CN110511962A - 一种通过双位点切割实现猪Gjb2基因编码序列精准编辑的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于动物基因组编辑技术领域，具体涉及通过双位点切割实现猪Gjb2基因编码序列精准编辑的方法。本发明要解决的技术问题是提供一种Gjb2基因编码序列编辑精准编辑的猪模型制备方法。本发明解决上述技术问题的技术方案是提供通过双位点切割实现猪Gjb2基因编码序列精准编辑的方法。该方法包括以下步骤：a、准备sgRNA对；b、将sgRNA对、供体DNA、编码spCas9的mRNA和/或spCas9纯化重组蛋白的混合物导入猪早期胚胎细胞质中；c、将猪早期胚胎移至受体母猪输卵管中，使之受孕；d、妊娠期满后产下仔猪，得到Gjb2基因精准编辑后的猪模型。本发明方法可高效精准的实现猪Gjb2基因编码序列的精准突变，该类突变动物模型具有很好的应用前景。

Description

一种通过双位点切割实现猪Gjb2基因编码序列精准编辑的 方法
技术领域
本发明属于动物基因组编辑技术领域，具体涉及一种通过双位点切割实现猪Gjb2基因编码序列精准编辑的方法和用于此法的试剂盒。
背景技术
Gjb2(Gap Junction Protein Beta 2)基因编码的Cx26蛋白属于缝隙连接蛋白基因家族，与相邻细胞的缝连接蛋白组成一个完整的缝隙连接通道，这些通道在信息传导和物质交换中起重要作用，是完成电解质、第二信使和代谢产物的细胞间转换的重要通道。Gjb2基因在物种之间高度保守，表达于内耳、食道、小肠、大脑皮质等部位，是重要的耳聋相关基因。Gjb2基因突变引起的耳聋大多表现为语前发病，且导致中重度或极重度耳聋，表现为先天性耳聋或迟发性听力损伤。Gjb2基因含有两个外显子，其中第一外显子为5’-UTR区，而蛋白编码序列则完全包含于第二外显子。
Gjb2基因由于其高度的保守性和重要的生物学功能，其双等位基因***性敲出后动物往往具有致死表型。在遗传性耳聋病人中，Gjb2基因突变方式复杂多变，目前已有111种突变方式被报道，其中显性突变9种。Gjb2基因编码序列第235位碱基C缺失(Gjb2c.235delC)突变是中国人群最常见的遗传性耳聋突变，其人群突变携带率高达1.88-1.925％。Gjb2 c.235delC纯合突变导致常染色体隐性非综合征遗传性耳聋，患者多为双耳重深度耳聋(双耳大于90dB)，不仅纯合突变可以致聋，Gjb2c.235delC和其他致病突变位于两条不同的染色体上形成双重杂合性突变时，也可以导致耳聋。除Gjb2c.235delC突变以外，Gjb2基因编码蛋白第37位缬氨酸突变为异亮氨酸(GJB2 p.V37I)突变在中国人群中也有很高的发病率，并呈现与听力的高度相关性。但是，能精准模拟人类突变模式的“拟人化”Gjb2突变动物模型缺乏，导致其致病机制不清、靶向性治疗方案缺乏。因此，精准构建Gjb2基因突变动物模型，对深入研究Gjb2基因突变的致聋机制、研发更精准的基于机制的靶向治疗策略等具有重要的意义。
猪与人类在解剖学、生理学和生物化学方面具有相似性，并且猪模型被认为是生物医学研究与开发中具有广阔前景的转化模型。猪是创制耳聋动物模型的理想材料：猪与人在听觉器官的形态和结构方面具有极高相似性；猪对声音频率的敏感性及其阈值与人高度一致；猪耳蜗大小、形态、结构与人类非常相似；与人一样，在猪出生时，内耳形态已基本发育成熟，并具备正常听力，而小鼠等啮齿类动物为听觉***晚熟动物：出生时无听力，出生后内耳需继续发育才具备正常听力；此外，由于耳蜗骨壁厚度、强度与人更为接近，猪耳蜗已经被广泛应用于耳蜗开窗术、耳蜗精细断层扫描术、电子耳蜗植入等外科技术的研发，是耳科学转化医学研究的重要模式动物。
尽管猪(尤其是体重与器官大小与人高度相似的小型猪)已用于多种人类重大疾病的基础与转化医学研究，例如心血管、代谢综合征、消化(胃)和骨骼疾病、糖尿病、心脏病、皮肤病和急性和慢性肠道炎症等，但是，目前尚无Gjb2基因突变猪及其它大动物模型的报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种Gjb2基因编码序列精准编辑的猪模型制备方法。本发明解决上述技术问题的技术方案是提供了一种通过双位点切割实现猪Gjb2基因编码序列精准编辑的方法。
该方法包括以下步骤：
a、准备一对sgRNA，其中一条sgRNA识别Gjb2基因编码序列上游的切割位点，另一条sgRNA识别基因编码序列下游的切割位点；
所述识别Gjb2基因编码序列下游切割位点的sgRNA能识别猪的Gjb2基因上的PAM位点为CGG；
所述识别Gjb2基因编码序列上游切割位点的sgRNA能识别猪的Gjb2基因上的PAM位点为GGG。
b、将步骤a所述的一对sgRNA、带有预期突变序列的供体DNA、编码spCas9的mRNA和/或spCas9纯化重组蛋白充分混合后，将混合物通过显微注射导入猪早期胚胎的细胞质中；
c、将步骤a处理后的猪早期胚胎移植至受体母猪的输卵管中，使受体母猪受孕；
d、受孕的受体母猪在妊娠期满后产下仔猪，得到Gjb2基因精准编辑后的猪模型。
进一步的，上述方法中所述的sgRNA中：
识别猪Gjb2基因编码序列下游切割位点的sgRNA的引导序列为5′-GAAUCUGUAUCUGGGAGACG-3′或其互补序列；
识别猪Gjb2基因编码序列上游切割位点的sgRNA的引导序列为5′-GACCAAGCGACACGGCACAG-3′或其互补序列。
