CN110499260A - 一种高产红景天苷和/或酪醇的工程菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种高产红景天苷和/或酪醇的工程菌及其应用。本发明公开了一种高产红景天苷的工程菌，它是将酿酒酵母菌中的ARO4基因编码第229位氨基酸的密码子突变为编码亮氨酸的密码子、ARO7基因第141位甘氨酸的密码子突变为编码丝氨酸的密码子、ARO3基因第222位赖氨酸的密码子突变为编码亮氨酸的密码子的重组酵母菌。本发明还公开了采用前述工程菌制备红景天苷的发酵。本发明工程菌可以高产红景天苷和/或酪醇，经济价值高，工业应用前景良好。

Description

一种高产红景天苷和/或酪醇的工程菌及其应用

本申请要求于2018年09月25日提交中国专利局、申请号为201811116170.0、发明名称为“一种高产红景天苷的工程菌及其应用”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。

技术领域

本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种高产红景天苷和/或酪醇的工程菌及其应用。

背景技术

红景天是生长在高寒无污染地带的珍稀野生植物，是我国藏族人民的习用药物，至今己有1000多年的应用历史，其具有刺激神经***、增加工作效率、消除疲劳和预防高山症等作用，还具有保护心脑血管，神经细胞以及抗肿瘤抗辐射等功能。红景天的主要药用活性成分是红景天苷及其苷元酪醇。近年来，以红景天苷及其苷元酪醇作为主要原料生产的药剂、饮料、食品以及化妆品等产品种类越来越多，对红景天苷及其苷元酪醇的需求也越来越高。

红景天苷的苷元酪醇(Tyrosol)，其化学名称为4-(2-Hydroxyethyl)pHeno1,分子式为C₈H₁₀O₂，分子量为138.164，CAS号为501-94-0，结构式如式Ⅰ所示：

酪醇(对羟基苯乙醇)作为苯乙醇的一种衍生物，是源于橄榄油的一种天然抗氧化剂，同时具有抗疲劳、抗辐射、调节机体免疫等多种作用。除自身具有重要价值外，酪醇是合成多种有机化合物及衍生物的重要前体物质。例如，用酪醇合成的羟基酪醇和红景天苷都具有较高的药用价值，羟基酪醇的抗氧化性强于酪醇，在医药和功能食品方面应用广泛。

红景天苷(Salidroside)的化学名称为2-(4-hydroxypHenyl)ethyl-β-D-glucopyranoside，分子式为C₁₄H₂₀O₇，分子量为300.304，CAS号为10338-51-9，结构式如式Ⅱ所示：

目前，红景天苷及其苷元酪醇的主要生产途径是从红景天植株中提取。然而，由于自然生长的红景天植物资源稀有，人工栽培的红景天植物的成本也较高，并且，其红景天苷含量较低，如最常用的高山红景天和大花红景天中红景天苷的含量仅有0.5％-0.8％，提取的成本高，效率低。而化学合成工艺过程长不易操作控制，成本高，难以实现产业化；植物组织培养反应周期长，效价较低。生物合成对自然环境的依赖较小，有可能克服从红景天苷植物中提取红景天苷及其苷元酪醇存在的上述问题。

酪醇的生物合成来说，以大肠杆菌为载体进行生产受到大肠内毒素挑战。而以酿酒酵母为载体的合成中，在缺省培养条件下，酪醇的浓度只能达到1.326g/L。

红景天苷的化学合成工艺过程长不易操作控制，成本高，难以实现产业化；已经发现的功能微生物转化效率较低，需要添加外源底物；植物组织培养反应周期长，效价较低；在已经人工构建好的大肠杆菌生物合成途径中，红景天苷的产物浓度较低。

王梦亮等以D-葡萄糖和酪醇为底物，经筛选得到的微生物菌株作用，成功合成红景天苷(王梦亮，张芳，刘滇生，微生物催化D-葡萄糖与酪醇葡糖基转移合成红景天甙的初步研究，催化学报，2006，27(3)：233-236)，但是得到较高产物浓度非常低。现有文献报道了通过改变大肠杆菌和酿酒酵母的基因来提高红景天苷产物浓度的方式，但是也不尽如人意，导致后期提取仍然存在难度大、成本高的问题。如：毕慧萍等，以大肠杆菌为平台构建的高产酪醇和/或红景天苷和淫羊藿次苷D2菌株，实现了一条不同于植物的酪醇生物合成通路。在构建的菌株中，酪醇的产量可达600mg/L，红景天苷的产量可达50mg/L，淫羊藿次苷D2的产量可达40mg/L。(毕慧萍，白艳芬，庄以彬等.一种高产酪醇和/或红景天苷和淫羊藿次苷D2的大肠杆菌表达菌株及其应用.CN 104940575A,2015.)；刘涛等在构建的产红景天苷重组大肠杆菌研究中，通过敲除或沉默galE、galT、ugd，并导入过表达ARO10、pgm、UGT73B6、galU、T7ploymerase基因，红景天苷的最高产量能够提升至0.7g/L(刘涛，毕慧萍，庄以彬等，一种生产红景天苷的重组大肠杆菌及构建方法及应用.CN107435049A，2016.)；华东理工大学刘涛课题组已经利用酿酒酵母从头合成红景天苷，但产量较低，只有732.5mg/L(Jiang J,Yin H,Wang S,etal.Metabolic Engineering of Saccharomyces cerevisiaefor High-Level ProductionofSalidroside from Glucose.Journal of Agricultural&Food Chemistry,2018.)。

虽然在随后的重组大肠中红景天苷的产量提高到0.7g/L的浓度，低浓度无疑增加了后期提取的难度和成本；以葡萄糖和木糖两种碳源为底物的两种大肠杆菌共培养技术，虽能获得6.03g/L的红景天苷，使用价格更贵的木糖为底物，同时也增加了生产成本；虽然通过优化酿酒酵母合成途径，将以廉价葡萄糖为底物合成红景天苷产量提高到1-1.1g/L，但对于工业化生产来说，任有优化提高需求。

因此，实现进一步优化酪醇和红景天苷在微生物体内生物全合成途径，在控制生产成本的同时并得到更高的产物浓度具有重要的科研价值及社会效益。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种新的工程菌，其可以高产红景天苷和/或酪醇。

本发明高产红景天苷的工程菌，它是将酿酒酵母菌中的ARO4基因编码第229位氨基酸的密码子突变为编码亮氨酸的密码子(即将ARO4基因突变为ARO4^K229L)、ARO7基因第141位甘氨酸的密码子突变为编码丝氨酸的密码子(即ARO7基因突变为ARO7^G141S)、ARO3基因第222位赖氨酸的密码子突变为编码亮氨酸的密码子(即ARO3基因突变为ARO3^K222L)的重组酵母菌。

ARO4基因：是指，Gene ID:852551，Chromosome:II；NC_001134.8(716882..717994)。

ARO7基因：是指，Gene ID:856173，Chromosome:XVI；NC_001148.4(674861..675631)。

ARO3基因：是指，Gene ID:851605，Chromosome:IV；NC_001136.10(521816..522928)。

所述ARO4基因第229位的密码子为TTG，所述ARO7基因第141位的密码子为agt；第222位的密码子为CTA，具体地：

ARO4^K229L的序列如SEQ ID No.1所示：

atgagtgaatctccaatgttcgctgccaacggcatgccaaaggtaaatcaaggtgctgaagaagatgtcagaattttaggttacgacccattagcttctccagctctccttcaagtgcaaatcccagccacaccaacttctttggaaactgccaagagaggtagaagagaagctatagatattattaccggtaaagacgacagagttcttgtcattgtcggtccttgttccatccatgatctagaagccgctcaagaatacgctttgagattaaagaaattgtcagatgaattaaaaggtgatttatccatcattatgagagcatacttggagaagccaagaacaaccgtcggctggaaaggtctaattaatgaccctgatgttaacaacactttcaacatcaacaagggtttgcaatccgctagacaattgtttgtcaacttgacaaatatcggtttgccaattggttctgaaatgcttgataccatttctcctcaatacttggctgatttggtctccttcggtgccattggtgccagaaccaccgaatctcaactgcacagagaattggcctccggtttgtctttcccagttggtttcaagaacggtaccgatggtaccttaaatgttgctgtggatgcttgtcaagccgctgctcattctcaccatttcatgggtgttactTTGcatggtgttgctgctatcaccactactaagggtaacgaacactgcttcgttattctaagaggtggtaaaaagggtaccaactacgacgctaagtccgttgcagaagctaaggctcaattgcctgccggttccaacggtctaatgattgactactctcacggtaactccaataaggatttcagaaaccaaccaaaggtcaatgacgttgtttgtgagcaaatcgctaacggtgaaaacgccattaccggtgtcatgattgaatcaaacatcaacgaaggtaaccaaggcatcccagccgaaggtaaagccggcttgaaatatggtgtttccatcactgatgcttgtataggttgggaaactactgaagacgtcttgaggaaattggctgctgctgtcagacaaagaagagaagttaacaagaaatag

