时荧光PCR引物，以质粒分子pYCID-1905为阳性对照，对提取的转基因油菜DNA样品进行转基因成分筛查检测。
实时荧光PCR分析在一台CFX96PCR仪上进行，PCR反应体系20μL，含1μL DNA模板,1×PCR buffer，1U Taq DNA聚合酶，4.5mM MgCl2,300μM dNTPs,200nM正向和反向引物,100nM探针。PCR反应程序：50℃ 2分钟和95℃ 10分钟预变性以后，进行50次PCR循环：95℃15秒变性，60℃ 1分钟退火及延伸，收集荧光信号。
四、实验结果
(一)pYCID-1905的构建和测序分析
对质粒分子pYCID-1905进行全分子测序，测序结果表明，合成DNA靶标序列与预期DNA序列(SEQ ID NO.19)完全一致，证明构建的质粒分子中含有预期的11个油菜转化体特异性靶标和2个油菜内标准基因。
(二)验证pYCID-1905上各转化体的检测靶标
用合成的11个转化体和2个油菜内标准基因的普通PCR引物，以质粒分子pYCID-1905为模板进行PCR扩增。对PCR产物进行电泳检测，发现各基因元件均扩增出了预期大小的PCR产物(图2)，表明质粒分子pYCID-1905上含有各转化体的普通PCR检测靶标。质粒分子pYCID-1905可以用作转基因油菜转化体鉴定普通PCR的阳性对照和质控样品。
用合成的11个转化体和2个油菜内标准基因的实时荧光PCR引物，以质粒分子pYCID-1905为模板进行实时荧光PCR扩增。发现各转化体靶标产生了典型扩增曲线(图3)，表明质粒分子pYCID-1905上含有各转化体的实时荧光PCR检测靶标。质粒分子pYCID-1905可以用作转基因油菜转化体鉴定实时荧光PCR的阳性对照和质控样品。
(三)将pYCID-1905用作转基因油菜普通PCR鉴定检测的阳性对照和质控样品
以质粒分子pYCID-1905作为阳性对照，用合成的2个油菜内标准基因引物和11个转化体的引物进行普通PCR扩增，对11个转基因油菜(GT73、Topas 19/2、T45、MS1、RF1、RF2、MS8、RF3、OXY235、MON88302和73496)进行转化体鉴定检测。检测PCR产物发现，每个引物组合仅在质粒分子pYCID-1905和相应转化体中有扩增产物(图4)。结果表明质粒分子pYCID-1905可以作为油菜内标准基因和11个转化体进行普通PCR扩增时的对照样品，通过对照样品的扩增可以判定样品DNA的提取质量以及PCR扩增体系是否正常。
4.4、将pYCID-1905用作转基因油菜实时荧光PCR鉴定检测的阳性对照和质控样品
以质粒分子pYCID-1905作为阳性对照，用合成的2个油菜内标准基因引物和11个转化体的引物进行实时荧光PCR扩增，对11个转基因油菜(GT73、Topas 19/2、T45、MS1、RF1、RF2、MS8、RF3、OXY235、MON88302和73496)进行实时荧光PCR鉴定分析。2个油菜的内标准基因在质粒分子pYCID-1905和所有油菜中都有良好的扩增；11个转化体引物/探针组合仅在质粒分子pYCID-1905和相应转化体中有典型扩增曲线(图5)。结果表明质粒分子pYCID-1905可以作为油菜内标准基因和11个转化体进行实时荧光PCR扩增时的对照样品，通过对照样品的扩增可以判定样品DNA的提取质量以及PCR扩增体系是否正常。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院油料作物研究所
<120> 一种转基因油菜及其产品转化体鉴定阳性质粒分子pYCID-1905及应用
<130> CP11903925C
<160> 96
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 6314
<212> DNA
<213> pYCID-1905
<400> 1
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240
attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300
tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360
tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgccaa gcttgcatgc ctgcaggtcg 420
actctagagg atcccctaat aacgctgcgg acatctacat ttttgaattg aaaaaaaatt 480
ggtaattact ctttcttttt ctccatattg accatcatac tcattgctga tccatgtaga 540
tttcccggac atgaagatca tcctccttcc tttccttgcc tttccttcct tttcttgcct 600
tcgtataagc ttgtgtcaat tgttgacaga gaatcttgct gaataacgct gcggacatct 660
acatttttga attgaaaaaa aattggtaat tactctttct ttttctccat attgaccatc 720
atactcattg ctgatccacc tagccgactt ttttaaataa ccatatccca ctatccatca 780
ggcataaata accatatccc gtcgatgctt ccatcttcag cttccgatct agaccaccgg 840
tgagtaatat tgtacggcta agagcgaatt tggcctgtag acctcaattg cgagctttct 900
aatttcaaac tattcgggcc taacttttgg tgtgatgatg ctgaagaacc tatccatgaa 960
actcacaaaa acatcatcac ctgagaattc tctggaatct aagtccaaag atggaatgtt 1020
taaccagaga tttctttgtt tattgctttc gcctataaat acgacggatc gtaatttgtc 1080
gttttatcaa aatgtacttt cattttataa taacgctgcg gacatctaca tttttgaatt 1140
gaaaaaaaat tggtaattac tctttctttt tctccatatt gaccatcata ctcattgctg 1200
atccatgtag atttcccgga catgaagcca tttacaattg aatatatcct catcgccggt 1260
agagataatt tcacgattct cttaattcaa ttctctcatc gccactgaat ggtttactag 1320
atttgtctta gaattcagat ttaccagccc gggccgtcga ccacgcgtgc cctatagtgc 1380
ctaacttttg gtgtgatgat gctgactggc aagttaatct agtttccggt tatgaagcac 1440
ggcgtgtcag ctgatggcaa gttaatctcc ccgaagtcga caagactcac accaccatct 1500
atcgaaggca aattttaaaa acttgtggga tgctgtggcc ataaaccttg aggacgcttt 1560
gatcatattc tattaactac agtacgaata tgattcgacc tttgcaattt tctcttccag 1620
tactcggccg tcgaactcgg ccgtcgagta catggtcgat aagaaaaggc aatggttaga 1680
aaaagtaaac aattaatata gccggctatt tgtgtaaaaa tccctaatat aatcgacgga 1740
tccccgggaa ttccggggga agcttagatc catggatttg ttatgataac caaaaacacc 1800
ctcctttcat aaaggaagat ggagacttga gaagtttttt ttggactttg tttagctttg 1860
ttgggcgttt tttttttttg atcaataact ttgttgggct tatggtcgat aagcgtgcgc 1920
atgtctgatg gtacatgcta aatgctatat ttctgtttaa agtgttaaaa tcattttctg 1980
atggaactaa atccagtttt aagagtaact gacaagtaca attaagcaca acaataaaat 2040
agtagtaatt ggcatctttg attgttaaat atcaaaacaa taaagttaca aaaaaaaata 2100
ccaaaccaat aatgaagact tggcggagac agtgccgtgc gaaggttttc ggaggtccga 2160
gacgagtttt ttgtaattag aaaccctgaa atttgtacaa aacttggacc cctaggtaaa 2220
tgcctttttc atctcgcgat aagaaaaggc aatttgtaga tgttaattcc catcttgaga 2280
ctctgtatga actgttcgcc agtctttacg gcgagttctg ttaggtcctc tatttgaatc 2340
tttgactcca tgggaattca tttacaactg tattccatat gcataattca tgtgtccatt 2400
gattttaccc cttattttat cattcaaaat acttcaagat atttagattt catgtaatgt 2460
agagaataaa ccgatttgct tatggtttct ttatcttttc tctaatccat attgtcgtgt 2520
tgtcatatat atctctgtag tgactagtga agaatttata gtgaccgtaa ataaatggga 2580
gggcctgtgg tctcaagatg gatcattaat ttccaccttc acctacgatg gggggcatcg 2640
caccggtgag taatattgta cggctaagag cgaatttggc ctgtagacct caattgcgag 2700
