CN110501393A - 一种用于检测降钙素原的光电化学免疫传感器的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于检测降钙素原的光电化学免疫传感器的制备方法。本发明采用构建拼合式光电化学传感器的方式，将免疫识别分析与无机半导体材料光电响应测试分析分开，实现光电测试不破坏生物分子的免疫识别过程的目的。以硫化镉纳米材料修饰的锡酸铋纳米材料作为基底材料提供基础的光电响应，二者带隙结构匹配，能够很好的提高可见光利用效率。其次在96微孔板中进行抗原与抗体的特异性免疫识别过程，乙酰胆碱酯酶通过胺化合醛基化的二氧化硅材料与降钙素原二抗牢固结合，以此复合物作为标记物标记的降钙素原二抗，当96微孔板中滴入碘化乙酰硫代胆碱后，乙酰胆碱酯酶与之发生催化反应，得到的产物硫代胆碱作为电子供体，捕获材料受光激发产生的空穴，在不同程度上提高光电流，实现对降钙素原的灵敏检测。其检测限为0.20 pg/mL。

Description

一种用于检测降钙素原的光电化学免疫传感器的制备方法

技术领域

本发明涉及一种用于检测降钙素原的光电化学免疫传感器的制备方法，具体是以硫化镉敏化的锡酸铋作为基底材料，以二氧化硅连接的乙酰胆碱酯酶作为标记物标记降钙素原二抗，制备一种检测降钙素原的拼合式光电化学传感器，属于新型功能材料与生物传感检测技术领域。

背景技术

降钙素原(PCT，proclacitonin)是一种脓毒症诱导蛋白，它是无激素活性的降钙素前肽物质，它可作为一种感染炎症的标志物，用于区分细菌性感染和病毒性感染，并判断细菌性感染的严重程度和预后检测。PCT与常规用于炎症诊断的指标相比，已被公认为最理想的诊断严重细菌感染的指标，并且目前PCT有广泛的临床应用，例如自身免疫疾病的监测、器官移植的监测、脓毒症监测、急性胰腺炎监测等。因此，构建一种快速、灵敏的检测降钙素原的分析方法十分重要。目前已有的降钙素原检测方法有很多，如放射免疫学分析法（利用人工合成的多克隆抗体特异地识别和连接合成氨基酸降钙素原，Whang KT,Steinwald PM, Goldberg RL, et al. Serum calcitonin precursors in sepsis andsystemic inflammation[J]. Clin Endocrinol Metab, 1998, 83(9): 3296-301.）、化学发光法(一种基于双共试剂放大信号的电致发光免疫传感器的制备方法及应用，201610935907.6）。但是放射免疫分析检测和化学发光法检测耗时长，而且放射免疫检测有放射性元素的污染使用受到限制。本发明设计了一种拼合式光电化学传感器，拼合式传感器相较于前两种检测时间较短，灵敏高，干扰少；而且光电化学免疫分析背景信号低，稳定性好，本发明设计的拼合式光电化学传感器检测简单快速，稳定无毒，对降钙素原的检测限达到0.20 pg/mL。

锡酸铋，作为铋系纳米半导体半导体材料，可见光下具有优良的光催化效果，且制备简单，成本低；经过硫化镉敏化之后，大幅度提高了对可见光的吸收效率，获得了优异的光电流，为后续的测试提供稳定响应基础。二氧化硅具有良好的生物相容性，因此利用二氧化硅来连接乙酰胆碱酯酶和降钙素原二抗，形成乙酰胆碱酯酶标记的降钙素原二抗。然后滴入的碘化乙酰硫代胆碱和标记的乙酰胆碱酯酶反应生成的硫代胆碱可以作为电子供体以减少光生电子和空穴的复合，从而引起光电流的变化，以实现对目标物的定量检测。同时，采用拼合式的构建方式，免疫识别分析和光电测试分开，降低了对基底光敏材料光电响应的要求，同时避免了由于电化学测试对免疫反应的影响，构建操作简单，提高了传感器的稳定性和灵敏度。

光电化学传感器是基于物质的光电转换特性来确定待测物浓度的一类检测装置。光电化学检测方法具有设备简单、灵敏度高、易于微型化的优点，已经发展成为一种极具应用潜力的分析方法，在食品、环境、医药等领域具有广阔的应用前景。本发明基于锡酸铋/硫化镉复合材料作为基底材料，以二氧化硅连接的乙酰胆碱酯酶作为二抗标记物，根据不同浓度的待测物对光信号强度的影响不同，实现了对降钙素原的检测。本发明制备的光电化学传感器具有制作简单、成本低、检测快速和灵敏度高等特点，实现了在可见光范围内对降钙素原的稳定、灵敏检测，有效克服了目前对降钙素原检测方法的不足。