ARO7^G141S的序列如SEQ ID No.2所示：

ATGGATTTCACAAAACCAGAAACTGTTTTAAATCTACAAAATATTAGAGATGAATTAGTTAGAATGGAGGATTCGATCATCTTCAAATTTATTGAGAGGTCGCATTTCGCCACATGTCCTTCAGTTTATGAGGCAAACCATCCAGGTTTAGAAATTCCGAATTTTAAAGGATCTTTCTTGGATTGGGCTCTTTCAAATCTTGAAATTGCGCATTCTCGCATCAGAAGATTCGAATCACCTGATGAAACTCCCTTCTTTCCTGACAAGATTCAGAAATCATTCTTACCGAGCATTAACTACCCACAAATTTTGGCGCCTTATGCCCCAGAAGTTAATTACAATGATAAAATAAAAAAAGTTTATATTGAAAAGATTATACCATTAATTTCGAAAAGAGATGGTGATGATAAGAATAACTTCagtTCTGTTGCCACTAGAGATATAGAATGTTTGCAAAGCTTGAGTAGGAGAATCCACTTTGGCAAGTTTGTTGCTGAAGCCAAGTTCCAATCGGATATCCCGCTATACACAAAGCTGATCAAAAGTAAAGATGTCGAGGGGATAATGAAGAATATCACCAATTCTGCCGTTGAAGAAAAGATTCTAGAAAGATTAACTAAGAAGGCTGAAGTCTATGGTGTGGACCCTACCAACGAGTCAGGTGAAAGAAGGATTACTCCAGAATATTTGGTAAAAATTTATAAGGAAATTGTTATACCTATCACTAAGGAAGTTGAGGTGGAATACTTGCTAAGAAGGTTGGAAGAGTAA

ARO3^K222L的序列如SEQ ID No.3所示：

AtgttcattaaaaacgatcacgccggtgacaggaaacgcttggaagactggagaatcaaaggttatgatccattaacccctccagatctgcttcaacatgaatttccaatttcagccaaaggtgaggaaaacattatcaaggcaagagactccgtctgtgatattttgaatggtaaagatgatcgtttagttatcgtgatcgggccatgttccctacatgaccccaaagccgcttacgattacgctgacagattggctaaaatttcagaaaagttgtcaaaagacttattgattattatgagagcgtatttagaaaaaccaaggactactgttggctggaaagggttgattaacgaccctgatatgaataactcttttcaaatcaataaaggtctacggatttcgagagaaatgttcataaaactggttgaaaaattacccattgctggtgagatgttggataccatttctccgcagtttttgagtgattgtttctccttgggtgccatcggcgccagaactactgaatcccaactgcacagagaattagcatccggtctatctttccctattggatttaagaacggtactgatggtggtttgcaagtcgccatcgacgctatgagagccgctgcacatgaacattacttcctttctgtcacaCTAccaggtgtcactgctatcgtgggcactgaaggtaacaaggataccttcctgatcttgagaggtggtaagaacggtactaactttgacaaagaaagtgttcaaaatactaagaaacagttagaaaaggccggtttgactgatgattcccagaaaagaattatgatcgattgttcccacggcaacagtaataaagatttcaagaaccaaccaaaggttgccaaatgtatttatgaccagctgacggagggtgagaatagtctctgtggtgttatgattgagtccaacataaatgaaggtagacaagatattcccaaagaaggtggcagagagggattgaagtatggttgttctgttacggatgcttgtattggctgggagtccaccgaacaggtattggagctattggcagaaggtgttagaaacagaagaaaggccttgaaaaaatag

备注：下划线表示突变位点。

进一步地，所述重组酵母菌中，所述重组酵母菌中，基因RIC1、基因pHA2和/或TRP2被失活；优选地，基因RIC1、基因pHA2和/或TRP2分别突变为SEQ ID NO：4～6所示的序列。

RIC1基因：是指，Gene ID:850728Chromosome:XII；NC_001144.5(225426..228596)。

pHA2基因：是指，Gene ID:855400Chromosome:XIV；NC_001146.8(42071..43075)。

TRP2基因：是指，Gene ID:856824Chromosome:V；NC_001137.3(337949..339472)。

基因敲除的序列(备注：阴影部分代表基因已经被敲除)

ΔRIC1(SEQ ID No.4):

ΔTRP2(SEQ ID No.5)

ΔPHA2(SEQ ID No.6)

进一步地，所述重组酵母菌中包含携带UGP1，PGM和/或RrU8GT33的严谨型质粒pRS413质粒；优选地，所述重组酵母菌中还包含携带ARO10、ARO2和/或ARO1的整合型pRS425质粒。

UGP1基因：是指，GeneID:853830Chromosome:XI；NC_001143.9(369891..371390)；

PGM基因：是指，GeneID:853732；

RrU8GT33基因：是指，GenBank:MF674558.1；

ARO1基因：是指，Gene ID:851705Chromosome:IV；NC_001136.10(704484..709250)；

ARO2基因：是指，Gene ID:852729Chromosome:VII；NC_001139.9(226399..227529)；

ARO10基因：是指，Gene ID:851987Chromosome:IV；NC_001136.10(1234218..1236125)。

进一步地，所述重组酵母中，突变后的ARO4、ARO7、ARO3基因表达片段被扩增、串联(ARO4p-ARO4-ARO4t-ARO7p-ARO7-ARO7t-ARO3p-ARO3-ARO3t)，并***酵母基因组的308a位置，即在酵母细胞中ARO4、ARO7、ARO3的拷贝数增加了一个。

进一步地，所述重组酵母菌中，基因pHA2和基因pdc1被失活。

优选地，基因pHA2和基因PDC1分别突变为SEQ ID NO：5～6所示的序列。

pHA2基因：是指，Gene ID:855400Chromosome:XIV；NC_001146.8(42071..43075)。

PDC1基因：是指，Gene ID：850733Chromosome:XII；NC_001144.5(232390..234081,complement)。

基因敲除的序列(备注：阴影部分代表基因已经被敲除)。

ΔPHA2(SEQ ID No.6)

ΔPDC1(SEQ ID No.24)

进一步地，所述重组酵母菌中还包含携带ARO10、ARO2、RKI1和TKL1的整合型pRS406质粒，作为优选，ARO10、ARO2、RKI1和TKL1过表达；优选地，所述重组酵母菌中还包含携带RrU8GT33的组成型质粒pRS405质粒。

ARO2基因：是指，Gene ID:852729Chromosome:VII；NC_001139.9(226399..227529)。

ARO10基因：是指，Gene ID:851987Chromosome:IV；NC_001136.10(1234218..1236125)。

RKI1基因：是指，Gene ID:854262Chromosome:XV；NC_001147.6(503552..504328)。

TKL1基因：是指，Gene ID:856188Chromosome:XVI；NC_001148.4(692796..694838)。

RrU8GT33基因：是指，GenBank:MF674558.1。

本发明还提供了前述工程菌在生产红景天苷和/或酪醇中的应用。

本发明还提供了一种制备红景天苷和/或酪醇的方法，它是采用前述的工程菌发酵制备。

所述方法包括如下步骤：

(1)取前述的工程菌，培养，得到酿酒酵母种子液；

(2)将酿酒酵母种子液接种到发酵培养基中，发酵，得发酵液；

(3)分离纯化。

步骤(1)的工艺为：取工程菌，接种到SC液体培养基或YPAD培养基中，28～32℃、100～300rpm摇床培养12～36h，优选30℃、200rpm摇床培养24h。

SC液体培养基：

步骤(2)中，发酵的条件为：将酿酒酵母种子液接种到发酵培养基中后，OD600为0.4～0.9；发酵的温度为28～32℃，搅动速度100～300rpm；控制控制pH为5.3～5.8；空气流速为2.5vvm～3.5vvm；发酵时间为120～170h。