ctttctaatt tcaaactatt cgggcctaac ttttggtgtg atgatgctga ctgggtgagg 2760
atgatgagtc gcgtgtagtc accggaaaag atggaaaagg gttcttcgcc tgctacatct 2820
tgacctccct tagcccttca acgttgcggt tctgtcagtt ccaaacgtaa aacggcttgt 2880
cccgcgtcat cggcgggggt cgtaacgtga ctcccggtca tatatcagcg ccggtcggcc 2940
ccgggcctgg ggtgggatta aggccgaagt tttggtggac ccttgaggaa actggtagct 3000
gttgtgggcc tgtggtctca agatggatca ttaatttcca ccttcaccta cgatgggggg 3060
catcgcaccg gtgagtaata ttgtacggct aagagcgaat ttggccggtg agtaatattg 3120
tactggcaca gctatatata cgtcgatata ttgtctcacc ctattagatg ggaagtcctt 3180
ccgtttcctc gccgaggcct agaggtcgtc ctcctaaggc gaaaggacct tcctcggagg 3240
tggagacgaa agttgcggca ccgagtggct ccgggaggcc acgtggacga ccgccgaaga 3300
agcagaagac ggaatccgag gcggttaaag ccgatgttga acctgcggag gctccggctg 3360
gggagcggag agggcgtgga aggccagggc ttccgtgata tgcaccagaa agtggagcac 3420
ataaggactg gggacaccat cgctacacat cccggtgtag cccaatggtt ctacaacgac 3480
ggaaaccaac cacttgtcat cgtttccgtc ctcgatttag ccagccacca gcacttgttc 3540
gttggagttg tctactgctt gctgagctgg tccgtgggcc ttcctaaacg tgccgtaagt 3600
tcttctcttc atagctcatt acagttttca ttagttagat caggatattc ttgtttaaga 3660
tgttgaactc tatggaggtt tgtatgaact gatgatctag gaccggataa gttcccttct 3720
tcatagcgaa cttattcaaa gaatgttttg tgtatcattc ttgttacatt gttattaatg 3780
aaaaaatatt attggtcatt ggactgaaca cgagtatcct cctcaagttg tacagtcttg 3840
aagagattgt aacacacggt ttcctacatt taaatactta attaatgtct cagtatttgt 3900
attatcagtt ccttgaacct tattttatag tgcacaaaac cttttagtca tcatgttgta 3960
ccacttcaaa cactgatagt ttaaactgaa ggcgggaaac gacaatctga tccccatcaa 4020
gctctagcta gagcggccgc gttatcaagc ttctgcaggt cctgcggtac cgagctcgaa 4080
ttcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca caattccaca 4140
caacatacga gccggaagca taaagtgtaa agcctggggt gcctaatgag tgagctaact 4200
cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct 4260
gcattaatga atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc 4320
ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca 4380
ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg 4440
agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca 4500
taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa 4560
cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc 4620
tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc 4680
gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct 4740
gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg 4800
tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag 4860
gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta 4920
cggctacact agaaggacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg 4980
aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt 5040
tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt 5100
ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag 5160
attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat 5220
ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc 5280
tatctcagcg atctgtctat ttcgttcatc catagttgcc tgactccccg tcgtgtagat 5340
aactacgata cgggagggct taccatctgg ccccagtgct gcaatgatac cgcgagaccc 5400
acgctcaccg gctccagatt tatcagcaat aaaccagcca gccggaaggg ccgagcgcag 5460
aagtggtcct gcaactttat ccgcctccat ccagtctatt aattgttgcc gggaagctag 5520
agtaagtagt tcgccagtta atagtttgcg caacgttgtt gccattgcta caggcatcgt 5580
ggtgtcacgc tcgtcgtttg gtatggcttc attcagctcc ggttcccaac gatcaaggcg 5640
agttacatga tcccccatgt tgtgcaaaaa agcggttagc tccttcggtc ctccgatcgt 5700
tgtcagaagt aagttggccg cagtgttatc actcatggtt atggcagcac tgcataattc 5760
tcttactgtc atgccatccg taagatgctt ttctgtgact ggtgagtact caaccaagtc 5820
attctgagaa tagtgtatgc ggcgaccgag ttgctcttgc ccggcgtcaa tacgggataa 5880
taccgcgcca catagcagaa ctttaaaagt gctcatcatt ggaaaacgtt cttcggggcg 5940
aaaactctca aggatcttac cgctgttgag atccagttcg atgtaaccca ctcgtgcacc 6000
caactgatct tcagcatctt ttactttcac cagcgtttct gggtgagcaa aaacaggaag 6060
gcaaaatgcc gcaaaaaagg gaataagggc gacacggaaa tgttgaatac tcatactctt 6120
cctttttcaa tattattgaa gcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt 6180
tgaatgtatt tagaaaaata aacaaatagg ggttccgcgc acatttcccc gaaaagtgcc 6240
acctgacgtc taagaaacca ttattatcat gacattaacc tataaaaata ggcgtatcac 6300
gaggcccttt cgtc 6314
<210> 2
<211> 207
<212> DNA
<213> GT73 3'端序列
<400> 2
taataacgct gcggacatct acatttttga attgaaaaaa aattggtaat tactctttct 60
ttttctccat attgaccatc atactcattg ctgatccatg tagatttccc ggacatgaag 120
atcatcctcc ttcctttcct tgcctttcct tccttttctt gccttcgtat aagcttgtgt 180
caattgttga cagagaatct tgctgaa 207
<210> 3
<211> 191
<212> DNA
<213> MS1 3'端序列
<400> 3
taacgctgcg gacatctaca tttttgaatt gaaaaaaaat tggtaattac tctttctttt 60
tctccatatt gaccatcata ctcattgctg atccacctag ccgacttttt taaataacca 120
