CN110499255B - 亳菊内生镰刀菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种亳菊内生镰刀菌及其应用。该亳菊内生镰刀菌为亳菊内生镰刀菌(Fusarium sp)BJF6，保藏编号为GDMCC No.60047。本发明的亳菊内生镰刀菌(Fusarium sp)BJF6与现有镰刀菌相比，具有如下特点：(1)对多种病原菌发挥抑菌效果；(2)具有解钾功能；(3)具有固氮功能；(4)能够降解纤维素。

Description

亳菊内生镰刀菌及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一种亳菊内生镰刀菌及其应用。
背景技术
内生菌(endophyte)是指生活在健康的植物组织或细胞内且不会引起宿主植物明显感染症状的一类微生物群。被感染的宿主植物不表现出外在病症，可通过组织学方法从严格表面消毒的植物组织中分离或从植物组织内直接扩增出微生物DNA的方法来证明其内生。内生菌按种类可分为内生真菌、内生细菌、内生放线菌。
亳菊(Chrysanthemum morifolium cv.Boju)主产于安徽亳州，作为安徽道地药材,是药菊中的佳品。亳菊具有抗肿瘤、抗菌抗病毒、抗心血管疾病、抗氧化、抗衰老、抗凝血、驱铅、镇痛等作用。
目前国内外对亳菊研究主要集中在化学成分分析、加工工艺研究、脱毒苗技术、栽培技术等方面，而对亳菊内生菌的研究较少，特别是亳菊内生镰刀菌。
发明内容
基于此，本发明的主要目的是提供一种亳菊内生镰刀菌。该菌株对病原菌具有拮抗作用，并且还具有解钾、固氮、降解纤维素的功能。
本发明的主要目的是通过以下技术方案实现的：
一种亳菊内生镰刀菌(Fusarium sp)BJF6，保藏编号为GDMCC No.60047。
本发明亳菊内生镰刀菌(Fusarium sp)BJF6的分子分类地位确定。本发明的亳菊内生镰刀菌(Fusarium sp)BJF6的ITS序列如SEQID No.3所示。
本发明的亳菊内生镰刀菌(Fusarium sp)BJF6与现有镰刀菌相比，具有如下特点：(1)对多种病原菌发挥抑菌效果；(2)具有解钾功能；(3)具有固氮功能；(4)能够降解纤维素。
本发明的另一目的是提供上述的亳菊内生镰刀菌(Fusarium sp)BJF6作为拮抗菌在防治作物病害中的应用。
在其中一些实施例中，所述的作物病害是由玉米弯孢菌、瓜炭疽菌感染引发的病害。
在其中一些实施例中，所述的作物病害是由串珠镰刀菌、黄瓜枯萎菌感染引发的病害。
在其中一些实施例中，所述的作物病害是由茶叶轮斑菌、茶叶炭疽菌感染引发的病害。
在其中一些实施例中，所述的作物病害是由小麦赤霉菌、禾谷镰刀菌感染引发的病害。
本发明的再一目的是提供上述的亳菊内生镰刀菌(Fusarium sp)BJF6作为固氮菌在增强土壤氮含量中的应用。
本发明的还一目的是提供上述的亳菊内生镰刀菌(Fusarium sp)BJF6作为纤维降解菌在分解废弃纤维中的应用。
本发明的再一目的是提供上述的亳菊内生镰刀菌(Fusarium sp)BJF6作为解钾菌在降低土壤难容性钾含量中的应用。
本发明的又一目的是提供一种生物制剂，所述的生物制剂以上述的亳菊内生镰刀菌(Fusarium sp)BJF6和/或其代谢物为活性成分。
本发明提供的菌株已在广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)保藏，地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，邮政编码510075；本发明菌株的信息为：亳菊内生镰刀菌(Fusarium sp)BJF6；保藏号为GDMCC No.60047；保藏日期为2016年6月16日。
附图说明
图1、8种病原菌在PDA平板的形态特征。
图2、亳菊内生真菌株BJF6分别与8种病原菌的对峙培养图。
图3、亳菊内生真菌株BJF6分别对8种病原菌的抑菌率统计图。
图4、亳菊内生真菌株BJF6与8种病原菌对峙培养的显微观察，同一字母标注的两幅图中，左为对照组病原菌菌丝，右为对峙培养病原菌菌丝。