进一步的，上述方法中所述的供体DNA为将猪Gjb2基因的37位缬氨酸(V37)密码子突变为异亮氨酸(I)密码子的供体DNA。
优选的，上述方法中所述的供体DNA的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示或为其互补序列。
进一步的，上方法步骤b中所述的sgRNA对、供体DNA以及编码spCas9的mRNA和/或spCas9纯化重组蛋白之间的配比为按在混合物中的终浓度sgRNAs 10～15ng/uL、spCas9mRNA和/或spCas9纯化重组蛋白20～25ng/uL、以及供体DNA 5～10ng/uL。
其中，上述方法中所述的猪早期胚胎为4细胞期及之前的胚胎。
进一步的，上述方法步骤c中还包括有检测验证步骤：使用引物对扩增仔猪基因组DNA样品，根据扩增结果测序确定是否含有预期基因编辑基因型Gjb2c.109-111GTG>ATC，若含有该基因型即表明建模成功。
其中，所述的检测引物对为Gjb2-CDS-F/Gjb2-CDS-R引物对，序列为：
Gjb2-CDS-F：5-TCACCTTTGTGGGTGAGGTTGCGTAAGAA-3；
Gjb2-CDS-R：5-GCTTGACGACGGGAATCTGTATCTGG-3。
本发明还提供了一种制备Gjb2基因突变猪模型的试剂盒。该试剂盒包括引导序列如下所示的sgRNA对：
5′-GAAUCUGUAUCUGGGAGACG-3′；
5′-GACCAAGCGACACGGCACAG-3′。
进一步的，上述试剂盒还包括将猪Gjb2基因的37位缬氨酸(V)密码子突变为异亮氨酸(I)密码子的供体DNA。优选的，该供体DNA的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示或为其互补序列。
更进一步的，上述试剂盒还包括编码spCas9蛋白的mRNA和/或spCas9重组蛋白。
本发明的关键之一是使用特殊的供体DNA，以将猪Gjb2基因编码序列中第37个密码子由GTG突变为ATC(c.109-111GTG>ATC)，使其编码的氨基酸由缬氨酸(V)突变为异亮氨酸(I)。供体DNA在突变的编码序列上游***一段含有通用内含子剪切受体序列的异源性序列(heterology)，在突变编码序列下游引入一段人Gjb2基因翻译终止密码子3’端的侧翼非编码序列(3’UTR)序列以作为异源序列；在上、下游异源序列的两侧，精确依照上、下游sgRNA在猪Gjb2基因中的切割位点，各引入一段猪Gjb2基因组序列以作为同源臂。配合特定的sgRNA对，利用crispr/cas9体系，实现猪Gjb2基因的精准高效编辑。
本发明的有益效果在于：通过双位点切割可以实现对猪Gjb2基因编码序列高效率的基于“同源序列引导修复”(homology-directed repair,HDR)机制的精准编辑；该方法一方面能够扩大sgRNA选择范围，解决可能在目标编辑区域没有高效sgRNA位点的问题；另一方面利用长链DNA为模板，能实现Gjb2基因编码序列从单碱基突变到序列置换等不同实验目的；此外，避免了对Gjb2基因编码序列的直接切割，理论上可减少对动物生长发育的潜在影响，更有利于突变动物的获得；作为应用案例，设计了可实现高效双位点切割的sgRNA对，和与之配套的可实现Gjb2 c.109-111GTG>ATC精准编辑的长链DNA模板；基于上述的发现，得到了猪的Gjb2基因突变模型，实现了预期的精准突变。本研究领域的人员可利用上述切割位点，利用含有不同突变的DNA模板，实现任何所需要的猪Gjb2基因编码序列的突变或置换，具有很好的应用前景。
附图说明
图1、本发明设计的长单链DNA模板结构图。
图2、本发明方法作用机制示意图。
图3、猪Gjb2基因结构与sgRNA对的切割位点所在位置示意图。E1、E2表示外显子，E2中的方框表示猪Gjb2基因的编码序列，ATG表示起始密码子，TAA表示终止密码子；白框箭头表示转录方向，pGjb2-5fs-sgRNA和pGjb2-3fs-sgRNA分别表示上、下游sgRNA的切割位点所对应的位置。
图4用于猪Gjb2基因编码序列人源化精确突变的长单链DNA模板的设计示意图。方框：发生了c.109-111GTG>ATC突变(即p.V37I突变)的猪Gjb2基因编码序列；浅灰色细线条：上、下游异源序列；黑色粗线条：上、下游同源重组臂。
图5通过双位点切割，细胞通过HDR机制实现猪Gjb2编码序列的置换和突变位点的准确导入。left Cas9/sgRNA:左侧(上游)sgRNA切割位点；Right Cas9/sgRNA:右侧(下游)sgRNA切割位点；pig Gjb2 CDS：猪Gjb2基因编码序列；pig genomic locus:猪基因组位点；Right arm：右侧(上游)同源臂；Left arm：左侧(下游)同源臂；lssODN:长单链供体DNA；pGJB2p.V37I CDS:编码pGJB2 p.V37I突变蛋白的编码序列；Mutant locus:预期突变位点。
图6通过对猪Gjb2基因编码序列的单位点切割实现猪Gjb2基因编码序列c.109-111GTG>ATC(p.V37I)突变的导入。A:白框箭头表示基因转录方向；E1位猪Gjb2基因的第一外显子；E2位猪Gjb2基因第二外显子；第二外显子中的方框区域表示猪Gjb2基因的编码序列；黑色箭头表示pGjb2-V37-sgRNA的结合区域；灰色线条表示pGjb2-V37I-ssODN的覆盖区域；B：白框箭头表示pGjb2-V37-sgRNA结合区域；黑色加粗的gtg表示拟突变的靶位点；黑色加粗的atc表示目标突变碱基.