tatcccacta tccatcaggc ataaataacc atatcccgtc gatgcttcca tcttcagctt 180
ccgatctaga c 191
<210> 4
<211> 200
<212> DNA
<213> MS1 5'端序列
<400> 4
caccggtgag taatattgta cggctaagag cgaatttggc ctgtagacct caattgcgag 60
ctttctaatt tcaaactatt cgggcctaac ttttggtgtg atgatgctga agaacctatc 120
catgaaactc acaaaaacat catcacctga gaattctctg gaatctaagt ccaaagatgg 180
aatgtttaac cagagatttc 200
<210> 5
<211> 344
<212> DNA
<213> OXY235 3'端序列
<400> 5
tttgtttatt gctttcgcct ataaatacga cggatcgtaa tttgtcgttt tatcaaaatg 60
tactttcatt ttataataac gctgcggaca tctacatttt tgaattgaaa aaaaattggt 120
aattactctt tctttttctc catattgacc atcatactca ttgctgatcc atgtagattt 180
cccggacatg aagccattta caattgaata tatcctcatc gccggtagag ataatttcac 240
gattctctta attcaattct ctcatcgcca ctgaatggtt tactagattt gtcttagaat 300
tcagatttac cagcccgggc cgtcgaccac gcgtgcccta tagt 344
<210> 6
<211> 129
<212> DNA
<213> OXY235 5'端序列
<400> 6
gcctaacttt tggtgtgatg atgctgactg gcaagttaat ctagtttccg gttatgaagc 60
acggcgtgtc agctgatggc aagttaatct ccccgaagtc gacaagactc acaccaccat 120
ctatcgaag 129
<210> 7
<211> 164
<212> DNA
<213> MS8 5'端序列
<400> 7
caaattttaa aaacttgtgg gatgctgtgg ccataaacct tgaggacgct ttgatcatat 60
tctattaact acagtacgaa tatgattcga cctttgcaat tttctcttca ggtactcggc 120
cgtcgaactc ggccgtcgag tacatggtcg ataagaaaag gcaa 164
<210> 8
<211> 164
<212> DNA
<213> MS8 3'端序列
<400> 8
caaattttaa aaacttgtgg gatgctgtgg ccataaacct tgaggacgct ttgatcatat 60
tctattaact acagtacgaa tatgattcga cctttgcaat tttctcttca ggtactcggc 120
cgtcgaactc ggccgtcgag tacatggtcg ataagaaaag gcaa 164
<210> 9
<211> 361
<212> DNA
<213> RF3 3'端序列
<400> 9
tcataaagga agatggagac ttgagaagtt ttttttggac tttgtttagc tttgttgggc 60
gttttttttt tttgatcaat aactttgttg ggcttatggt cgataagcgt gcgcatgtct 120
gatggtacat gctaaatgct atatttctgt ttaaagtgtt aaaatcattt tctgatggaa 180
ctaaatccag ttttaagagt aactgacaag tacaattaag cacaacaata aaatagtagt 240
aattggcatc tttgattgtt aaatatcaaa acaataaagt tacaaaaaaa aataccaaac 300
caataatgaa gacttggcgg agacagtgcc gtgcgaaggt tttcggaggt ccgagacgag 360
t 361
<210> 10
<211> 110
<212> DNA
<213> RF3 5'端序列
<400> 10
tttttgtaat tagaaaccct gaaatttgta caaaacttgg acccctaggt aaatgccttt 60
ttcatctcgc gataagaaaa ggcaatttgt agatgttaat tcccatcttg 110
<210> 11
<211> 304
<212> DNA
<213> T45 3'端序列
<400> 11
agactctgta tgaactgttc gccagtcttt acggcgagtt ctgttaggtc ctctatttga 60
atctttgact ccatgggaat tcatttacaa ctgtattcca tatgcataat tcatgtgtcc 120
attgatttta ccccttattt tatcattcaa aatacttcaa gatatttaga tttcatgtaa 180
tgtagagaat aaaccgattt gcttatggtt tctttatctt ttctctaatc catattgtcg 240
tgttgtcata tatatctctg tagtgactag tgaagaattt atagtgaccg taaataaatg 300
ggag 304
<210> 12
<211> 254
<212> DNA
<213> RF1 5'端序列
<400> 12
ggcctgtggt ctcaagatgg atcattaatt tccaccttca cctacgatgg ggggcatcgc 60
accggtgagt aatattgtac ggctaagagc gaatttggcc tgtagacctc aattgcgagc 120
tttctaattt caaactattc gggcctaact tttggtgtga tgatgctgac tgggtgagga 180
tgatgagtcg cgtgtagtca ccggaaaaga tggaaaaggg ttcttcgcct gctacatctt 240
gacctccctt agcc 254
<210> 13
<211> 134
<212> DNA
<213> Topas 19/2 3'端序列
<400> 13
cttcaacgtt gcggttctgt cagttccaaa cgtaaaacgg cttgtcccgc gtcatcggcg 60
ggggtcgtaa cgtgactccc ggtcatatat cagcgccggt cggccccggg cctggggtgg 120
gattaaggcc gaag 134
<210> 14
<211> 206
<212> DNA
<213> RF2 5'端序列
<400> 14
ttttggtgga cccttgagga aactggtagc tgttgtgggc ctgtggtctc aagatggatc 60
attaatttcc accttcacct acgatggggg gcatcgcacc ggtgagtaat attgtacggc 120
taagagcgaa tttggccggt gagtaatatt gtactggcac agctatatat acgtcgatat 180
attgtctcac cctattagat gggaag 206
<210> 15
<211> 284
<212> DNA
<213> 73496 5'端序列
<400> 15
cacttgttcg ttggagttgt ctactgcttg ctgagctggt ccgtgggcct tcctaaacgt 60
gccgtaagtt cttctcttca tagctcatta cagttttcat tagttagatc aggatattct 120
tgtttaagat gttgaactct atggaggttt gtatgaactg atgatctagg accggataag 180
ttcccttctt catagcgaac ttattcaaag aatgttttgt gtatcattct tgttacattg 240
ttattaatga aaaaatatta ttggtcattg gactgaacac gagt 284
<210> 16
<211> 250
<212> DNA
<213> MON88302 5'端序列
<400> 16
atcctcctca agttgtacag tcttgaagag attgtaacac acggtttcct acatttaaat 60
acttaattaa tgtctcagta tttgtattat cagttccttg aaccttattt tatagtgcac 120
aaaacctttt agtcatcatg ttgtaccact tcaaacactg atagtttaaa ctgaaggcgg 180
gaaacgacaa tctgatcccc atcaagctct agctagagcg gccgcgttat caagcttctg 240
caggtcctgc 250
<210> 17
<211> 206
<212> DNA
<213> 油菜内标基因HMG I/Y序列
<400> 17
tccttccgtt tcctcgccga ggcctagagg tcgtcctcct aaggcgaaag gaccttcctc 60
ggaggtggag acgaaagttg cggcaccgag tggctccggg aggccacgtg gacgaccgcc 120
gaagaagcag aagacggaat ccgaggcggt taaagccgat gttgaacctg cggaggctcc 180
ggctggggag cggagagggc gtggaa 206
<210> 18
<211> 150
<212> DNA
<213> 油菜内标基因CruA序列
<400> 18
ggccagggct tccgtgatat gcaccagaaa gtggagcaca taaggactgg ggacaccatc 60
