CN104263754B - 白化病模型猪的重构卵及其构建方法和模型猪的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种白化病模型猪的重构卵及其构建方法和模型猪的构建方法，该重构卵的构建方法通过敲除酪氨酸酶基因获得了白化小型猪的重构卵，且将CRISPR/Cas9基因敲除技术与体细胞核移植技术结合，证明该方法用于构建基因修饰猪的高效可行性。获得TYR基因敲除猪具有典型白化特征，可为人类白化疾病研究提供一种可靠的动物模型，且能应用于毒性及过敏反应的检测等多方面，有望成为类似白化小鼠的一种标准化实验动物。

Description

白化病模型猪的重构卵及其构建方法和模型猪的构建方法

技术领域

本发明涉及基因工程领域，尤其是涉及一种白化病模型猪的重构卵及其构建方法和模型猪的构建方法。

背景技术

人类疾病的研究和治疗离不开实验动物模型。啮齿类动物在基因表达和各项生理指标方面与人类差异较大，而非人灵长类动物虽是最接近于人类的实验动物，但价格昂贵，且存在伦理方面的障碍。猪在体型大小、生理条件、器官发育和疾病发展等方面与人类相似，因此，猪被认为是一种合适的实验动物模型。基因修饰猪模型有望在人类疾病发病机理研究、治疗策略研究中发挥重要的作用。目前制作基因修饰动物的方法中只有胚胎细胞嵌合法和转基因克隆法能够实现哺乳动物的基因打靶。通过基因修饰胚胎干细胞和嵌合体技术相对容易获得基因修饰小鼠，但迄今还没有办法获得具有生殖系嵌合能力的猪胚胎细胞，因而基因修饰猪制备要比小鼠困难很多。

研究人员一直致力于开发新方法，实现高效率的基因定点修饰。最近兴起的锌指技术(Zinc Finger Nucleases，ZFNs)和TALENs(TRNAscription activator-like(TAL)effector nucleases)技术为基因打靶技术创造了新的途径。有研究显示利用ZFNs技术可使猪体细胞中基因打靶效率从10^-6提高到4％以上(Yang D，Yang H，Li W，etal.Production of PPAR-gamma mono-allelic knockout pigs via zinc-fingernucleases and nuclear tRNAsfer cloning.Cell Research，2011，21(6):979-82.)。利用TALENs技术也成功高效率地获得了大鼠、斑马鱼、爪蟾、小鼠、兔等多种基因打靶动物。ZFNs和TALENs技术极大地提高了基因打靶效率，但ZFNs和TALENs技术设计和构建组装仍需要有前后序列特异的要求，经大量的优化条件以获得特定的基因打靶，在的获得性、灵活性、费用上均受到限制(Juillerat，A.，Dubois，G.，Valton，J.，et al.Comprehensive analysisof the specificity of tRNAscription activator-like effector nucleases.NucleicAcids Res.，2014，42，5390–5402.)。

CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat(CRISPR)/CRISPR-associated endonuclease(Cas9))技术主要基于细菌的一种获得性免疫***改造而成。该***由两部分组成：一是哺乳动物密码子优化版本的Cas9蛋白，其带有一个核定位信号，以确保在哺乳动物细胞的核中表达；二是引导核糖核酸(Single-guideRNA，gRNAs)指引Cas9的蛋白质进行序列特异性地切割目标DNA。较ZFNs或TALENS而言，CRISPR/Cas9***具有可扩展性和复用性、能同时作用于多个靶位点(Wang H，Yang H，Shivalila C S，et al.One-step generation of mice carrying mutations inmultiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.Cell，2013，153:910–918)等优点，被认为是一种具有广阔应用前景的基因组定点改造分子工具(Mussolino C，Cathomen T.RNA guides genome engineering.NatBiotechnol，2013，31(3):208-209)。利用CRISPR/Cas9已获得多种基因打靶动物，如大鼠、小鼠、兔子、猴子等，但均是通过注射Cas9 mRNA和gRNA mRNA到一细胞胚胎的方法获得的，这种方法获得的克隆动物多是带有多种突变类型的嵌合体，需进行多次交配和选择才能得到单一突变基因型的动物。

白化病是人和动物界的一种常见疾病。目前白化小鼠己成为生物医药研究中常用的实验动物，在烧伤、皮肤毒性、过敏检测等研究中使用较多，但是迄今为止仍未有基因修饰型白化猪的报道。目前野生型小型猪的皮肤和毛发多为黑色或花色，在研究中不利于观察，而野生型白色猪中多见于商品肉用大型猪种，体型大不利于实验操作，不适合做实验动物。