步骤(2)中，所述发酵培养基为SC培养基或YPAD培养基，在发酵的过程中连续添加葡萄糖溶液，保持发酵培养基中葡萄糖浓度为0.5～5g/L。

步骤(3)中，所述分离纯化方法为柱层析方法。

所述柱层析方法为：将发酵液用HP20大孔吸附树脂吸附，后用清水洗涤树脂，再依次用40％乙醇、70％乙醇洗脱，得红景天苷的纯品；优选地，上样体积：柱体积为3：1；吸附完成后用3倍柱体积的水洗涤树脂，后用20倍柱体积的40％乙醇，再40倍柱体积的70％乙醇洗脱。

本发明还提供了一种制备红景天苷和/或酪醇的方法，它是采用前述的工程菌发酵制备。

所述方法包括如下步骤：

(1)取前述的工程菌，培养，得到酿酒酵母种子液；

(2)将酿酒酵母种子液接种到发酵培养基中，发酵，得发酵液；

(3)分离纯化。

步骤(1)的工艺为：取工程菌，接种到YPD液体培养基中，优选30℃、200rpm摇床培养12h，将培养好的菌液转接到接种到含50mlYPD培养基的250ml锥形瓶中(接种比例1％)，30℃200rpm培养OD到5-6。

YPD液体培养基：

步骤(2)中，发酵的条件为：将酿酒酵母种子液接种到含2.25L发酵培养基的发酵罐中后，OD600为0.5～0.6；发酵的温度为30℃，搅动速度为400～600rpm，并关联溶氧大于40％；控制控制pH为5.3～5.8；空气流速为2.5vvm～3.5vvm(vvm为单位时间单位发酵液的通气量)；发酵时间为168h。

步骤(2)中，所述发酵培养基为YPD培养基，在发酵的过程中连续添加葡萄糖溶液。

步骤(3)中，所述分离纯化方法为柱层析方法。

所述柱层析方法为：发酵液经过离心后，上清液用HP20大孔吸附树脂吸附，后用清水洗涤树脂，再依次用40％乙醇、70％乙醇洗脱，得红景天苷的乙醇水溶液，经减压旋蒸得红景天苷样品；优选地，上样体积：柱体积为3：1；吸附完成后用3倍柱体积的水洗涤树脂，后用20倍柱体积的40％乙醇，再40倍柱体积的70％乙醇洗脱。本发明的关键在于建立了高产红景天苷和/或酪醇的重组酿酒酵母，采用该酿酒酵母可以高产红景天苷和/或酪醇，具体制备方法并不局限于本发明列举的方法。

本发明的一些实验结果证明，本发明改造后的两株工程菌可以分别高产红景天苷和酪醇，红景天苷产量为1.5g/L酪醇产量为0.7g/L本发明的另一些实验结果证明，本发明改造后的工程菌可以高产红景天苷，5L发酵罐中红景天苷最高产量为26.56g/L。经济价值高，且发酵工艺简单，成本低廉，工业应用前景良好。本发明的另一些实验结果证明，本发明改造后的工程菌可以高产酪醇，在5L发酵罐中发酵，酪醇最高产量为10g/L。

显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示重组质粒的构建示意图。

具体实施方式

本发明公开了一种高产红景天苷的工程菌及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

实施例1、本发明工程菌的构建

1、工程菌的构建方法

(1)从原始酿酒酵母菌株HY001(CEN.PK-1C)出发，依次对主代谢流途径的三种ARO基因进行突变，突变方法为CRISPR-Cas9介导的基因组定点突变技术：

基因定点突变的方法，采用的质粒携带有Cas9蛋白的基因和一段用来转录的基因，转录的RNA与Cas9蛋白结合，只需在质粒上再导入一段与目标基因配对的基因spacer和同源重组片段，将重新构建好的质粒导入细胞，因为设计的同源重组片段是定点突变的，酵母真核细胞体内被切断的目的基因，以同源重组方式，以质粒上的同源臂为模板，修复造成定点突变，从而完成基因定点突变目的。

在HY001菌株上，将ARO4基因突变为ARO4^K229L，由此得到菌株HY002(CEN.PK-1C-mutARO4)；

Spacer：TTCATGGGTGTTACTAAGCA(如SEQ ID No.7所示)

同源臂：

HR-Left:aatgttgctgtggatgcttgtcaagccgctgctcattctcaccatttcatgggtgttactTTG(如SEQ ID No.8所示)

HR-Right:catggtgttgctgctatcaccactactaagggtaacgaacactgcttcgttattcta(如SEQ ID No.9所示)。

在HY002菌株上，将ARO7基因突变为ARO7^G141S，由此得到菌株HY003(CEN.PK-1C-mutARO4-mutARO7)；

spacer：GGTGATGATAAGAATAACTT(如SEQ ID No.25所示)

同源臂

HR-Left:

GATTATACCATTAATTTCGAAAAGAGATGGTGATGATAAGAATAACTTCAGT(如SEQ ID No.26所示)

HR-Right:

TCTGTTGCCACTAGAGATATAGAATGTTTGCAAAGCTTGAGTAGGAGA(如SEQ ID No.27所示)

在HY003菌株上，将ARO3基因突变为ARO3^K222L，由此得到菌株HY004(CEN.PK-1C-mutARO4-mutARO7-mutARO3)。

ARO3^K229L突变信息：

Spacer：TTCCTTTCTGTCACAAAGCC(如SEQ ID No.10所示)

HR-Left：

CATCGACGCTATGAGAGCCGCTGCACATGATCATTACTTCCTTTCTGTCACACTA(如SEQ IDNo.11所示)

HR-Right：

CCAGGTGTCACTGCTATCGTGGGCACTGAAGGTAACAAGGATACCTTCCTGATCTTGAG(如SEQ IDNo.12所示)

(2)在酿酒酵母菌株HY004上，先基因敲除RIC1，解决转录相关抑制，获得菌株HY005(CEN.PK-1C-mutARO4-mutARO7-mutARO3-ΔRIC1)。突变方法为CRISPR-Cas9介导的基因组敲除。

基因定点敲除的方法，采用的质粒携带有Cas9蛋白的基因和一段用来转录的基因，转录的RNA与Cas9蛋白结合，只需在质粒上再导入一段与目标基因配对的基因spacer和同源重组片段，将重新构建好的质粒导入细胞，因为设计的同源重组片段是有一段碱基缺失的，酵母真核细胞体内被切断的目的基因，以同源重组方式，以质粒上的同源臂为模板，修复造成移码突变，造成基因功能破坏，从而完成基因敲除目的。

ΔRIC1信息：

Spacer：GGAATTCTAAGCAATTGGGG(如SEQ ID No.13所示)

HR-Left：

CGGAAGCTGTAAGAAACTGAACACGTGGAAAATGCACTTATGGCCAGTCA(如SEQ ID No.14所示)

HR-Right：

CAATTGCTTAGAATTCCACCCCGCAACGCCGAATTAGGTGAGGGTACTAA(如SEQ ID No.15所示)

(2)在酿酒酵母菌株HY005上，敲除pHA2，TRP2，减少色氨酸和苯丙氨酸竞争途径，获得菌株HY006(CEN.PK-1C-mutARO4-mutARO7-mutARO3-ΔRIC1-ΔpHA2-ΔTRP2)。突变方法为CRISPR-Cas9介导的基因组敲除。

PHA2

Spacer：GGGGGATAGAGGCTGCTGGG(如SEQ ID No.16所示)

同源臂

HR-Left:AGGTACGTATTCCCATCAAGCTGCATTACAACAATTTCAATCAACATCTGATGTTGAGTA(如SEQ ID No.17所示)

HR-Right:AATGTTTTAACCAATTGGAGAACGACACTAGTATAGATTATTCAGTGGTACCGTTGG(如SEQ ID No.18所示)

TRP2

Spacer：ATTGGATCTGACTCCTCACG(如SEQ ID No.19所示)

同源臂

HR-Left:ACAGCAGCAAAATGACGATAGTTCCATAAATATGTATCCCGTGTATGCGTATTTGCCATC(如SEQ ID No.20所示)

HR-Right:CATATCTAAAATTGGCACAATTGAACAACCCTGATAGAAAGGAATCATTTCTGTTGGAAA(如SEQ ID No.21所示)