图7首建猪个体耳部组织的遗传分析。pGjb2 genomic locus:猪Gjb2基因序列；Founderpiglet1,2表示发生预期突变的首建猪个体；Sequencing chromatography:PCR产物测序峰图。
图8GJB2 p.V37I突变猪传代分析。pGjb2 genomic sequence:猪Gjb2基因序列；F1piglet#1-6:6只F1代仔猪；Sequencing chromatography:突变位点的测序峰图。
具体实施方式
GJB2突变会引起的耳聋大多表现为语前发病，且导致中重度或极重度耳聋。研究其发病具体机制以及治疗手段的筛选都离不开合适的动物模型。
已有临床研究表明，人GJB2分子第37位缬氨酸(V)突变为异亮氨酸(I)的GJB2p.V37I(Gjb2 c.109-111GTG>ATC)突变与耳聋高度相关。GJB2分子在物种之间高度保守，人GJB2分子第37位缬氨酸(V)即对应于猪GJB2分子相应位置的缬氨酸。为了制备与人类遗传突变模式高度一致的猪模型，本发明前期研究利用CRISPR***，尝试通过直接对猪Gjb2基因编码序列中编码第37位缬氨酸的密码子位点进行切割，以制备GJB2 p.V37I突变的猪模型。但是发现，使用直接对Gjb2基因编码序列进行单位点切割的方法，难以获得含有预期Gjb2基因突变的猪模型。
针对上述问题，本发明在猪Gjb2基因编码序列上、下游各设计了1个sgRNA，使其作为一对sgRNA同时切割猪Gjb2基因编码序列上、下游的非编码区域；同时，设计了一个与上述sgRNA对配套、携带有Gjb2 c.109-111GTG>ATC突变的长链DNA作为供体DNA，然后通过“同源序列引导的DNA修复”(HDR)机制，达到基因编辑的目的。基于本发明提供的sgRNA对，本领域研究人员可对猪Gjb2基因编码序列进行所需要的任何精准突变或序列置换。
具体而言，在本发明提供的一个实施例中，将猪Gjb2基因编码序列中第37个密码子由GTG突变为ATC(c.109-111GTG>ATC)，使其编码的氨基酸由缬氨酸(V)突变为异亮氨酸(I)；在突变的编码序列上游***一段含有通用内含子剪切受体序列的异源性序列(heterology)，在突变编码序列下游引入一段人Gjb2基因翻译终止密码子3’端的侧翼非编码序列(3’UTR)序列以作为异源序列；在上、下游异源序列的两侧，精确依照上、下游sgRNA在猪Gjb2基因中的切割位点，各引入一段猪Gjb2基因组序列以作为同源臂，具体结构如图4所示。所述的同源序列是其序列指与上述sgRNA对在猪Gjb2基因序列中的切割位点之间区域的上、下游侧翼序列相同；
在设计了携带有Gjb2 c.109-111GTG>ATC突变的长链DNA后，进行基因编辑的原理为：
1、通过体外转录、逆转录以及RNaseH酶切RNA-DNA杂交双链中的RNA，获得上述长链供体DNA的单链(长单链DNA，long single-stranded DNA，lssDNA)；
2、在基因编码序列两侧的非编码区域，选取两个活性强、特异性高的CRISPR切割位点及其对应的sgRNAs；
3、将针对两个切割位点的sgRNA,spCas9 mRNA或纯化的重组spCas9蛋白和作为同源重组模板的长单链DNA，通过细胞转染或显微注射等途径导入细胞内；
4、识别两侧切割位点的sgRNA在编码序列两侧切割DNA，形成双链断裂(DSB)；
5、细胞通过核酸外切酶在DSB处对DNA断裂末端进行5’-3’外切，形成含有3’末端的局部单链DNA；
6、细胞以其中一侧的DSB中能与长单链DNA模板的同源序列互补的单链DNA为引物，以长单链DNA为模板，通过DNA复制合成长单链模板的互补链(即合成第一条链)；
7、细胞以另一侧DSB中的单链DNA为引物，以新合成的长单链DNA的互补链为模板，通过DNA复制合成第二条链；
8、通过两条链的复制，目的基因在两个切割位点之间的序列被游离，而双链化的长单链DNA模板序列与两个切割位点的上、下游侧翼序列相连接；
9、在长链DNA模板设计中，一是将两侧同源序列的位置准确对应目标外显子两侧的切割位点，提高同源重组的效率，二是在两侧同源序列的内侧，引入一段异源序列，促使细胞必须以对侧DSB的单链DNA为引物启动DNA的复制，而不能用同一侧DSB的单链DNA为引物启动复制，确保了突变序列对目标序列的准确置换，提高了基因编辑效率。
在本发明的一个实例中，利用本发明设计的长单链DNA作为供体DNA，以及两侧的sgRNA对的基础上，本领域技术人员就能够通过CRISPR/Cas9的基因组编辑***，将上述的sgRNA对、供体DNA与编码spCas9的mRNA和/或spCas9纯化重组蛋白充分混合后，将混合物通过显微注射导入猪早期胚胎的细胞质中；再将上述处理后的猪早期胚胎移植至受体母猪的输卵管中，使受体母猪受孕；受孕的受体母猪在妊娠期满后产下仔猪，得到Gjb2突变猪模型。
其中，上述的sgRNA对、供体DNA以及编码spCas9的mRNA和/或spCas9纯化重组蛋白之间的配比例为按在混合物中的终浓度为：sgRNA10～15ng/uL、spCas9 mRNA和/或spCas9纯化重组蛋白20～25ng/uL、以及供体DNA 5～10ng/uL。