发明内容

基于此，有必要提供一种白化病模型猪的重构卵及其构建方法和模型猪的构建方法。

一种白化病模型猪的重构卵的构建方法，包括如下步骤：

步骤一：针对猪物种的酪氨酸酶基因的第一外显子的正链及互补链上满足G(N)₁₉NGG序列模式的序列部分分别设计gRNA的识别序列，分别记为第一gRNA识别序列和第二gRNA识别序列，其中，所述第一gRNA识别序列与所述第一外显子的正链上序列G(N)₁₉一致，所述第二gRNA识别序列与所述第一外显子的互补链上序列G(N)₁₉一致，N为A、T、C或G，下标19表示N的个数；

步骤二：分别对所述第一gRNA识别序列和第二gRNA识别序列设计互补序列，以构建含有所述第一gRNA识别序列的第一双链DNA和含有第二gRNA识别序列的第二双链DNA；

步骤三：分别根据所述第一双链DNA和所述第二双链DNA设计gRNA表达载体，记为第一gRNA载体和第二gRNA载体，其中，所述第一gRNA载体中含有所述第一双链DNA，所述第二gRNA载体中含有所述第二双链DNA；

步骤四：将所述第一gRNA载体、所述第二gRNA载体及含有Cas9切口酶基因的表达载体转染进微型猪胎儿成纤维细胞中，筛选出酪氨酸酶基因敲除的阳性克隆细胞；

步骤五：将所述阳性克隆细胞注入母猪的去核***中，形成重构卵。

在其中一个实施例中，所述步骤一中，所述猪物种的酪氨酸酶基因的序列为NCBI数据库中基因编号为407745所示的序列；所述第一外显子的正链上满足G(N)₁₉NGG序列模式的序列如SEQ ID No.1所示，所述第一外显子的互补链上满足G(N)₁₉NGG序列模式的序列如SEQ ID No.2所示；所述第一gRNA识别序列如SEQ ID No.3所示，所述第二gRNA识别序列如SEQ ID No.4所示。

在其中一个实施例中，所述步骤二具体包括如下步骤：

分别对所述第一gRNA识别序列和第二gRNA识别序列设计互补序列；

在所述第一gRNA识别序列的5’端加上CACC序列片段，形成如SEQ ID No.7所示的序列片段，并在所述第一gRNA识别序列的互补序列的5’端加上AAAC序列片段，形成如SEQIDNo.8所示的序列片段，将加有粘性末端的第一gRNA识别序列及加有粘性末端的互补序列进行退火处理，得到带有粘性末端的所述第一双链DNA；

在所述第二gRNA识别序列的5’端加上CACC序列片段，形成如SEQ ID No.9所示的序列片段，并在所述第二gRNA识别序列的互补序列的5’端加上AAAC序列片段，形成如SEQIDNo.10所示的序列片段，将加有粘性末端的第二gRNA识别序列及加有粘性末端的互补序列进行退火处理，得到带有粘性末端的所述第二双链DNA。

在其中一个实施例中，所述步骤三具体包括如下步骤：

在gRNA-GFP-T1质粒载体中引入两个BbsI酶切位点，得到中间体质粒；

对所述中间体质粒使用限制性内切酶BbsI酶切，并将带有粘性末端的所述第一双链DNA和所述第二双链DNA对应连接到酶切后的中间体质粒上，分别得到所述第一gRNA载体和所述第二gRNA载体。

在其中一个实施例中，所述步骤四中，在将所述第一gRNA载体、所述第二gRNA载体及含有Cas9切口酶基因的表达载体转染进微型猪胎儿成纤维细胞之前，还包括分别对所述第一gRNA载体、所述第二gRNA载体及含有Cas9切口酶基因的表达载体经转化处理后扩大培养，再提取所述第一gRNA载体、所述第二gRNA载体及含有Cas9切口酶基因的表达载体的步骤。

在其中一个实施例中，所述重构卵的构建方法还包括对得到的重构卵进行融合和激活的步骤，具体如下：

将所述重构卵从去核操作液中转至胚胎培养液中待融合与激活；

将所述重构卵转移至融合液激活液进行平衡，将平衡好的重构卵移入融合容器内，轻轻拨动重构卵，使***与注入的细胞的接触面平行于两条电极，两条电极之间间隔为1mm，然后进行电脉冲刺激，电融合参数为：120volts/mm、30μs、2次；