gctacacatc ccggtgtagc ccaatggttc tacaacgacg gaaaccaacc acttgtcatc 120
gtttccgtcc tcgatttagc cagccaccag 150
<210> 19
<211> 3629
<212> DNA
<213> 融合序列
<400> 19
taataacgct gcggacatct acatttttga attgaaaaaa aattggtaat tactctttct 60
ttttctccat attgaccatc atactcattg ctgatccatg tagatttccc ggacatgaag 120
atcatcctcc ttcctttcct tgcctttcct tccttttctt gccttcgtat aagcttgtgt 180
caattgttga cagagaatct tgctgaataa cgctgcggac atctacattt ttgaattgaa 240
aaaaaattgg taattactct ttctttttct ccatattgac catcatactc attgctgatc 300
cacctagccg acttttttaa ataaccatat cccactatcc atcaggcata aataaccata 360
tcccgtcgat gcttccatct tcagcttccg atctagacca ccggtgagta atattgtacg 420
gctaagagcg aatttggcct gtagacctca attgcgagct ttctaatttc aaactattcg 480
ggcctaactt ttggtgtgat gatgctgaag aacctatcca tgaaactcac aaaaacatca 540
tcacctgaga attctctgga atctaagtcc aaagatggaa tgtttaacca gagatttctt 600
tgtttattgc tttcgcctat aaatacgacg gatcgtaatt tgtcgtttta tcaaaatgta 660
ctttcatttt ataataacgc tgcggacatc tacatttttg aattgaaaaa aaattggtaa 720
ttactctttc tttttctcca tattgaccat catactcatt gctgatccat gtagatttcc 780
cggacatgaa gccatttaca attgaatata tcctcatcgc cggtagagat aatttcacga 840
ttctcttaat tcaattctct catcgccact gaatggttta ctagatttgt cttagaattc 900
agatttacca gcccgggccg tcgaccacgc gtgccctata gtgcctaact tttggtgtga 960
tgatgctgac tggcaagtta atctagtttc cggttatgaa gcacggcgtg tcagctgatg 1020
gcaagttaat ctccccgaag tcgacaagac tcacaccacc atctatcgaa ggcaaatttt 1080
aaaaacttgt gggatgctgt ggccataaac cttgaggacg ctttgatcat attctattaa 1140
ctacagtacg aatatgattc gacctttgca attttctctt ccagtactcg gccgtcgaac 1200
tcggccgtcg agtacatggt cgataagaaa aggcaatggt tagaaaaagt aaacaattaa 1260
tatagccggc tatttgtgta aaaatcccta atataatcga cggatccccg ggaattccgg 1320
gggaagctta gatccatgga tttgttatga taaccaaaaa caccctcctt tcataaagga 1380
agatggagac ttgagaagtt ttttttggac tttgtttagc tttgttgggc gttttttttt 1440
tttgatcaat aactttgttg ggcttatggt cgataagcgt gcgcatgtct gatggtacat 1500
gctaaatgct atatttctgt ttaaagtgtt aaaatcattt tctgatggaa ctaaatccag 1560
ttttaagagt aactgacaag tacaattaag cacaacaata aaatagtagt aattggcatc 1620
tttgattgtt aaatatcaaa acaataaagt tacaaaaaaa aataccaaac caataatgaa 1680
gacttggcgg agacagtgcc gtgcgaaggt tttcggaggt ccgagacgag ttttttgtaa 1740
ttagaaaccc tgaaatttgt acaaaacttg gacccctagg taaatgcctt tttcatctcg 1800
cgataagaaa aggcaatttg tagatgttaa ttcccatctt gagactctgt atgaactgtt 1860
cgccagtctt tacggcgagt tctgttaggt cctctatttg aatctttgac tccatgggaa 1920
ttcatttaca actgtattcc atatgcataa ttcatgtgtc cattgatttt accccttatt 1980
ttatcattca aaatacttca agatatttag atttcatgta atgtagagaa taaaccgatt 2040
tgcttatggt ttctttatct tttctctaat ccatattgtc gtgttgtcat atatatctct 2100
gtagtgacta gtgaagaatt tatagtgacc gtaaataaat gggagggcct gtggtctcaa 2160
gatggatcat taatttccac cttcacctac gatggggggc atcgcaccgg tgagtaatat 2220
tgtacggcta agagcgaatt tggcctgtag acctcaattg cgagctttct aatttcaaac 2280
tattcgggcc taacttttgg tgtgatgatg ctgactgggt gaggatgatg agtcgcgtgt 2340
agtcaccgga aaagatggaa aagggttctt cgcctgctac atcttgacct cccttagccc 2400
ttcaacgttg cggttctgtc agttccaaac gtaaaacggc ttgtcccgcg tcatcggcgg 2460
gggtcgtaac gtgactcccg gtcatatatc agcgccggtc ggccccgggc ctggggtggg 2520
attaaggccg aagttttggt ggacccttga ggaaactggt agctgttgtg ggcctgtggt 2580
ctcaagatgg atcattaatt tccaccttca cctacgatgg ggggcatcgc accggtgagt 2640
aatattgtac ggctaagagc gaatttggcc ggtgagtaat attgtactgg cacagctata 2700
tatacgtcga tatattgtct caccctatta gatgggaagt ccttccgttt cctcgccgag 2760
gcctagaggt cgtcctccta aggcgaaagg accttcctcg gaggtggaga cgaaagttgc 2820
ggcaccgagt ggctccggga ggccacgtgg acgaccgccg aagaagcaga agacggaatc 2880
cgaggcggtt aaagccgatg ttgaacctgc ggaggctccg gctggggagc ggagagggcg 2940
tggaaggcca gggcttccgt gatatgcacc agaaagtgga gcacataagg actggggaca 3000
ccatcgctac acatcccggt gtagcccaat ggttctacaa cgacggaaac caaccacttg 3060
tcatcgtttc cgtcctcgat ttagccagcc accagcactt gttcgttgga gttgtctact 3120
gcttgctgag ctggtccgtg ggccttccta aacgtgccgt aagttcttct cttcatagct 3180
cattacagtt ttcattagtt agatcaggat attcttgttt aagatgttga actctatgga 3240
ggtttgtatg aactgatgat ctaggaccgg ataagttccc ttcttcatag cgaacttatt 3300
caaagaatgt tttgtgtatc attcttgtta cattgttatt aatgaaaaaa tattattggt 3360
cattggactg aacacgagta tcctcctcaa gttgtacagt cttgaagaga ttgtaacaca 3420
cggtttccta catttaaata cttaattaat gtctcagtat ttgtattatc agttccttga 3480
accttatttt atagtgcaca aaacctttta gtcatcatgt tgtaccactt caaacactga 3540
tagtttaaac tgaaggcggg aaacgacaat ctgatcccca tcaagctcta gctagagcgg 3600
ccgcgttatc aagcttctgc aggtcctgc 3629
<210> 20
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
cggtgagtaa tattgtacgg ctaa 24
<210> 21
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
atctctggtt aaacattcca tctttg 26