发明内容

本发明目的之一是采用硫化镉敏化锡酸铋纳米半导体光敏材料作为基底材料产生光电响应。硫化镉作为一种良好的敏化剂与锡酸铋具有匹配的能级，可以提高单纯光敏材料的光电性能，为后续测试提供光电流基础。

本发明目的之二是采用二氧化硅来连接乙酰胆碱酯酶和降钙素原二抗，乙酰胆碱酯酶作为二抗的标记物，当滴入碘化乙酰硫代胆碱时，乙酰胆碱酯酶发生催化反应生成的产物硫代胆碱可以作为电子供体，减少光生电子和空穴的复合，可以提高光电响应。

本发明目的之三是构建一种拼合式的光电化学传感器，拼合式的传感器将无机半导体材料的光电测试与生物分子之间的特异性识别免疫反应分开，这样电化学测试不会对免疫反应产生干扰，且省去了生物分子对电子传递的阻碍作用，对基底材料光电响应要求较低，无其他干扰。

本发明目的之四是以硫化镉/锡酸铋作为基底，以二氧化硅连接的乙酰胆碱酯酶标记二抗，制备了一种灵敏度高、选择性好、检测速度快的拼合式光电化学传感器，实现了在可见光下对降钙素原抗原的灵敏检测。

本发明技术方案如下：

1、基于一种用于检测降钙素原的光电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）锡酸铋材料的制备

取0.8 ~ 1.0 g五水合四氯化锡溶解于10 ~ 30 mL超纯水中，用3 ~ 5 M.的氢氧化钠水溶液将上述溶液调pH至4 ~ 6，搅拌10 ~ 20分钟，后离心得到白色沉淀；将得到的沉淀溶于30 ~ 50 mL含有1.8 ~ 2.0 g五水硝酸铋超纯水中，用3 ~ 5 M.的氢氧化钠水溶液调节pH至11 ~ 13，继续搅拌10 ~ 20分钟后将此溶液转入高压反应釜，于160 ~ 200 °C反应12~ 24小时，反应结束后自然冷却至室温，之后产品用无水乙醇和超纯水各洗涤3次，最后产品于 40 ~ 60 °C下干燥过夜，得到锡酸铋材料；

（2）硫化镉材料的制备

取0.4 ~ 0.5 g九水和硫化钠溶解于20 ~ 40 mL水中，搅拌5 ~ 10分钟，此溶液作为溶液A；取0.5 ~ 0.6 g乙酸镉溶解于20 ~ 40 mL水中，搅拌5 ~ 10分钟，此溶液作为溶液B；将溶液A和溶液B混合，室温下搅拌1 ~ 2小时后将溶液转入高压反应釜，于160 ~ 180 °C反应20 ~ 24小时，反应结束后自然冷却至室温，之后产品用无水乙醇和超纯水各洗涤3次，最后产品于40 ~ 60 °C下干燥过夜，得到硫化镉产品；

（3）二氧化硅纳米材料的制备

取70 ~ 80 mL无水乙醇和3 ~ 5 mL超纯水混合，搅拌均匀，向该溶液加入6 ~ 8 mL正硅酸四乙酯溶液，搅拌5 ~ 10分钟后，将15 ~ 20 mL质量分数为25 %的氨水溶液以1 ~ 3mL/min的速率滴入上述溶液，于40 °C下搅拌3 ~ 5小时，之后离心除去溶剂，并用乙醇和超纯水洗涤至中性，最后产品于40 ~ 60 °C下干燥10 ~ 16小时，得到二氧化硅纳米材料；

（4）二氧化硅的胺化

取2 ~ 4 mL APTES（3-氨丙基三乙氧基硅烷）和1 ~ 2 g制备的二氧化硅加入100 ~200 mL无水甲苯中，溶液超声20 ~ 30分钟后，将该溶液置于80 ~ 100 °C下搅拌20 ~ 24小时，然后用乙醇和超纯水离心洗涤至中性，最后产品于40 ~ 60 °C下干燥过夜，得到胺化的二氧化硅粉末；

（5）PBS缓冲溶液的配置

取7.0980 g十二水合磷酸氢二钠定容于500 mL的容量瓶中配置成浓度为0.1 M.的水溶液，作为甲液；取6.8045 g无水磷酸二氢钾定容于500 mL的容量瓶中配置成浓度为0.1M.的水溶液，作为乙液；将甲液和乙液按比例混合，配置成一系列pH在5.0 ~ 8.0的PBS缓冲溶液；

（6）乙酰胆碱酯酶-胺化二氧化硅-降钙素原二抗的制备

取1 ~ 2 mL的5 mg/mL胺化的二氧化硅加入到0.5 ~ 1.0 mL质量分数为2.5 %的戊二醛中，室温下搅拌6小时，离心后用pH为7.4的PBS洗涤除去戊二醛，然后将离心后的产品溶于1 mL、pH为7.4的PBS中并加入200 ~ 400 μg/mL的降钙素原二抗和200 ~ 400 μL浓度为1~ 5 mg/mL的乙酰胆碱酯酶，将溶液于37 °C下剧烈震荡1小时，并离心洗涤，将洗涤后得到的产品分散于2 mL、pH为7.4的PBS溶液中，同时加入50 ~ 80 μL质量分数为1 ~ 3 %的BSA溶液，以此来封闭非特异性活性位点，然后在室温下剧烈振荡1小时，离心并洗涤，最后将离心后得到的产品分散于5 mL、pH为7.4的PBS溶液中，并于4 °C下保存；