电脉冲刺激后将重构卵移入胚胎操作液中，筛选出融合成功的重构卵。

一种采用上述任一实施例所述的白化病模型猪的重构卵的构建方法构建得到的重构卵。

一种白化病模型猪的构建方法，包括如下步骤：

按照上述任一实施例所述的白化病模型猪的重构卵的构建方法构建重构卵；

对所述重构卵进行细胞融合和激活，得到激活的重构卵；

将所述激活的重构卵至于***母猪的输卵管中，或者将所述激活的重构卵在体外或体内进行培养，形成重构胚，然后再将所述重构胚移植到***母猪的子宫内；

饲养所述***母猪，产生白化病模型猪。

在其中一个实施例中，所述对所述重构卵进行细胞融合和激活，得到激活的重构卵，具体包括如下步骤：

将所述重构卵从去核操作液中转至胚胎培养液中待融合与激活；

将所述重构卵转移至融合液激活液进行平衡，将平衡好的重构卵移入融合容器内，轻轻拨动重构卵，使***与注入的细胞的接触面平行于两条电极，两条电极之间间隔为1mm，然后进行电脉冲刺激，电融合参数为：120 volts/mm、30μs、2次；

电脉冲刺激后将重构卵移入胚胎操作液中，筛选出融合成功的重构卵。

上述白化病模型猪的重构卵及模型猪的构建方法，通过敲除酪氨酸酶基因(TYR基因)获得了白化小型猪，且将CRISPR/Cas9基因敲除技术与体细胞核移植技术结合，证明该方法用于构建基因修饰猪的高效可行性。获得TYR基因敲除猪具有典型白化特征，可为人类白化疾病研究提供一种可靠的动物模型，且能应用于毒性及过敏反应的检测等多方面，有望成为类似白化小鼠的一种标准化实验动物。

附图说明

图1为一实施方式的白化病模型猪的重构卵的构建方法的流程示意图；

图2为白化病模型猪与黑猪的外形及眼睛对比图；

图3为另一视角的白化病模型猪与黑猪的外形对比图；

图4为白化病模型猪与黑猪的皮肤基层对比图，其中A表示黑猪，B表示白化病模型猪；

图5为白化病模型猪与黑猪的虹膜组织对比图，其中C表示黑猪，D表示白化病模型猪。

具体实施方式

下面主要结合附图及具体实施例对白化病模型猪的重构卵及其构建方法及模型猪的构建方法作进一步详细的说明。

一实施方式的白化病模型猪的构建方法包括构建模型猪的重构卵、对该重构卵进行激活以及将激活的重构卵导入***母猪体内进行生长的过程。

如图1所示，本实施方式的白化病模型猪的重构卵的构建方法包括如下步骤：

步骤S110，针对猪物种的酪氨酸酶基因的第一外显子的正链及互补链上满足G(N)₁₉NGG序列模式的序列部分分别设计gRNA的识别序列，分别记为第一gRNA识别序列和第二gRNA识别序列。其中，所述第一gRNA识别序列与所述第一外显子的正链上序列G(N)₁₉一致，所述第二gRNA识别序列与所述第一外显子的互补链上序列G(N)₁₉一致，N为A、T、C或G，下标19表示N的个数。

上述猪物种优选但不限于山猪(学名：Sus scrofa)，其酪氨酸酶基因的序列为NCBI数据库中基因编号为407745(Gene ID：407745)所示的序列。本实施方式所用的第一外显子的正链的部分序列(5’-GCACCCCTGGGACCTCAGTTCCCCTTCACCGGGGTGGATGAACGGGAGTCTTGGCCCT-3’)如SEQ ID No.1所示，第一外显子的互补链的部分序列(3’-CGTGGGGACCCTGGAGTCAAGGGGAAGTGGCCCCACCTACTTGCCCTCAGAACCGGGA-5’)如SEQ ID No.2所示。针对该正链及互补链的部分序列设计的第一gRNA识别序列(5’-GGGTGGATGA ACGGGAGTCT-3’)如SEQ IDNo.3所示，第二gRNA识别序列(5’-GAAGGGGAAC TGAGGTCCCA-3’)如SEQ ID No.4所示。可理解，在其他实施方式中，第一sgRNA识别序列及第二gRNA识别序列还可以为其他序列结构，只要该第一外显子的正链上及互补链上存在满足G(N)₁₉NGG的序列模式的序列就可对应设计第一gRNA识别序列和第二gRNA识别序列。

步骤S120：分别对第一gRNA识别序列和第二gRNA识别序列设计互补序列，以构建含有第一gRNA识别序列的第一双链DNA和含有第二gRNA识别序列的第二双链DNA。