<210> 22
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
cctgtggtct caagatggat ca 22
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
ggtgactaca cgcgactcat 20
<210> 24
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
ttggtggacc cttgaggaaa c 21
<210> 25
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
ccatctaata gggtgagaca at 22
<210> 26
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
ccttttctta tcgaccatgt actc 24
<210> 27
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
aattttaaaa acttgtggga tgct 24
<210> 28
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
caataacttt gttgggctta tgg 23
<210> 29
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
ctcgtctcgg acctccgaaa ac 22
<210> 30
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
tttgtttatt gctttcgcc 19
<210> 31
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
ccaggggatt cagttgga 18
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
cggccttaat cccaccccag 20
<210> 33
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
agttccaaac gtaaaacggc tt 22
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
tcccatttat ttacggtcac 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
ccatgggaat tcatttacaa 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
aataacgctg cggacatcta 20
<210> 37
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
cagcaagatt ctctgtcaac aa 22
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
acttgttcgt tggagttgtc 20
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
tcgtgttcag tccaatgacc 20
<210> 40
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
ctcctcaagt tgtacagtct tgaagaga 28
<210> 41
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 41
caggacctgc agaagcttga taac 24
<210> 42
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
ggccagggct tccgtgat 18
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 43
ctggtggctg gctaaatcga 20
<210> 44
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 44
tccttccgtt tcctcgcc 18
<210> 45
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 45
ttccacgccc tctccgct 18
<210> 46
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 46
ccatattgac catcatactc attgct 26
<210> 47
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 47
gcttatacga aggcaagaaa agga 24
<210> 48
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 48
ttcccggaca tgaagatcat cctcctt 27
<210> 49
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 49
atctctggtt aaacattcca tctttg 26
<210> 50
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 50
cgagctttct aatttcaaac tattcgg 27
<210> 51
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 51
tggataggtt cttcagcatc atcacacc 28
<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 52
acgctgcgga catctacatt 20
<210> 53
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 53
ctagatcgga agctgaagat gg 22
<210> 54
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 54
ctcattgctg atccacctag ccgactt 27
<210> 55
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 55
ctaacttttg gtgtgatgat gctga 25
<210> 56
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 56
cgatagatgg tggtgtgagt cttg 24
<210> 57
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 57
agctgatggc aagttaatct ccccgaagtc g 31
<210> 58
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 58
agagaatcgt gaaattatct ctaccg 26
<210> 59
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 59
attgaccatc atactcattg ctga 24
<210> 60
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 60
ccatgtagat ttcccggaca tgaagcc 27
<210> 61
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 61
ccttgaggac gctttgatca tatt 24
<210> 62
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 62
ccttttctta tcgaccatgt actc 24
<210> 63
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 63
ccgagttcga cggccgagta ctg 23
<210> 64
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 64
gttagaaaaa gtaaacaatt aatatagccg g 31
<210> 65
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 65
ggagggtgtt tttggttatc 20
<210> 66
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 66
aatataatcg acggatcccc gggaattc 28
<210> 67
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 67
tttgtacaaa acttggaccc ctaggt 26
<210> 68
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 68
ttctttcaag atgggaatta acatct 26
<210> 69
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 69
tgccttttct tatcgcgaga tgaaaaaggc 30
<210> 70
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 70
cataaaggaa gatggagact tgag 24
<210> 71
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 71
agcatttagc atgtaccatc agaca 25
<210> 72