(3)本发明的酿酒酵母菌株中还通过单交换的方法，***了基因UGP1，PGM，RrU8GT33，以及与主代谢流调控相关的基因ARO10，ARO2，ARO1。基因组整合通常是确保群体中途径稳定性和同源表达的最佳方法。

本发明利用严谨型质粒pRS413将UGP1，PGM，RrU8GT33串联表达，构成模块1，利用酿酒酵母染色体上的多个Delta位点作为***点，将基因整合进基因组，实现基因的高表达目的。

整合位点：

delta1:(如SEQ ID No.22所示)

ctcgagggatataggaatcctcaaaatggaatctatatttctacatactaatattacgattattcattccgttttatatgtttatatttcattgatcctattacattatcaatccttgcgtttcagcttccactaatttagatgactatttctcatcatttgcgtcatcttctaagccagccgtatatgataatatactagtaatgtaaatactagttagtagatgatagttgatttctattccaaca

delta2：(如SEQ ID No.23所示)

tggaagctgaaacgtctaacggatcttgatttgtgtggacttccttagaagtaaccgaagcacaggcgctaccatgagaaatgggtgaatgttgagataattgttgggattccattgttgataaaggctataatattaggtatacagaatatactagaagttctc

选用整合型质粒pRS406将与主代谢流调控相关的基因ARO10，ARO2，ARO1按顺序串联表达，构成模块2。

***位点为：ura 3-52。

模块1，模块2的构建方法为酵母连接法。

利用Delta位点将其整合至酵母基因组上，技术路线如图1所示。连接步骤如下：

将各片段DNA按照等摩尔比混合，确定最后总体积(浓缩至10μl)，浓缩方式可为QIAquick浓缩。

1)在YPAD平板上划板，制备新鲜的HZ848单克隆；

2)挑单克隆至2-3mlYPAD中，30℃摇床过夜培养(约16h)；

3)取1ml种子菌液在50ml YPAD中，30℃培养至OD600＝0.6-0.8(一般养4h)；

酵母传代2h/代；

4)将酵母于4℃，4000rpm，离心2-3min，弃上清；

5)加50ml预冷ddH₂O，清洗细胞，离心，弃上清(先取1ml无菌水，吹匀菌体后，再加剩下的水)；

6)加1ml预冷ddH₂O，重悬，移至1.5ml EP管，7000rpm，4℃，离心30s，弃上清；

7)加1ml预冷1M sorbitol，清洗细胞，离心，弃上清；

8)加400-600μl预冷1M sorbitol，重悬，分装成100μl/管；

电转：

1)取10μl DNA加入100μl感受态，混匀后转移至预冷电转杯(1.5kv，5.0-5.2ms点击)，电击后快速加入1ml YPAD；

2)30℃，250rpm，复苏1h。5000rpm，离心1min，弃上清；

3)加1ml 1M sorbitol清洗细胞，洗三次，最后重悬至1ml 1M sorbitol；

4)分100μl，900μl分别涂布于筛选平板，30℃培养。

转化：酵母化转法将构建好的质粒导入目的菌株中。

1、接种目的菌株于5ml YPAD，30℃振养过夜；

2、取2ml菌液于50ml YPAD，置30℃振养4-5h，OD600＝0.8-1.0(细胞至少完成两次***，在三或四次***期间，转化效率恒定)；

3、离心，2500rpm，5min(也可以4000rpm，2-3min)，弃上清；

4、将SSDNA样品煮沸10min，快速***冰中；

5、水洗：用50ml无菌水重悬，同上离心；

6、100mM LiAc洗:用50μl的100mM LiAc重悬，12000rpm，3s(或4000rpm，1min)吸尽上清；

7、悬浮细胞到最终体积500μl，约加100mM LiAc 400μl，分成50μl/管，离心，弃上清(4000rpm，30s)时间缩短是为了后面涡旋更容易；

8、按顺序加入“转化混合液”：

240μl PEG3350(50％)

36μl 1M LiAc

10μl ssDNA(10mg/ml)

50μl水和质粒(质粒1ug-5ug)

9、涡旋震荡每个反应管直到细胞完全混匀；

10、置30℃保温30min；

11、置42℃热激20min-25min；

12、以6000-8000rpm离心15s，吸尽上清；

13、用200μl无菌水轻轻重悬沉淀；

14、涂选择平板，置恒温箱。

通过前述方法带有基因UGP1，PGM，RrU8GT33的严谨型质粒pRS413，以及携带有主代谢流调控相关的基因ARO10，ARO2、RKI1、TKL1，ARO1的整合型质粒pRS406，得到红景天苷高产菌株HY007。

实施例2采用本发明工程菌发酵制备红景天苷

取实施例1制备的红景天苷高产菌株HY007，按照如下方法制备红景天苷：

1、发酵方法：

(1)将1ml过夜培养的上述菌液(每1ml菌液中约有1×10⁹个活细胞)接种至50mlSC液体培养基中，接种后OD600＝0.2，30℃，200rpm摇床培养24小时，得到酿酒酵母种子液；

(2)将步骤1中培养得到的50ml酿酒酵母种子液接种到含2.5L SC培养基的5L发酵罐中，接种后初始OD600＝0.2，发酵温度30℃，搅动速度200-300rpm，控制pH＝5.5(通过自动添加5M的氨水调节)，空气流速4L/min，500g/L葡萄糖溶液连续添加，以保持发酵培养基中的葡萄糖浓度介于10-20g/L，发酵培养144小时。

2、纯化方法

将发酵得到的发酵液用HP20大孔吸附树脂吸附目标产物，上样体积：柱体积＝3：1，吸附完成后用三倍柱体积的水洗涤树脂，最后用20倍柱体积的40％乙醇，40倍柱体积的70％乙醇依次洗脱，得红景天苷的纯品。

3、检测结果

经测定，高产红景天苷酿酒酵母菌株HY007在5L发酵罐中发酵，红景天苷产量为1g/L-1.1g/L。

综上，采用本发明工程菌生产红景天苷，红景天苷产量为1g/L-1.1g/L，经济价值高，并且，发酵工艺简单，原料比较常规而且便宜，成本低廉，工业应用前景良好。

实施例3

(1)在HY004菌株上，将突变后的ARO4、ARO7、ARO3表达片段扩增、串联(ARO4p-ARO4-ARO4t-ARO7p-ARO7-ARO7t-ARO3p-ARO3-ARO3t)，并将串联片段重组到酵母基因组的308a位置，由此得到菌株HY008。

(2)在酿酒酵母菌株HY008上，敲除pHA2，pdc1减少色氨酸和苯丙氨酸竞争途径，获得菌株HY009(CEN.PK-1C-mutARO4-mutARO7-mutARO3-ΔpHA2-Δpdc1)。突变方法为CRISPR-Cas9介导的基因组敲除。

PHA2

Spacer：GGGGGATAGAGGCTGCTGGG(如SEQ ID No.16所示)

同源臂

HR-Left:AGGTACGTATTCCCATCAAGCTGCATTACAACAATTTCAATCAACATCTGATGTTGAGTA(如SEQ ID No.17所示)

HR-Right:AATGTTTTAACCAATTGGAGAACGACACTAGTATAGATTATTCAGTGGTACCGTTGG(如SEQ ID No.18所示)

敲除pdc1

spacer：AGTCACCGTTACCCAAGGTG(如SEQ ID No.28所示)

同源臂

HR-Left:TGTTTTGCACGTTGTTGGTGTCCCATCCATCTCTTCTCAAGCTAAGCAATTGTTGTTGCA(如SEQ ID No.29所示)

HR-Right:TCACTGTTTTCCACAGAATGTCTGCCAACATTTCTGAAACCACTGCTA

TGATCACTGACATTG(如SEQ ID No.30所示)

(3)本发明的酿酒酵母菌株中还通过单交换的方法，***了与主代谢流调控相关的基因ARO10，ARO2、RKI1、TKL1，以及基因RrU8GT33。

基因组整合通常是确保群体中途径稳定性和同源表达的最佳方法。

本发明利用整合型质粒pRS406将与主代谢流调控相关的基因ARO10，ARO2、RKI1、TKL1按顺序串联表达，构成模块1。

选用组成型质粒pRS405将RrU8GT33表达，构成模块2将基因整合进基因组，实现基因的高表达目的。

***位点为：ura 3-52。

模块1，模块2的构建方法为酵母连接法。

连接步骤如下：

将各片段DNA(模块1和线性化的pRS406质粒或模块2的DNA和线性化的pRS405质粒)按照等摩尔比混合，确定最后总体积(浓缩至10μl)，浓缩方式可为QI Aquick浓缩。

1)在YPAD平板上划板，制备新鲜的HZ848单克隆；

2)挑单克隆至2-3ml YPAD中，30℃摇床过夜培养(约16h)；

3)取1ml种子菌液(每1ml菌液中约有1×10⁹个活细胞)在50ml YPAD中，30℃培养至OD600＝0.6-0.8(一般养4h)酵母传代2h/代；

4)将酵母于4℃，4000rpm，离心2-3min，弃上清；

5)加50ml预冷ddH₂O，清洗细胞，离心，弃上清(先取1ml无菌水，吹匀菌体后，再加剩下的水)；

6)加1ml预冷ddH₂O，重悬，移至1.5ml EP管，7000rpm，4℃，离心30s，弃上清；

7)加1ml预冷1M sorbitol,清洗细胞，离心，弃上清；

8)加400-600μl预冷1M sorbitol，重悬，分装成100μl/管；

电转

1)取10μlDNA(模块1和模块2浓缩的DNA)加入100μl感受态，混匀后转移至预冷电转杯(1.5kv，5.0-5.2ms点击)，电击后快速加入1ml YPAD；

2)30℃，250rpm，复苏1h。5000rpm，离心1min，弃上清；

3)加1ml 1M sorbitol清洗细胞，洗三次，最后重悬至1ml 1M sorbitol；

4)分100μl，900μl分别涂布于筛选平板，30℃培养。

转化：酵母化转法将构建好的质粒导入目的菌株中。

1、接种目的菌株(约有1×10⁷个活细胞)于5mlYPAD，30℃振养过夜；

2、取2ml菌液于50ml YPAD，置30℃振养4-5h，OD600＝0.8-1.0(细胞至少完成两次***，在三或四次***期间，转化效率恒定)；

3、离心，2500rpm，5min(也可以4000rpm，2-3min)，弃上清；

4、将SSDNA样品煮沸10min，快速***冰中；

5、水洗：用50ml无菌水重悬，同上离心；

6、100mM LiAc洗:用50μl的100mM LiAc重悬,12000rpm,3s(或4000rpm，1min)吸尽上清；

7、悬浮细胞到最终体积500μl，约加100mM LiAc 400μl，分成50μl/管，离心,弃上清(4000rpm，30s)时间缩短是为了后面涡旋更容易；

8、按顺序加入“转化混合液”：

240μl PEG3350(50％)

36μl 1M LiAc

10μl ssDNA(10mg/ml)

50μl水和质粒(质粒1μg-5μg)；

9、涡旋震荡每个反应管直到细胞完全混匀；

10、置30℃保温30min；

11、置42℃热激20min-25min；

12、以6000-8000rpm离心15s，吸尽上清；

13、用200μl无菌水轻轻重悬沉淀；

14、涂选择平板，置恒温箱；

通过上述方法在菌株HY009的基础上***模块1得到酪醇高产菌株HY010。

进一步通过上述方法在菌株HY010的基础上***模块2得到红景天苷高产菌株HY011。

实施例4采用本发明工程菌发酵制备酪醇

取实施例3制备的红景天苷高产菌株HY010，按照如下方法制备酪醇：

1、发酵方法：

(1)将1ml过夜培养的上述菌液(每1ml菌液中约有1×10⁹个活细胞)接种至50mlYPD液体培养基中，接种后OD600＝0.2，30℃，200rpm摇床培养16～24小时，得到酿酒酵母种子液；

(2)将步骤1中培养得到的50ml酿酒酵母种子液接种到含2.5L YPD培养基的5L发酵罐中，接种后初始OD600＝0.5-0.6，发酵温度30℃，搅动速度400～600rpm，并关联溶氧>40％，控制pH＝5.3～5.8(通过自动添加6M的氢氧化钠调节)，空气流速2.5vvm～3.5vvm，600g/L葡萄糖溶液连续添加，发酵培养168小时。

2、检测结果：

经测定，高产酪醇酿酒酵母菌株HY010在5L发酵罐中发酵，酪醇最高产量为10g/L。

实施例5采用本发明工程菌发酵制备红景天苷

取实施例3制备的红景天苷高产菌株HY011，按照如下方法制备红景天苷：

1、发酵方法：

(1)将1ml过夜培养的上述菌液(每1ml菌液中约有1×10⁹个活细胞)接种至50mlYPD液体培养基中，接种后OD600＝0.2，30℃，200rpm摇床培养24小时，得到酿酒酵母种子液；

(2)将步骤1中培养得到的50ml酿酒酵母种子液接种到含2.5L YPD培养基的5L发酵罐中，接种后初始OD600＝0.5-0.6，发酵温度30℃，搅动速度400～600rpm，并关联溶氧>40％，控制pH＝5.3～5.8(通过自动添加6M的氢氧化钠调节)，空气流速2.5vvm～3.5vvm，600g/L葡萄糖溶液连续添加，发酵培养168小时。

2、纯化方法

将发酵得到的发酵液经菌液分离后，上清液用HP20大孔吸附树脂吸附目标产物，上样体积：柱体积＝3：1，吸附完成后用三倍柱体积的水洗涤树脂，最后用20倍柱体积的40％乙醇，40倍柱体积的70％乙醇依次洗脱，得到红景天苷的样品。

3、检测结果

经测定，高产红景天苷酿酒酵母菌株HY011在5L发酵罐中发酵，红景天苷最高产量为26.56g/L。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 成都薇合生物科技有限公司

<120> 一种高产红景天苷和/或酪醇的工程菌及其应用

<130> MP1921962

<150> 201811116170.0

<151> 2018-09-25

<160> 30

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1113

<212> DNA

<213> ARO4K229L

<400> 1

atgagtgaat ctccaatgtt cgctgccaac ggcatgccaa aggtaaatca aggtgctgaa 60

gaagatgtca gaattttagg ttacgaccca ttagcttctc cagctctcct tcaagtgcaa 120

atcccagcca caccaacttc tttggaaact gccaagagag gtagaagaga agctatagat 180

attattaccg gtaaagacga cagagttctt gtcattgtcg gtccttgttc catccatgat 240

ctagaagccg ctcaagaata cgctttgaga ttaaagaaat tgtcagatga attaaaaggt 300

gatttatcca tcattatgag agcatacttg gagaagccaa gaacaaccgt cggctggaaa 360

ggtctaatta atgaccctga tgttaacaac actttcaaca tcaacaaggg tttgcaatcc 420

gctagacaat tgtttgtcaa cttgacaaat atcggtttgc caattggttc tgaaatgctt 480

gataccattt ctcctcaata cttggctgat ttggtctcct tcggtgccat tggtgccaga 540

accaccgaat ctcaactgca cagagaattg gcctccggtt tgtctttccc agttggtttc 600

aagaacggta ccgatggtac cttaaatgtt gctgtggatg cttgtcaagc cgctgctcat 660

tctcaccatt tcatgggtgt tactttgcat ggtgttgctg ctatcaccac tactaagggt 720

aacgaacact gcttcgttat tctaagaggt ggtaaaaagg gtaccaacta cgacgctaag 780

tccgttgcag aagctaaggc tcaattgcct gccggttcca acggtctaat gattgactac 840

tctcacggta actccaataa ggatttcaga aaccaaccaa aggtcaatga cgttgtttgt 900

gagcaaatcg ctaacggtga aaacgccatt accggtgtca tgattgaatc aaacatcaac 960

gaaggtaacc aaggcatccc agccgaaggt aaagccggct tgaaatatgg tgtttccatc 1020

actgatgctt gtataggttg ggaaactact gaagacgtct tgaggaaatt ggctgctgct 1080

gtcagacaaa gaagagaagt taacaagaaa tag 1113

<210> 2

<211> 771

<212> DNA

<213> ARO7G141S

<400> 2

atggatttca caaaaccaga aactgtttta aatctacaaa atattagaga tgaattagtt 60

agaatggagg attcgatcat cttcaaattt attgagaggt cgcatttcgc cacatgtcct 120

tcagtttatg aggcaaacca tccaggttta gaaattccga attttaaagg atctttcttg 180

gattgggctc tttcaaatct tgaaattgcg cattctcgca tcagaagatt cgaatcacct 240

gatgaaactc ccttctttcc tgacaagatt cagaaatcat tcttaccgag cattaactac 300

ccacaaattt tggcgcctta tgccccagaa gttaattaca atgataaaat aaaaaaagtt 360

tatattgaaa agattatacc attaatttcg aaaagagatg gtgatgataa gaataacttc 420

agttctgttg ccactagaga tatagaatgt ttgcaaagct tgagtaggag aatccacttt 480

ggcaagtttg ttgctgaagc caagttccaa tcggatatcc cgctatacac aaagctgatc 540

aaaagtaaag atgtcgaggg gataatgaag aatatcacca attctgccgt tgaagaaaag 600

attctagaaa gattaactaa gaaggctgaa gtctatggtg tggaccctac caacgagtca 660

ggtgaaagaa ggattactcc agaatatttg gtaaaaattt ataaggaaat tgttatacct 720

atcactaagg aagttgaggt ggaatacttg ctaagaaggt tggaagagta a 771

<210> 3

<211> 1113

<212> DNA

<213> ARO3K222L

<400> 3

atgttcatta aaaacgatca cgccggtgac aggaaacgct tggaagactg gagaatcaaa 60

ggttatgatc cattaacccc tccagatctg cttcaacatg aatttccaat ttcagccaaa 120

ggtgaggaaa acattatcaa ggcaagagac tccgtctgtg atattttgaa tggtaaagat 180

gatcgtttag ttatcgtgat cgggccatgt tccctacatg accccaaagc cgcttacgat 240

tacgctgaca gattggctaa aatttcagaa aagttgtcaa aagacttatt gattattatg 300

agagcgtatt tagaaaaacc aaggactact gttggctgga aagggttgat taacgaccct 360

gatatgaata actcttttca aatcaataaa ggtctacgga tttcgagaga aatgttcata 420

aaactggttg aaaaattacc cattgctggt gagatgttgg ataccatttc tccgcagttt 480

ttgagtgatt gtttctcctt gggtgccatc ggcgccagaa ctactgaatc ccaactgcac 540

agagaattag catccggtct atctttccct attggattta agaacggtac tgatggtggt 600

ttgcaagtcg ccatcgacgc tatgagagcc gctgcacatg aacattactt cctttctgtc 660

acactaccag gtgtcactgc tatcgtgggc actgaaggta acaaggatac cttcctgatc 720

ttgagaggtg gtaagaacgg tactaacttt gacaaagaaa gtgttcaaaa tactaagaaa 780

cagttagaaa aggccggttt gactgatgat tcccagaaaa gaattatgat cgattgttcc 840

cacggcaaca gtaataaaga tttcaagaac caaccaaagg ttgccaaatg tatttatgac 900

cagctgacgg agggtgagaa tagtctctgt ggtgttatga ttgagtccaa cataaatgaa 960

ggtagacaag atattcccaa agaaggtggc agagagggat tgaagtatgg ttgttctgtt 1020

acggatgctt gtattggctg ggagtccacc gaacaggtat tggagctatt ggcagaaggt 1080

gttagaaaca gaagaaaggc cttgaaaaaa tag 1113

<210> 4

<211> 3163

<212> DNA

<213> ∆RIC1

<400> 4

atgttcatca aacagtctga aaaaaataca cctaaatgcc tctacaaaaa aaaaggtaag 60

gtaagagtgt tattgaccgg aagctgtaag aaactgaaca cgtggaaaat gcacttatgg 120

ccagtcacaa ttgcttagaa ttccaccccg caacgccgaa ttaggtgagg gtactaaaat 180

agatgattgc aatattcttc aatcaatgac actaccccag gccaatgttc ttatcatgct 240

aaccccaaca agagtgctca tttacaactt caaaccaatg gcactagtag ctagccatga 300

acgaacaatg gcttctctta aggaatttgg cgataacaga tcaatgaaac gatcagctcc 360

atataatgat atcatcgaag ggcttatttc aaaaaaggac tcgcaatact tattgtggca 420

ccagggaaag ctgatatttt acgtaatgac tgataaaaac ttccttttaa cataccaaat 480

tttaaaaaac tgcacaaatg aaataatttt caaagaatac ggcatacccg tcatagagcc 540

tcttttaatg agtgaagaag aagcgaacag tgctgaatat gactataaca acgatgatga 600

tactctcacg gtatttgata aaaatagttc ttcaagaatt atacagaatg gatttggcat 660

aactaaggaa aaagggtttt tacactttct ttctaatcaa gaaaacattg atgaactccc 720

cgtgaaaaaa ctagaacttc gtttaaaagt agttcttaaa tttgactatg aaatcataga 780

catgattggc atcaagacat tttccaaagt cggggatggg cgttatgaag aagttttgat 840

agttttattc cctcatggat tacaaatact tacaatatcg gattttaaag ttagcaagag 900

ctcgttggtt gaagtgaaga agggatccaa gacaattgtg tgtaataaac aattaatggt 960

tttatctcat gattccgtcg aaaagcagac tattgtaagc attatagaca ttgaaaagca 1020

agctgttgaa gcaataccgt taacggacac accagatgaa cttttgactt gcctagaagt 1080

taatggatac ctggtggtcg tttacaaaga aaaaataatc tgctttgata caagaattaa 1140

aaaagtaagc cattcttgga aaccaccatt tgtgataaaa ctttgcgata aaattaatga 1200

taaaatatta cttttggttt ctgaggatag tgttaacatt catttttaca cagaatttgg 1260

gaatctgcta ttcgctacat attttgacga agatgattat aatggtgata acaataatga 1320

caacagcaag gataaaaatg agaaaaaggc ggctgaatat aaaatttctg attttgtatg 1380

cttggataaa tcactaataa cagtgtctca ttccggaaaa tatcaagttt ggaaattatg 1440

ggaagaaata aaacaaacac aatttgattt cagaaaccca aaatgttacg tattaaccaa 1500

tacgaacaat gatgtaatca tatattcacc tgtgacaagt tcttcaatca ataatgataa 1560

tttacaagtc ataaaacttc ctacaaagac tttcaataat catattgctt ttgtaaaaat 1620

taattcttcc ttgaggttat ttgctactta tgtgtcgaac aaaaacatac tgcttatcca 1680

caatctagag accaatatgt ggtctagttt tgctgaccaa aacgtgttgg atttacattg 1740

gctaggtgat aattatttgg tttgtcatat gaagaatgat gatggctcaa caaatctgaa 1800

atgtctgcag attccactgc aagaagcgaa tccggacgtg gaactatcag attatgtcat 1860

gtgggaatac aatgttccag agaatacgat tgttttcagt ttacatgtta atactttatc 1920

ccggtataag ttgttgaaaa tgaaatccaa gaatcacaat gcttctgaaa aacaacctga 1980

tgcattgctt aaaactgccg agattatttt agttactgat acacagacaa ttgtcttcga 2040

tgtaatttct actgtacatc catgtggatt aaacatcatc aaaaaattct accagtatct 2100

caaaattaac attccaattg atgttttacc caacaaaatt gagtggataa ttaacatgaa 2160

ggagggcttg ttattttttg ccgataggaa atttataaag cttggcaaag tggatggagg 2220

gggctggcaa accttaactt tgttggataa catagaaaaa ataatcgatg ttatcaggga 2280

cgaaatattt gtagttcaag gccataatta cgtcgtatac tctttggaag atttatggga 2340

tgataaaaag ccactagttt ccattccaat cgaagaagat ttgtatccaa tatcaaccac 2400

cccagaaaca gctacaacac atacacttca ctgcattttt aacgcgcgat tttccaaatt 2460

ggtggtgaaa caccaaatat acctcgacca attaatctta gccaaattag aagacaacac 2520

agatttggag gatatttcac acaattatcg ttttttaaag ccttacaaat ttgcactcga 2580

aaagattttg tctactaaaa tactgcgaag cgactctttg gatgatatcc tgaaattaat 2640

taagatgtat gacaacaccg atcctgagca taatatttca ccaccaaccc acagtggtat 2700

gttagaaatt attagtaatt gtttaaggaa gatcgaaact aaatactgga accatctatt 2760

cactaatcta aagatgacac caagagattt attagcactc tgtatcgaag aaaatgaggc 2820

taaaatgctt ggcgtacttc tgttagtgtt tttaaattac gatgagaaag atttgggaga 2880

tgatctacat tttaagaaat cagatttagg gactgaggaa agcaaagctc taaatgataa 2940

ctctacaaaa aagtcagaga aatctgtcac taatttattg aaggatgaag aattaatgct 3000

taaagtctta gagcttttgg tgacaagtgc tgcaaacgcc acagacccaa ttaaagctac 3060

cgattcgtgg gacatgtgtt tccaattaat acgcttactc aaggaattag acagagaaaa 3120

caacacacaa ttggttcaaa aagcactcga gagattcaaa taa 3163

<210> 5

<211> 1524

<212> DNA

<213> ∆TRP2

<400> 5

atgaccgctt ccatcaaaat tcaaccggat attgactctc taaagcaatt acagcagcaa 60

aatgacgata gttccataaa tatgtatccc gtgtatgcgt atttgccatc attggatctg 120

actcctcacg tggcatatct aaaattggca caattgaaca accctgatag aaaggaatca 180

tttctgttgg aaagtgctaa gacaaataat gaattagatc gttattcatt cataggtatc 240

tcgccacgca agaccatcaa aaccggtcct actgaaggca ttgaaacaga tcctttggaa 300

attttggaaa aggagatgtc cacctttaaa gtagccgaaa atgttcctgg tttaccgaag 360

ttaagtggtg gtgctattgg ttatatttct tatgactgtg ttcgttattt cgagccaaaa 420

acaagaaggc ctttgaaaga tgtcctaaga cttccagagg catatttaat gctttgtgat 480

accattattg cctttgataa tgtttttcag agatttcaaa tcattcataa cattaatacc 540

aatgaaactt cgttggagga aggttacaaa gctgcagcac aaataatcac tgatatcgta 600

tcaaagctaa ccgacgattc ctcgccaata ccatatccag aacaacctcc tattaaattg 660

aatcaaactt ttgaatcgaa tgtaggcaag gaaggttacg aaaatcacgt ctccactttg 720

aagaagcata ttaagaaagg tgatattatt caaggtgtgc catcgcaaag agtggcaagg 780

ccaacttcgt tacatccttt caatatttac agacatttac gtactgtgaa cccatctcct 840

tacctgtttt atattgattg tttggatttc caaatcattg gtgcatctcc agaattgttg 900

tgcaaatcgg attccaaaaa tagagtcatt acccatccaa ttgctggtac tgtcaaacgt 960

ggggctacta ctgaagagga tgatgcttta gcggaccaat tacgtggctc gttaaaagac 1020

cgtgcagaac atgttatgct ggtagattta gcaagaaacg atattaacag aatttgtgac 1080

ccattaacaa caagtgtcga taaactgtta actattcaaa aattttctca tgtccaacat 1140

ctggtttctc aagtcagcgg tgttttccgc ccagaaaaga caagatttga tgcattcaga 1200

tcgattttcc ctgcaggtac tgtcagtggt gctccaaagg ttagagccat ggaattgatt 1260

gccgaactag aaggagaaag gcgtggggtt tatgcgggcg ccgtaggtca ttggtcatac 1320

gacggtaaaa caatggacaa ttgtatcgct ttaaggacta tggtctataa agatggtatt 1380

gcttacttgc aagctggcgg tggtattgtt tacgattcag atgagtacga tgaatatgtc 1440

gaaaccatga ataaaatgat ggccaatcac agtactattg tgcaagcaga agaattgtgg 1500

gccgatatcg taggatcggc ttaa 1524

<210> 6

<211> 1005

<212> DNA

<213> ∆PHA2

<400> 6

atggccagca agactttgag ggttcttttt ctgggtccca aaggtacgta ttcccatcaa 60

gctgcattac aacaatttca atcaacatct gatgttgagt acctcccagc agcctctatc 120

ccccaatgtt ttaaccaatt ggagaacgac actagtatag attattcagt ggtaccgttg 180

gaaaattcca ccaatggaca agtagttttt tcctatgatc tcttgcgtga taggatgatc 240

aaaaaagccc tatccttacc tgctccagca gatactaata gaattacacc agatatagaa 300

gttatagcgg agcaatatgt acccattacc cattgtctaa tcagcccaat ccaactacca 360

aatggtattg catcccttgg aaattttgaa gaagtcataa tacactcaca tccgcaagta 420

tggggccagg ttgaatgtta cttaaggtcc atggcagaaa aatttccgca ggtcaccttt 480

ataagattgg attgttcttc cacatctgaa tcagtgaacc aatgcattcg gtcatcaacg 540

gccgattgcg acaacattct gcatttagcc attgctagtg aaacagctgc ccaattgcat 600

aaggcgtaca tcattgaaca ttcgataaat gataagctag gaaatacaac aagattttta 660

gtattgaaga gaagggagaa cgcaggcgac aatgaagtag aagacactgg attactacgg 720

gttaacctac tcacctttac tactcgtcaa gatgaccctg gttctttggt agatgttttg 780

aacatactaa aaatccattc actcaacatg tgttctataa actctagacc attccatttg 840

gacgaacatg atagaaactg gcgatattta tttttcattg aatattacac cgagaagaat 900

accccaaaga ataaagaaaa attctatgaa gatatcagcg acaaaagtaa acagtggtgc 960

ctgtggggta cattccccag aaatgagaga tattatcaca aataa 1005

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> Spacer of ARO4K229L

<400> 7

ttcatgggtg ttactaagca 20

<210> 8

<211> 63

<212> DNA

<213> HR-Left of ARO4K229L

<400> 8

aatgttgctg tggatgcttg tcaagccgct gctcattctc accatttcat gggtgttact 60

ttg 63

<210> 9

<211> 57

<212> DNA

<213> HR-Right of ARO4K229L

<400> 9

catggtgttg ctgctatcac cactactaag ggtaacgaac actgcttcgt tattcta 57

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> Spacer of ARO3K229L

<400> 10

ttcctttctg tcacaaagcc 20

<210> 11

<211> 55

<212> DNA

<213> HR-Left of ARO3K229L

<400> 11

catcgacgct atgagagccg ctgcacatga tcattacttc ctttctgtca cacta 55

<210> 12

<211> 59

<212> DNA

<213> HR-Right of ARO3K229L

<400> 12

ccaggtgtca ctgctatcgt gggcactgaa ggtaacaagg ataccttcct gatcttgag 59

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> ARO4K229L(Spacer of ∆RIC1)