（7）光电化学传感器的制备

1）将导电玻璃依次用洗洁精、丙酮、乙醇和超纯水超声清洗，在70 °C烘箱中烘干140分钟；

2）取8 ~ 10 µL、2 ~ 6 mg/mL的锡酸铋水溶液滴加到ITO导电玻璃的导电面，红外灯下晾干；

3）在修饰的电极表面继续滴加8 ~ 10 µL、2 ~ 6 mg/mL的硫化镉水溶液，电极于室温下自然晾干；

4）取50 µL浓度为5 ~ 20 μg/mL的降钙素原捕获抗体滴入96微孔板中，于4 °C条件下放置10 ~ 14 小时以保证抗体与96微孔板牢固结合，抗体孵化结束后，吸出未结合的降钙素原抗体，用PBS缓冲溶液小心清洗96微孔板；

5）取25 µL用PBS配制的质量分数在1 ~ 3 %的牛血清白蛋白滴于96微孔板中，于室温下孵化1小时，之后吸出未结合的牛血清白蛋白，用PBS清洗96微孔板；

6）取50 µL浓度为0.0005 ~ 200 ng/mL的降钙素原抗原滴于96微孔板中，在室温下孵化1小时，之后用PBS缓冲溶液清洗96微孔板；

7）取50 µL浓度为5 ~ 20 μg/mL二氧化硅与降钙素原二抗和乙酰胆碱酯酶连接复合物滴于96微孔板中，室温下孵化1小时后，用PBS缓冲溶液冲洗96微孔板；

8）取50 µL用PBS缓冲溶液配制的浓度为1 ~ 5mg/mL的碘化乙酰硫代胆碱滴入96微孔板中，作用10 ~ 30分钟；

9）将96微孔板中的溶液吸出，注入10 mL的PBS缓冲溶液中作为光电测试的电解质溶液，将修饰的硫化镉/锡酸铋/导电玻璃电极浸入该电解质溶液中，制得一种检测降钙素原的光电化学传感器。

2. 如权利要求1所述制备的光电化学传感器的检测方法，其特征在于，步骤如下：

（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂电极为辅助电极，制备的ITO修饰电极为工作电极，在含有从96微孔板吸出的溶液的pH为5.0 ~ 8.0的PBS缓冲溶液中进行测试；

（2）将所修饰的电极浸入含有从96微孔板中吸出的不同的溶液的PBS缓冲溶液中，利用时间-电流法进行测试，设置电压为-0.1 ~ 0.1 V，运行时间120 s，光源波长为小于750 nm的白光；

（3）电极放置好之后，每隔10 s开灯持续照射10 s，记录光电流，绘制工作曲线；

（4）将待测的降钙素原样品溶液代替降钙素原标准溶液进行检测；

合成材料所需要的化学试剂均为当地试剂店购得，没有经过再处理。

本发明的有益成果

（1）本发明采用硫化镉敏化的锡酸铋作为光敏基底材料，解决了单纯硫化镉和单纯锡酸铋的光电转换效率低的问题。

（2）本发明采用二氧化硅来连接乙酰胆碱酯酶和降钙素原二抗，乙酰胆碱酯酶作为二抗的标记物，当存在碘化乙酰硫代胆碱时，乙酰胆碱酯酶发挥催化作用，得到电子供体硫代胆碱，促进光生电子快速转移，以提高光电响应。

（3）本发明采用拼合式的光电化学传感器的方式，将半导体材料的光电测试过程与生物分子之间的特异性免疫识别反应过程分开，一方面降低了对基底材料光电响应的要求，另一方面生物分子识别过程单独进行，不会被光电测试过程破坏活性，并且减小了传感器层层修饰过程中的其他干扰作用。

（4）本发明制备的光电化学传感器，用于降钙素原的检测，响应时间短，检测限低，线性范围宽，稳定性好，可以实现简便快捷、高灵敏和高稳定性检测。

具体实施方案

实施例1 光电化学传感器的制备

取0.8 g五水合四氯化锡溶解于10 mL超纯水中，用3 M.的氢氧化钠水溶液将上述溶液调pH至4，搅拌10分钟，后离心得到白色沉淀；将得到的沉淀溶于30 mL含有1.8 g五水硝酸铋超纯水中，用3 M.的氢氧化钠水溶液调节pH至11，继续搅拌10分钟后将此溶液转入高压反应釜，于160 °C反应12小时，反应结束后自然冷却至室温，之后产品用无水乙醇和超纯水各洗涤3次，最后产品于40 °C下干燥过夜，得到锡酸铋材料；