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 72
cgcacgctta tcgaccataa gccca 25
<210> 73
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 73
caatggacac atgaattatg c 21
<210> 74
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 74
gactctgtat gaactgttcg c 21
<210> 75
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 75
tagaggacct aacagaactc gccgt 25
<210> 76
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 76
ctaagggagg tcaagatgta gc 22
<210> 77
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 77
cgggcctaac ttttggtgtg 20
<210> 78
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 78
ctcatcatcc tcacccagtc agcatca 27
<210> 79
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 79
gttgcggttc tgtcagttcc 20
<210> 80
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 80
cgaccggcgc tgatatatga 20
<210> 81
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 81
tcccgcgtca tcggcgg 17
<210> 82
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 82
gggtgagaca atatatcgac g 21
<210> 83
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 83
gggcatcgca ccggtgag 18
<210> 84
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 84
caccggccaa attcgctctt agccgt 26
<210> 85
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 85
gttcttctct tcatagctca ttacagtttt 30
<210> 86
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 86
caaacctcca tagagttcaa catcttaa 28
<210> 87
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 87
ttagttagat caggatattc ttg 23
<210> 88
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 88
tccttgaacc ttattttata gtgcaca 27
<210> 89
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 89
tcagattgtc gtttcccgcc ttca 24
<210> 90
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 90
tagtcatcat gttgtaccac ttcaaacact 30
<210> 91
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 91
ggccagggct tccgtgat 18
<210> 92
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 92
ccgtcgttgt agaaccattg g 21
<210> 93
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 93
agtccttatg tgctccactt tctggtgca 29
<210> 94
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 94
ggtcgtcctc ctaaggcgaa ag 22
<210> 95
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 95
cttcttcggc ggtcgtccac 20
<210> 96
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 96
cggagccact cggtgccgca actt 24
Claims (10)
1.一种转基因油菜及其产品转化体鉴定阳性质粒分子pYCID-1905，其特征在于：其碱基序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种转基因油菜及其产品转化体鉴定阳性质粒分子pYCID-1905，其含有11个油菜转化体靶标和2个油菜内标基因，依次为：GT73 3’端序列如SEQ ID NO.2；MS1 3’端序列如SEQID NO.3；MS1 5’端序列如SEQ ID NO.4；OXY235 3’端序列如SEQ ID NO.5；OXY235 5’端序列如SEQ ID NO.6；MS8 5’端序列如SEQ ID NO.7；MS8 3’端序列如SEQ ID NO.8；RF3 3’端序列如SEQ ID NO.9；RF3 5’端序列如SEQ ID NO.10；T45 3’端序列如SEQ ID NO.11；RF15’端序列如SEQ ID NO.12；Topas 19/2 3’端序列如SEQ ID NO.13；RF2 5’端序列如SEQ IDNO.14；73496 5’端序列如SEQ ID NO.15；MON88302 5’端序列如SEQ ID NO.16；油菜内标基因HMG I/Y序列如SEQ ID NO.17；油菜内标基因CruA序列如SEQ ID NO.18。
3.一种转基因油菜及其产品转化体鉴定阳性质粒分子pYCID-1905，其为在pUC18载体上***融合序列SEQ ID No.19，构成的质粒分子。
4.按权利要求1所述质粒分子作为转基因油菜及其产品转化体鉴定的阳性对照和或质控样品。
5.一种用于普通PCR鉴定转基因油菜及其产品的试剂盒，其包括权利要求1-3任一项所述的质粒分子以及转基因油菜转化体和油菜内标基因的检测引物。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其中，转基因油菜转化体和油菜内标基因的检测引物如下：
MS1 5′：
引物F 5′—CGGTGAGTAATATTGTACGGCTAA—3′SEQ ID NO.20
R 5′—ATCTCTGGTTAAACATTCCATCTTTG—3′SEQ ID NO.21,
RF1 5′：
引物F 5′—CCTGTGGTCTCAAGATGGATCA—3′SEQ ID NO.22
R 5′—GGTGACTACACGCGACTCAT—3′SEQ ID NO.23；
RF2 5′：
引物F 5′—TTGGTGGACCCTTGAGGAAAC—3′SEQ ID NO.24
R 5′—CCATCTAATAGGGTGAGACAAT—3′SEQ ID NO.25；
MS8 5′：
引物F 5′—CCTTTTCTTATCGACCATGTACTC—3′SEQ ID NO.26
R 5′—AATTTTAAAAACTTGTGGGATGCT—3′SEQ ID NO.27；
RF3 3′：
引物F 5′—CAATAACTTTGTTGGGCTTATGG—3′SEQ ID NO.28
R 5′—CTCGTCTCGGACCTCCGAAAACC—3′SEQ ID NO.29；
OXY235 3′：
F 5′—TTTGTTTATTGCTTTCGCC—3′SEQ ID NO.30
R 5′—CCAGGGGATTCAGTTGGA—3′SEQ ID NO.31；
Topas 19/2 3′：
引物F 5′—CGGCCTTAATCCCACCCCAG—3′SEQ ID NO.32
R 5′—AGTTCCAAACGTAAAACGGCTT—3′SEQ ID NO.33；
T45 3′：
引物F 5′—TCCCATTTATTTACGGTCAC—3′SEQ ID NO.34
R 5′—CCATGGGAATTCATTTACAA—3′SEQ ID NO.35；
GT73 3′：
引物F 5′—AATAACGCTGCGGACATCTA—3′SEQ ID NO.36
R 5′—CAGCAAGATTCTCTGTCAACAA—3′SEQ ID NO.37；
73496 5′：
引物F 5′—ACTTGTTCGTTGGAGTTGTC—3′SEQ ID NO.38
R 5′—TCGTGTTCAGTCCAATGACC—3′SEQ ID NO.39；
MON88302 5′：
引物F 5′—CTCCTCAAGTTGTACAGTCTTGAAGAGA—3′SEQ ID NO.40
R 5′—CAGGACCTGCAGAAGCTTGATAAC—3′SEQ ID NO.41；
油菜内标准基因CruA：
CruAF398 5′—GGCCAGGGCTTCCGTGAT—3′SEQ ID NO.42
CruAR547 5′—CTGGTGGCTGGCTAAATCGA—3′SEQ ID NO.43；
油菜内标准基因HMG I/Y：
hmg-F 5′—TCCTTCCGTTTCCTCGCC—3′SEQ ID NO.44
hmg-R 5′—TTCCACGCCCTCTCCGCT—3′SEQ ID NO.45。
7.一种用于实时荧光PCR鉴定转基因油菜及其产品的试剂盒，其包括权利要求1-3任一项所述质粒分子以及转基因油菜转化体和油菜内标基因的检测引物对和探针。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，转基因油菜转化体和油菜内标基因的检测引物和探针如下：