进一步的，上述方法中所述的猪早期胚胎为4细胞期及之前的胚胎。为了检测上述方法建模是否成功，还可以使用引物扩增仔猪基因组DNA样品，根据扩增结果测序确定是否含有预期基因编辑基因型，若含有该基因型即表明建模成功。本发明也提供了有效的检测用引物。
在本发明的一个实例中，利用本发明方法将相应的体外转录的sgRNA对和体外制备的长单链DNA模板以及spCas9 mRNA通过显微注射同时导入猪1～4细胞期的受精卵中，并将注射后的受精卵移植于处于发情期的成年母猪输卵管中，高效获得了猪Gjb2c.109-111GTG>ATC突变猪，首建猪的精准突变率为50％；进一步通过首建猪之间的交配繁殖，其后代小猪的纯合突变率为100％。而使用常规CRISPR-Cas9方法的对照组，则没有能够获得突变猪。
以下通过对实施例对本发明进行更详细的说明。
实施例一猪Gjb2基因编码序列的精确突变一、实验方案：
实验目的为对猪的Gjb2基因的编码序列进行精准突变，使其第37位缬氨酸(V)突变为异亮氨酸(I)。
1、长单链DNA的制备
1)通过基因合成获得含有长单链DNA模板序列的双链DNA，并将其置于T7启动子序列的下游，获得长单链DNA模板体外转录质粒；
2)在上述体外转录质粒中长单链DNA模板序列的下游，选择合适的酶切位点切割质粒，实现质粒的充分线性化(选用的酶切位点不能切割长单链DNA模板序列或T7启动子序列)。
3)进行线性质粒DNA的纯化并去除RNA酶污染；
4)用无RNA酶的70％乙醇充分洗涤DNA沉淀，之后用无RNA酶的去离子水溶解DNA沉淀；
5)取1ug线性的模板质粒DNA，用体外转录试剂盒MEGAshortscriptTM T7Transciption Kit(invitrogen，AM1354)进行体外转录，获得长单链模板的互补RNA(详细实验步骤参见试剂盒说明书)；
6)取1ug长单链模板的互补RNA，利用与互补RNA的3’末端序列互补的引物，以互补RNA为逆转录模板，利用逆转录试剂盒PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TAKARA，6210A)，通过逆转录合成互补DNA，获得RNA-DNA杂合双链产物(操作详见试剂盒说明书)；
7)在步骤6)的反应产物中，加入RNAaseH，以特异性消化RNA-DNA杂合双链中的RNA，得到长单链DNA；
8)用QIAquick PCR Purification Kit回收长单链DNA，用无RNase的去离子水洗脱长单链DNA，测浓度后分装保存备用。
2、sgRNA的制备
1)合成两条互补的含有sgRNA识别序列的寡聚核苷酸单链DNA(oligo DNA)(注意：两条互补单链DNA复性为双链后，末端要与sgRNA体外转录质粒上的酶切后的亚克隆位点互补；本实施例所使用的sgRNA体外转录质粒为pUC57kan-T7-gRNA(Addgene#115520,用于亚克隆的酶切位点为BsaI)；
2)每条合成的单链oligo DNA取1OD，以0.2ug/uL的浓度溶解于去离子水中，并以20uL/管分装后保存备用；
3)各取1管互补的单链oligo DNA溶液，等体积混合并充分混匀后，在含有1L自来水的水浴锅中，于95摄氏度温育10min，以使两条互补的单链oligo DNA充分变性为单链状态；
4)关掉水浴锅电源，使其自然冷却，让互补的单链oligo DNA复性为双链状态；
5)用BsaI充分酶切sgRNA体外转录载体质粒pUC57Kan-T7-gRNA，回收线性质粒片段；
6)将步骤4)获得的双链DNA与步骤5)获得的线性质粒片段，用T4DNA连接酶连接，获得重组质粒；
7)步骤6)的连接产物转化感受态细菌，挑取卡那霉素抗性菌落，并扩增培养获得抗性菌液；
8)利用抗性菌液提取重组质粒，并测序验证；
9)用内切酶DraI充分酶切测序验证正确的步骤8)获得的质粒，实现重组质粒完全、充分的线性化；
10)通过蛋白酶K消化、酚:氯仿提取、醋酸钠中和、冰乙醇沉淀、冰浴以及冷冻离心等步骤，获得DNA沉淀，实现线性质粒DNA的纯化并去除RNA酶污染；
11)用无RNA酶的70％乙醇充分洗涤DNA沉淀，之后用无RNA酶的去离子水溶解DNA沉淀；
12)取1ug步骤11)获得的纯化的线性质粒为模板，用体外转录试剂盒MEGAshortscriptTMT7 Transciption Kit(invitrogen，AM1354)进行体外转录，获得sgRNA(操作步骤详见试剂盒说明书)；
13)利用MEGAClear Transcription Clean-Up Kit(invitrogen,AM1908)，纯化步骤12)获得的体外转录产物，根据浓度大小分装为5-10uL/管保存备用(操作步骤详见试剂盒说明书)。
3、Cas9 mRNA的制备
1)转录模板的准备：
用AgeI内切酶充分(过夜)酶切质粒pST1374-N-NLS-flag-linker-Cas9(Addgene#44758)，其余步骤同sgRNA体外转录模板的准备。
2)体外转录：
利用mMESSAGEmMACHINE T7 Ultra kit转录Cas9 mRNA，实验步骤详见试剂盒说明书。转录完成后向体系中加入1ul Turbo DNase，37℃孵育15min，以去除残留的模板DNA。
3)加尾：
(1)向T7 Ultra Reaction体系中依次加入表1中的试剂：
表1
成分 用量
T7 Ultra Reaction 20ul
5xE-PAP Buffer 20ul