（2）硫化镉材料的制备

取0.4 g硫化钠溶解于20 mL水中，搅拌5分钟，此溶液作为溶液A；取0.5 g乙酸镉溶解于20 mL水中，搅拌5分钟，此溶液作为溶液B；将溶液A和溶液B混合，室温下搅拌1小时后将溶液转入高压反应釜，于160 °C反应20小时，反应结束后自然冷却至室温，之后产品用无水乙醇和超纯水各洗涤3次，最后产品于40 °C下干燥过夜，得到硫化镉产品；

（3）二氧化硅纳米材料的制备

取70 mL无水乙醇和3 mL超纯水混合，搅拌均匀，向该溶液加入6 mL正硅酸四乙酯溶液，搅拌5分钟后，将15 mL质量分数为25 %的氨水溶液以1 mL/min的速率滴入该溶液，于40°C下搅拌3小时，之后于离心除去溶剂，并用无水乙醇和超纯水洗涤至中性，最后产品于40°C下干燥过夜，得到二氧化硅纳米材料；

（4）二氧化硅的胺化

取2 mL APTES（3-氨丙基三乙氧基硅烷）和1.0 g制备的二氧化硅加入到100 mL无水甲苯中，将溶液超声20分钟后，将该溶液置于80 °C搅拌20小时，然后用无水乙醇和超纯水洗涤至中性，最后产品于40 °C下干燥过夜，得到胺化的二氧化硅粉末；

（5）PBS缓冲溶液的配置

取7.0980 g十二水合磷酸氢二钠定容于500 mL的容量瓶中配置成浓度为0.1 M.的水溶液，作为甲液；取6.8045 g无水磷酸二氢钾定容于500 mL的容量瓶中配置成浓度为0.1M.的水溶液，作为乙液；将甲液和乙液按比例混合，配置成pH为5.0的PBS缓冲溶液；

（6）乙酰胆碱酯酶-胺化二氧化硅-降钙素原二抗的制备

取1 mL的5 mg/mL胺化的二氧化硅加入到0.5 mL质量分数为2.5 %的戊二醛中，室温下搅拌6小时，离心后用pH为5.0的PBS洗涤除去戊二醛，然后将离心后的产品溶于1 mL、pH为5.0的PBS中并加入400 μg/mL的降钙素原二抗和400 μL的1 mg/mL的乙酰胆碱酯酶，将溶液于37 °C下剧烈震荡1小时，并离心洗涤，将洗涤后得到的产品分散于2 mL、pH为5.0的PBS溶液中，同时加入80 μL质量分数为1 %的BSA溶液，以此来封闭乙酰胆碱酯酶的非特异性活性位点，然后在室温下剧烈振荡1小时，离心并洗涤，最后将离心后得到的产品分散于5 mL、pH为5.0的PBS溶液中，并于4 °C下保存；

（7）光电化学传感器的制备

1）将导电玻璃依次用洗洁精、丙酮、乙醇和超纯水超声清洗，在70 °C烘箱中烘干140分钟；

2）取8 µL、2 mg/mL的锡酸铋水溶液滴加到ITO导电玻璃的导电面，红外灯下晾干；

3）在修饰的电极表面继续滴加8 µL、2 mg/mL的硫化镉水溶液，电极于室温下自然晾干；

4）取50 µL浓度为5 μg/mL的降钙素原捕获抗体滴入96微孔板中，于4 °C条件下放置10小时以保证抗体与96微孔板牢固结合，抗体孵化结束后，吸出未结合的降钙素原抗体，用PBS缓冲溶液小心清洗96微孔板；

5）取25 µL用PBS配制的质量分数在2 %的牛血清白蛋白滴于96微孔板中，于室温下孵化1小时，之后吸出未结合的牛血清白蛋白，用PBS清洗96微孔板；

6）取50 µL浓度为0.0005 ng/mL的降钙素原抗原滴于96微孔板中，在室温下孵化1 小时，之后用PBS缓冲溶液清洗96微孔板；

7）取50 µL浓度为5 μg/mL二氧化硅与降钙素原二抗和乙酰胆碱酯酶连接复合物滴于96微孔板中，室温下孵化1小时后，用PBS缓冲溶液冲洗96微孔板；

8）取50 µL用PBS缓冲溶液配制的浓度为1.0 mg/mL的碘化乙酰硫代胆碱滴入96微孔板中，作用10分钟；

9）将96微孔板中的溶液吸出，注入10 mL的PBS缓冲溶液中作为光电测试的电解质溶液，将修饰的硫化镉/锡酸铋/导电玻璃电极浸入该电解质溶液中，制得一种检测降钙素原的光电化学传感器。