RT73转化体：
引物RT73F 5′—CCATATTGACCATCATACTCATTGCT—3′SEQ ID NO.46
RT73R 5′—GCTTATACGAAGGCAAGAAAAGGA—3′SEQ ID NO.47，
探针RT73P 5′—TTCCCGGACATGAAGATCATCCTCCTT—3′SEQ ID NO.48；
MS1转化体5’；
引物MS1-5F 5′—ATCTCTGGTTAAACATTCCATCTTTG—3′SEQ ID NO.49
MS1-5R 5′—CGAGCTTTCTAATTTCAAACTATTCGG—3′SEQ ID NO.50，
探针MS1-5P 5′—TGGATAGGTTCTTCAGCATCATCACACC—3′SEQ ID NO.51；
MS1转化体3′:
引物MS1-MLD025 5′—ACGCTGCGGACATCTACATT—3′SEQ ID NO.52
MS1-MDB175 5′—CTAGATCGGAAGCTGAAGATGG—3′SEQ ID NO.53，
探针MS1-TM030 5′—CTCATTGCTGATCCACCTAGCCGACTT—3′SEQ ID NO.54；
OXY235转化体5’：
引物OXY235-5F 5′—CTAACTTTTGGTGTGATGATGCTGA—3′SEQ ID NO.55
OXY235-5R 5′—CGATAGATGGTGGTGTGAGTCTTG—3′SEQ ID NO.56，
探针OXY235-5P 5′—AGCTGATGGCAAGTTAATCTCCCCGAAGTCG—3′SEQ ID NO.57；
OXY235转化体3’：
引物QOXY235-3LG 5′—AGAGAATCGTGAAATTATCTCTACCG—3′SEQ ID NO.58
QOXY235-3LV 5′—ATTGACCATCATACTCATTGCTGA—3′SEQ ID NO.59，
探针QOXY235-3L 5′—CCATGTAGATTTCCCGGACATGAAGCC—3′SEQ ID NO.60；
MS8转化体5’；
引物QMS8RG 5′—CCTTGAGGACGCTTTGATCATATT—3′SEQ ID NO.61
QMS8RV 5′—CCTTTTCTTATCGACCATGTACTC—3′SEQ ID NO.62，
探针QMS8RFAM 5′—CCGAGTTCGACGGCCGAGTACTG—3′SEQ ID NO.63；
MS8转化体3’；
引物MS8L-KVM085 5′—GTTAGAAAAAGTAAACAATTAATATAGCCGG—3′SEQ ID NO.64
MS8L-HCA048 5′—GGAGGGTGTTTTTGGTTATC—3′SEQ ID NO.65，
探针MS8L-TM011 5′—AATATAATCGACGGATCCCCGGGAATTC—3′SEQ ID NO.66；
RF3转化体3’；
引物QRF3RG 5′—TTTGTACAAAACTTGGACCCCTAGGT—3′SEQ ID NO.67
QRF3RV 5′—TTCTTTCAAGATGGGAATTAACATCT—3′SEQ ID NO.68，
探针QRF3P5′—TGCCTTTTCTTATCGCGAGATGAAAAAGGC—3′SEQ ID NO.69；
RF3转化体5’：
RF3DPA165 5′—CATAAAGGAAGATGGAGACTTGAG—3′SEQ ID NO.70
RF3KVM084 AGCATTTAGCATGTACCATCAGACA—3′SEQ ID NO.71，
探针RF3TM010 5′—CGCACGCTTATCGACCATAAGCCCA—3′SEQ ID NO.72；
T45转化体：
引物T45KVM172 5′—CAATGGACACATGAATTATGC—3′SEQ ID NO.73
T45MDB599 5′—GACTCTGTATGAACTGTTCGC—3′SEQ ID NO.74，
探针T45TM026 5′—TAGAGGACCTAACAGAACTCGCCGT—3′SEQ ID NO.75；
RF1转化体：
引物RF1-MDB118 5′—CTAAGGGAGGTCAAGATGTAGC—3′SEQ ID NO.76
RF1-KVM170 5′—CGGGCCTAACTTTTGGTGTG—3′SEQ ID NO.77，
探针RF1-TM022 5′—CTCATCATCCTCACCCAGTCAGCATCA—3′SEQ ID NO.78；
Topas转化体：
引物TOPAS 19/2MDB685 5′—GTTGCGGTTCTGTCAGTTCC—3′SEQ ID NO.79
TOPAS 19/2KVM180 CGACCGGCGCTGATATATGA—3′SEQ ID NO.80，
探针TOPAS 19/2TM029 5′—TCCCGCGTCATCGGCGG—3′SEQ ID NO.81；
RF2转化体：
引物RF2-MDB207 5′—GGGTGAGACAATATATCGACG—3′SEQ ID NO.82
RF2-KVM171 5′—GGGCATCGCACCGGTGAG—3′SEQ ID NO.83，
探针RF2-TM024 5′—CACCGGCCAAATTCGCTCTTAGCCGT—3′SEQ ID NO.84；
73496转化体：
引物73496-2824 5′—GTTCTTCTCTTCATAGCTCATTACAGTTTT—3′SEQ ID NO.85
73496-2825 5′—CAAACCTCCATAGAGTTCAACATCTTAA—3′SEQ ID NO.86，
探针73496-QP-83 5′—TTAGTTAGATCAGGATATTCTTG—3′SEQ ID NO.87；
MON88302转化体：
引物88302QF 5′—TCCTTGAACCTTATTTTATAGTGCACA—3′SEQ ID NO.88
88302QR 5′—TCAGATTGTCGTTTCCCGCCTTCA—3′SEQ ID NO.89，
探针88302QP 5′—TAGTCATCATGTTGTACCACTTCAAACACT—3′SEQ ID NO.90；
油菜内标准基因
CruA：qCruAF 5′—GGCCAGGGCTTCCGTGAT—3′SEQ ID NO.91
qCruAR 5′—CCGTCGTTGTAGAACCATTGG—3′SEQ ID NO.92，
探针qCruAP 5′—AGTCCTTATGTGCTCCACTTTCTGGTGCA—3′SEQ ID NO.93；
油菜内标准基因HMG I/Y：qhmg-F 5′—GGTCGTCCTCCTAAGGCGAAAG—3′SEQ ID NO.94和qhmg-R5′—CTTCTTCGGCGGTCGTCCAC—3′SEQ ID NO.95，
探针qhmg-P 5′—CGGAGCCACTCGGTGCCGCAACTT—3′SEQ ID NO.96。
9.一种转基因油菜及其产品普通PCR鉴定的方法，其包括以下步骤：
1)提取样品总DNA，
2)利用权利要求6所述转基因油菜转化体和油菜内标基因的检测引物对权利要求1-3任一项所述的阳性质粒分子，以及样品基因组DNA进行PCR扩增；
3)琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色后鉴定是否存在扩增产物；在阳性质粒分子正常扩增且样品中油菜内标准基因正常扩增的情况下，如存在扩增产物则说明油菜样品中含相应油菜转化体。
10.一种转基因油菜及其产品荧光实时PCR鉴定的方法，其包括以下步骤：
1)提取样品总DNA，
2)利用权利要求8所述转基因油菜筛查单元和油菜内标基因的检测引物对和探针对权利要求1-3任一项所述的阳性质粒分子，以及样品基因组DNA进行PCR扩增；
3)实时荧光PCR产物根据是否有典型扩增曲线判断是否有相应油菜转化体；在阳性质粒分子正常扩增且样品中油菜内标准基因正常扩增的情况下，如存在扩增产物则说明油菜样品中含有油菜转化体。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910775552.2A CN110527737B (zh) | 2019-08-21 | 2019-08-21 | 一种转基因油菜及其产品转化体鉴定阳性质粒分子pYCID-1905及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910775552.2A CN110527737B (zh) | 2019-08-21 | 2019-08-21 | 一种转基因油菜及其产品转化体鉴定阳性质粒分子pYCID-1905及应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110527737A true CN110527737A (zh) | 2019-12-03 |
| CN110527737B CN110527737B (zh) | 2024-03-08 |
Family
ID=68663958
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910775552.2A Active CN110527737B (zh) | 2019-08-21 | 2019-08-21 | 一种转基因油菜及其产品转化体鉴定阳性质粒分子pYCID-1905及应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN110527737B (zh) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109811083A (zh) * | 2019-04-03 | 2019-05-28 | 深圳出入境检验检疫局食品检验检疫技术中心 | 转基因油菜品系mon88302检测方法和试剂 |
| CN109825631A (zh) * | 2019-04-03 | 2019-05-31 | 深圳出入境检验检疫局食品检验检疫技术中心 | 转基因油菜品系Topas19-2检测方法和试剂 |
| CN109825630A (zh) * | 2019-04-03 | 2019-05-31 | 深圳出入境检验检疫局食品检验检疫技术中心 | 一种转基因油菜品系t45检测试剂、试剂盒和检测方法 |
| CN109852724A (zh) * | 2019-04-03 | 2019-06-07 | 深圳出入境检验检疫局食品检验检疫技术中心 | 转基因油菜品系oxy235检测方法、试剂和试剂盒 |
| CN111621585A (zh) * | 2020-04-16 | 2020-09-04 | 大连民族大学 | 一种同时检测多种转基因油菜品系的快速检测试剂盒及其应用 |