MnCl2 10ul
ATP 10ul
水 36ul
(2)混合后，吸取2.5ul mix作为对照；加入4ul E-PAP enzyme，混合后37℃孵育45min。
4)mRNA纯化回收
利用Qiagen公司的RNAeasy kit，纯化回收mRNA：
(1)将模板用NFW水调至100ul；
(2)加入350ul的RLT Buffer充分混合均匀；
(3)加入250ul的无水乙醇，混匀；
(4)转入试剂盒自带的柱子中，≥8000g，离心15s；
(5)弃收集管中的废液，加入500ul的Buffer RPE，≥8000g，离心15s；
(6)重复上述步骤
(7)将柱子转入新的2ml收集管，空转1min；
(8)将柱子放于1.5ml离心管，加入40ul的RFW，≥8000g，1min；
(9)取2ul测浓度，依据浓度将mRNA溶液按照1-5uL/管的体积分装至无RNA酶的EP管中,将分装后的mRNA溶液置于-80摄氏度冰箱冻存。
(10)取1管mRNA电泳，以加尾前的mRNA为对照，检测mRNA的质量及加尾效果(加尾后的mRNA的条带位置应稍滞后于加尾前的mRNA)。使用前将Cas9 mRNA稀释到20ng/ul。
4、猪早期胚胎的获取、CRISR试剂的显微注射及移植
1)猪早期胚胎的获取
(1)选取3-5头处于发情期的健康性成***猪，与健康性成熟公猪配种后作为胚胎供体母猪，并另备一头处于发情期的健康性成***猪作为受体母猪；
(2)供体母猪配种后24-36h，通过耳缘静脉注入质量分数为3％的戊巴比妥钠溶液10-15mL或利用异氟烷通过呼吸机实现供体猪的全身麻醉，并将母猪绑定于V形手术台上；
(3)常规清洗、消毒母猪腹部之后，沿腹部正中线，在母猪倒数第一和第三对***之间，切开腹部皮肤、筋膜、肌肉及腹膜，切口大小为5-8cm；
(4)取出母猪卵巢、输卵管及部分子宫，此时可见母猪卵巢表面***点，表明母猪已***；
(5)将内径为4-6mm两端钝化的玻璃导管，通过输卵管伞部***输卵管；
(6)用注射器抽取在38℃水浴中充分温育的冲胚液(PBS+1％胎牛血清)约20mL，通过静脉输液针将含有冲胚液的注射器与输卵管腔相连(其含针头一端通过输卵管与子宫的结合部***输卵管腔，另一端与注射器相连)；
(7)通过注射器将冲胚液注入输卵管，并用灭菌的50mL离心管收集流经输卵管、从***输卵管伞部的玻璃导管中流出的冲胚液；
(8)将收集的冲胚液转入直径为9cm的无菌培养皿中，在体视显微镜下捡取胚胎，此时捡取的胚胎一般为1-cell或2-cell期；
(9)将捡取的猪胚胎置于上覆石蜡油、已在培养箱中充分温育平衡的培养液液滴中培养备用(本案例所用的猪胚胎培养液为PZM-3，其配方见文献Biology ofReproduction,2002,66:112)；
2)猪早期胚胎的显微注射：
将步骤上述制备的sgRNA,spCas9 mRNA和同源重组模板DNA(供体DNA)，分别以终浓度sgRNA 10ng/uL,spCas9 mRNA 20ng/uL和供体DNA 10ng/uL充分混合，之后将混合溶液通过显微注射注入猪早期胚胎的细胞质。详细操作见Hogan et al.Manipulating MouseEmbryo Manipulation Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1994,SecondEdition。
3)猪胚胎移植
(1)依照与胚胎获取相同的方式麻醉和保定受体母猪、切开腹腔、取出卵巢、输卵管及部分子宫；
(2)将捡胚吸管(美国，Agtech公司)与1mL注射器相连接，并在捡胚吸管中预先吸入一段空气；
(3)在体视显微镜下，通过连接的注射器将培养液中20-30枚注射后的胚胎吸入捡胚吸管中(注意：在胚胎所在液段前要吸入一段空气，并在空气前再吸入一段液体，以防污染)；
(4)将装有胚胎的捡胚吸管通过伞部***受体猪输卵管，推动注射器将胚胎导入输卵管中；
(5)将受体猪子宫、输卵管和卵巢放回腹内，依次缝合腹膜、肌肉、筋膜及皮肤，并对创口做常规消毒处理；受孕的受体母猪在妊娠期满后即可产下仔猪。
二、实验结果：
1、猪Gjb2基因突变用长单链DNA
我们的前期研究表明，猪Gjb2基因含有2个外显子，其中第二外显子含有其完整的编码序列。本发明通过大量的研究，在猪Gjb2基因的编码序列上、下游的位置选择了两个sgRNA识别位点(sgRNA的名称分别为pGjb2-5fs-sgRNA和pGjb2-3fs-sgRNA,其识别位点序列见表5，其识别靶位点的引导序列见表6)，测试以长单链DNA为模板、通过双位点切割介导基因编辑的有效性。猪Gjb2基因的结构及sgRNA位点的选择参见图3。
依照图3长单链DNA模板的结构设计，通过全长双链DNA人工合成获得含有T7启动子和长单链DNA模板序列的双链DNA片段，并亚克隆至克隆载体质粒(如pUC19)，由此获得长单链DNA模板的体外转录载体质粒。
在进行上述全长双链DNA片段合成时，将猪Gjb2基因编码序列中第37个密码子由GTG突变为ATC(c.109-111GTG>ATC)；在突变的编码序列上游***一段通用的内含子剪切受体序列，在突变编码序列下游分别引入一段人Gjb2基因翻译终止密码子3’端的侧翼非编码序列(3’UTR)序列，以作为异源序列(heterology)；在上、下游异源序列的两侧，精确依照上、下游sgRNA(Gjb2-5fs-sgRNA/Gjb2-3fs-sgRNA)在猪Gjb2基因中的切割位点，各引入一段猪Gjb2基因组序列以作为同源臂。具体结构如图4所示(长单链供体DNA模板序列为SEQID NO.1所示)。