实施例2 光电化学传感器的构架

（1）锡酸铋材料的制备

取0.9 g五水四氯化锡溶解于20 mL超纯水中，用4 M.的氢氧化钠水溶液将溶液调pH至4，搅拌十分钟后，离心得到白色沉淀；将得到的沉淀溶于含有1.94 g五水硝酸铋的40 mL超纯水中，再将此溶液用4 M.氢氧化钠水溶液调pH至12，继续搅拌15分钟后将此溶液转入高压反应釜，于180 °C反应24小时，反应结束后自然冷却至室温，之后产品用无水乙醇和超纯水各洗涤3次，最后产品于 60 °C下干燥过夜，得到锡酸铋材料；

（2）硫化镉材料的制备

取0.48 g硫化钠溶解于20 mL水中，搅拌5分钟，此溶液作为溶液A；取0.53 g乙酸镉溶解于20 mL水中，搅拌5分钟，此溶液作为溶液B；将溶液A和溶液B混合，室温下搅拌1.5小时后将溶液转入高压反应釜，于180 °C反应24小时，反应结束后自然冷却至室温，之后产品用无水乙醇和超纯水各洗涤3次，最后产品于60 °C下干燥过夜，得到硫化镉产品；

（3）二氧化硅纳米材料的制备

取75 mL无水乙醇和3 mL超纯水混合，搅拌均匀，向该溶液加入7 mL正硅酸四乙酯溶液，搅拌5分钟后将20 mL质量分数为25 %的氨水溶液以2 mL/min的速率滴入上诉溶液，于40 °C下搅拌4小时，之后用乙醇和超纯水离心洗涤至中性，最后产品于60 °C下干燥12小时，得到二氧化硅纳米材料；

（4）二氧化硅的胺化

取2 mL APTES（3-氨丙基三乙氧基硅烷）和1.0 g制备的二氧化硅加入到200 mL无水甲苯中，将溶液超声30分钟后将该溶液置于90 °C搅拌24小时，用无水乙醇和超纯水离心洗涤至中性，最后产品于60 °C下干燥过夜，得到胺化的二氧化硅粉末；

（5）PBS缓冲溶液的配置

取7.0980 g十二水合磷酸氢二钠定容于500 mL的容量瓶中配置成浓度为0.1 M.的水溶液，作为甲液；取6.8045 g无水磷酸二氢钾定容于500 mL的容量瓶中配置成浓度为0.1M.的水溶液，作为乙液；将甲液和乙液按比例混合，配置成pH在7.4的PBS缓冲溶液；

（6）乙酰胆碱酯酶-胺化二氧化硅-降钙素原二抗的制备

取2 mL的5 mg/mL胺化的二氧化硅加入到0.5 mL质量分数为2.5 %的戊二醛中，室温下搅拌6小时，离心后用pH为7.4的PBS洗涤除去戊二醛，然后将离心后的产品溶于1 mL、pH为7.4的PBS中并加入400 μg/mL的降钙素原二抗和400 μL浓度为1 mg/mL的乙酰胆碱酯酶，将溶液于37 °C下剧烈震荡1小时，并离心洗涤，将洗涤后得到的产品分散于2 mL、pH为7.4的PBS溶液中，同时加入80 μL质量分数为1 %的BSA溶液，以此来封闭乙酰胆碱酯酶的非特异性活性位点，然后在室温下剧烈振荡1小时，离心并洗涤，最后将离心后得到的产品分散于5mL、pH为7.4的PBS溶液中，并于4 °C下保存；

（7）光电化学传感器的制备

1）将导电玻璃依次用洗洁精、丙酮、乙醇和超纯水超声清洗，在70 °C烘箱中烘干140分钟；

2）取10 µL、2 mg/mL的锡酸铋水溶液滴加到ITO导电玻璃的导电面，红外灯下晾干；

3）在修饰的电极表面继续滴加10 µL、2 mg/mL的硫化镉水溶液，电极于室温下自然晾干；

4）取50 µL浓度为5 μg/mL的降钙素原捕获抗体滴入96微孔板中，于4 °C条件下放置10小时以保证抗体与96微孔板牢固结合，抗体孵化结束后，吸出未结合的降钙素原抗体，用PBS缓冲溶液小心清洗96微孔板；

5）取25 µL用PBS配制的质量分数在1 %的牛血清白蛋白滴于96微孔板中，于室温下孵化1小时，之后吸出未结合的牛血清白蛋白，用PBS清洗96微孔板；

6）取50 µL浓度为0.05 ng/mL的降钙素原抗原滴于96微孔板中，在室温下孵化1小时，之后用PBS缓冲溶液清洗96微孔板；

7）取50 µL浓度为5 μg/mL二氧化硅与降钙素原二抗和乙酰胆碱酯酶连接复合物滴于96微孔板中，室温下孵化1小时后，用PBS缓冲溶液冲洗96微孔板；

8）取50 µL用PBS缓冲溶液配制的浓度为2 mg/mL的碘化乙酰硫代胆碱滴入96微孔板中，作用25分钟；

9）将96微孔板中的溶液吸出，注入10 mL的PBS缓冲溶液中作为光电测试的电解质溶液，将修饰的硫化镉/锡酸铋/导电玻璃电极浸入该电解质溶液中，制得一种检测降钙素原的光电化学传感器。