| CN111826387A (zh) * | 2020-07-07 | 2020-10-27 | 黑龙江省农业科学院农产品质量安全研究所 | 一种转基因玉米品系鉴定阳性质粒分子 |
Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101020907A (zh) * | 2007-01-24 | 2007-08-22 | 中国农业科学院油料作物研究所 | 转基因油菜Topas 19/2事件外源***载体旁侧序列及其应用 |
| CN102212540A (zh) * | 2011-03-31 | 2011-10-12 | 中华人民共和国上海出入境检验检疫局 | 同时适于七个转基因油菜品系特异性检测的标准分子 |
| US20130316346A1 (en) * | 2012-05-23 | 2013-11-28 | E I Du Pont De Nemours And Company | Brassica genomic assays |
| CN104651511A (zh) * | 2015-02-14 | 2015-05-27 | 中国农业科学院油料作物研究所 | 一种阳性质粒分子pBI121-Screening及其应用 |
| CN106834346A (zh) * | 2017-01-23 | 2017-06-13 | 中国农业科学院油料作物研究所 | 一个聚合常用筛查靶标的转基因油菜SD‑rapeseed及其应用 |
| CN107385106A (zh) * | 2017-09-26 | 2017-11-24 | 农业部环境保护科研监测所 | 转基因油菜RF1、Oxy235、RF3多重实时荧光定量PCR检测试剂盒及应用 |
| CN108841990A (zh) * | 2018-07-18 | 2018-11-20 | 四川华汉三创生物科技有限公司 | 一种转基因油菜品系的检测试剂盒和方法 |
| CN109811083A (zh) * | 2019-04-03 | 2019-05-28 | 深圳出入境检验检疫局食品检验检疫技术中心 | 转基因油菜品系mon88302检测方法和试剂 |
| CN109825634A (zh) * | 2019-04-03 | 2019-05-31 | 深圳出入境检验检疫局食品检验检疫技术中心 | 转基因油菜品系dp-073496-4检测方法和试剂 |
-
2019
- 2019-08-21 CN CN201910775552.2A patent/CN110527737B/zh active Active
Patent Citations (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101020907A (zh) * | 2007-01-24 | 2007-08-22 | 中国农业科学院油料作物研究所 | 转基因油菜Topas 19/2事件外源***载体旁侧序列及其应用 |
| CN102212540A (zh) * | 2011-03-31 | 2011-10-12 | 中华人民共和国上海出入境检验检疫局 | 同时适于七个转基因油菜品系特异性检测的标准分子 |
| US20130316346A1 (en) * | 2012-05-23 | 2013-11-28 | E I Du Pont De Nemours And Company | Brassica genomic assays |
| CN104651511A (zh) * | 2015-02-14 | 2015-05-27 | 中国农业科学院油料作物研究所 | 一种阳性质粒分子pBI121-Screening及其应用 |
| CN106834346A (zh) * | 2017-01-23 | 2017-06-13 | 中国农业科学院油料作物研究所 | 一个聚合常用筛查靶标的转基因油菜SD‑rapeseed及其应用 |
| CN107385106A (zh) * | 2017-09-26 | 2017-11-24 | 农业部环境保护科研监测所 | 转基因油菜RF1、Oxy235、RF3多重实时荧光定量PCR检测试剂盒及应用 |
| CN108841990A (zh) * | 2018-07-18 | 2018-11-20 | 四川华汉三创生物科技有限公司 | 一种转基因油菜品系的检测试剂盒和方法 |
| CN109811083A (zh) * | 2019-04-03 | 2019-05-28 | 深圳出入境检验检疫局食品检验检疫技术中心 | 转基因油菜品系mon88302检测方法和试剂 |
| CN109825634A (zh) * | 2019-04-03 | 2019-05-31 | 深圳出入境检验检疫局食品检验检疫技术中心 | 转基因油菜品系dp-073496-4检测方法和试剂 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| ISABEL TAVERNIERS 等: "Event-specific plasmid standards and real-time PCR methods for transgenic Bt11, Bt176, and GA21 maize and transgenic GT73 canola", 《J AGRIC FOOD CHEM》 * |
| 余笑波 等: "转基因油菜Ms8质粒分子的制备", 《浙江农业学报》 * |
| 周云龙主编, 济南：山东大学出版社 * |
Cited By (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109811083A (zh) * | 2019-04-03 | 2019-05-28 | 深圳出入境检验检疫局食品检验检疫技术中心 | 转基因油菜品系mon88302检测方法和试剂 |
| CN109825631A (zh) * | 2019-04-03 | 2019-05-31 | 深圳出入境检验检疫局食品检验检疫技术中心 | 转基因油菜品系Topas19-2检测方法和试剂 |
| CN109825630A (zh) * | 2019-04-03 | 2019-05-31 | 深圳出入境检验检疫局食品检验检疫技术中心 | 一种转基因油菜品系t45检测试剂、试剂盒和检测方法 |
| CN109852724A (zh) * | 2019-04-03 | 2019-06-07 | 深圳出入境检验检疫局食品检验检疫技术中心 | 转基因油菜品系oxy235检测方法、试剂和试剂盒 |
| CN111621585A (zh) * | 2020-04-16 | 2020-09-04 | 大连民族大学 | 一种同时检测多种转基因油菜品系的快速检测试剂盒及其应用 |
| CN111621585B (zh) * | 2020-04-16 | 2021-03-02 | 大连民族大学 | 一种同时检测多种转基因油菜品系的快速检测试剂盒及其应用 |
| CN111826387A (zh) * | 2020-07-07 | 2020-10-27 | 黑龙江省农业科学院农产品质量安全研究所 | 一种转基因玉米品系鉴定阳性质粒分子 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN110527737B (zh) | 2024-03-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110527737B (zh) | 一种转基因油菜及其产品转化体鉴定阳性质粒分子pYCID-1905及应用 | |
| US5286636A (en) | DNA cloning vectors with in vivo excisable plasmids | |
| CN101302520B (zh) | 转基因水稻tt51-1转化事件外源载体整合位点全序列及其应用 | |
| CN112266914B (zh) | 一种熊蜂生假丝酵母强组成型启动子及其应用 | |
| CN105368732B (zh) | 一株产木糖醇的工业酿酒酵母菌株及构建方法 | |
| CN104962576B (zh) | 一种柱状黄杆菌基因定向敲除质粒及应用 | |
| CN110804559B (zh) | 一株重组产黄青霉基因工程菌及其构建方法与应用 | |
| CN111235118B (zh) | 一种人3型腺病毒复制缺陷型重组病毒、构建方法及应用 | |
| CN101838663A (zh) | 一种大肠杆菌-棒状杆菌穿梭组成型表达载体及其构建方法 | |
| US6774281B1 (en) | Method for the induction of pathogen resistance in plants | |
| CN107267538B (zh) | 一种植物质体表达载体的构建方法及应用 | |
| CN109234318B (zh) | 一种提高红曲霉菌胞外色素的方法 | |
| CN110117622B (zh) | 一种CRISPR/Cas基因编辑***及其制备方法和应用 | |
| CN110452893B (zh) | 一种高保真CRISPR/AsCpf1突变体的构建及其应用 | |
| CN111378684B (zh) | 一种热诱导的基因编辑***CRISPR-Cas12b在陆地棉中的应用 | |
| CN110331170A (zh) | 一种双重gRNA的基因表达元件及其构建方法与应用 | |
| CN114107369A (zh) | 一种myc标签融合表达载体的制备方法及其应用 | |
| CN113151276A (zh) | 一种il-4基因缺失斑马鱼 | |
| CN109777829A (zh) | 一种基因编辑U6启动子驱动的sgRNA表达组件的构建方法 | |
| CN108148876B (zh) | 一种哈茨木霉菌基因敲除方法 | |
| CN112760241B (zh) | 一株重组产黄青霉基因工程菌及其构建方法与应用 | |
| CN108949800B (zh) | 一种高效便利定位基因***座位的丝状真菌遗传转化***及其应用 | |
| KR102553935B1 (ko) | 단백질을 발현하는 세포의 배양 방법 | |
| CN102649961B (zh) | 一种乙肝病毒核心抗原的核酸适配体序列及用途 | |
| CN114317529B (zh) | 一种寡核苷酸链随机拼合方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |