CN110499254A

CN110499254A - 一种抗盐碱赭曲霉菌株w1及其菌剂和应用

Info

Publication number: CN110499254A
Application number: CN201910659129.6A
Authority: CN
Inventors: 魏毅; 唐紫琪; 张舒涵; 巩志远; 李柱刚; 张世宏
Original assignee: Jilin University
Current assignee: Jilin University
Priority date: 2019-07-22
Filing date: 2019-07-22
Publication date: 2019-11-26
Anticipated expiration: 2039-07-22
Also published as: CN110499254B

Abstract

本发明涉及一种抗盐碱赭曲霉菌株W1及其菌剂和应用，所述的菌株是保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的赭曲霉(Aspergillus ochraceus)，保藏名称为赭曲霉W1，保藏编号为CGMCC NO.17971。所述的抗盐碱赭曲霉菌株W1能够在高钠盐浓度、高PH的土壤中稳定的存活，有效的降解秸秆，适用于改造盐碱地。

Description

一种抗盐碱赭曲霉菌株W1及其菌剂和应用

技术领域

本发明属于微生物工程与技术领域，具体涉及一种抗盐碱赭曲霉菌株W1及其菌剂和应用。

背景技术

在我们这个农业大国中，每年秸秆的产量是7亿多吨。自1991年到如今，国家就农作物秸秆利用问题已出台一系列相关文件，目的是推动农作物秸秆的资源化利用，同时严禁农作物秸秆的焚烧。但秸秆资源化利用率低，人们对秸秆的综合利用主要集中在简单粗放的处理方式上，如传统的秸秆肥料化、饲料化、燃料化甚至直接丢弃焚烧等，而用作工业原料化、能源化等精细处理方式研究不足，进而导致了区域农作物秸秆过剩现象日益普遍，严重破坏了水源、土壤等生态环境，间接地造成了巨大的经济损失。

盐碱土壤最主要的特征是可溶性盐分和代换性钠的含量较多，当土壤含盐量超过0.1％或土壤pH值在8.0以上，钠碱化度(ESP)大于或等于5％时，就属于盐碱土的范围。土地盐碱化属于土地荒漠化的一种，是土地退化中的最大难题，可导致土壤肥力下降，表现为土壤的通气、透水性和保水、保肥性降低，造成作物根系吸水困难，减产甚至绝产。我国盐碱地面积巨大，盐碱土壤的理化性质较差、生态环境恶劣，土壤微生物的数量和种类明显少于正常的种植土壤，因此，盐碱地区的植被成活率和农业生产效率较低，严重影响农、林生产。

高抗盐碱真菌是从高盐、高碱或高盐碱共存环境中分离的微生物资源，具有重要的研究、应用与开发价值。目前，人们已将这些高抗盐碱真菌应用于环境治理中，如盐碱地的修复改造、淤泥污水的净化处理，以及农业废弃物的循环利用等，具有重大意义。利用微生物降解秸秆并还田是改良土壤，特别是修复盐碱土壤的一种重要措施。

目前的大部分微生物菌剂在正常土壤中可以发挥很好的作用，但在高浓度盐和高pH值的盐碱土壤中，这些菌株很难发挥应有的作用。

因此，亟需从盐碱土壤中筛选高抗盐碱真菌，使盐碱地秸秆能在短时间内被高效降解、实现肥料还田。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种抗盐碱赭曲霉菌株W1，能够在高钠盐浓度、高PH的土壤中稳定的存活，有效的降解秸秆，适用于改造盐碱地。

本发明提供的抗盐碱赭曲霉菌株于2019年6月14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏名称：W1，分类命名：赭曲霉(Aspergillus ochraceus)，保藏编号：CGMCC NO.17971。

本发明的抗盐碱赭曲霉菌由以下方式获得：

1、菌株分离：分离菌株的土壤秸秆样品来自吉林省白城市镇赉县。选取该地区荒芜多年且高度盐碱化的地块，采取土壤表层5cm左右的土壤秸秆，装入已灭菌处理的玻璃瓶中带回实验室4℃保存备用。采用平板稀释涂布法，将稀释后土壤上清液涂布于添加NaCl至250.0g/L的PDA培养基上，pH为10，培养4天，经过3轮筛选分离到一株真菌菌株，即为本发明的高抗盐碱类型的赭曲霉菌株，编号为CGMCC NO.17971。

2、菌株鉴定：将筛选得到的高抗盐碱菌株W1接种到含5％NaCL的PDA培养基上，30℃培养5d，观察菌落形态。用镊子夹取灭菌的盖玻片，斜插到5％NaCL的PDA培养基中部。在盖玻片正前方接种一个直径为7mm的菌片，菌丝面朝下，然后将平板放置在30℃恒温培养箱中，定期观察菌丝生长情况，待菌丝爬上盖玻片后，将与盖玻片相连的培养基切下，取出盖玻片，在显微镜下观察菌丝及孢子形态。30℃在含5％NaCL的PDA培养基上培养5d后，圆形菌落直径约为67-73.8mm，呈现白色，菌体表面疏松，产生大量黄色孢子，菌落结构为羊毛状，菌落边缘为纤毛状，在培养过程中，培养基颜色不发生变化，菌落表面无液体渗出，如图2所示；显微观察结果：菌丝直立，表面光滑，分生孢子球形单胞，着生在产孢梗顶端，呈现头状着生方式，如图3所示，经形态学鉴定为赭曲霉菌。

采用真菌核糖体rDNA区通用引物ITS1(TCCGTAGGT-GAACCTGCGG)和ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC)，对W1菌株进行ITS区段PCR扩增。PCR的扩增程序：94℃预变性2min，然后94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，进行30个循环；最后72℃延伸5min，扩增产物置于4℃保存。

将扩增的ITS序列数据提交GenBank，利用NCBI网站上的在线软件Blast进行同源性比对，菌株W1与曲霉属(Aspergillus ochraceus.)菌株KX090251.1的同源性达100％；使用生物信息学分析软件MEGA 7.0中的Maximum likelihood方法构建***发育树，进一步鉴定菌株为赭曲霉菌。

3、菌株保藏：将所述的赭曲霉菌株于2019年6月14日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏名称为赭曲霉W1，分类命名为赭曲霉(Aspergillus ochraceus)，保藏编号为CGMCC NO.17971。

本发明另一个目的是提供一种上述赭曲霉菌株发酵得到的高抗盐碱的赭曲霉菌剂。

本发明还有一个目的是所述的抗盐碱赭曲霉W1制备得到的微生物菌剂的使用方法，将菌株液体发酵制剂按照每亩用1～1.5L的用量施入盐碱地。

有益效果如下：

1、具有抗盐特性：菌株适宜生长在Na盐环境，最适生长钠盐浓度为5-13％(克/升)，高盐环境条件下菌株可以长期存活；

2、具有抗碱特性：菌株可在PH 3.0至11.0范围内生长，最适pH范围为4.0至9.0；

3、秸秆降解作用：每0.6g玉米秸秆可产生2.95mg还原糖；

4、使盐碱地适于种植：pH下降17.5％，钠离子的浓度降低72.9％，全盐量降低58.0％。

综上所述：本发明的高抗盐碱类型的赭曲霉菌株W1能够在高盐浓度、高PH的土壤中稳定的存活，可以有效的降解秸秆，适用于改造盐碱地。

附图说明

图1为根据赭曲霉菌株W1的DNA序列构建的***进化树；

图2为赭曲霉菌株W1的菌落形态特征；

图3为赭曲霉菌株W1的分生孢子梗及分生孢子；

图4为赭曲霉菌株W1秸秆降解作用情况。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。

实施例1、高抗盐碱赭曲霉菌株的分离

分离菌株的土壤秸秆样品来自吉林省白城市镇赉县。选取该地区荒芜多年且高度盐碱化的地块，采取土壤表层5cm左右的土壤秸秆，装入已灭菌处理的玻璃瓶中带回实验室4℃保存备用。采用平板稀释涂布法，将稀释后土壤上清液涂布于添加NaCl至250.0g/L的PDA培养基上，pH为10，培养4天，经过3轮筛选分离到一株高抗盐碱的真菌菌株，高抗盐碱类型的赭曲霉菌株编号为CGMCC NO.17971。

实施例2、高抗盐碱菌株的鉴定

形态学鉴定：将筛选得到的高抗盐碱菌株W1接种到含5％NaCL的PDA培养基上，30℃培养5d，观察菌落形态。用镊子夹取灭菌的盖玻片，斜插到5％NaCL的PDA培养基中部。在盖玻片正前方接种一个直径为7mm的菌片，菌丝面朝下然后将平板放置在30℃恒温培养箱中，定期观察菌丝生长情况，待菌丝爬上盖玻片后，将与盖玻片相连的培养基切下，取出盖玻片，在显微镜下观察菌丝及孢子形态。30℃在含5％NaCL的PDA培养基上培养5d后，圆形菌落直径约为67-73.8mm，呈现白色，菌体表面疏松，产生大量黄色孢子，菌落结构为羊毛状，菌落边缘为纤毛状，在培养过程中，培养基颜色不发生变化，菌落表面无液体渗出，如图2所示；显微观察结果：菌丝直立，表面光滑，分生孢子球形单胞，着生在产孢梗顶端，呈现头状着生方式，如图3所示。经形态学鉴定为赭曲霉菌。

分子生物学鉴定：采用真菌核糖体rDNA区通用引物ITS1(TCCGTAGGT-GAACCTGCGG)和ITS4(TCCTCCGCTTATTGATATGC)，对W1菌株进行ITS区段PCR扩增。PCR的扩增程序：94℃预变性2min，然后94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，进行30个循环；最后72℃延伸5min，扩增产物置于4℃保存。将扩增的ITS序列数据提交GenBank。利用NCBI网站上的在线软件Blast进行同源性比对，菌株W1与曲霉属(Aspergillus floccosus.)菌株KX090251.1的同源性达100％；使用生物信息学分析软件MEGA 7.0中的Maximum likelihood方法构建***发育树，如图1所示，进一步鉴定菌株W1为赭曲霉菌。

实施例3、菌株赭曲霉W1高抗盐性及最适钠盐浓度的鉴定

1、配制梯度NaCl含量的PDA培养基，pH为7.0，其盐浓度(质量分数)由0％增加到31％(饱和浓度)，每级增加2％。将等量的菌株接种于培养基中心位置，30℃培养1周。结果发现，在30℃的温度下，0％-31％NaCl PDA培养基中，菌株均能生长，但是随着盐浓度增长，菌株生长明显受到抑制。在1％-5％浓度下生长相对较缓慢；5％-13％浓度下菌株生长加快，15％-25％浓度下菌株生长急剧变慢，27％-31％浓度下菌体基本不生长，因此，该菌株具有抗盐的特性，属于高抗盐特性的真菌。

2、为了确定菌株生长的最适盐浓度，用上述系列盐梯度PD，马铃薯液体培养基，不加琼脂，pH为7.0，培养菌株，30℃摇培一周后，离心收集菌丝，用去离子水反复冲洗4次，105℃下烘干测定菌丝干重，比较菌株干重，如下表1，

表1

NaCl浓度(％)	5	7	9	11	13
						菌丝干重(g)	0.162	0.153	0.142	0.137	0.119

由以上可知：在浓度5-13％NaCl PDA培养基中的菌株干重最大，其最适生长的盐浓度为5-7％。

实施例4、菌株赭曲霉W1生长pH测定

1、配制pH1.0-13.0的酸碱梯度PDA培养基，添加NaCl至终浓度(质量分数)5％，接菌，30℃培养。结果发现，菌株在不同PH的培养基上开始生长的时间不同。培养1d，在pH＝3.0～9.0的培养基中可见菌丝生长，培养2d在pH＝10.0的培养基中可见菌丝生长，培养4d在pH＝11.0的培养基中可见菌丝生长。而在pH＝1.0，2.0，12.0和13.0的培养基中，始终未见菌丝生长。研究结果表明菌株的生长pH范围为3.0～11.0。

2、为了确定该菌株生长的最适pH范围，利用上述pH梯度进一步用PD液体培养基培养，30℃摇培1周后，离心收集菌丝，用去离子水反复冲洗4次，105℃下烘干，比较菌丝干重。菌株在pH4至9范围内，菌体干重最大，因此，该菌株的最适pH范围为4.0至9.0，菌株干重如下表2。