实施例3 光电化学免疫传感器的构建

（1）锡酸铋材料的制备

取1.0 g五水四氯化锡溶解于30 mL超纯水中，用5 M.的氢氧化钠溶液将上诉溶液调节pH至6，搅拌20分钟后离心得到白色沉淀；将得到的沉淀溶于含有2.0 g五水硝酸铋50 mL超纯水中，再将此溶液用5 M.氢氧化钠水溶液调节pH至13，继续搅拌20分钟后将此溶液转入高压反应釜，于200 °C反应24小时，反应结束后自然冷却至室温，产品用无水乙醇和超纯水各洗涤3次，最后产品于60 °C下干燥过夜，得到锡酸铋材料；

（2）硫化镉材料的制备

取0.50 g硫化钠溶解于30 mL水中，搅拌10分钟，此溶液作为溶液A；取0.60 g乙酸镉溶解于30 mL水中，搅拌10分钟，此溶液作为溶液B；将溶液A和溶液B混合，室温下搅拌2小时后将溶液转入高压反应釜，于180 °C反应24小时，反应结束后自然冷却至室温，之后产品用无水乙醇和超纯水各洗涤3次，最后产品于60 °C下干燥过夜，得到硫化镉产品；

（3）二氧化硅纳米材料的制备

取80 mL无水乙醇和5 mL超纯水混合，搅拌均匀，向该溶液加入8 mL正硅酸四乙酯溶液，搅拌10分钟，后将20 mL质量分数为25 %的氨水溶液以2 mL/min的速率滴入上诉溶液，于40 °C下搅拌5小时，并用乙醇和超纯水离心洗涤至中性，最后产品于60 °C下干燥14小时，得到二氧化硅纳米材料；

（4）二氧化硅的胺化

取4 mL APTES（3-氨丙基三乙氧基硅烷）和2 g制备的二氧化硅加入到200 mL无水甲苯中，将溶液超声30分钟，之后将该溶液置于90 °C下搅拌22小时，用乙醇和超纯水离心洗涤至中性，最后产品于60 °C下干燥过夜，得到胺化的二氧化硅粉末；

（5）PBS缓冲溶液的配置

取7.0980 g十二水合磷酸氢二钠定容于500 mL的容量瓶中配置成浓度为0.1 M.的水溶液，作为甲液；取6.8045 g无水磷酸二氢钾定容于500 mL的容量瓶中配置成浓度为0.1M.的水溶液，作为乙液；将甲液和乙液按比例混合，配置成pH在8.0的PBS缓冲溶液；

（6）乙酰胆碱酯酶-胺化二氧化硅-降钙素原二抗的制备

取2 mL的5 mg/mL胺化的二氧化硅加入到0.5 mL质量分数为2.5 %的戊二醛中，室温下搅拌6小时，离心后用pH为8.0的PBS洗涤除去戊二醛，然后将离心后的产品溶于1 mL、pH为8.0的PBS中并加入400 μg/mL的降钙素原二抗和400 μL的5 mg/mL的乙酰胆碱酯酶，将溶液于37 °C下剧烈震荡1小时，并离心洗涤，将洗涤后得到的产品分散于2 mL、pH为8.0的PBS溶液中，同时加入80 μL质量分数为3 %的BSA溶液，以此来封闭乙酰胆碱酯酶的非特异性活性位点，然后在室温下剧烈振荡1小时，离心并洗涤，最后将离心后得到的产品分散于5 mL、pH为8.0的PBS溶液中，并于4 °C下保存；

（7）光电化学传感器的制备

1）将导电玻璃依次用洗洁精、丙酮、乙醇和超纯水超声清洗，在70 °C烘箱中烘干140分钟；

2）取9 µL、2 mg/mL的锡酸铋水溶液滴加到ITO导电玻璃的导电面，红外灯下晾干；

3）在修饰的电极表面继续滴加9 µL、2 mg/mL的硫化镉水溶液，电极于室温下自然晾干；

4）取50 µL浓度为10 μg/mL的降钙素原捕获抗体滴入96微孔板中，于4 °C条件下放置10小时以保证抗体与96微孔板牢固结合，抗体孵化结束后，吸出未结合的降钙素原抗体，用PBS缓冲溶液小心清洗96微孔板；