具体在本实施方式中，第一双链DNA和第二双链DNA的构建过程包括如下步骤：

分别对所述第一gRNA识别序列(GGGTGGATGA ACGGGAGTCT)和第二gRNA识别序列(GAAGGGGAAC TGAGGTCCCA)设计互补序列；

在所述第一gRNA识别序列的5’端加上CACC序列片段，形成如SEQ ID No.7所示的序列片段(CACCGGGTGG ATGAACGGGA GTCT)，并在所述第一gRNA识别序列的互补序列的5’端加上AAAC序列片段，形成如SEQ ID No.8所示的序列片段(AAACAGACTCCCGTTCATCC ACCC)，将加有粘性末端的第一gRNA识别序列及加有粘性末端的互补序列进行退火处理，得到带有粘性末端的所述第一双链DNA；

在所述第二gRNA识别序列的5’端加上CACC序列片段，形成如SEQ ID No.9所示的序列片段(CACCGAAGGG GAACTGAGGT CCCA)，并在所述第二gRNA识别序列的互补序列的5’端加上AAAC序列片段，形成如SEQ ID No.10所示的序列片段(AAACTGGGACCTCAGTTCCC CTTC)，将加有粘性末端的第二gRNA识别序列及加有粘性末端的互补序列进行退火处理，得到带有粘性末端的所述第二双链DNA。

形成的第一双链DNA与第二双链DNA均具有“CACC”和“AAAC”粘性末端，该粘性末端可用于连接至相应的载体上。

该加上粘性末端的过程可以使用但不限于全基因合成的方法或设计合适的引物经PCR扩增得到。

步骤S130：分别根据第一双链DNA和第二双链DNA设计gRNA表达载体，记为第一gRNA载体和第二gRNA载体。其中，所述第一gRNA载体中含有所述第一双链DNA，所述第二gRNA载体中含有所述第二双链DNA。

本步骤是将第一双链DNA和第二双链DNA对应连接到含有gRNA编码序列的质粒中，如gRNA-GFP-T1质粒载体，该过程具体包括如下步骤：在含有gRNA编码序列的质粒载体中引入相应的酶切位点，如BbsI酶切位点，得到中间体质粒，再将第一双链DNA和第二双链DNA通过引入的酶切位点(即粘性末端)连接到酶切后的中间体质粒的对应位置得到所需的质粒。其中，酶切位点可以但不限于BbsI酶切位点，当酶切位点为BbsI酶切位点时，该第一双链DNA与该第二双链DNA均连接有上述“CACC”和“AAAC”粘性末端，且克隆载体经BbsI酶切处理。

步骤S140：将第一gRNA载体、第二gRNA载体及含有Cas9切口酶基因的表达载体转染进微型猪胎儿成纤维细胞中，筛选出酪氨酸基因敲除的阳性克隆细胞。

筛选出酪氨酸基因敲除的阳性克隆细胞包括如下步骤：

对部分培养的克隆细胞进行裂解，提取裂解液；

对裂解液进行PCR处理，其中，PCR的引物序列分别如SEQ ID No.5及SEQ ID No.6所示，PCR条件为：95℃预变性5分钟，94℃变形20秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，共35个循环；

取PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，挑选阳性克隆细胞。

此外，在本实施方式中，在将第一gRNA载体、第二gRNA载体及含有Cas9切口酶基因的表达载体转染进猪胎儿成纤维细胞之前，还包括分别对第一gRNA载体、第二gRNA载体及含有Cas9切口酶基因的表达载体经转化处理后扩大培养，再分别提取第一gRNA载体、第二gRNA载体及含有Cas9切口酶基因的表达载体的步骤。

步骤S150：将阳性克隆细胞注入母猪的去核***中，形成重构卵。

具体在本实施方式中，可以采用如下步骤进行：

将阳性克隆细胞使用胰蛋白酶进行消化之后进行离心处理，弃上清，重悬细胞；

在去核操作液中对***用盲吸法去核后，吸取上步重悬的细胞直接注射于去核的***的卵周隙中，轻轻挤压***，使***的细胞膜与注入的细胞的细胞膜接触。

步骤S160，对得到的重构卵进行融合和激活。

具体在本实施方式中，可通过如下步骤进行：

将重构卵从去核操作液中转至胚胎培养液中待融合与激活；

将重构卵转移至融合激活液进行平衡，并将平衡好的重构卵移入融合容器内，轻轻拨动重构卵，使***与注入的细胞的接触面平行于两条电极，再进行电脉冲刺激融合；

电脉冲刺激后将重构卵移入胚胎操作液中，筛选出融合成功的重构卵。

本实施方式所述的将激活的重构卵导入***母猪体内进行生长的过程，可以是将激活的重构卵至于***母猪的输卵管中，或者将激活的重构卵在体外或体内进行培养，形成重构胚，然后再将重构胚移植到***母猪的子宫内，再饲养***母猪，产生白化病模型猪。