图5、亳菊内生真菌株BJF6的生物活性测试图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1供试病原菌
玉米弯孢菌(Curvularia lunata)、瓜炭疽菌(Colletotrichum lagenarium)、串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)、黄瓜枯萎菌(Fusarium oxysporum)、茶叶轮斑菌(Pestalotiopsis theae)、茶叶炭疽菌(Colletotrichum lagenarium)、小麦赤霉菌(Fusariumgraminearum)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)，保存于安徽阜阳师范学院微生物实验室。本发明的供试病原菌均为公知菌株，通过市购等途径就可获得。1.1.2供试内生真菌
亳菊内生真菌BJF6，保存于安徽阜阳师范学院微生物实验室，已寄送广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)完成保藏。
该菌株是通过以下步骤筛选获得的：
(1)亳菊内生真菌获取：将亳菊健康植株先用流水冲洗干净并晾干，将其剪成几部分放入超净工作台中，先用75％酒精浸泡3min，后用无菌水冲洗3次，再用0.1％升汞漂洗30sec，然后再用无菌水冲洗3～4次。分别用PDA和LB培养基进行培养，细菌培养温度是37℃，真菌培养温度是28℃。培养3～4d后，根据其断面处的菌落形态、颜色等挑取菌落，经划线法反复纯化菌株后，4℃保存备用。
(2)初筛：采用平板对峙法，将PDA平板培养3d的供试病原菌打成直径6mm菌饼接种于PDA培养基的培养皿中央，在距PDA平板中心3cm处同一直线的两点上分别接种2个亳菊内生真菌菌饼(6mm)，对照不接亳菊内生真菌菌饼，重复3皿，在28℃下培养5～7天后，每天观察并记录抑菌情况，选取对病原菌生长有明显抑制作用，并且被抑制菌丝边缘平齐的内生真菌菌株进入后续复筛。
(3)复筛：进入复筛的内生真菌菌株，同样按平板对峙法进行实验，在28℃下培养，直到对照组平板长满病原菌，测量处理组病原菌半径，并计算抑菌率，按如下方法计算抑菌率：抑菌率＝(对照病原菌菌落半径－对峙培养病原菌菌落半径)/对照病原菌菌落半径×100％。
根据复筛结果，亳菊内生真菌BJF6对多种病原菌具有抑制作用。
1.1.3培养基
真菌培养基采用PDA培养基、阿须贝氏培养基、解钾菌分离培养基、羧甲基纤维素钠培养基。
1.2方法
1.2.1菌种的活化
将保存于4℃冰箱中的供试内生真菌(亳菊内生真菌BJF6)与供试病原菌制成直径为6mm的菌饼，移入无菌PDA平板中央，28℃培养3-4天，备用。1.2.2ITS区段的PCR扩增及检测
按照常规分子生物学手段，提取亳菊内生真菌BJF6基因组DNA，采用ITS真菌通用引物ITS4、ITS5进行PCR扩增。25μL反应体系见表1。于95℃预变性5min后，反应程序见表2。
ITS4(SEQ ID No.1)：5’-tcctccgcttattgatatgc-3’
ITS5(SEQ ID No.2)：5’-ggaagtaaaagtcgtaacaagg-3’
取PCR产物在1％琼脂糖凝胶上，110mV电泳，EB染色20min后于凝胶成像仪拍照。
Figure BDA0002162281160000061
1.2.3内生真菌抑菌活性
(1)菌株抑菌活性。
采用对峙培养法，无菌条件下，取活化好的内生真菌和供试病原菌，用打孔器制成直径为6mm的菌饼，分别移至PDA平板上，二者相距1.5cm，以只接病原菌的作为对照(处理和对照均设3次重复)，置于28℃下恒温避光培养。4d后，观察记录病原菌菌落的生长状况及抑菌作用，测量菌丝扩展半径，计算抑菌率：
抑制率(％)＝(对照菌落半径-处理菌落对峙面半径)/(对照菌落半径)×100％
(2)对峙培养菌丝的显微观察。
用灭菌毛刷蘸取熔化的无菌PDA培养基刷在已灭菌的载玻片上，制成1mm厚的PDA膜，再分别接种直径为6mm的内生真菌和供试病原菌的菌饼于载玻片两端，二者相距2cm，28℃培养3-4天，用显微镜观察并拍照。