<400> 13

ggaattctaa gcaattgggg 20

<210> 14

<211> 50

<212> DNA

<213> HR-Left of ∆RIC1

<400> 14

cggaagctgt aagaaactga acacgtggaa aatgcactta tggccagtca 50

<210> 15

<211> 50

<212> DNA

<213> HR-Right of ∆RIC1

<400> 15

caattgctta gaattccacc ccgcaacgcc gaattaggtg agggtactaa 50

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> Spacer of ∆PHA2

<400> 16

gggggataga ggctgctggg 20

<210> 17

<211> 60

<212> DNA

<213> HR-Left of ∆PHA2

<400> 17

aggtacgtat tcccatcaag ctgcattaca acaatttcaa tcaacatctg atgttgagta 60

<210> 18

<211> 57

<212> DNA

<213> HR-Right of ∆PHA2

<400> 18

aatgttttaa ccaattggag aacgacacta gtatagatta ttcagtggta ccgttgg 57

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> Spacer of ∆TRP2

<400> 19

attggatctg actcctcacg 20

<210> 20

<211> 60

<212> DNA

<213> HR-Left of ∆TRP2

<400> 20

acagcagcaa aatgacgata gttccataaa tatgtatccc gtgtatgcgt atttgccatc 60

<210> 21

<211> 60

<212> DNA

<213> HR-Right of ∆TRP2

<400> 21

catatctaaa attggcacaa ttgaacaacc ctgatagaaa ggaatcattt ctgttggaaa 60

<210> 22

<211> 248

<212> DNA

<213> delta1

<400> 22

ctcgagggat ataggaatcc tcaaaatgga atctatattt ctacatacta atattacgat 60

tattcattcc gttttatatg tttatatttc attgatccta ttacattatc aatccttgcg 120

tttcagcttc cactaattta gatgactatt tctcatcatt tgcgtcatct tctaagccag 180

ccgtatatga taatatacta gtaatgtaaa tactagttag tagatgatag ttgatttcta 240

ttccaaca 248

<210> 23

<211> 165

<212> DNA

<213> delta2

<400> 23

tggaagctga aacgtctaac ggatcttgat ttgtgtggac ttccttagaa gtaaccgaag 60

cacaggcgct accatgagaa atgggtgaat gttgagataa ttgttgggat tccattgttg 120

ataaaggcta taatattagg tatacagaat atactagaag ttctc 165

<210> 24

<211> 1669

<212> DNA

<213> ΔPDC1

<400> 24

atgtctgaaa ttactttggg taaatatttg ttcgaaagat taaagcaagt caacgttaac 60

accgttttcg gtttgccagg tgacttcaac ttgtccttgt tggacaagat ctacgaagtt 120

gaaggtatga gatgggctgg taacgccaac gaattgaacg ctgcttacgc cgctgatggt 180

tacgctcgta tcaagggtat gtcttgtatc atcaccacct tcggtgtcgg tgaattgtct 240

gctttgaacg gtattgccgg ttcttacgct gaacacgtcg gtgttttgca cgttgttggt 300

gtcccatcca tctcttctca agctaagcaa ttgttgttgc atcactgttt tccacagaat 360

gtctgccaac atttctgaaa ccactgctat gatcactgac attgctaccg ccccagctga 420

aattgacaga tgtatcagaa ccacttacgt cacccaaaga ccagtctact taggtttgcc 480

agctaacttg gtcgacttga acgtcccagc taagttgttg caaactccaa ttgacatgtc 540

tttgaagcca aacgatgctg aatccgaaaa ggaagtcatt gacaccatct tggctttggt 600

caaggatgct aagaacccag ttatcttggc tgatgcttgt tgttccagac acgacgtcaa 660

ggctgaaact aagaagttga ttgacttgac tcaattccca gctttcgtca ccccaatggg 720

taagggttcc attgacgaac aacacccaag atacggtggt gtttacgtcg gtaccttgtc 780

caagccagaa gttaaggaag ccgttgaatc tgctgacttg attttgtctg tcggtgcttt 840

gttgtctgat ttcaacaccg gttctttctc ttactcttac aagaccaaga acattgtcga 900

attccactcc gaccacatga agatcagaaa cgccactttc ccaggtgtcc aaatgaaatt 960

cgttttgcaa aagttgttga ccaatattgc tgacgccgct aagggttaca agccagttgc 1020

tgtcccagct agaactccag ctaacgctgc tgtcccagct tctaccccat tgaagcaaga 1080

atggatgtgg aaccaattgg gtaacttctt gcaagaaggt gatgttgtca ttgctgaaac 1140

cggtacctcc gctttcggta tcaaccaaac cactttccca aacaacacct acggtatctc 1200

tcaagtctta tggggttcca ttggtttcac cactggtgct accttgggtg ctgctttcgc 1260

tgctgaagaa attgatccaa agaagagagt tatcttattc attggtgacg gttctttgca 1320

attgactgtt caagaaatct ccaccatgat cagatggggc ttgaagccat acttgttcgt 1380

cttgaacaac gatggttaca ccattgaaaa gttgattcac ggtccaaagg ctcaatacaa 1440

cgaaattcaa ggttgggacc acctatcctt gttgccaact ttcggtgcta aggactacga 1500

aacccacaga gtcgctacca ccggtgaatg ggacaagttg acccaagaca agtctttcaa 1560

cgacaactct aagatcagaa tgattgaggt tatgttgcca gtcttcgatg ctccacaaaa 1620

cttggttgaa caagctaagt tgactgctgc taccaacgct aagcaataa 1669

<210> 25

<211> 20

<212> DNA

<213> spacer of ARO7G141S

<400> 25

ggtgatgata agaataactt 20

<210> 26

<211> 52

<212> DNA

<213> HR-Left of ARO7G141S

<400> 26

gattatacca ttaatttcga aaagagatgg tgatgataag aataacttca gt 52

<210> 27

<211> 48

<212> DNA

<213> HR-Right of ARO7G141S

<400> 27

tctgttgcca ctagagatat agaatgtttg caaagcttga gtaggaga 48

<210> 28

<211> 20

<212> DNA

<213> spacer of ΔPDC1

<400> 28

agtcaccgtt acccaaggtg 20

<210> 29

<211> 60

<212> DNA

<213> HR-Left of ΔPDC1

<400> 29

tgttttgcac gttgttggtg tcccatccat ctcttctcaa gctaagcaat tgttgttgca 60

<210> 30

<211> 63

<212> DNA

<213> HR-Right of ΔPDC1

<400> 30

tcactgtttt ccacagaatg tctgccaaca tttctgaaac cactgctatg atcactgaca 60

ttg 63

Claims (10)

1.一种高产红景天苷的工程菌，其特征在于：它是将酿酒酵母菌中的ARO4基因编码第229位氨基酸的密码子突变为编码亮氨酸的密码子、ARO7基因第141位甘氨酸的密码子突变为编码丝氨酸的密码子、ARO3基因第222位赖氨酸的密码子突变为编码亮氨酸的密码子的重组酵母菌；ARO4/ARO7/ARO3基因来源的酿酒酵母菌株不限于S288C和/或CEN.PK菌株。

2.根据权利要求1所述的工程菌，其特征在于：所述ARO4基因第229位的密码子为TTG，所述ARO7基因第141位的密码子为AGT；第222位的密码子为CTA。

3.根据权利要求1所述的工程菌，其特征在于：所述重组酵母菌中，基因RIC1、基因pHA2和/或TRP2失活；优选地，基因RIC1、基因pHA2和/或TRP2分别突变为SEQ ID No.4～6所示的序列。

4.根据权利要求1或2所述的工程菌，其特征在于：所述重组酵母菌中包含携带UGP1，PGM和/或RrU8GT33的严谨性质粒PRS413质粒；优选地，所述重组酵母菌中还包含携带ARO10、ARO2、RKI1、TKL1和/或ARO1的整合型pRS425质粒。

5.根据权利要求1或2所述的工程菌，其特征在于：所述重组酵母菌还包括突变后的ARO4、ARO7、ARO3的表达片段扩增、串联后获得的串联片段ARO4p-ARO4-ARO4t-ARO7p-ARO7-ARO7t-ARO3p-ARO3-ARO3t；

所述突变后的ARO4、ARO7、ARO3分别为ARO4^K229L、ARO7^G141S和ARO3^K222L。

6.根据权利要求5所述的工程菌，其特征在于：所述串联片段重组到酵母基因组的308a位置。

7.根据权利要求5或6所述的工程菌，其特征在于：所述重组酵母菌的基因pHA2和/或pdc1失活。

8.根据权利要求5至7任一项所述的工程菌，其特征在于：所述重组酵母菌还包括基因RrU8GT33、ARO10、ARO2、RKI1和TKL1。

9.根据权利要求1～8任意一项所述的工程菌在生产红景天苷和/或酪醇中的应用。

10.一种制备红景天苷和/或酪醇的方法，其特征在于：它是采用权利要求1～8任意一项所述的工程菌发酵制备；

包括如下步骤：

(1)取权利要求1～8任意一项所述的工程菌，培养，得到酿酒酵母种子液；

(2)将酿酒酵母种子液接种到发酵培养基中，发酵，得发酵液；

(3)分离纯化；

步骤(1)的工艺为：取工程菌，接种到SC液体培养基或YPAD培养基中，28～32℃、100～300rpm摇床培养12～36h，优选30℃、200～220rpm摇床培养12～24h；

步骤(2)中，发酵的条件为：将酿酒酵母种子液接种到发酵培养基中后，OD600为0.4～0.9；发酵的温度为28～32℃，优选为30℃，搅动速度300～600rpm；控制控制pH为5.3～5.8，；空气流速为2.5vvm～3.5vvm；发酵时间为120～170h；

和/或，步骤(2)中，所述发酵培养基为SC培养基或YPAD培养基，在发酵的过程中连续添加葡萄糖溶液，保持发酵培养基中葡萄糖浓度为0.5～5g/L和/或，步骤(3)中，所述分离纯化方法为柱层析方法；

所述柱层析方法为：将发酵液用HP20大孔吸附树脂吸附，后用清水洗涤树脂，再依次用40％乙醇、70％乙醇洗脱，得红景天苷的纯品；优选地，上样体积：柱体积为3：1；吸附完成后用3倍柱体积的水洗涤树脂，后用20倍柱体积的40％乙醇，再40倍柱体积的70％乙醇洗脱。