该白化病模型猪的重构卵及模型猪的构建方法，通过敲除酪氨酸酶基因(TYR基因)获得了白化小型猪，且将CRISPR/Cas9基因敲除技术与体细胞核移植技术结合，证明该方法用于构建基因修饰猪的高效可行性。获得TYR基因敲除猪具有典型白化特征，可为人类白化疾病研究提供一种可靠的动物模型，且能应用于毒性及过敏反应的检测等多方面，有望成为类似白化小鼠的一种标准化实验动物。

以下为具体实施例部分：

以下试剂，除非特别说明，均购自Sigma公司，括弧后面为对应的中文名称和/或商品目录号。

本实施例主要包括以下步骤：(1)CRISPR/Cas9打靶***的构建；(2)细胞转染与筛选，以及TYR基因敲除细胞克隆的获得；(3)体细胞核移植；(4)基因修饰猪的基因型和表型鉴定。

(1)CRISPR/Cas9打靶***的构建：

根据NCBI数据库中猪物种Sus scrofa的TYR基因的序列(Gene ID：407745)，在第一外显子序列上按照G(N)₁₉NGG原则，分别对正链(部分序列如SEQ ID No.1所示)和互补链(部分序列如SEQ ID No.2所示)设计一gRNA的识别序列，分别记为第一gRNA识别序列(如SEQ ID No.3所示)和第二gRNA识别序列(如SEQ ID No.4所示)。

提取用于待转染细胞的基因组，在gRNA的识别序列识别的靶序列两端设计一对引物，其中上游引物序列为：5’-CCTGATGGAGAAGGAAT GCTGC-3’(如SEQ ID No.5所示)，下游引物序列为：5’-TTGGCCATAGGTGCCTGTG-3’(如SEQ ID No.6所示)，PCR扩增含有靶序列的DNA片段，片段大小为388bp。PCR扩增条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环。扩增的靶序列片段经测序后与GenBank上的序列比对，确定序列正确。

在质粒gRNA-GFP-T1(购自Addgene公司，产品目录号为41819)质粒引入2个BbsⅠ酶切位点，得到U6-gRNA克隆载体。分别对第一gRNA识别序列和第二gRNA识别序列设计互补序列，并在第一gRNA识别序列和第二gRNA识别序列及对应的互补序列两端加上粘性末端，再退火处理形成第一双链DNA和第二双链DNA。第一双链DNA与第二双链DNA均包含有粘性末端“CACC”和“AAAC”，其中，第一双链DNA中两条链的序列分别如SEQID No.7和SEQ ID No.8所示，第二双链DNA中两条链的序列分别如SEQ ID No.9和SEQ IDNo.10所示。

分别将第一双链DNA和第二双链DNA对应连接到经BbsI酶切的U6-gRNA克隆载体中，得到第一gRNA载体和第二gRNA载体，经测序确定序列连接正确。

(2)细胞转染与筛选：

将含有Cas9基因的质粒载体(Cas9-nickase，购自Addgene公司，产品目录号为41816)以及得到的第一gRNA载体和第二gRNA载体经转化后扩大培养，大提质粒，三种质粒各制备20μg。

转染前一天复苏版纳微型猪胎儿成纤维细胞(来源于版纳微型猪37日龄胎儿)，在10cm细胞培养皿中加入10mL 15％FBS DMEM培养基，置于37℃培养箱培养；培养24小时后电转，转入Cas9质粒载体、第一gRNA载体和第二gRNA载体各20μg，电转参数：电压230V电容500μF，仪器为美国伯乐电穿孔***(Bio-Rad Gene Pulser Xcell)。

电转染后细胞分成25个10cm大培养皿培养；隔天换液，换成含G418(浓度为200μg/mL)的15％FBS DMEM培养基培养；隔2天换液，约10天后克隆生长，用记号笔在大培养皿底部画出克隆，在超净台中去掉培养基后用PBS溶液洗一次，用克隆环圈住记号笔画出的克隆，加入50-100μl 0.05％胰酶消化5-8min，加培养基终止，将克隆环中的细胞尽量全部转移到48孔板中，并用培养基洗两次。传代时取1/10的细胞用于鉴定。

离心收集取出用于鉴定的单克隆细胞，加15μl NP40裂解液(含0.45％NP-40和0.6％蛋白酶K)，依次在56℃裂解1h、在95℃裂解10min，得到的裂解液于-20℃保存备用。