1.2.4内生真菌固氮活性
将纯化的BJF6菌株接种到阿须贝氏培养基平板上，28℃恒温培养数天，每天观察。能生长则视为有固氮活性。
1.2.5内生真菌解钾活性
将纯化的BJF6菌株接种到以钾长石为唯一钾源的解钾菌分离培养基上，置于28℃恒温培养箱中培养数天，且每天观察。能生长则视为有解钾活性。4d后记录结果。
1.2.6内生真菌解纤维素活性
将纯化的BJF6菌株接种于羧甲基纤维素钠培养基上，置于28℃恒温培养箱中培养数天。用1mg/ml刚果红染色15分钟，倾去染液，再加入1mol/L的氯化钠溶液漂洗，15分钟后倒掉氯化钠溶液，测透明圈的直径与菌落直径，通过透明圈直径与菌落直径比值的大小判断菌株纤维素降解能力的强弱。
2结果与分析
2.1鉴定结果
(1)形态学鉴定
本发明提供的亳菊内生真菌BJF6，边缘较整齐，呈粉红色菌落，中间微黄色。
(2)分子生物学鉴定
亳菊内生真菌BJF6的ITS序列SEQ ID No.3如下所示：
tggaagtaaaagtcgtaacaaggtctccgttggtgaaccagcggagggatcattaccgagtttacaactcccaaacccctgtgaacataccttaatgttgcctcggcggatcagcccgcgccccgtaaaacgggacggcccgccagaggacccaaactctaatgtttcttattgtaacttctgagtaaaacaaacaaataaatcaaaactttcaacaacggatctcttggttctggcatcgatgaagaacgcagcaaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaacgcacattgcgcccgctggtattccggcgggcatgcctgttcgagcgtcatttcaaccctcaagcccccgggtttggtgttggggatcggctctgcccttctgggcggtgccgcccccgaaatacattggcggtctcgctgcagcctccattgcgtagtagctaacacctcgcaactggaacgcggcgcggccatgccgtaaaaccccaacttctgaatgttgacctcggatcaggtaggaatacccgctgaacttaagcatatcaataagcggaggaa
经分析，此菌为镰刀菌属。
2.2菌株的抑菌活性
8种病原菌在PDA平板上形态特征和亳菊内生真菌BJF6对病原菌抑菌现象分别见图1和图2(平板左侧为亳菊内生真菌BJF6、右侧为病原菌)。通过亳菊内生真菌BJF6菌株与病原菌平板对峙实验，发现BJF6对玉米弯孢菌、瓜炭疽病菌、串珠镰刀病菌、黄瓜枯萎病菌、茶叶轮班病菌、茶叶炭疽病菌、小麦赤霉病菌、禾谷镰刀病菌8种病原菌都有明显的抑菌作用，且多数伴有抑菌带出现。图1中：A.玉米弯孢病菌；B.瓜炭疽病菌；C.串珠镰刀病菌；D.黄瓜枯萎病菌；E.茶叶轮班病菌；F.茶叶炭疽病菌；G.小麦赤霉病菌；H.禾谷镰刀病菌。图2中：A.玉米弯孢病菌；B.瓜炭疽病菌；C.串珠镰刀病菌；D.黄瓜枯萎病菌；E.茶叶轮班病菌；F.茶叶炭疽病菌；G.小麦赤霉病菌；H.禾谷镰刀病菌。
亳菊内生真菌BJF6对8种病原菌的抑菌率统计请参见图3。根据图3，亳菊内生真菌BJF6对8种病原菌的抑菌率均在58％以上，其中对茶叶轮班病菌抑菌率最高(72％)。
经对峙培养菌丝的显微观察(请参见图4)，未观察到亳菊内生真菌BJF6菌丝，亳菊内生真菌BJF6未与病原菌菌丝互作，结合图2，可推测BJF6可与病原菌竞争营养物质，使病原菌菌丝分支变多、变密，甚至使病原菌菌丝变畸形。图4中：A.玉米弯孢病菌；B.瓜炭疽病菌；C.串珠镰刀病菌；D.黄瓜枯萎病菌；E.茶叶轮班病菌；F.茶叶炭疽病菌；G.小麦赤霉病菌；H.禾谷镰刀病菌。
2.2菌株的生物活性
菌株BJF6可以在阿须贝氏培养基上生长(图5中A)。28℃培养4d后，菌落直径为30.75±2.99mm，说明菌株BJF6具有固氮作用。
菌株BJF6可在以钾长石为唯一钾源的解钾菌分离培养基生长(图5中B)。28℃培养4d后，菌落直径为26.50±2.12mm，说明菌株BJF6具有解钾作用。