黑色未加粗的碱基序列为上、下游同源臂；划线的碱基序列为分别为导入Gjb2基因编码序列上、下游的异源序列(上游异源序列包含通用内含子剪切受体序列，spliceacceptor；下游异源序列源自人Gjb2基因的3’UTR区)；斜体碱基序列为pGjb2 c.109-111GTG>ATC(pGJB2 p.V37I)突变编码序列；黑色加粗碱基为T7启动子互补序列。
以上述构建的长单链DNA模板体外转录质粒为体外转录模板，按照本实施例前述的长单链DNA制备实验步骤，分别通过体外转录、逆转录和RNaseH酶消化，获得长单链DNA模板。
以上述制备的长单链DNA为模板，通过双位点切割，细胞预计会依据图2所示的机制，通过“同源序列引导的DNA修复”(HDR)实现对猪Gjb2基因编码序列的精确置换，引入猪Gjb2基因V37I突变的编码序列(pGJB2 p.V37I CDS，参见图5)。
2、对照实验设计
本实施例以目前常用的以单链寡聚核苷酸(ssODN)为模板、通过对靶位点进行直接的单位点切割实现基因编辑的方案为对照实验组。在猪Gjb2基因编码序列的第109-111位碱基GTG(c.109-111GTG)处，以距离该位点一个碱基的三碱基序列5’-TGG-3’为PAM结构，选取一个覆盖c.109-111GTG位点的sgRNA识别位点(命名为：pGjb2-V37-sgRNA；剪切位点位置见图6，剪切位点序列见表5，sgRNA识别靶位点的引导序列见表6)。该sgRNA识别位点位于正义链(编码链)。在设计短单链HDR模板DNA(pGjb2-V37I-ssODN)时，取Gjb2基因编码序列第109-111位碱基GTG上、下游约60bp序列为同源臂、且包含c.109-111GTG>ATC突变的正义链序列为模板序列(结构见图6所示)。在Cas9在pGjb2-V37-sgRNA识别位点切割DNA后，理论上细胞可以pGjb2-V37I-ssODN为模板，通过HDR机制实现c.109-111GTG>ATC突变的导入(参见图6)。
pGjb2-V37I-ssODN的序列为(SEQ ID NO.2)：
其中黑色未加粗的碱基序列为上、下游同源臂；划线加粗的碱基ATC为目标突变碱基；黑色加粗碱基序列为pGjb2-V37-sgRNA所覆盖的序列。
3、基因编辑效率分析
3.1首建猪个体的遗传分析
实验组共出生4头首建猪。分别在猪Gjb2基因组序列中编码区的上、下游各选取一条上、下游引物(Gjb2-CDS-F/Gjb2-CDS-R，序列见表2)，扩增首建猪的Gjb2基因编码区，扩增产物大小为931bp。剪取首建猪耳部组织并提取首建猪基因组DNA，以首建猪基因组DNA为模板，获得上述引物的PCR扩增产物。先将PCR扩增产物直接送样测序，若无测序套峰，则该个体为纯合子基因型；若出现测序套峰，说明该个体为杂合或嵌合基因型，则进一步将PCR产物进行TA克隆，每头首建猪随机挑取15-20个转化菌克隆送样进行Sanger测序。
表2首建猪遗传分析所用引物
引物名称 引物序列
Gjb2-CDS-F(SEQ ID NO.3)： 5-TCACCTTTGTGGGTGAGGTTGCGTAAGAA-3
Gjb2-CDS-R(SEQ ID NO.4)： 5-GCTTGACGACGGGAATCTGTATCTGG-3
结果表明，在4头首建猪中，通过PCR产物直接测序发现，4头个体中有2头发生了预期突变，首建猪精准突变率为50％；PCR产物测序无套峰，说明其耳部组织的基因型均为纯合基因型，且都为预期精准突变。首建猪的遗传检测结果见图7，首建猪基因型统计见表3。
表3首建动物基因型统计
编号 性别 基因型
G00101 雌性 Gjb2 c.109-111GTG>ATC
G00102 雄性 Gjb2 c.109-111GTG>ATC
G00103 雄性 WT
G00104 雄性 WT
3.2对照组的基因编辑效率分析
依照上述的sgRNA位点及同源重组模板pGjb2-V37I-ssODN，尝试进行通过单位点切割外显子实现pGjb2 c.109-111GTG>ATC突变。通过与实验组相同的方式将pGjb2-V37-sgRNA,pGjb2-V37I-ssODN和Cas9 mRNA(浓度分别为20ng/uL、10ng/uL和10ng/uL)导入猪早期胚胎细胞并移植于受体母猪；受体受孕后，获取早期胎儿以评估基因编辑的有效性。结果发现：在获取的4个胎儿中靶位点均没有发生基因编辑。说明单位点切割外显子难以实现pGjb2 c.109-111GTG>ATC(pGJB2 p.V37I)突变。探究其原因或可能是直接针对猪Gjb2基因外显子的切割有一定的胚胎致死性，导致发生编辑的胎儿未能发育，而成功发育的均为未进行基因编辑的胎儿；当然，也有一定的可能是所选取的sgRNA位点活性不够强，未能实现基因编辑。实验组与对照组的基因编辑效率汇总见表4。
表4实验组和对照组基因编辑效率
3.3GJB2 p.V37I纯合突变后代猪的获得