对得到的裂解液利用上述设计的引物对，其中上游引物序列为：5’-CCTGATGGAGAAGGAAT GCTGC-3’(如SEQ ID No.5所示)，下游引物序列为：5’-TTGGCCATAGGTGCCTGTG-3’(如SEQ ID No.6所示)，采用PCR程序进行扩增，PCR条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环。取3μl PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测分析。得到单一明亮一条带的PCR产物以正向引物送深圳华大基因测序。测序结果与原序列比对，部分测序结果为后双峰图谱的PCR产物，回收纯化后与pMD18T载体经TA克隆连接，转化提质粒后用通用引物M13测序，得到序列。部分阳性克隆的靶位点序列测序结果如表1所示。

表1

共挑取89个细胞克隆，有效测序87个，敲除比率为49.4％，其中双敲比率为20.7％，单敲比率为28.7％。选择6株细胞克隆(T 5，T 12，T 47，T 65，T 70，T 79)为核移植供体细胞，进行体细胞核移植。

(3)体细胞核移植：

猪***的体外成熟

从屠宰场收集猪卵巢置于39℃加有青霉素、链霉素的0.9％的生理盐水中。用带有12号针头的10mL注射器将卵巢卵泡中的***吸出于50mL的离心管中，39℃水浴保温。静置4min后弃上清，加入洗卵液PVA-TL-HEPES(称取6.6633g NaCl、0.2386g KCl、0.1680gNaHCO₃、0.0408g NaH₂PO4、0.1017g MgCl₂·6H₂O、2.3830g Hepes(4-羟乙基哌嗪乙磺酸，H3784)，0.0650g Penicillin(青霉素，P3032)，0.0100g pHenol Red(苯酚红，5530)，0.2940g CaCl₂·2H₂O，0.1000g Polyvinyl alcohol(PVA，聚乙烯醇P8136)，2.1860gSorbitol(山梨糖醇，S1876)，0.0250gGentamicin(庆大霉素)，0.0220g Sodium pyruvate(丙酮酸钠，P4562)，加998.132mL Milli Q H₂O(超纯水)后再加1.868mL Na Lactate(乳酸钠，L7900)，溶解后调节pH为7.2-7.4，渗透压为295-310mOsm)挑取卵丘***复合物，转移至提前平衡好的成熟液(TCM-199(Gibco公司)加3.05mM D-glucose(D-葡萄糖，G7021)，0.91mM Sodium pyruvate(丙酮酸钠，P4562)，0.1％PVA(Sigma，P8136)，75μg/mLPenicillin(Sigma，P3032)，50μg/mLStreptomycin(链霉素，S1277)，0.5μg/mLLuteinizing hormone(LH，促黄体激素，L5269)，10 ng/mL Epidermal growth factor(EGF，表皮生长因子，S4127)，0.5μg/mL Follicle stimulating hormone(FSH，促卵泡激素，F2293)，0.57mM Cysteine(半胱氨酸，C8152)，10％***。)中于5％CO₂、饱和湿度、39℃条件下培养。12孔板每空放置40-70枚卵丘***复合物。体外成熟培养42-44h后，将卵丘***复合物转移入39℃去卵丘操作液(0.030gHyaluronidase(透明质酸酶，H3506)，5.46g Mannitol(甘露醇，M9647)，0.001g BSA(牛血清白蛋白，A8022)，5mL PVA-TL-Hepes洗卵液，95mL Milli Q H₂O)，涡旋震荡5min，至卵丘细胞脱落。将消化后的***转移入盛有胚胎操作液(9.500g TCM-199(Gibco公司)，0.050gNaHCO₃，0.750g Hepes(H3784)，0.050g Penicillin(P3032)，0.060g Streptomycin(S1277)，1.755g NaCl，3.00gBSA，1000mL Milli Q H₂O，溶解后调节pH为7.2-7.4溶解后调节pH为7.2-7.4，渗透压为295-310 mOsm)的35mm培养皿中，体式镜下挑取排放第一极体的***于另一盛有胚胎操作液的35mm培养皿中，39℃保存，待用。

培养的阳性克隆细胞用0.05％胰蛋白酶进行消化处理3分钟，之后以1000转/分钟的速率离心3分钟，弃上清，用DMEM培养基重悬细胞。***用盲吸法去核后，吸取一个供体细胞注射于去核***的卵周隙中，并轻轻挤压***，使***膜与供体细胞膜接触。将重构卵放入平衡好的胚胎培养液PZM3中，38.5℃培养箱中放置，待融合与激活。

将重构卵从胚胎培养液中转至融合激活液(0.3M Mannitol(M9647)，1.0mMCaCl₂·2H₂O，0.1mM MgCl₂·6H₂O，0.5mM Hepes(H3784))中待融合与激活，融合前将重构卵转移至融合激活液进行平衡，将平衡好的重构卵移入融合槽内，用毛细玻璃针轻轻拨动重构胚胎，使***与供体细胞的接触面平行于两条电极，两条电极之间间隔为1mm，然后进行电脉冲刺激，电融合参数为：120 volts/mm、30μs、2次。电脉冲刺激后将重构卵移入胚胎操作液(9.500gTCM-199(Gibco公司)，0.050g NaHCO₃，0.750g Hepes(H3784)，0.050gPenicillin，0.060gStreptomycin(S1277)，1.755g NaCl，3.00g BSA，1000mL Milli QH₂O，溶解后调节pH为7.2-7.4溶解后调节pH为7.2-7.4，渗透压为295-310 mOsm)中，置39℃半小时后，在体式镜下用毛细玻璃针拨动重构卵，检查供体细胞是否已经融合入***，将未融合的重构卵丢弃，统计融合率。重构卵融合的同时即激活。将融合与激活的重构卵在胚胎培养液PZM-3中洗三遍，并放入PZM-3中置于5％CO₂、饱和湿度、39℃条件下培养。

胚胎移植

核移植后第二天进行胚胎移植。选择胚胎移植当天或者前一天发情的太湖猪为***受体。将培养中的胚胎从胚胎培养液转移入盛有操作液的1.5mL EP管中，放入38.5℃恒温胚胎运输箱备用。对受体猪注射***进行诱导麻醉，异氟烷呼吸麻醉维持。在倒数第一对和倒数第二对***之间开口8cm左右，找到子宫后顺着子宫输卵管方向找到卵巢，将卵巢输卵管慢慢牵出腹腔，观察卵巢***情况，并找到输卵管的伞部用镊子进行固定。将装好的胚胎移植管，从输卵管伞部慢慢伸入输卵管，将胚胎推入输卵管。胚胎移植完成后，将输卵管伞重新包回卵巢，将卵巢输卵管送回腹腔。以生理盐水冲洗创口后进行缝合，首先缝合腹膜和肌肉层，肌肉层缝合完成后，涂撒青链霉素，再缝合皮肤层。手术后肌肉注射青链霉素防止创口感染发炎，并进行术后护理。胚胎移植后24-26天进行B超监测妊娠情况，并对怀孕受体每隔一周进行一次B超监测，追踪克隆胚胎发育情况。

如表2所示，本实施例共移植了1705个重构卵到7头受体母猪体内，其中4头怀孕并出生了18头克隆猪，分别编号#T1-18，其中有15头具有典型的I型眼皮肤白化病(OCA1)特征，皮肤和毛发均为白色，眼睛呈透明粉红色，如图2和图3所示。基因型鉴定15头白化病猪均为TYR基因敲除猪。

表2

(4)基因修饰猪的基因型和表型鉴定

沿克隆猪的耳边缘剪少量组织，用TIANamp Genomic DNA Kit试剂盒提取基因组，用鉴定细胞克隆的上述引物对，以同样的条件PCR扩增包含靶位点两端的序列，测序后与原序列进行比对，确定基因型。

取基因修饰猪的皮肤和耳组织，4％多聚甲醛固定48h，经脱水透明，浸蜡包埋后，制成切片。对切片进行苏木精-伊红染色，以显示在皮肤基底层和虹膜组织是否有黑色素存在。

基因型鉴定15头猪为TYR基因敲除猪，敲除方式缺失17碱基至60碱基，或***1碱基至188碱基，如表3所示。如图4和图5所示，表型鉴定在TYR基因敲除猪的皮肤基底层和虹膜组织无黑色素存在，表明TYR基因表达产物及其下游产物完全没有。

表3

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (9)

1.一种白化病模型猪的重构卵的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一：针对猪物种的酪氨酸酶基因的第一外显子的正链及互补链上满足G(N)₁₉NGG序列模式的序列部分分别设计gRNA的识别序列，分别记为第一gRNA识别序列和第二gRNA识别序列，其中，所述第一gRNA识别序列与所述第一外显子的正链上序列G(N)₁₉一致，所述第二gRNA识别序列与所述第一外显子的互补链上序列G(N)₁₉一致，N为A、T、C或G，下标19表示N的个数；所述猪物种的酪氨酸酶基因的序列为NCBI数据库中基因编号为407745所示的序列；所述第一外显子的正链上满足G(N)₁₉NGG序列模式的序列如SEQ ID No.1所示，所述第一外显子的互补链上满足G(N)₁₉NGG序列模式的序列如SEQ ID No.2所示；

步骤二：分别对所述第一gRNA识别序列和第二gRNA识别序列设计互补序列，以构建含有所述第一gRNA识别序列的第一双链DNA和含有第二gRNA识别序列的第二双链DNA；

步骤三：分别根据所述第一双链DNA和所述第二双链DNA设计gRNA表达载体，记为第一gRNA载体和第二gRNA载体，其中，所述第一gRNA载体中含有所述第一双链DNA，所述第二gRNA载体中含有所述第二双链DNA；

步骤四：将所述第一gRNA载体、所述第二gRNA载体及含有Cas9切口酶基因的表达载体转染进微型猪胎儿成纤维细胞中，筛选出酪氨酸酶基因敲除的阳性克隆细胞；

步骤五：将所述阳性克隆细胞注入母猪的去核***中，形成重构卵。

2.如权利要求1所述的白化病模型猪的重构卵的构建方法，其特征在于，所述步骤一中，所述第一gRNA识别序列如SEQ ID No.3所示，所述第二gRNA识别序列如SEQ ID No.4所示。

3.如权利要求2所述的白化病模型猪的重构卵的构建方法，其特征在于，所述步骤二具体包括如下步骤：

分别对所述第一gRNA识别序列和第二gRNA识别序列设计互补序列；

在所述第一gRNA识别序列的5’端加上CACC序列片段，形成如SEQ ID No.7所示的序列片段，并在所述第一gRNA识别序列的互补序列的5’端加上AAAC序列片段，形成如SEQ IDNo.8所示的序列片段，将加有粘性末端的第一gRNA识别序列及加有粘性末端的互补序列进行退火处理，得到带有粘性末端的所述第一双链DNA；

在所述第二gRNA识别序列的5’端加上CACC序列片段，形成如SEQ ID No.9所示的序列片段，并在所述第二gRNA识别序列的互补序列的5’端加上AAAC序列片段，形成如SEQ IDNo.10所示的序列片段，将加有粘性末端的第二gRNA识别序列及加有粘性末端的互补序列进行退火处理，得到带有粘性末端的所述第二双链DNA。

4.如权利要求3所述的白化病模型猪的重构卵的构建方法，其特征在于，所述步骤三具体包括如下步骤：

在gRNA-GFP-T1质粒载体中引入两个BbsI酶切位点，得到中间体质粒；

对所述中间体质粒使用限制性内切酶BbsI酶切，并将带有粘性末端的所述第一双链DNA和所述第二双链DNA对应连接到酶切后的中间体质粒上，分别得到所述第一gRNA载体和所述第二gRNA载体。

5.如权利要求4所述的白化病模型猪的重构卵的构建方法，其特征在于，所述步骤四中，在将所述第一gRNA载体、所述第二gRNA载体及含有Cas9切口酶基因的表达载体转染进微型猪胎儿成纤维细胞之前，还包括分别对所述第一gRNA载体、所述第二gRNA载体及含有Cas9切口酶基因的表达载体经转化处理后扩大培养，再提取所述第一gRNA载体、所述第二gRNA载体及含有Cas9切口酶基因的表达载体的步骤。

6.如权利要求1-5中任一项所述的白化病模型猪的重构卵的构建方法，其特征在于，还包括对得到的重构卵进行融合和激活的步骤，具体如下：

将所述重构卵从去核操作液中转至胚胎培养液中待融合与激活；

将所述重构卵转移至融合液激活液进行平衡，将平衡好的重构卵移入融合容器内，轻轻拨动重构卵，使***与注入的细胞的接触面平行于两条电极，两条电极之间间隔为1mm，然后进行电脉冲刺激，电融合参数为：120volts/mm、30μs、2次；

电脉冲刺激后将重构卵移入胚胎操作液中，筛选出融合成功的重构卵。

7.一种如权利要求1-6中任一项所述的白化病模型猪的重构卵的构建方法构建得到的重构卵。

8.一种白化病模型猪的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

按照权利要求1-5中任一项所述的白化病模型猪的重构卵的构建方法构建重构卵；

对所述重构卵进行细胞融合和激活，得到激活的重构卵；

将所述激活的重构卵至于***母猪的输卵管中，或者将所述激活的重构卵在体外或体内进行培养，形成重构胚，然后再将所述重构胚移植到***母猪的子宫内；

饲养所述***母猪，产生白化病模型猪。

9.如权利要求8所述的白化病模型猪的构建方法，其特征在于，所述对所述重构卵进行细胞融合和激活，得到激活的重构卵，具体包括如下步骤：

将所述重构卵从去核操作液中转至胚胎培养液中待融合与激活；

将所述重构卵转移至融合液激活液进行平衡，将平衡好的重构卵移入融合容器内，轻轻拨动重构卵，使***与注入的细胞的接触面平行于两条电极，两条电极之间间隔为1mm，然后进行电脉冲刺激，电融合参数为：120volts/mm、30μs、2次；

电脉冲刺激后将重构卵移入胚胎操作液中，筛选出融合成功的重构卵。