5）取25 µL用PBS配制的质量分数在3 %的牛血清白蛋白滴于96微孔板中，于室温下孵化1小时，之后吸出未结合的牛血清白蛋白，用PBS清洗96微孔板；

6）取50 µL浓度为50 ng/mL的降钙素原抗原滴于96微孔板中，在室温下孵化1小时，之后用PBS缓冲溶液清洗96微孔板；

7）取50 µL浓度为5 μg/mL二氧化硅与降钙素原二抗和乙酰胆碱酯酶连接复合物滴于96微孔板中，室温下孵化1小时后，用PBS缓冲溶液冲洗96微孔板；

8）取50 µL用PBS缓冲溶液配制的浓度为5 mg/mL的碘化乙酰硫代胆碱滴入96微孔板中，作用25分钟；

9）将96微孔板中的溶液吸出，注入10 mL的PBS缓冲溶液中作为光电测试的电解质溶液，将修饰的硫化镉/锡酸铋/导电玻璃电极浸入该电解质溶液中，制得一种检测降钙素原的光电化学传感器。

实施例4 降钙素原的检测

（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，制备的ITO修饰电极为工作电极，在含有从96微孔板吸出的溶液的pH为5.0的PBS缓冲溶液中进行测试；

（2）将所修饰的电极浸入含有从96微孔板中吸出不同的溶液的PBS缓冲溶液中，利用时间-电流法进行测试，设置电压为-0.1 V，运行时间120 s，光源波长为小于750 nm的白光；

（3）电极放置好之后，每隔10 s开灯持续照射10 s，记录光电流，绘制工作曲线；

（4）将待测的降钙素原样品溶液代替降钙素原标准溶液进行检测。

实施例5 降钙素原的检测

（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，制备的ITO修饰电极为工作电极，在含有从96微孔板吸出的溶液的pH为7.4的PBS缓冲溶液中进行测试；

（2）将所修饰的电极浸入含有从96微孔板中吸出不同的溶液的PBS缓冲溶液中，利用时间-电流法进行测试，设置电压为0 V，运行时间120 s，光源波长为小于750 nm的白光；

（3）电极放置好之后，每隔10 s开灯持续照射10 s，记录光电流，绘制工作曲线；

（4）将待测的降钙素原样品溶液代替降钙素原标准溶液进行检测。

实施例6 降钙素原的检测

（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，制备的ITO修饰电极为工作电极，在含有从96微孔板吸出的溶液的pH为8.0的PBS缓冲溶液中进行测试；

（2）将所修饰的电极浸入含有从96微孔板中吸出不同的溶液的PBS缓冲溶液中，利用时间-电流法进行测试，设置电压为0.1 V，运行时间120 s，光源波长为小于750 nm的白光；

（3）电极放置好之后，每隔10 s开灯持续照射10 s，记录光电流，绘制工作曲线；

（4）将待测的降钙素原样品溶液代替降钙素原标准溶液进行检测。

Claims (2)

1.基于一种用于检测降钙素原的光电化学免疫传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）锡酸铋材料的制备

取0.8 ~ 1.0 g五水合四氯化锡溶解于10 ~ 30 mL超纯水中，用3 ~ 5 M.的氢氧化钠水溶液将上述溶液调pH至4 ~ 6，搅拌10 ~ 20分钟，后离心得到白色沉淀；将得到的沉淀溶于30 ~ 50 mL含有1.8 ~ 2.0 g五水合硝酸铋的超纯水中，用3 ~ 5 M.的氢氧化钠水溶液调节pH至11 ~ 13，继续搅拌10 ~ 20分钟后将此溶液转入高压反应釜，于160 ~ 200 °C反应12 ~ 24小时，反应结束后自然冷却至室温，之后产品用无水乙醇和超纯水各洗涤3次，最后产品于40 ~ 60 °C下干燥过夜，得到锡酸铋材料；

（2）硫化镉材料的制备

取0.4 ~ 0.5 g九水合硫化钠溶解于20 ~ 40 mL水中，搅拌5 ~ 10分钟，此溶液作为溶液A；取0.5 ~ 0.6 g乙酸镉溶解于20 ~ 40 mL水中，搅拌5 ~ 10分钟，此溶液作为溶液B；将溶液A和溶液B混合，室温下搅拌1 ~ 2小时后将混合溶液转入高压反应釜，于160 ~ 180 °C反应20 ~ 24小时，反应结束后自然冷却至室温，之后产品用无水乙醇和超纯水各洗涤3次，最后产品于40 ~ 60 °C下干燥过夜，得到硫化镉产品；

（3）二氧化硅纳米材料的制备

取70 ~ 80 mL无水乙醇和3 ~ 5 mL超纯水混合，搅拌均匀，向该溶液加入6 ~ 8 mL正硅酸四乙酯溶液，搅拌5 ~ 10分钟后，将15 ~ 20 mL质量分数为25 %的氨水溶液以1 ~ 3mL/min的速率滴入上述溶液，于40 °C下搅拌3 ~ 5小时，之后离心除去溶剂，并用乙醇和超纯水洗涤至中性，最后产品于40 ~ 60 °C下干燥10 ~ 16小时，得到二氧化硅纳米材料；