通过将上述获得的GJB2 p.V37I突变首建猪之间的配种繁殖，获得了6头后代(F1代)猪。利用上述遗传检测引物(Gjb2-CDS-F/Gjb2-CDS-R)扩增突变靶位点，并直接对PCR产物进行Sanger测序，发现：所有个体的PCR产物测序结果均为单峰，且均存在预期的Gjb2c.109-111GTG>ATC突变，表明所获得的5头F1代个体均为GJB2 p.V37I纯合突变个体(参见图8)。上述结果提示在首建猪中获得GJB2 p.V37I突变基因型可稳定传代并能高效获得纯合突变个体。
表5sgRNA在猪Gjb2基因上的识别位点序列
识别位点名称 识别位点序列
Gjb2基因编码序列上游剪切位点(SEQ ID NO.5) 5′-GAATCTGTATCTGGGAGACG-CGG-3′
Gjb2基因编码序列下游剪切位点(SEQ ID NO.6) 5′-GACCAAGCGACACGGCACAG-GGG-3′
Gjb2基因编码序列V37剪切位点(SEQ ID NO.7) 5′-CCGCGTCATGATCCTGATCG-TGG-3′
表6sgRNA识别靶位点的引导序列
sgRNA名称 引导序列
pGjb2-3fs-sgRNA(SEQ ID NO.8) 5′-GAAUCUGUAUCUGGGAGACG-3′
pGjb2-5fs-sgRNA(SEQ ID NO.9) 5′-GACCAAGCGACACGGCACAG-3′
pGjb2-V37-sgRNA(SEQ ID NO.10) 5′-CCGCGUCAUGAUCCUGAUCG-3′
本发明发现以长单链DNA为模板、通过双位点切割可以实现更高效率的基于HDR的动物基因组精准编辑；基于上述的发现，建立了猪的Gjb2基因突变模型，并实现了预期的精准突变。而且由于切割位点在内含子，理论上减少了对动物个体发育的影响；而对照的利用常规的以单链寡聚核苷酸(ssODN)为模板、通过单位点切割，在相同的基因位点未发生基因编辑事件，证明了本发明所采用技术的有效性和可行性。
序列表
<110> 中国人民解放军陆军军医大学
<120> 一种通过双位点切割实现猪Gjb2 基因编码序列精准编辑的方法
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1058
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tttaaaggtt ttgtcctcac ctttgtgggt gaggttgcgt aagaatcagt gtttgcccag 60
gaagaggttt cacgctgcct gctccccctg gtcctgtccc gagcggtcac ccctgctgac 120
atccactttg cctttctctc cacaggaccg tccggaggag aagatggact ggggcgcgct 180
gcagaccatc ctgggcggcg tgaacaagca ctccaccagc atcggcaaga tctggctcac 240
ggtgctcttc atcttccgcg tcatgatcct gatcgtggcg gccaaggagg tgtggggcga 300
cgagcaggcc gacttcatct gcaacaccct gcagcccggc tgcaagaacg tgtgctacga 360
ccactacttc cccatctcgc acatccggct ctgggcgctg cagctcatct tcgtgtccac 420
gcccgccctg ctggtggcca tgcacgtggc ctaccggcga cacgagaaga aaaggaagtt 480
catcaagggc gagatgaaga gcgagttcaa ggacatcgaa gagatcaaga cccagaaggt 540
ccgcatcgag ggcgccctct ggtggaccta caccggcagc atcttcttcc gcatcctctt 600
cgaggccgcc ttcatgtacg tgttctacgt catgtacagc gggttctcca tgcagcgcct 660
ggtcaagtgc aacgcgtggc cttgtcccaa cacggtggac tgcttcgtgt ccaggcccac 720
ggagaagacg gtctttacgg ttttcatggt cgtggtgtcg gggatctgca ttctgctcaa 780
cgtcaccgaa ctgtgctatt tgctcatcag atattgttcc ggaaagtcca agaagccagt 840
gtaacgcatt gcccagttgt tagattaaga aatagacagc atgagaggga tgaggcaacc 900
cgtgctcagc tgtcaaggct ctcccagata cagattcccg tcgtcaagct cccccccacc 960
cgcgaccctc ctgtggccca cgtgggactc cagacgcctc cggctgcggc cccgcggtcg 1020
gccccgcggt ccacaggcgc ctatagtgag tcgtatta 1058
<210> 2
<211> 123
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tccaccagca tcggcaagat ctggctcacg gtgctcttca tcttccgcgt catgatcctg 60