表2

PH	4.0	5.0	6.0	7.0	8.0	9.0
							菌丝干重(g)	0.225	0.254	0.275	0.269	0.237	0.226

实施例5、菌株赭曲霉W1产纤维素酶活性测定

纤维素酶活性测定：将等量的菌株接种到不含NaCL和含5％NaCL的产酶培养基中，CMC-Na 5.0g/L，酵母浸粉0.5g/L，酶水解干酪素0.5g/L，酸水解干酪素0.5g/L，Ca(NO₃)₂1.0g/L，K₂HPO₄ 0.2g/L，MgSO₄·7H₂O 0.25g/L，PH为7.0，30℃摇培4d，采用DNS方法测定菌株产纤维素酶的活性。

结果表明：使用不含NaCl产酶培养基培养4d，酶活达到58.73U/mL，使用5％NaCl产酶培养基培养4d，酶活达到168.25U/mL。

实施例6、菌株赭曲霉W1在秸秆基质上生产和对秸秆的降解

在50mL锥形瓶中放入0.6g经搅碎机打碎的秸秆，长度为5mm左右，121℃灭菌20min，向每个锥形瓶中接种3mL孢子悬液，培养液PH7.0，浓度为5％的NaCL，调节孢子悬液浓度为1×10⁵～1×10⁷，置于30℃培养箱中培养，定期观察生长情况。培养5天后，发现该菌株可以在秸秆上生长，如图3所示。然后用无菌水浸润发酵物2小时，过滤，采用DNS法测定滤出液中还原糖的含量。

将赭曲霉W1菌株孢子悬浮液中加入0.6g玉米秸秆，生长5天后，用无菌水浸润发酵物2小时，过滤，采用DNS法测定滤出液中还原糖的含量，每0.6g玉米秸秆可产生2.95mg还原糖。结果表明，赭曲霉W1能够降解秸秆。因此，该菌株可以用于环境中秸秆的降解，从而对环境污染进行处理。

实施例7、菌株发酵液对盐碱土中pH和全盐量影响的鉴定

使用本领域的常规方法活化并产生分生孢子的菌株，用无菌水洗下孢子，过滤，将孢子浓度调配约为10⁶-10⁸，按照1:10的比例加入PD液体培养基，PH为7.0，NaCL质量分数为5％，置于发酵罐，30℃，培养5天得到微生物液体菌剂。

将发酵菌株液体制剂施入吉林省松原市东白音花村盐碱地。

春天翻耕灌水3天后，加入有机肥料进行搅混；15天后进行耙田平整，种植水稻，插秧分蘖前期按照每亩用1～1.5L的用量均匀施入本发明的得到微生物液体菌剂，秋天进行收获。

空白对照组的土壤pH为10.3、全盐量为0.181％，水稻无法正常分蘖；施入赭曲霉W1发酵菌剂的实验组土壤pH为8.5、全盐量为0.076％，水稻能够正常的生长、分蘖；具体的鉴定结果如表3所示，其中的改良效果为试验点数据与空白对照点数据之差与空白对照点数据的百分比，可以看出本发明提供的赭曲霉W1菌株经过发酵得到的菌剂处理盐碱地之后，pH下降17.5％，钠离子的浓度降低72.9％，全盐量降低58.0％。

表3

地点	PH	钠离子(mg/kg)	全盐量(g/kg)
				空白对照点	10.3	524	1.81
试验点	8.5	142	0.76
				改良效果	-17.5％	-72.9％	-58.0％

由此可见：本发明提供的菌剂能够有效改善盐碱地的状况，使盐碱地适于种植。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。

Claims

1.一种抗盐碱赭曲霉菌株W1，其特征在于：所述的菌株W1保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，建议的分类命名为赭曲霉(Aspergilus ochraceus)，保藏编号为CGMCC NO.17971。

2.一种抗盐碱的赭曲霉菌剂，其特征在于，由含有权利要求1所述的抗盐耐碱的赭曲霉菌株W1经发酵得到。

3.如权利要求1所述的抗盐碱赭曲霉菌株W1的应用，其特征在于：所述的抗盐碱赭曲霉菌株W1在降解秸秆中的应用。

4.如权利要求1所述的抗盐碱赭曲霉菌株W1的应用，其特征在于：所述的抗盐碱赭曲霉菌株W1在改造盐碱地中的应用。