菌落BJF6可在羧甲基纤维素钠培养基生长，且经刚果红染色和氯化钠溶液漂洗后，可明显观察到透明圈现象(图5中C)。28℃培养4d后，透明圈的直径与菌落直径之比为1.21±0.06，说明菌株BJF6具有降解纤维素的能力。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 阜阳师范大学
<120> 亳菊内生镰刀菌及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tcctccgctt attgatatgc 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggaagtaaaa gtcgtaacaa gg 22
<210> 3
<211> 589
<212> DNA
<213> 亳菊内生镰刀菌(Fusarium )
<400> 3
tggaagtaaa agtcgtaaca aggtctccgt tggtgaacca gcggagggat cattaccgag 60
tttacaactc ccaaacccct gtgaacatac cttaatgttg cctcggcgga tcagcccgcg 120
ccccgtaaaa cgggacggcc cgccagagga cccaaactct aatgtttctt attgtaactt 180
ctgagtaaaa caaacaaata aatcaaaact ttcaacaacg gatctcttgg ttctggcatc 240
gatgaagaac gcagcaaaat gcgataagta atgtgaattg cagaattcag tgaatcatcg 300
aatctttgaa cgcacattgc gcccgctggt attccggcgg gcatgcctgt tcgagcgtca 360
tttcaaccct caagcccccg ggtttggtgt tggggatcgg ctctgccctt ctgggcggtg 420
ccgcccccga aatacattgg cggtctcgct gcagcctcca ttgcgtagta gctaacacct 480
cgcaactgga acgcggcgcg gccatgccgt aaaaccccaa cttctgaatg ttgacctcgg 540
atcaggtagg aatacccgct gaacttaagc atatcaataa gcggaggaa 589

Claims (10)

1.一种亳菊内生镰刀菌(Fusarium sp)BJF6，其特征在于，保藏编号为GDMCCNo.60047。
2.权利要求1所述的亳菊内生镰刀菌(Fusarium sp)BJF6作为拮抗菌在防治作物病害中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的作物病害是由玉米弯孢菌、瓜炭疽菌感染引发的病害。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的作物病害是由串珠镰刀菌、黄瓜枯萎菌感染引发的病害。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的作物病害是由茶叶轮斑菌、茶叶炭疽菌感染引发的病害。
6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的作物病害是由小麦赤霉菌、禾谷镰刀菌感染引发的病害。
7.权利要求1所述的亳菊内生镰刀菌(Fusarium sp)BJF6作为固氮菌在增强土壤氮含量中的应用。
8.权利要求1所述的亳菊内生镰刀菌(Fusarium sp)BJF6作为纤维降解菌在分解废弃纤维中的应用。
9.权利要求1所述的亳菊内生镰刀菌(Fusarium sp)BJF6作为解钾菌在降低土壤难容性钾含量中的应用。
10.一种生物制剂，其特征在于，所述的生物制剂以权利要求1所述的亳菊内生镰刀菌(Fusarium sp)BJF6为活性成分。
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