（4）二氧化硅的胺化

取2 ~ 4 mL APTES（3-氨丙基三乙氧基硅烷）和1 ~ 2 g制备的二氧化硅加入100 ~200 mL无水甲苯中，溶液超声20 ~ 30分钟后，将该溶液置于80 ~ 100 °C下搅拌20 ~ 24小时，然后用乙醇和超纯水离心洗涤至中性，最后产品于40 ~ 60 °C下干燥过夜，得到胺化的二氧化硅粉末；

（5）PBS缓冲溶液的配置

取7.0980 g十二水合磷酸氢二钠定容于500 mL的容量瓶中配置成浓度为0.1 M.的水溶液，作为甲液；取6.8045 g 无水磷酸二氢钾定容于500 mL的容量瓶中配置成浓度为0.1M.的水溶液，作为乙液；将甲液和乙液按比例混合，配置成一系列pH在5.0 ~ 8.0的PBS缓冲溶液；

（6）乙酰胆碱酯酶-胺化二氧化硅-降钙素原二抗的制备

取1 ~ 2 mL的5 mg/mL胺化的二氧化硅加入到0.5 ~ 1.0 mL质量分数为2.5 %的戊二醛中，室温下搅拌6小时，离心后用pH为7.4的PBS洗涤除去戊二醛，然后将离心后的产品溶于1 mL、pH为7.4的PBS中并加入200 ~ 400 μg/mL的降钙素原二抗和200 ~ 400 μL浓度为1~ 5 mg/mL的乙酰胆碱酯酶，将溶液于37 °C下剧烈震荡1小时，并离心洗涤，将洗涤后得到的产品分散于2 mL、pH为7.4的PBS溶液中，同时加入50 ~ 80 μL质量分数为1 ~ 3 %的BSA溶液（pH为7.4的PBS缓冲液配置），以此来封闭非特异性活性位点，然后在室温下剧烈振荡1小时，离心并洗涤，最后将离心后得到的产品分散于5 mL、pH为7.4的PBS溶液中，并于4 °C下保存；

（7）光电化学传感器的制备

1）将导电玻璃依次用洗洁精、丙酮、乙醇和超纯水超声清洗，在70 °C烘箱中烘干140分钟；

2）取8 ~ 10 µL、2 ~ 6 mg/mL的锡酸铋水溶液滴加到ITO导电玻璃的导电面，红外灯下晾干；

3）在修饰的电极表面继续滴加8 ~ 10 µL、2 ~ 6 mg/mL的硫化镉水溶液，电极于室温下自然晾干；

4）取50 µL浓度为5 ~ 20 μg/mL的降钙素原捕获抗体滴入96微孔板中，于4 °C条件下放置10 ~ 14小时以保证抗体与96微孔板牢固结合，抗体孵化结束后，吸出未结合的降钙素原抗体，用PBS缓冲溶液小心清洗96微孔板；

5）取25 µL用PBS配制的质量分数在1 ~ 3 %的牛血清白蛋白滴于96微孔板中，于室温下孵化1小时，之后吸出未结合的牛血清白蛋白，用PBS清洗96微孔板；

6）取50 µL浓度为0.0005 ~ 100 ng/mL的降钙素原抗原滴于96微孔板中，在室温下孵化1小时，之后用PBS缓冲溶液清洗96微孔板；

7）取50 µL二氧化硅与降钙素原二抗和乙酰胆碱酯酶连接复合物滴于96微孔板中，室温下孵化1 小时后，用PBS缓冲溶液冲洗96微孔板；

8）取50 µL用PBS缓冲溶液配制的浓度为1 ~ 5mg/mL的碘化乙酰硫代胆碱滴入96微孔板中，作用10 ~ 30 分钟；

9）将96微孔板中的溶液吸出，注入10 mL的pH为7.4的PBS缓冲溶液中作为光电测试的电解质溶液，将修饰的硫化镉/锡酸铋/导电玻璃电极浸入该电解质溶液中，制得一种检测降钙素原的光电化学传感器。

2.如权利要求1所述制备的光电化学传感器的检测方法，其特征在于，步骤如下：

（1）使用电化学工作站以三电极体系进行测试，饱和甘汞电极为参比电极，铂电极为辅助电极，制备的ITO修饰电极为工作电极，在含有从96微孔板吸出的溶液的pH为5.0 ~ 8.0的PBS缓冲溶液中进行测试；

（2）将所修饰的电极浸入含有从96微孔板中吸出的不同的溶液的PBS缓冲溶液中，利用时间-电流法进行测试，设置电压为-0.1 ~ 0.1 V，运行时间120 s，光源波长为小于750 nm的白光；

（3）电极放置好之后，每隔10 s开灯持续照射10 s，记录光电流，绘制工作曲线；

（4）将待测的降钙素原样品溶液代替降钙素原标准溶液进行检测。