atcgtggcgg ccaaggaggt gtggggcgac gagcaggccg acttcatctg caacaccctg 120
cag 123
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcacctttgt gggtgaggtt gcgtaagaa 29
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gcttgacgac gggaatctgt atctgg 26
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gaatctgtat ctgggagacg cgg 23
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gaccaagcga cacggcacag ggg 23
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ccgcgtcatg atcctgatcg tgg 23
<210> 8
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gaaucuguau cugggagacg 20
<210> 9
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gaccaagcga cacggcacag 20
<210> 10
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ccgcgucaug auccugaucg 20

Claims (10)

1.通过双位点切割对猪Gjb2基因编码序列进行精准编辑的方法，其特征在于包括以下步骤：
a、准备一对sgRNA，其中一条sgRNA识别Gjb2基因编码序列上游的切割位点，另一条sgRNA识别基因编码序列下游的切割位点；
所述识别Gjb2基因编码序列下游切割位点的sgRNA能识别猪的Gjb2基因上的PAM位点为CGG；
所述识别Gjb2基因编码序列上游切割位点的sgRNA能识别猪的Gjb2基因上的PAM位点为GGG。
b、将步骤a所述的一对sgRNA、带有预期突变序列的供体DNA、编码spCas9的mRNA和/或spCas9纯化重组蛋白充分混合后，将混合物通过显微注射导入猪早期胚胎的细胞质中；
c、将步骤b处理后的猪早期胚胎移植至受体母猪的输卵管中，使受体母猪受孕；
d、受孕的受体母猪在妊娠期满后产下仔猪，得到Gjb2基因精准编辑后的猪模型。
2.根据权利要求1所述的通过双位点切割对猪Gjb2基因编码序列进行精准编辑的方法，其特征在于所述的sgRNA对中：
识别猪Gjb2基因编码序列下游切割位点的sgRNA的引导序列为5′-GAAUCUGUAUCUGGGAGACG-3′(SEQ ID NO.8)或其互补序列；
识别猪Gjb2基因编码序列上游切割位点的sgRNA的引导序列为5′-GACCAAGCGACACGGCACAG-3′(SEQ ID NO.9)或其互补序列。
3.根据权利要求1所述的通过双位点切割对猪Gjb2基因编码序列进行精准编辑的方法，其特征在于：所述的供体DNA为将猪Gjb2基因的37位缬氨酸(V)密码子突变为异亮氨酸(I)密码子的供体DNA。
4.根据权利要求1所述的通过双位点切割对猪Gjb2基因编码序列进行精准编辑的方法，其特征在于：所述的供体DNA的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示或为其互补序列。
5.根据权利要求1所述的通过双位点切割对猪Gjb2基因编码序列进行精准编辑的方法，其特征在于：所述的sgRNA对、供体DNA以及编码spCas9的mRNA和/或spCas9纯化重组蛋白之间的配比为按在混合物中的终浓度sgRNAs 10～15ng/uL、spCas9 mRNA和/或spCas9纯化重组蛋白20～25ng/uL、以及供体DNA 5～10ng/uL。
6.根据权利要求1的方法，其特征在于：所述的猪早期胚胎为4细胞期及之前的胚胎。
7.据权利要求9的方法，其特征在于所述的步骤c中还包括有检测验证步骤：使用引物对扩增仔猪基因组DNA样品，根据扩增结果测序确定是否含有预期基因编辑基因型Gjb2c.109-111GTG>ATC，若含有该基因型即表明建模成功。
8.制备Gjb2基因突变猪模型的试剂盒，其特征在于包括引导序列如下所示的sgRNA对：
5′-GAAUCUGUAUCUGGGAGACG-3′；
5′-GACCAAGCGACACGGCACAG-3′。
9.根据权利要求8所述的制备Gjb2基因突变猪模型的试剂盒，其特征在于还包括将猪Gjb2基因的37位缬氨酸(V)密码子突变为异亮氨酸(I)密码子的供体DNA，其核苷酸序列为SEQ ID No.1所示或为其互补序列。
10.根据权利要求8或9所述的制备Gjb2基因突变猪模型的试剂盒，其特征在于：还包括编码spCas9蛋白的mRNA和/或spCas9重组蛋白。
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